CN116359272B - 一种代谢标志物及其在诊断、预测食管癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种代谢标志物及其在诊断、预测食管癌中的应用，具体的，所述的代谢标志物包括N‑Methylnicotinamide、alpha‑Ketoisovalerate和/或para‑Hydrxoyphenylacetate，优选地，所述的代谢标志物还包括Trigonelline、Ascorbate、3‑Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和/或5‑Hydroxyindole‑3‑acetate。本发明还提供了用于测定所述的代谢标志物的水平的试剂，及其在制备用于预测或诊断食管癌的产品中的应用。本发明为食管癌的快速高效诊断提供了新方法。

Description

一种代谢标志物及其在诊断、预测食管癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种代谢标志物及其在诊断、预测食管癌中的应用。
背景技术
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，在全球最常见癌中居第7位，在癌症相关死亡人数中排名第6位，主要有食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)2种病理类型。食管癌早期症状不明显，且病灶局限，影像学检查(如X射线食管造影、GT扫描、胃肠镜等)检出率及准确性有限，而目前临床常用的肿瘤标志物检测，如细胞角蛋白19片段(cytokeratin-19-fragment，CYFRA21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和p53蛋白抗体缺乏理想的灵敏度和特异度，故多数患者就诊时已为晚期，单独外科手术治疗的5年生存率＜20％。尽管多学科综合治疗方法已有了进一步发展，但由于疾病进展，食管癌预后仍然较差。因此，急需找到一种可以早期诊断食管癌的检测方法，便于患者早期治疗，从而改善患者的生存率和生活质量。
癌症是一种与代谢相关的疾病，近年来代谢组学研究迅速发展，为发现体内代谢相关的生物标志物提供了一个有力的检测方法。代谢组学(metabolomics)的研究对象是分子量小于1kDa的机体内源性代谢物,主要来源于物质、能量代谢的中间体或产物,它们不仅是生物体受刺激或扰动后体内能量、代谢途径变化的结果,它们也具有信号转导、辅酶、细胞因子和诱变剂等作用,在机体生理或病理过程中发挥着重要的生物学功能。因此,开展对这些小分子代谢物的研究,可以观察机体在生理或疾病状态下发生的代谢途径或产物的改变。当前主要的代谢组学技术有核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)、气相色谱质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相色谱质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)及毛细管电泳质谱联用技术(capillary electrophoresismass spectrometry,CE-MS)、红外光谱、电化学检测等。NMR是代谢组学研究的主要技术,优势在于样本不需要繁琐预处理，可对样本实现无创性、无偏向的检测,结果具有良好的客观性、重现性。使用增加场强、低温探头和微探头等方法，使NMR的灵敏度达到了纳克级水平。
代谢组学检测技术已广泛应用于食管癌早期诊断生物标志物的发现、食管癌的进展与预后，以及新辅助放化疗的疗效评价等方面，具有无创、高灵敏度和特异度的优点。代谢组学可以帮助了解食管癌的代谢特征以及代谢途径的变化。许多研究已经发现了与食管癌早期诊断、肿瘤进展、预后及放化疗疗效相关的生物标志物，且灵敏度和特异度较好。
发明内容
本发明的目的在于基于代谢组学的研究，筛选食管癌的差异代谢物，获得可用于食管癌诊断的代谢标志物，为食管癌的早期诊断提供新的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种测定取自受试者的样本中的代谢标志物的水平的试剂，所述的代谢标志物包括N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate和/或para-Hydrxoyphenylacetate。
如本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
代谢标志物的“水平”意指样本中所述代谢标志物的绝对或相对量或浓度。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、马、羊、狗、牛、猪、鸡和其它兽医受试者。在一个典型的实施方案中，受试者是人。
如本说明书中所用，词语“包含”，“含有”，“包括”，和相似的词语不应以排他性或穷尽性含义解释。换言之，其旨在意为“包括，但不限于”。
本发明使用的术语“代谢标志物”、“代谢生物标志物”或“生物标志物”被定义为适合作为食管癌存在和状态的指标化合物，这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。术语“生物标志物”和“代谢标志物”通常在本发明的上下文中同义使用，并且通常是指适合作为食管癌存在和状态的指标化合物，这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。
进一步，所述的代谢标志物还包括Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和/或5-Hydroxyindole-3-acetate。
进一步，所述的代谢标志物为N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate、para-Hydrxoyphenylacetate、Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和5-Hydroxyindole-3-acetate的组合。
在本发明中，“样品”或“样本”的代表性实例包括但不限于血液、血浆或血清、唾液、尿液、脑脊髓液、乳汁、宫颈分泌物、精液、组织、细胞培养物和其它体液或组织标本。在一些实施方案中，样本是尿液。
进一步，所述的试剂通过以下一种或多种方法测定代谢标志物的水平：色谱法、光谱法、质谱法、荧光测定、电泳、免疫亲和、免疫杂交、免疫化学、荧光分析、化学分析、光散射分析、比浊法。
进一步，所述的色谱法包括高效液色谱法、薄层色谱法、气相色谱法。
进一步，所述的光谱法包括核磁共振波谱法、折射率光谱法、紫外光谱法、近红外光谱法。
进一步，所述的质谱法包括串联质谱法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法、MALDI-TOF-TOF质谱法、MALDI四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱法、电喷射离子化(ESI)-TOF质谱法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-离子阱质谱法、ESI三重四极杆质谱法、ESI傅立叶变换质谱法(FTMS)。
进一步，所述的化学分析法包括电化学分析法、放射化学分析法。
进一步，所述的试剂通过核磁共振波谱法测定代谢标志物的水平。
本发明还提供了前面所述的试剂在制备用于预测或诊断食管癌的产品中的应用。所述产品可以是任何形式，包括但不限于试剂盒、芯片。
作为一种可选择的实施方式，试剂盒的组分可以被包装在一个或多个容器如一个或多个小瓶中。除了代谢物标准物，试剂盒优选进一步包括用于存储的防腐剂或缓冲剂。此外，试剂盒可以包含使用说明书。
作为一种可选择的实施方式，芯片具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种代谢物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样品中代谢标志物的含量或浓度。
在测定从受试者获得的生物样品中一种或多种代谢标志物的含量后，将所述含量与其参照的参比含量(例如，源自其本人的参比含量和/或选定的参比含量(例如，按照年龄、性别、食管癌类型等条件选择的参比样品的含量))进行比较。如果受试者的代谢标志物组中的全部标志物的所述含量与其参照的参比含量相比，没有明显增高或降低(例如，与参比含量相同、与参比含量基本上相同、与参比含量并未统计不同、处于参比含量既定范围内部等含量)，那么该受试者被评估为食管癌阴性。与其参照的参比含量相比，所述代谢标志物组中的N-Methylnicotinamide和/或alpha-Ketoisovalerate的含量出现降低，和/或para-Hydrxoyphenylacetate的含量出现升高，那么该受试者被评估为食管癌阳性。
标志物的“参比含量”可以是标志物的绝对或相对的量或浓度、标志物的存在或不存在、标志物的量或浓度的范围、标志物的最低和/或最高量或浓度、标志物的平均量或浓度和/或标志物的中位量或浓度。标志物的合适的参比含量可以通过多次测量相同受试者的所需标志物含量来确定；还可以通过测量多位特定受试者(例如，相同性别且相同年龄的受试者)所需标志物含量来确定，以作为特定群体的参比含量。参比含量和受试者的标志物含量可能根据用来测量生物样品中标志物的特定技术(例如，LC-MS、GC-MS)而改变。
可以使用多种方式将受试者的标志物含量与其参照的参比含量比较，例如简单比较、统计分析(例如，t检验、Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon rank sum test))。在一些实施例中，上述比较可以通过人工手动和/或自动化系统来实现。在一些实施例中，受试者的一种或多种标志物含量高于其参照的参比含量的5％、10％、15％、20％或更多，可以被视为受试者的一种或多种标志物含量的升高。在一些实施例中，受试者的一种或多种标志物含量低于其参照的参比含量的5％、10％、15％、20％或更多，可以被视为受试者的一种或多种标志物含量的降低。
本发明还提供了代谢标志物在构建预测或诊断食管癌的计算模型中的应用，所述的代谢标志物包括N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate和/或para-Hydrxoyphenylacetate。
进一步，所述的代谢标志物还包括Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和/或5-Hydroxyindole-3-acetate。
进一步，所述的代谢标志物为N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate、para-Hydrxoyphenylacetate、Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和5-Hydroxyindole-3-acetate的组合。
进一步，所述的计算模型的输入变量为所述的代谢标志物的水平。
本发明还提供了一种利用代谢标志物诊断或预测食管癌的系统，所述的代谢标志物包括N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate和/或para-Hydrxoyphenylacetate。
进一步，所述的代谢标志物还包括Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和/或5-Hydroxyindole-3-acetate。
进一步，所述的代谢标志物为N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate、para-Hydrxoyphenylacetate、Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和5-Hydroxyindole-3-acetate的组合。
进一步，所述的系统包括检测装置、参照装置、比对装置。
检测装置用于检测参照组中各个参照者和待测者样本中代谢标志物的水平；参照组由n例食管癌患者与m例非食管癌健康者组成；
参照装置用于接收检测装置输出的所有参照者样本中代谢标志物的水平的信息，将参照组中的所有食管癌患者设定为食管癌组，将参照组中的所有非食管癌健康者设定为非食管癌组，将参照组中的所有参照者样本中代谢标志物的水平的信息设定为已知分组信息；
比对装置用于接收检测装置输出的待测者样本中代谢标志物的水平的信息和参照装置输出的已知分组信息，将待测者样本中代谢标志物的水平的信息设定为未知信息，利用聚类分析比较未知信息与已知分组信息数据集，判断待测者属于食管癌组还是非食管癌组。
检测装置具体可为NMR波谱检测仪。
参照装置具体可为计算机。
比对装置具体可为计算机。
本发明的有益效果：
本发明基于代谢组学研究，首次发现N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate、para-Hydrxoyphenylacetate可以用于预测或诊断食管癌，并进一步发现，将N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate、para-Hydrxoyphenylacetate、Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和5-Hydroxyindole-3-acetate联用具有更好的诊断效果，本发明为食管癌的诊断提供了新方法，该方法具有高特异性、敏感度，能够为食管癌的尽早治疗提供保障，适于推广应用。
附图说明
图1是食管鳞癌患者组织与正常食管上皮的差异代谢物及“食管正常黏膜→早期食管鳞癌组织→进展期食管鳞癌组织”演进过程中改变的代谢途径分析结果图；
图2是食管鳞癌患者与健康对照人群的尿液代谢物差异及“术前荷瘤期尿液→术后恢复期尿液→健康者尿液”改变的代谢通路分析结果图；
图3是Trigonelline的差异表达统计图；
图4是N-Methylnicotinamide的差异表达统计图；
图5是Ascorbate的差异表达统计图；
图6是3-Methylhistidine的差异表达统计图；
图7是Inosine的差异表达统计图；
图8是alpha-Ketoisovalerate的差异表达统计图；
图9是Riboflavin的差异表达统计图；
图10是Malonate的差异表达统计图；
图11是para-Hydrxoyphenylacetate的差异表达统计图；
图12是5-Hydroxyindole-3-acetate的差异表达统计图；
图13是N-Methylnicotinamide用于诊断食管鳞癌的ROC图；
图14是alpha-Ketoisovalerate用于诊断食管鳞癌的ROC图；
图15是para-Hydrxoyphenylacetate用于诊断食管鳞癌的ROC图；
图16是在训练集中代谢物组联合诊断食管鳞癌的ROC图；
图17是在验证集中代谢物组联合诊断食管鳞癌的ROC图；
图18是在验证集中代谢物组联合诊断食管鳞癌的交叉验证结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1食管鳞癌诊断预测相关代谢物的筛选及效能判断
一、实验方法
1.研究对象和研究设计
从汕头大学医学院第二附属医院收集就诊的54例食管鳞癌患者严格匹配的样本，包括术前和术后1周的尿液(晨起中段尿)、手术肿瘤组织及距癌灶远端5cm的正常食管上皮粘膜组织，以及完善的临床表型数据。126份健康对照人群的尿液从本单位体检中心收集。诊断标志物模型构建完成后，另取25例早期食管鳞癌患者体液进行模型效能验证。样本收集后，经前处理、分装、液氮速冻后，储存于-80℃冰箱，运输过程以干冰作冷链。
纳排标准：
1)食管鳞癌经由病理活检明确诊断；无明显下消化道症状及胃和小肠的器质性病变；无其他全身性重大疾病等；一年内未行放/化疗，无使用抗生素。
2)健康者(匹配好年龄、性别、BMI等基线资料)各项体检指标正常，内镜检查未发现异常；参加实验前3个月无任何系统的疾病及药物治疗史。
3)本项目涉及的临床样本使用均通过伦理委员会审核，取样前均已征求受试者同意并签署知情同意书。
2.组织、尿液样本配制及NMR波谱检测
2.1代谢物提取
1)磷酸重水缓冲溶液PBS/D2O配制：
pH 7.4，K2HPO4和NaH2PO4的摩尔比为4:1。其中，尿液PBS 1.5M、含0.05％TSP(3-三甲基甲硅烷基丙酸钠-D4)；组织PBS 150mM、含0.05％TSP。
2)组织提取液制备：
甲醇/氯仿/水以2:2:3比例配成萃取剂。称量一定量组织，切为直径1～3mm小块状置于5mL圆底离心管，加入适量萃取剂、研磨珠，60Hz研磨60-90s。随后将匀浆液转移至新的10mL玻璃试管，加入余下所需萃取剂，盖好盖子，涡旋60s。混匀后，将匀浆液转移至新的5mL尖底离心管；冰上静置15min，4℃10000rpm离心10min，再次取上清液转移至新的标记好的5mL尖底离心管中。开盖，置于流动的氮气下以去除甲醇(每隔10min观察标记液面的下降程度至液面不再降低为止)。得到的液体置于-80℃冷冻，完全冰冻结实后，再冷冻干燥过夜。将冻干处理后的组织粉末溶于550μLPBS/D2O缓冲液，充分涡旋混匀后于4℃10000rpm离心5分钟，取上清500μL移至5mm核磁管中待测。
3)尿液制备：
尿液500μL+尿液PBS 50μL，涡旋混匀；4℃10000rpm离心10min，取上清500μL，置于5mm核磁管内进行采样。
2.2代谢产物1H-NMR检测
采用Bruker 600MHz谱仪采集一维1H-NMR谱。组织提取液和尿液使用NOESYGPPR1D自旋回波脉冲序列：[RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ]进行采样。采用标准的预饱和脉冲序列压制水峰信号，获得自由衰减信号(FID信号)。FID信号经过傅立叶变换转为一维NMR谱图，以TSP信号峰或乳酸峰为内标0点调整化学位移值，获得各样本相应的1H-NMR图谱。
2.31H-NMR数据预处理、谱图分析
原始NMR谱由于信号量大、噪音复杂等问题，运用MestReNova核磁谱图处理软件(V14.0版)对原始数据进行预处理，包括傅立叶转换、相位校正、基线校正、频率校准及谱峰归属。所有谱图在进行傅立叶变换时均乘以增宽因子为1Hz的指数窗函数以提高信噪比。通过内标物TSP(δ0.00ppm)或乳酸峰(δ1.33ppm)确定代谢物的化学位移，将δ0～9ppm范围内的谱以每0.002ppm分段积分进行数据降维，积分之前需将4.6～5.2ppm的峰强度置为0以消除残留水峰对周围谱峰的影响，然后对谱图进行全谱归一化。
3.潜在生物标志物筛选
3.1多元变量统计分析
将数据矩阵中的各组数据按总积分面积归一化处理后导入SIMCA 14.1软件，进行帕莱托换算(Pareto scaling)以对数据进行标准化处理，消除变量间的量纲关系。采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)过滤与模型分类不相关信号及正交信号，获得OPLS-DA模型。并进一步对模型的质量行交叉检验(Cross-validation，CV)及排列实验(PermutationTest)以验证模型的有效性。
3.2代谢标志物筛选
潜在标志物根据模型的变量重要性投影值(VIP值)、组间代谢物统计学差异(校正P值<0.05)进行筛选。用SPSS 26.0进行非参数检验和受试者工作曲线(ROC)分析，结合模式识别与机器学习方法，抽提出对分类有贡献的代谢物，并确定其敏感性、特异性，构建诊断模型，并测试其预测早期食管鳞癌的准确度。
4.食管鳞癌的关键代谢途径与诊断代谢标志物(组)
4.1分析食管鳞癌演进过程中的关键代谢途径
利用模式识别方法得到的特征变量，结合NMR谱图的归属信息，明确引起类别差异的特征代谢物，使食管鳞癌早期筛查标准化有客观依据。结合生物化学、分子生物学、病理学与病理生理学知识及HMDB 5.0(The Human Metabolome Database)数据库等信息，运用MetaboAnalyst 5.0数据库及KEGG Pathway分析，分析组织中“食管正常黏膜→早期食管鳞癌组织→进展期食管鳞癌组织”演进过程、以及体液中“术前荷瘤期体液→术后恢复期体液→健康者体液”改变的代谢通路，初探食管鳞癌的发生发展的可能机制。
4.2评估代谢标志物(组)的诊断预测效能
1)分别计算组织、体液(尿液)中差异代谢物的受试者工作曲线下面积(AUC)，结合支持向量机(SVM)、随机森林(RF)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等算法，获得多个备选诊断模型。
2)再从组织(食管癌发生本源)出发，从中挑选出能体现在尿液中的、AUC值最优的差异代谢物作为诊断标志物。
3)采用蒙特卡罗交叉验证(Monte-Carlo cross-validation，MCCV)进一步验证诊断模型对早期食管鳞癌的预测能力。
二、实验结果
1、组织中“食管正常黏膜→早期食管鳞癌组织→进展期食管鳞癌组织”演进过程、以及体液中“术前荷瘤期体液→术后恢复期体液→健康者体液”改变的整个过程中，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢改变贯穿全程，具体地：
1)食管鳞癌患者组织与正常食管上皮的差异代谢物分析，及“食管正常黏膜→早期食管鳞癌组织→进展期食管鳞癌组织”演进过程中改变的代谢途径(如图1所示)，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢，组氨酸代谢，牛磺酸和次牛磺酸代谢，核黄素代谢，柠檬酸循环(TCA循环)，脂肪酸生物合成，丙酮酸代谢等重要代谢途径。2)食管鳞癌患者与健康对照人群的尿液代谢物差异，及“术前荷瘤期尿液→术后恢复期尿液→健康者尿液”改变的代谢通路(如图2所示)，同样复现了1所述的组织中发生的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢，组氨酸代谢，柠檬酸循环(TCA循环)，核黄素代谢和牛磺酸和次牛磺酸代谢改变。
2、比对组织(食管癌发生本源)中发生改变的关键代谢物，筛选出能体现在体液中的、AUC值最优的差异代谢物作为诊断标志物，构建尿液诊断模型。
尿液诊断模型代谢标志物包括Trigonelline、N-Methylnicotinamide、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、alpha-Ketoisovalerate、Riboflavin、Malonate、para-Hydrxoyphenylacetate、5-Hydroxyindole-3-acetate中的一种或几种组合，或代谢物两两比值。每个代谢物的表达差异如图3-12所示、N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate、para-Hydrxoyphenylacetate的诊断效能数据如图13-15所示，该尿液代谢物组联合诊断食管鳞癌的效能如图16所示。
3、另取19例早期食管鳞癌患者、39例健康对照组的尿液样本数据，使用本发明构建的尿液标志物组进行验证，其诊断、预测效能如图17、图18所示：
尿液标志物组：多个差异代谢物联合诊断的效能较好，优于单个代谢物的诊断效能，其尿液样本采集更便捷，与血清可优势互补。尿液标志物组联合诊断早期食管鳞癌AUC可达0.991(如图17所示)，其基于100次交叉验证的预测早期食管鳞癌的平均准确率为0.942(如图18所示)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (14)

1.测定取自受试者的样本中的代谢标志物的水平的试剂在制备用于预测或诊断食管癌的产品中的应用，特征在于，所述的代谢标志物包括N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate和para-Hydrxoyphenylacetate。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢标志物还包括Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和/或5-Hydroxyindole-3-acetate。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的代谢标志物为N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate、para-Hydrxoyphenylacetate、Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和5-Hydroxyindole-3-acetate的组合。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的样本为尿液。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂通过以下一种或多种方法测定代谢标志物的水平：色谱法、光谱法、质谱法、荧光测定、电泳、免疫亲和、免疫杂交、免疫化学、荧光分析、化学分析、光散射分析、比浊法。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的色谱法包括高效液色谱法、薄层色谱法、气相色谱法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的光谱法包括核磁共振波谱法、折射率光谱法、紫外光谱法、近红外光谱法。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的质谱法包括串联质谱法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法、MALDI-TOF-TOF质谱法、MALDI四极杆-飞行时间质谱法、电喷射离子化-TOF质谱法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-离子阱质谱法、ESI三重四极杆质谱法、ESI傅立叶变换质谱法。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的化学分析法包括电化学分析法、放射化学分析法。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的试剂通过核磁共振波谱法测定代谢标志物的水平。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括试剂盒、芯片。
12.一种利用代谢标志物诊断或预测食管癌的系统，其特征在于，所述的代谢标志物包括N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate和para-Hydrxoyphenylacetate，所述系统包括检测装置，用于检测参照组中各个参照者和待测者样本中代谢标志物的水平；所述参照组由食管癌患者与非食管癌健康者组成；
所述系统包括参照装置，用于接收检测装置输出的所有参照者样本中代谢标志物的水平的信息，将参照组中的所有参照者样本中代谢标志物的水平的信息设定为已知分组信息；
所述系统包括比对装置用于接收检测装置输出的待测者样本中代谢标志物的水平的信息和参照装置输出的已知分组信息，将待测者样本中代谢标志物的水平的信息设定为未知信息，比较未知信息与已知分组信息数据集，判断待测者属于食管癌组还是非食管癌组。
13.根据权利要求12所述的系统，其特征在于，所述的代谢标志物还包括Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和/或5-Hydroxyindole-3-acetate。
14.根据权利要求13所述的系统，其特征在于，所述的代谢标志物为N-Methylnicotinamide、alpha-Ketoisovalerate、para-Hydrxoyphenylacetate、Trigonelline、Ascorbate、3-Methylhistidine、Inosine、Riboflavin、Malonate和5-Hydroxyindole-3-acetate的组合。
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