CN105572355B

CN105572355B - 检测食管癌的生物标志物

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Publication number: CN105572355B
Application number: CN201510947274.6A
Authority: CN
Inventors: 赵晓航; 孙玉琳; 贾坤; 周兰萍; 马庆伟; 王凤; 林燕
Original assignee: Bioyong Tech Beijing Co ltd; Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Bioyong Tech Beijing Co ltd; Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2035-12-17
Also published as: CN105572355A

Abstract

本发明提供了用于食管癌早期诊断的生物标志物组合，具体地，本发明提供了可通过质谱检测的特征多肽组合物，其包括质荷比为1925.5m/z、2950.6m/z、5900.0m/z的三个多肽。当2950.6m/z、5900.0m/z多肽上调表达，1925.5m/z的多肽下调表达时表明受试者为食管癌患者或潜在食管癌患者。本发明的生物标志物可用于食管癌早期诊断和筛查，且方法简单，易于操作，准确性高，为食管癌早期诊断和筛查提供了新的方法和思路。同时，本发明还发现凝血酶敏感蛋白1(TSP1)可单独作为生物标志物用于在血清或组织中诊断食管鳞癌或预测食管鳞癌的预后。

Description

检测食管癌的生物标志物

技术领域

本发明涉及肿瘤标志物领域，涉及用于食管癌早期诊断的生物标志物，具体地，本发明提供了可通过质谱检测的特征多肽组合作为食管癌早期诊断的生物标志物。

背景技术

食管癌是在全世界范围内的第八大最常见的癌症，按照与癌症有关的致死原因排序，食管癌排在第六位。尽管目前各国医疗科研机构对食管癌的诊断、治疗的研究都有所进展，但它的五年生存率平均只有15％，仍然缺乏可靠的诊断方法、早期检测方法和有效的个体化治疗方案，并且预后效果差。据研究报导，处于早期阶段的肿瘤，如果切除成功，会使食管鳞状细胞癌患者的5年总生存率超过90％，表明早期诊断和治疗可降低病死率。目前用于识别食管癌患者的生物标志物，在癌症早期阶段还缺乏足够的灵敏度和特异性。

目前食管癌的检测仍然停留在临床表征检测水平，缺乏早期预警的技术手段。近年来也出现了一些新型质谱检测技术，如：中国专利申请200510075367、“一种在食管癌病人血清中检测肿瘤相关标志物的方法”公开了一种在食管癌病人血清中检测肿瘤相关标志物的方法，包括：蛋白免疫印迹证实Ku70蛋白为食管癌特异的肿瘤相关标志物，制备该标志物的抗体，然后利用该标记物检测病人血样，并通过SDS-PAGE电泳，分离肿瘤特异表达的蛋白条带，进行电喷雾离子化偶联在线离子阱质谱蛋白属性鉴定，最终实现检测目的。然而该方法涉及免疫组织化学方法、电泳分离纯化法，最终才进行质谱检测，过程耗时费力，影响了临床检测效果。

中国专利申请201210479435、“一种食管癌免疫质谱检测试剂盒” 则公开了另一种质谱检测技术，包括：将特定单克隆抗体结合到检测载体上，吸附样品中的待分析物，然后收集待分析物进行质谱检测。该方法仍然属于传统的免疫吸附分离联合质谱检测技术，由于前期的分离过程过于传统和复杂，涉及制备特定单抗和抗体/抗原的孵化结合等过程，无法实现食管癌的早期、快速准确诊断和微量检测的技术效果。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过真空飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同来检测离子，即被检测离子的质荷比(m/z)与该离子的飞行时间成正比。尽管MALDI-TOF的准确度高达0.1％～0.01％，远远高于目前常规应用的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与高效液相色谱技术，但迄今为止尚无采用MALDI-TOF-MS技术获得检测食管癌标志物或食管癌血清特征多肽的报道。

发明内容

本发明的发明人基于质谱检测技术，令人惊奇地发现了可用于食管癌诊断的生物标志物，该生物标志物可灵敏、准确地诊断食管癌或评估罹患食管癌的风险，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及生物标志物或生物标志物组合，其包括选自质荷比为1925.5±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.2m/z)、2950.6±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.3m/z)、5900.0±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.6m/z)的多肽中的一种、两种或三种，优选地，

所述质荷比为1925.5±3.0m/z的多肽具有如下所示的序列： Met-Gly-Val-Val-Ser-Leu-Gly-Ser-Pro-Ser-Gly-Glu-Val-Ser-His-Pro-Arg-Lys-Thr(SEQ ID NO:1)；

所述质荷比为2950.6±3.0m/z的多肽具有如下所示的序列：Asn-Arg-Ile-Pro-Glu-Ser-Gly-Gly-Asp-Asn-Ser-Val-Phe-Asp-Ile-Phe-G lu-Leu-Thr-Gly-Ala-Ala-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO:2)；

所述质荷比为5900.0±3.0m/z的多肽具有如下所示的序列：Ser-Ser-Ser-Tyr-Ser-Lys-Gln-Phe-Thr-Ser-Ser-Thr-Ser-Tyr-Asn-Arg-Gly-Asp-Ser-Thr-Phe-Glu-Ser-Lys-Ser-Tyr-Lys-Met-Ala-Asp-Glu-Ala-Gly-Ser-Glu-Ala-Asp-His-Glu-Gly-Thr-His-Ser-Thr-Lys-Arg-Gly-His-Ala-Lys-Ser-Arg-Pro-Val(SEQ ID NO:3)。

在本发明的实施方案中,所述生物标志物或生物标志物组合用于以下用途中的一种或数种：1)评估食管癌的患病风险；2)食管癌的诊断；3)筛选治疗食管癌的药物；和4)评估药物对食管癌的治疗效果。

在本发明的具体实施方案中,所述食管癌为食管鳞状细胞癌，例如为早期食管鳞状细胞癌，例如为TNM分期I期食管鳞状细胞癌。

本发明第二方面涉及试剂组合物，其含有用于检测本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合的试剂。

在本发明中，所述用于检测本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合的试剂为本领域所公知，或者可以根据本领域的技术常识制备得到，例如可以为能够与所述的生物标志物特异性结合的抗体或配体。

本发明第三方面涉及试剂盒，其含有本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合或第二方面任一项的试剂组合物。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物或生物标志物组合可以作为标准品。

在本发明的一个实施方案中，其还含有用于质谱检测本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合的试剂。

在本发明的一个实施方案中，其中所述用于质谱检测本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合的试剂包括能够和多肽结合的物质，例如弱阳离子磁珠或弱阳离子交换柱，以及任选的缓冲液、洗涤液和洗脱液。

在本发明的一个具体实施方案中，其中所述的能够和多肽结合的物质为弱阳离子磁珠；所述磁珠可以使用市售的，例如美国Bruker公司的WCX2磁珠试剂盒，或者申请人研制的SPE-C磁珠试剂盒(专利号ZL2008101879684)。

在本发明的一个实施方案中，其还含有本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合的标准数据库(例如食管癌患者的标准数据库)的软件或芯片，可用于待测样品进行质谱时提供标准数据或标准曲线的比对，以判断待测样品中所述的生物标志物或其组合的有无或含量。

本发明第四方面涉及试剂盒，其含有说明书，所述说明书记载了该试剂盒的用途以及使用方法，

所述用途选自以下用途中的一种或数种：1)评估食管癌的患病风险；2)食管癌的诊断；3)筛选治疗食管癌的药物；和4)评估药物对食管癌的治疗效果；

所述使用方法包括利用质谱检测选自以下质荷比为1925.5±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.2m/z)、2950.6±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.3m/z)、5900.0±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.6m/z)的多肽中的一种、两种或三种的步骤。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还含有含有本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合或第二方面任一项的试剂组合物。

本发明第五方面涉及本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合、或者第二方面任一项的试剂组合物在制备产品中的用途，所述产品通过对受试者待测样品的检测用于以下用途中的一种或数种：1)评估食管癌的患病风险；2)食管癌的诊断；3)筛选治疗食管癌的药物；和4)评估药物对食管癌的治疗效果。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的产品选自诊断试剂、芯片、载体和试剂盒。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的食管癌为食管鳞状细胞癌。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的食管鳞癌为早期食管鳞状细胞癌，例如为TNM分期I期食管鳞状细胞癌。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的待测样品为全血、血清或血浆。

在本发明的一个具体实施方案中，其中所述的待测样品为血清。

在本发明的一个实施方案中，其中当用于评估食管癌的患病风险或食管癌的诊断时，其包括以下步骤：1)确定本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合在受试者待测样品中的水平值；2)将步骤1)得到的水平值与参考数据库或参考值(例如健康人群的参考值)进行比较；3)当待测样品中质荷比为2950.6±3.0m/z和/或5900.0±3.0m/z的多肽的水平值上调时，受试者为食管癌患者或罹患食管癌的风险高，和/或当待测样品中质荷比为1925.5±3.0m/z的多肽的水平值下调时，受试者为食管癌患者或罹患食管癌的风险高。

在本发明的一个实施方案中，其中当用于筛选治疗食管癌的药物或评估食管癌的治疗效果时，其包括以下步骤：1)确定本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合在受试者待测样品中的水平值；2)将步骤1)得到的水平值与参考数据库或参考值(例如健康人群的参考值)进行比较；3)当待测样品中质荷比为2950.6±3.0m/z和/或5900.0±3.0m/z的多肽的水平值下调时，表明该药物可以作为治疗食管癌的药物或者该药物对食管癌的治疗有效，和/或当待测样品中质荷比为1925.5±3.0m/z的多肽的水平值上调时，表明该药物可以作为治疗食管癌的药物或者该药物对食管癌的治疗有效。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的确定本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合在受试者待测样品中的水平值的方法为质谱检测方法。

在本发明的一个实施方案中，所述基质辅助激光解吸离子化质谱为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。

在本发明的一个实施方案中，所述基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的检测条件为：所用基质为CHCA溶液(5mg/ml CHCA[α-cyano-4-hydroxycinnamic acid]溶于50％乙腈/0.1％TFA溶液中)。1μl纯化的多肽点于靶板上，空气干燥后，再次点加1μl基质溶液，空气干燥后上机检测。激光能量50％时，10shots去杂，36％时50shots采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集8次共400shots。激光频率：50Hz。数据收集范围：1-20KDa，平均分子量偏差小于100ppm。

在本发明的一个实施方案中，对质谱数据进行分析前还包括对数据进行质量控制的步骤，保留峰数量大于50的图谱，并采用Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足的一致性的允许范围(＜30％)来进行筛选，所述变异系数为15.52％。

在本发明的一个实施方案中，其中在步骤1)前还包括处理待测样品的步骤，优选地，所述处理样品包括吸附待测样品中的多肽的步骤，更优选地，所述吸附待测样品中的多肽包括使用弱阳离子磁珠或弱阳离子交换柱的步骤。

本发明第六方面涉及质谱模型，其含有本发明第一方面任一项的生物标志物或生物标志物组合。

在本发明的实施方案中，所述质谱模型是指质谱检测时所采用的具有一定质荷比的多肽或多肽组合，例如为生物标志物或生物标志物组合。

本发明第七方面涉及本发明第五方面任一项的质谱模型的建立方法，其包括以下步骤：

1)收集食管癌(例如食管鳞状细胞癌，例如早期食管鳞状细胞癌)患者和正常对照人群的血液样品(例如全血、血清或血浆)；

2)对步骤1)所述的血液样品进行纯化，例如分离所述的血液样品中的蛋白成分，得到处理后的样品；

3)对步骤2)得到的处理后的样品进行质谱检测，得到质谱数据；

4)利用生物信息学对质谱数据进行分析，筛选出能够用于区分食管癌患者和正常对照人群的三种多肽，所述三种多肽分别具有下述质荷比的特征吸收峰：1925.5±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.2m/z)、2950.6±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.3m/z)、5900.0±3.0m/z(例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.6m/z)，即得到所述的质谱模型。

在本发明的一个实施方案中，步骤2)中所述分离所述的血液样品中的蛋白成分是指用弱阳离子磁珠或弱阳离子交换柱吸附血液样品中的蛋白或多肽，为下一步质谱检测做准备。

在本发明的一个实施方案中，所述基质辅助激光解吸离子化质谱为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。

在本发明的一个实施方案中，步骤4)中对质谱数据进行分析前还包括对数据进行质量控制的步骤，保留峰数量大于50的图谱，并采用Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足的一致性的允许范围(＜30％)来进行筛选，所述变异系数为15.52％。

本发明还涉及人凝血酶敏感蛋白1(TSP1)或其片段、或者检测人凝血酶敏感蛋白1(TSP1)或其片段的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒通过对受试者待测样品的检测用于诊断食管癌和/或评估罹患食管癌的风险。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的待测样品选自全血、血清、血浆和组织(例如食管癌组织)。

本发明还涉及人凝血酶敏感蛋白1(TSP1)或其片段、或者检测人凝血酶敏感蛋白1(TSP1)或其片段的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒通过对受试者待测样品的检测用于评估食管癌的治疗效果或者判断食管癌的预后。

本发明还涉及人凝血酶敏感蛋白1(TSP1)或其片段、或者检测人凝血酶敏感蛋白1(TSP1)或其片段的物质用于筛选预防或治疗食管癌的药物的用途或者在制备试剂盒中的用途，其中所述的试剂盒用于筛选预防或治疗食管癌的药物。

在本发明中，所述质谱可以选自离子阱、四级杆、飞行时间质谱和静电场轨道离子阱等，这四类分析器的质量偏差分别为0.5amu、0.7amu、100ppm、3ppm。本发明的实验结果是飞行时间质谱分析得到的，因此优选静电场轨道离子阱和飞行时间质谱。本领域技术人员公知，当采用不同的质谱检测设备以及不同的检测方法时，本发明的生物标志物的带电荷可在+1到+4之间，因此质荷比会产生最高达飞行时间质谱测定质荷比1/4的波动，即使对于同样带+1个电荷的肽段，质荷比也会产生一定的波动，例如可以在±2amu范围内波动。在本发明的实施方案中，所述质荷比可以在±3.0m/z，例如±2.0m/z、±1.0m/z、±0.6m/z、±0.3m/z、 ±0.2m/z的范围内波动；在本发明的具体实施方案中，对于同一批次检测结果，1925.5m/z可以在±0.2m/z的范围内波动，2950.6m/z可以在±0.3m/z的范围内波动，5900.0m/z可以在±0.6m/z的范围内波动。

在本发明中，用质谱的峰面积(peak intensity)表示生物标志物的含量。

在本发明中，所述食管癌的分型分期为本领域技术人员所公知，例如可参考AJCC癌症分期手册第七版。

在本发明中，质荷比为1925.5±3.0m/z的多肽来源于α－2HS糖蛋白(Alpha-2Heremans Schmid Glycoprotein，AHSG)，蛋白序列号为gi:156523970|NP_001613；质荷比为2950.6±3.0m/z的多肽来源于凝血酶敏感蛋白1(Thrombin Sensitive Protein 1，TSP1)，蛋白序列号为gi:40317626|NP_003237；质荷比为5900.0±3.0m/z的多肽来源于纤维蛋白原α链(Fibrinogen Alpha Chain，FGA)，蛋白序列号为gi:4503689|NP_000499。

在本发明中，所述人凝血酶敏感蛋白1(TSP1)的片段是指TSP1蛋白的一部分，即该蛋白的截短形式，该片段存在于食管癌患者的肿瘤组织或血液样品(例如全血、血清、血浆)中，可以通过能够和该片段结合的试剂(例如抗体或配体)检测该片段的存在。

发明的有益效果

本发明从质谱检测方法着手发现了早期食管癌患者血清中的特征多肽，建立了血清特征多肽的质谱模型，可用于早期食管癌的筛查和诊断，该方法与以往的血清学检测方法比较，具有更高的敏感性和特异性；

同时，利用上述结果发明人进一步找到了可以同时在组织和血清中用于食管癌诊断和预后判断的相关蛋白，为食管癌的诊断和预后风险评估提供了新的方法；

另外，本发明的生物标志物可以用于筛选治疗食管癌的药物。

附图说明

图1为部分健康人血清和食管癌患者血清的多肽图谱，其中A-C为食管癌患者血清，D-F为健康人血清。

图2重复做样的5个Sigma血清质谱指纹图。

图3-A为多肽峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为1925.5m/z的食管癌特征多肽峰；图3-B表示根据多肽峰进行多肽的模拟凝胶电泳图，其中箭头指向建模型的1925.5m/z的特征多肽带。

图4-A为多肽峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为2950.6m/z的食管癌特征多肽峰；图4-B表示根据多肽峰进行多肽的模拟凝胶电泳图，其中箭头指向建模型的2950.6m/z的特征多肽带。

图5-A为多肽峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为5900.0m/z的食管癌特征多肽峰；图5-B表示根据多肽峰进行多肽的模拟凝胶电泳图，其中箭头指向建模型的5900.0m/z的特征多肽带。

图6ESCC组和健康对照组血清TSP1浓度分布图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1食管癌血清多肽的质谱检测和食管癌筛选模型的建立

1.样本和仪器：

选自397例血清样本，其中201例来自食管癌患者，另外196例来自健康人群，食管癌患者均经术后病理报告确诊为食管鳞状细胞癌。所有的血清样本均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80℃低温冰箱中。

基质辅助激光解析飞行时间质谱Clin-TOF(毅新兴业(北京)科技有限公司)及实验用的WCX磁珠试剂盒(SPE-C磁珠试剂盒，参见中国专利ZL2008101879684)由毅新兴业公司研制。数据的分析处理可以采用本领域常用的软件，例如Bruker Daltonics公司的ClinproTools等，在本发明中，使用毅新兴业公司的数据分析软件BioExplorer做数据的预处理(软件著作权登记号2009SR10696shRNA分析工具软件V1.0简称ShRNA，2009SR10697质谱数据模型分析系统V1.0简称质朴模型系统，2009SR10701质谱数据转换工具软件V1.0简称数据转换软件，2009SR10699质谱数据统计分析系统V1.0简称数据分析系统，2009SR10700探索者生物标志物发现软件V1.0简称BioExplorer，2009SR10698质谱数据预处理分析系统V1.0简称数据预处理软件)，处理后的数据采用统计分析软件R2.6.2的遗传算法包genalg进行处理(参见网址www.r-project.org/)。

2.技术路线：

血清的采集：收集静脉血在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)下血凝结1小时，垂直放置。其中血液必须精确凝结一小时，否则，由于样品不同的凝结时间而导致不同的肽谱。室温下，用临床离心机以1,400-2,000g离心SST管(真空采血管，BD公司)十分钟。吸取血清(上清液)到对应的已标记管中。标记干净的0.5ml离心管，同一血清样品50μl一管，分装多管。立即冻存血清样品于-80℃。由于反复冻融血清样品易造成多肽沉淀，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。冻存血清分为永久保存和待分装的。血清分装后可在-80℃保存多年。

血清样品的磁珠处理：在进行多肽提取实验前，从低温冰箱提取分装的血清样品各1管，放于湿冰上。化冻60－90分钟。取出10μl混匀的磁珠悬浮液，10μl血清样品至0.2ml样品管，95μl磁珠结合缓冲液(CB)，混匀。室温静置5min后，将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体，再向样品管中加入100μl磁珠清洗缓冲液(CW)，在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次。最后一次使样品管在磁珠分离器上静置，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体。重复从加100μl磁珠清洗缓冲液(CW)，到最后吸去悬浮液体的操作步骤共3次。从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入10μl磁珠洗脱缓冲液(CE)，溶解贴壁的磁珠，样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁2min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的0.2ml样品管。

3.生物信息学方法

(一)质谱数据采集

应用Clin-TOF质谱仪。所用基质为CHCA溶液(5mg/ml CHCA[α-cyano-4-hydroxycinnamic acid]溶于50％乙腈/0.1％TFA溶液中)。1μl纯化的多肽点于靶板上，空气干燥后，再次点加1μl基质溶液，干燥后上机检测。激光能量50％时，10shots去杂，36％时50shots采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集8次共400shots。激光频率：50Hz。数据收集范围：1-20KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正，平均分子量偏差小于100ppm。参见图1，图1为血清多肽指纹谱图，前三个(食管癌A-C)为食管癌患者，后三个(正常E-F)为健康人。

实验质控：(1)对于每一张采集到的原始图谱，我们设定S/N>＝5的峰数量做为评判图谱质量的一个标准；对于峰数量大于50的图谱才保存，舍弃峰数量小于50的图谱。(2)针对整个实验操作，采用Sigma血清的组内变异系数(变异系数＝标准差/平均值)保证实验的一致性，本实施例方法的变异系数为15.52％，满足一致性允许范围(＜30％)，说明实验一致性良好，参见表1、图2。表1为Sigma血清中10个多肽峰的变异系数值；图2为实验中5个Sigma A-E血清的指纹图谱。如表1所示，选择Sigma标准品中的10个标准多肽峰，这些多肽均不涉及食管癌血清样本的特征多肽。通过该10个多肽验证标准品的组内变异系数，用峰值的变异系数说明数据的稳定性和可靠性。

表1Sigma血清的组内变异系数

(二)原始数据预处理

原始数据经毅新兴业公司数据分析软件BioExplorer处理，1-10KDa的峰值经由Top hat方法做基线校准，最小基线宽度10％，以10％最小阀值聚类；然后用总离子流方法做归一化处理。

(三)食管癌特征多肽的选择

每个质荷比多肽峰对各类样本的区分的相对重要性都不同，这里综合运用了T检验P值和出峰频率的方法来评价每个多肽峰的相对重要性。

(四)遗传算法

遗传算法是一种很有效的全局随机化搜索算法，它借鉴了生物界自然选择和自然遗传的机制，其主要特点是群体搜索策略和群体中个体之间的信息交换搜索，不依赖于梯度信息。遗传算法对多个个体组成的群体进行操作,通过遗传算法可以使个体间的信息得以交换,这样的群体中的个体一代一代地得以优化,并逐步逼近最优解。它尤其适用于处理传统搜索方法难以解决的复杂和非线性问题，可广泛用于涉及高维空间的组合优化领域。本发明方法的遗传算法从统计差异多肽子集形成的特征空间中搜索次优特征子集。分类函数采用最近邻算法(KNN)。(参见刘燕德,吴颜红,欧阳爱国等.遗传算法在农产品质量评判中的应用[J].农业系统科学与综合研究,2003,19(3):169-171.刘定理.遗传算法综述[J].中国西部科技,2009,8(25):41-43.)

在训练遗传算法集合最近邻算法分类的过程中引入了交叉验证的过程，这里采用随机选择397例样本中食管癌的100例与健康的98例来建立模型，余下的样品作为验证。它可以监督训练过程，避免建立的模型出现对建模样本表现好，对预测样本表现差的“过学习”现象。

在利用遗传算法和最近邻算法对训练样本建立质谱数据分类模型后，利用验证样本来检验所建立模型的分类能力。

(五)多肽鉴定

磁珠富集法

1.根据分析确定待鉴定峰后，反查前期处理样本中待鉴定峰值强度最高的样品。

2.查明前期实验所用磁珠。把步骤1中的样品平行处理20份。富集为一管。

3.离心1300rmp，5min。磁架上取上清。避免留有磁珠影响后期实验。

4.把液体旋干，标记。

采用Waters公司Nano Aquity UPLC液相系统：参数如下设置，捕集柱：C18,5μm,180μm×20mm,nanoAcquity^TMColumn；分析柱：C₁₈,1.7μm,75μm×150mm,nanoAcquity^TMColumn；流动相A：5％乙腈，0.1％甲酸的水溶液；流动相B：95％乙腈，0.1％甲酸的水溶液，所有溶液均为HPLC级。捕集流速15μl/min，捕集时间3min，分析流速300ml/min；分析时间60min，色谱柱温度35℃；Partial Loop模式进样，进样体积18μl。

梯度洗脱程序设置：

采用ThermoFisher公司LTQ Obitrap XL(Thermo)质谱系统，Nano电喷雾离子源(Michrom)，喷雾电压1.4kV；质谱扫描时间60min；实验模式为数据依赖(Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion)，每个母离子进行2次MS/MS后排除60秒；扫描范围400-2000m/z；一级扫描(MS)使用Obitrap，分辨率设定为1000009(m/z 400处)；CID及二级扫描使用LTQ；在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS(单电荷排除，不作为母离子)。使用数据分析软件BioworksBrowser 3.3.1SP1进行Sequest^TM检索，检索数据库为IPI Human(版本3.45，71983条目)，为降低假阳性在数据库末端附加其反库。母离子误差设定为50ppm，碎片离子误差设为1Da，酶切方式为非酶切。检索结果参数设定为deltacn>＝0.10，两电荷Xcorr 2.0,三电荷Xcorr 2.5,三电荷以上Xcorr 3.0，peptide probability<＝1e-003。此参数条件下显示的肽段以及多肽结果准确度较高，按照文献和国际多肽质组规定来设定。

用健康人98例，食管癌患者100例的样本进行数据分析，共产生154个质核比的峰值，进一步用遗传算法筛选出1925.5m/z、2950.6m/z、5900.0m/z等二十一个多肽峰，参见表2、图3-5。

图3～5中依次为多肽荷质比峰1925.5m/z、2950.6m/z、5900.0m/z，的健康组与食管癌组样品图谱。在每个图中上面部分的为训练样本中多肽峰表达水平图，灰色表示正常组(下半部分)，黑色代表疾病组(上半部分)，下面的是对应多肽峰的模拟凝胶图，其中箭头指向为食管癌的特征多肽带。

表2健康人和食管癌患者三个用于建模的多肽峰的比较

对所有在正常组和食管癌组表现差异的多肽，应用磁珠富集法进行多肽鉴定。结果见表3。

表3多肽序列鉴定结果

实施例2食管癌筛选模型的盲选测试

随机选择397例血清样本(201例来自食管癌患者，另外196例来自健康人群)中的198例作为训练样本，用于模型的建立，其中100例来自食管癌患者，包括24例早期食管癌(TNM分期I期)，另外98例来自健康人群；食管癌患者均经术后病理报告确定。所有的血清样本均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80℃低温冰箱中。

另选剩余样本199例作为验证样本，用于盲选测试，其中已知101 例来自食管癌患者，包括19例早期食管癌(TNM分期I期)，另外98例来自健康人群。处理方式同上。

用实施例1筛选出的食管癌特征多肽峰建立食管癌多肽的质谱模型。该模型定为采用3个输入变量，分别是：1925.5m/z、2950.6m/z、5900.0m/z。

模型训练识别率为96.46％，并采用随机选择方法进行交叉验证，验证结果为98.49％，表明模型具有很好的预测能力。

表4模型训练结果

样本	例数	预测食管癌组	预测正常组	预测率％
					食管癌组	100	97	3	97.00
早期癌组	24	23	1	95.83
					正常组	98	4	94	95.92
总计	198	101	97

从表4中可以看出对训练样本的结果为：98例正常组中的94例判断正确，特异性95.92％；100例食管癌中的97例判断正确，敏感性为97.00％。而24例早期食管癌中的23例判断正确，敏感性为95.83％。

模型训练完成后，建立起了一个有三个输入变量的模型，接着用这个模型对199个验证样本来盲选预测，并判断出样本的类别，方法如实施例1所述。结果表明，101例食管癌患者中的98例被准确预测，19例早期食管癌全部被准确预测，而98例正常组中的98例被准确预测，详见表5。

表5验证样本预测结果

样本	例数	预测食管癌组	预测正常组	预测率％
					食管癌组	101	98	3	97.03
早期癌组	19	19	0	100
					正常组	98	0	98	100
总计	199	98	101

从表5中可以看出验证样本的结果为：98例正常组中的98例判断正确，特异性100％；101例食管癌组中的98例判断正确，敏感性为97.03％；而19例早期食管癌组全部判断正确，敏感性为100％。

另外，从表5中可以看出：本发明对于食管癌组的盲选检测准确率基本相同于模型训练，但对于正常组的预测结果达到100％，说明在模型训练后的结果上，实验人员通过细微优化，即可完全排除假阳性结果，这说明其对于阳性结果的诊断结果真实可信，最大程度上避免了漏诊和误诊，因此具有积极意义。

实施例3TSP1蛋白可用于在组织水平区分食管鳞癌和正常人群

鉴定到的凝血酶敏感蛋白1(TSP1)多肽片段(2950.6m/z)在食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)患者血清中表达升高，为了检测TSP1在组织中的表达情况，我们进行了免疫组织化学检测。

采用抗TSP1抗体(货号18304-1-AP,Proteintech Group Inc.,IL,USA)对包含86例食管鳞癌组织以及78例癌旁正常食管上皮组织的组织芯片(上海芯超生物科技有限公司，批号Heso-Squ172Sur-01)进行染色。染色方法采用增强型一步法Polymer检测系统(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号PV-6001)。组织芯片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化后,浸入30mL/L的H₂O₂中10min,以阻断内源性过氧化物酶活性.切片经PBS冲洗后,将其置入0.01mol/L,pH6.0的柠檬酸缓冲液沸水浴10min,以充分暴露抗原.切片室温冷却30min后,PBS冲洗，滴加兔抗人TSP1抗体(1∶50稀释),4℃孵育过夜.阴性对照采用兔的非免疫血清替代一抗。切片经PBS冲洗后,滴加染色试剂盒中的山羊抗兔IgG/HRP聚合物,室温孵育30min,PBS冲洗,而后切片组织经DAB溶液显色约1-2分钟后,PBS终止反应,再经苏木素复染、自来水冲洗返蓝.经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后,中性树脂封片。

结果发现，该组织芯片染色后的有效病例包括65例ESCC组织样本和75例健康对照样本(排除脱片，或是仅为纤维瘢痕组织的组织点)，在ESCC样本中81.5％(53/65)TSP1表达阳性，在健康对照样本中仅45.3％(34/75)TSP1表达阳性。ESCC中TSP1过表达与健康对照有明显差异(P<0.001)。此外，我们还发现ESCC患者中TSP1表达与肿瘤淋巴结转移相关(P＝0.049)。但TSP1的表达与性别、年龄、病理分级、肿瘤大小、TNM分期等因素无关。进一步分析TSP1与ESCC患者生存期关系进行分析发现TSP1表达阳性患者生存期较TSP1表达阴性患者缩短(P＝0.036)，TSP1表达阳性患者和TSP1表达阴性患者生存期分别为22个月和47个月。单因素和多因素Cox回归分析也证实这一结果。单因素分析发现SP1表达阳性患者较TSP1表达阴性患者死亡相对风险度增加2.21倍。其他的肿瘤风险因素包括肿瘤大小(P＝0.037),肿瘤进展程度(P＝0.020),淋巴结转移(P＝0.041)和TNM分期(P＝0.002)。多因素分析发现只有TSP1表达情况(RR＝3.00,P＝0.010)和肿瘤进展程度(RR＝3.18,P＝0.023)是独立的预后因子。所以，阳性表达的TSP1可以作为一个独立的ESCC预后因素，提示ESCC患者预后不良。

表6 TSP1免疫组化结果及临床意义

表7 ESCC患者总生存率的单因素和多因素分析

进一步，我们应用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测了106例ESCC患者和97例健康对照样本中血清TSP1蛋白的表达情况，其中，76例ESCC患者均为上述的质谱检测样本。ELISA试剂盒均购自美国Cloud-Clone Corp.公司，货品编号SEA611Hu 96T。

结果显示，TSP1在ESCC患者中的血清中位浓度为344.6ng/ml(最大值859.7ng/ml，最小值93.53ng/ml)；而健康对照的血清中位浓度为295.5ng/ml(最大值1066.0ng/ml，最小值0.8ng/ml)，统计学分析结果显示ESCC组TSP1表达高于健康对照，两者之间存在统计学差异 (p<0.001)。这一结果与质谱鉴定和免疫组化实验结果一致，更进一步证实了TSP1在ESCC患者血清中表达升高，具有辅助ESCC临床诊断的作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.试剂盒，其含有生物标志物组合，所述生物标志物组合包含：质荷比为1925.5±3.0m/z的多肽、质荷比为2950.6±3.0m/z的多肽和质荷比为5900.0±3.0m/z的多肽；并且，所述试剂盒用于食管癌的诊断。

2.权利要求1的试剂盒，其中：

所述质荷比为1925.5±3.0m/z的多肽具有如下所示的序列：Met-Gly-Val-Val-Ser-Leu-Gly-Ser-Pro-Ser-Gly-Glu-Val-Ser-His-Pro-Arg-Lys-Thr(SEQ ID NO:1)；

所述质荷比为2950.6±3.0m/z的多肽具有如下所示的序列：Asn-Arg-Ile-Pro-Glu-Ser-Gly-Gly-Asp-Asn-Ser-Val-Phe-Asp-Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Gly-Ala-Ala-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO:2)；

3.权利要求1的试剂盒，其还含有用于质谱检测所述生物标志物组合的试剂。

4.权利要求3的试剂盒，其中所述用于质谱检测所述生物标志物组合的试剂包括能够和多肽结合的物质，以及任选的缓冲液。

5.权利要求4的试剂盒，其中所述能够和多肽结合的物质是弱阳离子交换磁珠。

6.权利要求1-5任一项的试剂盒，其还包含，含有所述生物标志物组合的标准数据库的软件或芯片。

7.权利要求6的试剂盒，其中所述标准数据库是食管癌患者的标准数据库。

8.生物标志物或生物标志物组合或者用于检测所述生物标志物或生物标志物组合的试剂在制备产品中的用途，所述产品通过对受试者待测样品的检测用于食管癌的诊断；其中，所述生物标志物或生物标志物组合包括选自质荷比为1925.5±3.0m/z、2950.6±3.0m/z、5900.0±3.0m/z的多肽中的一种、两种或三种；

并且，所述的待测样品为全血、血清或血浆；并且，当待测样品中质荷比为2950.6±3.0m/z和/或5900.0±3.0m/z的多肽的水平值上调时，将所述受试者诊断为食管癌患者，和/或当待测样品中质荷比为1925.5±3.0m/z的多肽的水平值下调时，将所述受试者诊断为食管癌患者。

9.权利要求8所述的用途，其中：

10.权利要求8或9的用途，其中所述的产品选自诊断试剂、芯片、载体和试剂盒。

11.权利要求8或9的用途，其中所述的食管癌为食管鳞状细胞癌。

12.权利要求11的用途，其中所述的食管鳞状细胞癌为早期食管鳞状细胞癌。

13.权利要求11的用途，其中所述的食管鳞状细胞癌为TNM分期I期食管鳞状细胞癌。

14.权利要求8或9的用途，其中当用于食管癌的诊断时，其包括以下步骤：1)确定所述生物标志物或生物标志物组合在受试者待测样品中的水平值；2)将步骤1)得到的水平值与参考数据库或参考值进行比较；3)当待测样品中质荷比为2950.6±3.0m/z和/或5900.0±3.0m/z的多肽的水平值上调时，受试者为食管癌患者，和/或当待测样品中质荷比为1925.5±3.0m/z的多肽的水平值下调时，受试者为食管癌患者。

15.权利要求14的用途，其中，在步骤2)中，所述参考值为健康人群的参考值。

16.权利要求14的用途，其中所述的确定所述生物标志物或生物标志物组合在受试者待测样品中的水平值的方法为质谱检测方法。

17.权利要求14的用途，其中在步骤1)前还包括处理待测样品的步骤。

18.权利要求17的用途，其中所述处理待测样品包括吸附待测样品中的多肽的步骤。

19.权利要求18的用途，其中所述吸附待测样品中的多肽包括使用弱阳离子磁珠或弱阳离子交换柱的步骤。