CN113720900A - 一种基于madli-tof ms技术检测血清中m蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于MADLI‑TOF MS技术检测血清中M蛋白的方法。本发明建立的基于MALDI‑TOF MS技术直接检测血清M蛋白的快速筛查方法，该法具有快速、高通量、操作简便、谱图清晰易解读的优点，其检测灵敏度高于现有M蛋白筛查技术，有望在多发性骨髓瘤的筛查、诊断、疗效评估、预后判断及微小残留检测中发挥重要作用。

Description

一种基于MADLI-TOF MS技术检测血清中M蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种基于MADLI-TOF MS技术检测血清中M蛋白的方法，属于生物医学领域。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)目前仍无法治愈，早期鉴定其主要生物学指标并及时进行有效干预，是准确诊断、疗效评估及延长生存期的重要手段。血清中出现M蛋白是本病的突出特点，且M蛋白浓度与临床症状严重程度相关，早期鉴定M蛋白，进行及时有效干预，以追踪疾病进程和治疗反应，对临床诊疗具有重要指导意义。与大多数血清学肿瘤标志物不同，M蛋白非常多样化。每个M蛋白都有独特的可变区序列，分子量范围从五聚体IgM(～900,000道尔顿)到单体游离轻链(～24,000道尔顿)。
诊断MGUS、SMM和MM需要检测血清M蛋白，国际骨髓瘤工作组(InternationalMyeloma Working Group，IMWG)建议将PEL、IFE和FLC比值3项检测结合起来进行综合分析以最大程度的提高临床筛查的灵敏度。PEL检测M蛋白有2个主要缺陷。一是很难检出轻链型骨髓瘤(Light chain multiple myeloma,LCMM)；二是单克隆蛋白有时会迁移至蛋白电泳的β区，在PEL中仅显示微弱的M蛋白峰或没有显示。这是导致PEL检测假阴性的主要原因。IFE是目前公认的检测单克隆蛋白的金标准，它可以检测完整的免疫球蛋白、游离轻链、重链或二者的组合。但存在操作步骤繁琐、检测成本较高和检测通量低(1次只能检测9个样本)的缺点。在实际工作中可能会遇到非常微弱的条带或多个条带的不典型样本，这些条带可能不是单克隆的，这些情况都可能导致结果误判为假阳性或假阴性。血清游离轻链(sFLC)测定被IMWG纳入了MM诊治指南，目前限制sFLC广泛应用的主要原因是缺乏通用的测定标准(即测试结果因不同的测试平台而不同)和连续稀释时的非线性问题。此外，sFLC分析的问题还包括假阴性解释和对结果多达10倍的高估。
综上所述，现有的用于M蛋白检测的技术都存在一定的缺陷，不能满足临床精准诊疗的需求。因此，迫切需要寻找和研究一项更加灵敏、特异和准确的M蛋白检测方法。
近年来，随着质谱技术的快速发展及在临床检验中的广泛应用，人们也越来越关注采用质谱技术检测M蛋白的研究。使用MALDI-TOF MS进行定性测定有许多优点，如快速的采集速度、单个患者样本的残留消除、光谱解读直观明了。
来自梅奥诊所的学者开展了相关研究。Kohlhagen采用纳米抗体富集联合MALDI-TOF MS技术建立了定性筛查血清M蛋白的方法，研究指出可以检测出100％PEL阳性样本，且以IFE为金标准，方法的灵敏度和特异性可分别达到92％和80％。随后Mills在此基础上又建立了基于抗体富集的M蛋白相对定量方法。该法检测速度远远高于PEL和IFE，每个样本质谱检测用时不到1分钟；检测成本介于PEL和IFE之间；不受纤维蛋白原及β区单克隆免疫球蛋白的干扰，这些优点具备了高通量筛查试验的基本要求，但在样本前处理过程需进行抗体的免疫富集，一方面增加了操作的复杂性，另一方面也增加了检测成本，这对于MALDI-TOF MS简便、快速、低成本筛查M蛋白的优势有所消减，这也是该法有待改善的地方。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测血清中M蛋白的方法。
本发明提供的检测血清中M蛋白的方法，包括如下步骤：
1)将待测血清样本用去离子水稀释80倍，涡旋混匀，得到样本稀释液；
2)将所述样本稀释液采用浓度为0.4mol/L的TCEP还原剂溶液还原，得到样本还原液；
3)采用基质液对上述样本还原液进行稀释，得到样本基质稀释液；
4)将上述样本基质稀释液点样到靶板上，加热至结晶；
5)将所得结晶进行MADLI-TOF MS检测，采用阳离子模式检测轻链单电荷离子峰，将所得谱图与健康人M蛋白阴性血清样本经步骤1)-4)处理后进行MADLI-TOF MS检测所得谱图进行对照叠加，若在κ和λ轻链的单电荷和双电荷的m/z范围内出现明显尖峰，可判定为待测血清样本含M蛋白，依据出现的位置确定为单克隆κ轻链或λ轻链；
步骤2)中，所述样本稀释液与TCEP还原剂溶液的体积比可为9：1；
所述还原的时间可为20min；
步骤3)中，所述基质液与样本还原液的体积比可为4:1；
所述基质液为SA基质液，即10g/L的4-乙酰氧基-3-甲氧基肉桂酸溶液(溶剂为50％(体积比)乙腈+50％(体积比)0.1％(质量比)TFA水溶液)；
步骤4)中，所述点样可为直接点样或双层点样，具体可为直接点样；
所述直接点样为将样本基质稀释液直接点到靶板上，加热至结晶；
所述双层点样为第1次点样于靶板至干燥结晶后，再点第2次结晶；
步骤5)中，MADLI-TOF MS检测中，以单电荷离子峰作为检测离子，κ和λ轻链的单电荷和双电荷的m/z范围为：
κ轻链，[M+H]+m/z(Da)23100～24400，[M+2H]2+m/z(Da)11550～12200；
λ轻链，[M+H]+m/z(Da)22400～23100，[M+2H]2+m/z(Da)11200～11550。
对23例M蛋白阳性样本进行原倍、10倍、100倍和200倍稀释后，10倍稀释时MALDI-TOF MS的检出率为100％，IFE为96％；100倍和200倍稀释时，IFE的检出率分别为MALDI-TOFMS的28％和23％；在712例样本中，以IFE为金标准，PEL与MALDI-TOF MS总的符合率分别为85.9％和92.3％，PEL与MALDI-TOF MS的阳性符合率分别为72.8％和99.7％；在M蛋白的不同型别中，MALDI-TOF-MS在IgA、IgD、IgM、游离轻链型和双克隆组中对M蛋白的检出率为100％，而PEL对IgM、IgA和游离轻链型样本的检出率分别只有66.7％、58％和19.5％。对2例M蛋白阳性样本进行原倍、10倍、100倍和200倍稀释后，同时进行FLC比值和MALDI-TOF-MS检测，只有1例高值FLC比值样本在10倍稀释时可检到FLC比值异常，其他稀释样本未检出，而MALDI-TOF-MS可以检出所有稀释样本的M蛋白。
本发明无需免疫富集采用MALDI-TOF MS技术直接检测血清中M蛋白，建立一种简便、快速、价廉、灵敏、特异的M蛋白检测方法，进而在大型实验室推广应用，实现早期筛查MGUS、sMM和临床分期较早的MM，进行随访和相应的治疗干预，有望在提高MM生存和改善预后方面发挥重要作用。
本发明建立了一种基于MALDI-TOF MS技术直接检测血清M蛋白的快速筛查方法，该法具有快速、高通量、操作简便、谱图清晰易解读的优点，其检测灵敏度高于现有M蛋白筛查技术，有望在多发性骨髓瘤的筛查、诊断、疗效评估、预后判断及微小残留检测中发挥重要作用。
附图说明
图1为本发明样本检测操作步骤。
图2为免疫球蛋白纯品κ和λ轻链的单电荷质谱图。
图3为免疫球蛋白纯品κ和λ轻链的双电荷质谱图。
图4为健康人血清样本还原前后图谱对比。
图5为健康人血清样本与免疫球蛋白纯品κ和λ轻链的单电荷离子峰比对质谱图。
图6为健康人血清样本与免疫球蛋白纯品κ和λ轻链的双电荷离子峰比对质谱图。
图7为以去离子水与1×PBS为溶剂的Igκ和λ轻链离子峰比对质谱图。
图8为不同稀释倍数κ和λ轻链离子峰比对质谱图。
图9为不同浓度还原剂处理样本κ和λ轻链离子峰比对质谱图。
图10为还原剂不同作用时间κ和λ轻链离子峰比对质谱图。
图11为基质液与样本不同比例κ和λ轻链离子峰比对质谱图。
图12为3种点样方式κ和λ轻链离子峰比对质谱图。
图13为λ和κ轻链的单电荷和双电荷离子质谱图。
图14为单克隆蛋白检测操作流程图。
图15为20例健康人血清样本的κ和λ轻链单电荷离子峰叠加谱图。
图16为20例健康人血清样本的κ和λ轻链双电荷离子峰叠加谱图。
图17为M蛋白阳性样本谱图。
图18为M蛋白阴性样本谱图。
图19为MALDI-TOF MS和IFE对23例M蛋白阳性系列稀释样本检出率比较。
图20为1例M蛋白阳性样本经系列稀释后MALDI-TOF和IFE结果。
图21为MALDI-TOF MS和PEL与IFE结果的符合率。
图22为M蛋白阳性样本系列稀释的FLCκ/λ比值变化。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
仪器、试剂及材料
1仪器
1.1 QuanTOF宽谱定量飞行时间质谱仪(中国，融智生物)，属于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry，MALDI-TOF MS)
测试时质谱条件如下：实验激光强度设为9μJ，激光频率为1000Hz，扫描速度为0.5mm/s，采集连续10次激光辐照获得的质谱图累加作为最终质谱图。
1.2 Sebia HYDRASYS全自动电泳仪(法国，Sebia公司)
1.3 Beckman Coulter IMMAGE800特种蛋白分析仪(美国，Beckman公司)
1.4 Optilite特种蛋白分析仪(英国，BindingSite公司)
2试剂
2.1免疫球蛋白全组分抗血清试剂盒(法国，Sebia公司，批号552440，效期2021-03)
2.2κ轻链检测试剂盒(美国，Beckman公司，150测试/盒，批号M910179，效期2022-01)
2.3λ轻链检测试剂盒(美国，Beckman公司，150测试/盒，批号M001025，效期2022-03)
2.4 Optilite Freelite Kappa游离轻链检测试剂盒(英国，BindingSite公司，100测试/盒，批号461004，效期2021-06)
2.5 Optilite Freelite Lambda游离轻链检测试剂盒(英国，BindingSite公司，100测试/盒，批号463072，效期2021-06)
2.6 Optilite稀释液(英国，BindingSite公司，40mL，批号469560，效期2021-05)
2.7三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)(美国，Sigma公司)
2.8 HPLC级4-乙酰氧基-3-甲氧基肉桂酸(美国，Sigma公司)
2.9三氟乙酸(TFA)(美国，Sigma公司)
2.10 HPLC级乙腈(美国，Sigma公司)
2.11 IgA纯品(美国，Sigma公司，1mg，批号109M4796V)
2.12 IgG纯品(美国，Sigma公司，50mg，批号SLBR0560V)
3材料
2020年7月-2020年12月在首都医科大学附属北京朝阳医院申请M蛋白鉴定检测的患者和健康体检人群检验后剩余血清标本。
方法
1 MALDI-TOF MS检测M蛋白方法的建立
1.1轻链的鉴定
将免疫球蛋白纯品溶液IgA和IgG稀释到参考区间范围，用TCEP还原剂打开免疫球蛋白重链与轻链间及轻链与轻链间二硫键，获得总轻链，寻找κ和λ轻链单电荷和双电荷离子质谱峰。
选择健康人血清样本直接检测，观察是否可以检测到轻链峰，如未检测到，进行上述还原处理，并将谱图与上述免疫球蛋白纯品谱图叠加，确认样本中轻链峰成分。
1.2样本制备和测定条件的选择和优化
1.2.1样本稀释液的选择
为保证获得检测样本最佳质谱响应的谱图，我们选择去离子水和1×PBS作为候选样本稀释液，对稀释液种类进行选择，确定适宜的溶剂对样本进行稀释处理。
1.2.2样本稀释比例的选择
为保证获得检测样本最佳质谱响应的谱图，我们对样本的稀释条件进行了摸索。分别用去离子水进行50倍、60倍、80倍和100倍稀释，用MALDI-TOF MS方法分别检测κ和λ轻链离子峰，比较不同稀释比例的谱峰响应，确定血清样本的最佳稀释比例。
1.2.3还原剂浓度的选择
为保证获得检测样本最佳质谱响应的谱图，我们对处理样本的TCEP还原剂的浓度进行了摸索。分别配制0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.8mol/L和1.6mol/L的TCEP溶液处理同一份健康人血清样本，用MALDI-TOF MS方法检测κ和λ轻链离子峰，比较不同还原剂浓度处理样本的谱峰响应，确定还原剂的最佳浓度。
1.2.4还原时间的选择
为保证样本中重轻链被解离，使单克隆蛋白得以释放，从而获得检测样本最佳响应的谱图，我们对样本的还原时间进行了摸索。分别设置不加还原剂(即0min)、5min、10min、20min、30min和60min等6个时间点，处理同一份健康人血清样本，用MALDI-TOF MS方法检测κ和λ轻链离子峰，比较不同还原时间处理样本的谱峰响应，确定还原剂的最佳浓度。
1.2.5基质液与样本比例的选择
SA基质液：10g/L的4-乙酰氧基-3-甲氧基肉桂酸溶液(溶剂为50％(体积比)乙腈+50％0.1％TFA(质量比)水溶液)
为保证获得检测样本最佳质谱响应的谱图，我们对样本在基质液中的稀释比例进行了摸索。分别以样本：基质液为1:1、1:2、1:3、1:4、1:6和1:9的比例稀释，用MALDI-TOF MS方法分别检测κ和λ轻链离子峰，比较不同稀释比例的谱峰响应，确定样本与基质液的最优体积比。
1.2.6不同点样方式选择
为保证获得检测样本最佳质谱响应的谱图，我们尝试了直接点样、双层点样和夹心点样3种点样方式。直接点样为将样本基质稀释液直接点到靶板上，加热至结晶进行检测；双层点样为第1次点样于靶板至干燥结晶后，再点第2次结晶后检测；夹心点样为第1次空点基质液，结晶后再点样本基质稀释液，再次结晶后最后空点基质液结晶后检测，观察谱图响应效果，确定最终点样方式。
1.2.7质谱条件的选择和优化
分别选择κ和λ单克隆轻链高值和低值样本各1例，线性正离子模式，激光扫描m/z范围5000～80000，比较κ和λ轻链的单电荷和双电荷离子峰响应强度，选择最终检测的离子类型。
1.3样本检测程序
样本检测操作步骤见图1。
1.4质量控制
为保证检测结果的重复性和准确性，每批次样本测定时设置一个阴性样本和阳性样本，分别作为阴性质控和阳性质控。阴性质控为经IFE和PEL检测为M蛋白阴性的健康人混合血清；阳性质控为经IFE和PEL检测为M蛋白阳性的MM患者血清。
质控标准：阳性质控判读以在阴性对照背景下轻链单电荷质荷比范围出现明显尖峰为阳性在控；阴性质控判读以在上述条件下出现圆润高斯分布峰为阴性在控。
1.5κ和λ轻链m/z范围的确定
选择20例健康人血清样本，按上述样本检测方法，进行MALDI-TOF MS测定，将20份κ和λ轻链单电荷和双电荷离子峰谱图叠加，验证Kohlhagen等提出的κ和λ轻链离子的质荷比范围。
1.6 M蛋白的确定与识别
选取经IFE确诊的轻链类型分别为κ和λ型的多MM患者血清样本各1份，进行MALDI-TOF MS检测，同时测定健康人M蛋白阴性血清样本，将患者的谱图与阴性对照叠加，在阴性对照多克隆背景下κ和λ轻链m/z范围出现明显尖峰，认为是单克隆κ和λ轻链，判定为存在M蛋白，否则判读为阴性。
2方法学评价
2.1 MALDI-TOF MS与IFE的灵敏度和检测限
目前，对M蛋白检测公认的金标准是IFE。因此，为了确定MALDI-TOF MS方法相较于IFE方法作为定性试验的灵敏度，我们选取了23例不同浓度的M蛋白阳性的样本来评估分析检测M蛋白的灵敏度和检测限。使用健康人混合血清将这23例样本进行稀释，采用MALDI-TOF MS和IFE方法分别对原倍、10倍稀释、100倍稀释和200倍稀释样本进行测定，评价二者检出M蛋白的能力。
2.2 MALDI-TOF MS与IFE和PEL的一致性比对
对收集的712例血清标本，分别采用IFE、PEL和MALDI-TOF MS 3种方法进行M蛋白检测，并进行结果比对。对于MALDI-TOF MS结果的判读，需进行谱图解读训练。前期选择20例健康人和50例M蛋白阳性的多发性骨髓瘤患者样本进行MALDI-TOF MS检测，分析人员进行非盲性判读(即在判读谱图结果前，告知样本信息)，基于前述判读标准，综合M蛋白结果和谱图特征，进行判读经验积累和能力训练。随后进行712例样本的MALDI-TOF MS结果判读，并与IFE和PEL结果比对，计算MALDI-TOF MS方法与IFE和PEL的符合率。
2.3 MALDI-TOF MS和PEL在不同M蛋白分型中的一致性比对
以IFE为金标准，比较MALDI-TOF MS和PEL在不同分型M蛋白分型中对M蛋白的检出能力。
2.4 MALDI-TOF MS与FLC比值的检出能力比对
对MALDI-TOF MS与IFE结果不符的样本，我们进行了血清游离轻链的测定，以游离轻链κ和λ比值参考范围为0.26～1.65为标准，进行M蛋白结果的判定，辅助分析MALDI-TOFMS与IFE两种测定结果不同的原因。为评估血清游离轻链比值鉴定M蛋白方法的能力，用含多克隆轻链的健康人样本对2份M蛋白阳性样本进行梯度稀释，即测定原倍、10倍、100倍和200倍稀释样本，检测游离κ和λ轻链水平，计算κ/λ比值，得出M蛋白鉴定结果。
3 MALDI-TOF MS方法的临床评价
对上述检测结果不符的样本病例进行回顾和跟踪，比较、分析在疾病发展过程中MALDI-TOF MS与IFE、PEL对M蛋白的检出能力及与临床的符合度；比较、分析与MFC在MRD监测中的评估价值。
结果
1 MALDI-TOF MS检测M蛋白方法的建立
1.1轻链的鉴定
为鉴定作为M蛋白成分的κ和λ轻链，使用TCEP还原剂分别还原人源免疫球蛋白纯品IgA和IgG，获得相应的κ和λ轻链，经MALDI-TOF MS检测κ和λ轻链，其单电荷和双电荷谱图分别见图2和图3。
将健康人血清样本稀释后直接检测，在质谱图上未发现明显的κ和λ轻链的离子峰，这可能与血清中游离的κ和λ轻链含量过少有关，故将该样本进行还原处理，测定游离和与重链结合的轻链之和(即总轻链)，将还原后与还原前的样本谱图进行叠加，发现了κ和λ轻链的离子峰，见图4。为进一步验证这两个峰为κ和λ轻链离子，将其单电荷和双电荷离子峰分别与免疫球蛋白纯品的κ和λ轻链离子峰进行谱图叠加，验证了κ和λ轻链成分，见图5和图6。
并与上述Ig纯品κ和λ轻链离子的出峰位置进行比对，看到了κ和λ轻链的离子峰。因此，决定通过检测单克隆轻链判定单克隆免疫球蛋白(即M蛋白)。
1.2样本制备和测定条件的选择和优化
1.2.1样本稀释液的确定
分别选择去离子水和1×PBS作为候选样本稀释液，两种稀释液稀释同一份样本(健康人血清样本)，按照相同的前处理和质谱条件进行检测，结果见图7。从叠加谱图的峰型看，两种溶剂间没有明显区别；从叠加谱图的响应强度看，1×PBS略高于去离子水。但基于我们对M蛋白的判读是依据轻链的峰型(即尖峰还是圆润峰)以及从检测成本的经济性和所用试剂获取的便利性考虑，决定选择去离子水作为样本稀释液。
1.2.2样本稀释比例的确定
用去离子水进行50倍、60倍、80倍和100倍稀释，用MALDI-TOF MS方法分别检测κ和λ轻链离子峰，不同稀释比例处理的结果见图8。结合谱图响应和信噪比，最终确定稀释倍数为80倍。
1.2.3还原剂浓度的确定
配制0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.8mol/L和1.6mol/L 5个不同浓度的TCEP溶液，处理同一份健康人血清样本，不同还原剂浓度处理的结果见图9。从谱图响应看，0.4mol/L与0.8mol/L的TCEP还原剂的响应相近，1.6mol/L的TCEP还原剂虽然稍高，但考虑到TCEP溶液配制时较难溶解，故确定还原剂的最佳浓度为0.4mol/L(图中0.04mol/L是还原剂在整个反应体系中的终浓度)。
1.2.4还原时间的确定
分别将还原剂按不加还原剂(0分钟)、作用5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟的不同处理时间还原样本(健康人血清样本)，各时间点的结果见图10，可以看到20分钟和30分钟的作用时间谱图响应基本一致，在不影响样本还原的基础上，基于检测流程简便、快速的原则，选择20分钟作为还原实验条件。
1.2.5基质液与样本比例的确定
分别以基质液(10g/L的4-乙酰氧基-3-甲氧基肉桂酸溶液(溶剂为50％(体积比)乙腈+50％(体积比)0.1％(质量比)TFA水溶液)):样本(健康人血清样本)比例为9:1、6:1、4:1、3:1、2:1和1:1进行稀释，用MALDI-TOF MS方法分别检测κ和λ轻链离子峰，结果见图11。结合谱图响应和信噪比，最终确定基质液与样本比例为4:1。
1.2.6点样方式的确定
采用直接点样、双层点样和夹心点样3种方式进行靶板点样，结果见图12。双层点样方式虽略高于直接点样，但二者差别甚小，综合谱图响应和操作的简易性，最终确定使用直接点样方式。
1.2.7质谱条件的确定
分别选择κ和λ单克隆轻链样本各1例，线性正离子模式，激光扫描质量范围为5000～80000m/z，将阳性样本谱图叠加于健康人样本谱图上，在正常多克隆背景上会出现一显著尖峰，κ和λ轻链的单电荷和双电荷离子谱图见图13，结合谱图响应和离子在电场中的稳定性，可以看到轻链的单电荷离子峰比双电荷离子峰响应明显增高，更加容易判读M蛋白，因此，确定单电荷离子峰作为检测离子。
1.3样本检测程序的确定
经上述各种条件的选择和优化后，最终确定样本稀释倍数为80倍；基质液与样本比例为4:1；检测轻链单电荷离子峰，具体检测操作程序见图14。
1.4κ和λ轻链m/z范围的确定
经MALDI-TOF MS测定的20例健康人血清样本的κ和λ轻链单电荷和双电荷离子峰叠加谱图结果见图15、图16，与Kohlhagen等提出的κ和λ轻链离子的质荷比范围相近，从谱图中可以看到κ和λ离子峰质荷比呈高斯分布。
1.5 M蛋白的确定与识别
选取经免疫固定电泳确诊的轻链类型分别为κ和λ型的多发性骨髓瘤患者血清样本各1份，按照上述方法进行MALDI-TOF MS检测，同时测定健康人血清样本，将患者的谱图与健康对照叠加，在健康多克隆背景下κ和λ轻链m/z范围出现明显尖峰，见图17，认为是单克隆κ和λ轻链，判定为存在M蛋白。M蛋白阴性的谱图见图18。
依据结果4.4中20例健康人血清样本的κ和λ轻链单电荷和双电荷离子峰叠加谱图，确定κ和λ轻链的单电荷和双电荷的m/z范围，见表1，用于鉴定M蛋白。当待测样本谱图叠加与健康对照样本的谱图上时，在κ和λ轻链的单电荷和双电荷的m/z范围内出现一明显尖峰，可判定为M蛋白，依据出现的位置可确定为单克隆κ轻链或λ轻链。M蛋白阳性和阴性结果谱图见图17、18。
表1κ和λ轻链[M+H]+和[M+2H]2+的质荷比范围
Figure BDA0003261136590000131
2.方法学评价
2.1 MALDI-TOF MS与IFE的灵敏度和检测限
M蛋白检测对MALDI-TOF MS、IFE和PEL的分析灵敏度取决于其在多克隆背景中的强度和在多克隆分布中的相对位置。采用MALDI-TOF MS和IFE方法分别对23例M蛋白阳性样本的原倍、10倍稀释、100倍稀释和200倍稀释样本进行测定，结果显示MALDI-TOF MS在每种稀释度下相较IFE都能以较高百分比鉴定出M蛋白，见图19。其中，原倍时，100％的样本都能被MALDI-TOF MS和IFE鉴定出来；10倍稀释时，IFE可以鉴定出96％的样本；100倍稀释时，MALDI-TOF MS和IFE对M蛋白的检出率分别是91％和26％；200倍稀释时，IFE对M蛋白的检出率不到MALDI-TOF MS的25％。其中，初始样本的M蛋白浓度范围为1.2g/dL～7.9g/dL。基于血清M蛋白的初始值，MALDI-TOF MS和IFE对M蛋白的检测限分别为0.006g/dL～0.018g/dL和0.014g/dL～0.040g/dL。1例M蛋白阳性样本(G-κ型)经原倍、10倍、100倍和200倍系列稀释后，MALDI-TOF MS和IFE的结果谱图见图20。
2.2MALDI-TOF MS与IFE和PEL的一致性比对
对收集的712例血清标本，分别采用IFE、PEL和MALDI-TOF MS 3种方法进行M蛋白检测，比对结果见表2。以IFE为金标准，PEL的灵敏度和特异性分别为72.8％和100％，符合率为85.9％；MALDI-TOF MS的灵敏度和特异性分别为99.7％和84.3％，符合率为92.3％。从结果可以看出，MALDI-TOF MS检出M蛋白的能力大大高于PEL，且与IFE的符合率也更高一些。如果以PEL鉴定M蛋白的阳性样本比较，MALDI-TOF MS与IFE+/PEL+组的符合率达99.6％。如果单以IFE鉴定M蛋白的阳性样本比较，MALDI-TOF MS与IFE+的符合率为99.7％，远高于PEL与IFE+的72.8％的符合率。这一结果表明，MALDI-TOF MS和PEL两者符合率的差异主要体现在对低M蛋白浓度的检测能力。
表2 MALDI-TOF MS与IFE、PEL结果比对
Figure BDA0003261136590000141
2.3 MALDI-TOF MS和PEL在不同M蛋白分型中的一致性比对
712例样本中，M蛋白阴性345例、IgG209例、IgA81例、IgD13例、IgM12例、轻链L型25例、轻链K型16例，双克隆型11例。MALDI-TOF MS和PEL在不同分型M蛋白组别中与IFE的比对结果分别见表3和表4。以IFE结果为金标准，分别计算MALDI-TOF-MS和PEL与之的符合率，从图21中可以看到，在IgA、IgD、IgM、轻链型和双克隆组中，MALDI-TOF-MS与IFE的符合率达到100％；在与IFE阴性的样本中因有54例MALDI-TOF-MS判断为M蛋白阳性，而使符合率下降到84.3％；在IgG组有1例样本我们将MALDI-TOF-MS的结果判为阴性(盲性判读)。在图21中，我们可以明显看到除了IFE阴性组，在其他6组中，PEL与IFE的符合率明显低于MALDI-TOF-MS，而PEL与IFE阴性样本结果的完全符合也不一定能说明PEL的特异性就高于MALDI-TOF-MS。
表3在不同M蛋白分型亚组中MALDI-TOF-MS与IFE结果比对
Figure BDA0003261136590000151
表4在不同M蛋白分型亚组中PEL与IFE结果比对
Figure BDA0003261136590000152
2.4 MALDI-TOF MS与FLC比值的检出能力比对
712例样本中，MALDI-TOF-MS与IFE结果不符的样本共有55例，其中，以IFE为金标准，将MALDI-TOF-MS判定为“假阳性”的样本有54例；MALDI-TOF-MS判定为“假阴性”的样本有1例。对这55例样本进行游离轻链比值测定，54例“假阳性”样本中有19例检测出FLCκ/λ比值异常，且轻链分型结果与MALDI-TOF MS结果一致，35例FLCκ/λ比值正常；1例“假阴性”样本的FLCκ/λ比值正常。
为进一步验证FLCκ/λ比值鉴定单克隆轻链的能力，我们选取2例M蛋白阳性的样本，用多克隆背景的健康人血清进行10倍、100倍和200倍稀释，分别检测二者原倍、10倍、100倍和200倍稀释样本的游离κ和λ浓度，计算FLCκ/λ比值。其中，样本1原倍的FLCκ/λ比值为4.249；样本2原倍的FLCκ/λ比值为432.88。不同稀释倍数时，2份单克隆蛋白阳性样本的FLCκ/λ比值变化见图22，图中阴影部分表示FLCκ/λ比值处于参考范围内，即无法判读M蛋白阳性。从这个实验结果来看，FLCκ/λ比值鉴定M蛋白的能力非常有限，即使是FLCκ/λ比值高达400以上，10倍稀释以上则不能判别M蛋白的存在，因此，在上述54例MALDI-TOF-MS判定为“假阳性”的样本中，虽然FLCκ/λ比值可以从中鉴别出19例阳性样本，但剩余的35例样本依旧无法鉴别，这也说明FLCκ/λ比值鉴定单克隆蛋白的能力并不优于MALDI-TOF-MS方法。
总之，我们所建方法无需进行抗体富集，直接检测血清中还原后的总轻链，每个样本谱图采集不到1分钟，1次可以检测96个样本，远远高于IFE和PEL的检测容量，大大降低了检测成本、操作流程简易、对人员操作技术要求低、检测结果准确可靠、结果判读标准清晰，非常适合在实验室推广应用。同时，由于该方法较高的灵敏度和特异性，在临床早期诊断、治疗检测、疗效评估和判读预后方面显示出潜在的应用价值。

Claims (5)

1.一种检测血清中M蛋白的方法，包括如下步骤：
1)将待测血清样本用去离子水稀释80倍，涡旋混匀，得到样本稀释液；
2)将所述样本稀释液采用浓度为0.4mol/L的TCEP还原剂溶液还原，得到样本还原液；
3)采用基质液对上述样本还原液进行稀释，得到样本基质稀释液；
4)将上述样本基质稀释液点样到靶板上，加热至结晶；
5)将所得结晶进行MADLI-TOF MS检测，采用阳离子模式检测轻链单电荷离子峰，将所得谱图与健康人M蛋白阴性血清样本经步骤1)-4)处理后进行MADLI-TOF MS检测所得谱图进行对照叠加，若在κ和λ轻链的单电荷和双电荷的m/z范围内出现明显尖峰，可判定为待测血清样本含M蛋白，依据出现的位置确定为单克隆κ轻链或λ轻链。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述样本稀释液与TCEP还原剂溶液的体积比为9：1；
所述还原的时间为20min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述基质液与样本还原液的体积比为4:1；
所述基质液为SA基质液，即10g/L的4-乙酰氧基-3-甲氧基肉桂酸溶液，溶剂为50％乙腈+50％0.1％TFA水溶液。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述点样为直接点样或双层点样；
所述直接点样为将样本基质稀释液直接点到靶板上，加热至结晶；
所述双层点样为第1次点样于靶板至干燥结晶后，再点第2次结晶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：步骤5)中，MADLI-TOF MS检测中，以单电荷离子峰作为检测离子，
κ和λ轻链的单电荷和双电荷的m/z范围为：
κ轻链，[M+H]+m/z(Da)23100～24400，[M+2H]2+m/z(Da)11550～12200；
λ轻链，[M+H]+m/z(Da)22400～23100，[M+2H]2+m/z(Da)11200～11550。
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