CN108315414B

CN108315414B - 一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物

Info

Publication number: CN108315414B
Application number: CN201810115240.4A
Authority: CN
Inventors: 许晶; 于跃; 吴卫兵; 陈亮; 朱全; 阙军; 王俊; 闻伟; 潘相龙; 徐心峰; 曹靖
Original assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Current assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2038-02-06
Also published as: CN108315414A

Abstract

本发明公开了一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物，包括基于公共大数据的预后标志物的筛选、预后标志物的验证和预后标志物的效力检测。本研究首次发现并证实了ANO1联合MMP3蛋白可以作为预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物，其预测效力与目前临床常用的单纯利用临床信息进行预后预测的第八版TNM分期相当，两种方法联合使用能够显著提高食管鳞状细胞癌患者预后预测的准确性。研究同时发现ANO1基因在食管鳞状细胞癌患者癌组织中呈高表达，其表达增高能够促进食管鳞状细胞癌的增殖、侵袭和转移，利用shRNA敲降ANO1基因的表达可以显著抑制食管鳞状细胞癌在体内及体外水平的进展。

Description

一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物

技术领域

本发明涉及一种食管鳞状细胞癌预测预后的生物标志物，具体为一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物，属于食管鳞状细胞癌预测预后的生物标志物应用领域。

背景技术

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，食管癌发病率在所有恶性肿瘤中位居第八位，死亡率位居第六位，全球每年约有45000人罹患该病。与西方国家多为食管腺癌不同的是，食管鳞状细胞癌（食管鳞癌）在我国占食管癌总体发病率的95%以上。食管鳞癌目前主要的治疗手段为外科手术、放射治疗和化学治疗。虽然近十余年来，虽然食管鳞癌的综合治疗手段不断进步，但其预后仍不甚理想，目前其五年总体生存率仅为15%-25%。探索和研究食管鳞癌预后的影响因素，建立相对准确的预后预测模型，针对不同预后患者采用个体化的治疗方案，以期提高患者的治愈率和延长生存时间，在我国有着极为特殊的临床意义。

目前临床上常用于评估食管鳞癌预后的指标为第八版的TNM分期，主要依据食管鳞癌原发灶浸润深度、分化程度、肿瘤部位、有无淋巴结及远处转移等临床因素来预测食管鳞癌患者的远期生存情况。这一方法简单易用，但缺点在于没有考虑到食管鳞癌本身分子机制的差异导致的影响。大量研究证实，同一TNM分期而不同预后的食管鳞癌患者肿瘤组织内存在大量差异性表达的基因，这些差异性表达的基因引起了肿瘤细胞在代谢、运动能力、粘附性及外分泌功能等方面的改变，从而导致肿瘤细胞表现为不同的侵袭性与转移性。因此，探寻食管鳞癌发生发展过程中的关键预后分子，利用其建立较为精准的预后预测模型并作为治疗靶点进行个体化治疗是当今肿瘤研究的热点和方向，也是提高人类对恶性肿瘤的认识，并改善肿瘤患者生存及预后的必经之路。

发明内容

本发明的目的在于为了解决上述问题而提供了一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物，其特征在于：包括基于公共大数据的预后标志物的筛选、预后标志物的验证和预后标志物的效力检测，

所述基于公共大数据的预后标志物的筛选包括以下步骤：

（1）检索GEO数据库，搜索同一食管鳞状细胞癌患者队列组织样本的DNA测序及RNA芯片数据；

（2）寻找同时满足在DNA水平基因拷贝数变异频发及mRNA水平表达显著差异的基因，获得三个候选基因ANO1、MMP3和GAL。

优选地，所述预后标志物的验证包括组织芯片的构建和ANO1、MMP3和GAL基因表达检测，所述组织芯片的构建包括利用苏木精-伊红染色切片选择有代表性的组织区域和利用亲和素-生物素复合物法进行免疫组化分析。

优选地，所述代表性的组织区域包括癌组织和癌旁组织，所述癌组织中癌细胞的细胞数量大于该癌组织中细胞总量的80%，所述癌旁组织中不含癌细胞。

优选地，所述ANO1、MMP3和GAL的基因表达检测的工具包括试剂盒，所述试剂盒包括能够定量ANO1基因mRNA表达水平的试剂，以及能够定量ANO1、MMP3和GAL基因蛋白表达水平的试剂。

优选地，所述能够定量ANO1基因mRNA表达水平的试剂包括ANO1基因特异性扩增引物和特异性探针中的一种或两种共同使用，所述能够定量ANO1、MMP3和GAL蛋白表达水平的试剂包括特异性结合ANO1、MMP3和GAL蛋白的抗体。

优选地，预后标志物的效力检测包括RNA提取和ANO1基因在食管鳞状细胞癌细胞中敲降后的表达检测。

优选地，所述RNA提取中ANO1的引物具体如下：

上游引物：5’-GCCACCTCTTCGACAACCCC-3’；

下游引物：5’-TTTCCGCTTCCAGTGCTCCA-3’。

优选地，ANO1基因在食管鳞状细胞癌细胞中敲降后表达的检测工具包括试剂盒，所述试剂盒包括能够定量ANO1基因mRNA表达水平的试剂，能够定量ANO1基因蛋白表达水平的试剂，以及提取组织蛋白的试剂。

优选地，所述能够定量ANO1基因mRNA表达水平的试剂包括ANO1基因特异性扩增引物和特异性探针中的一种或两种共同使用，所述能够定量ANO1基因蛋白表达水平的试剂包括特异性结合ANO1蛋白的抗体。

优选地，所述能够定量ANO1基因mRNA表达水平的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

优选地，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS（扩增不应突变系统）法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

优选地，所述能够定量ANO1基因mRNA表达水平的试剂可以是ANO1基因或转录本的特异性引物，也可以是ANO1基因或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。

优选地，以上所述的ANO1基因或转录本的特异性引物包括实时定量PCR中使用的特异扩增ANO1基因的引物，引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

优选地，探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

优选地，本发明的定量ANO1、MMP3和GAL蛋白表达水平的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

优选地，本发明的定量ANO1、MMP3和GAL蛋白表达水平的试剂包括特异性结合ANO1、MMP3和GAL蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。

优选地，抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的ANO1、MMP3和GAL蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对ANO1、MMP3和GAL蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

优选地，标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight547和DyLight647(Techno Chemical Corp .)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

本发明用于ANO1、MMP3和GAL基因表达检测的样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。

本发明的有益效果是：本发明首次通过分析GEO数据库中同一中国汉族食管鳞状细胞癌患者队列的DNA测序和mRNA芯片数据，筛选出同时满足在DNA水平基因拷贝数变异频发和mRNA水平表达显著差异的三个基因（ANO1、MMP3及GAL基因），此种筛选方法同时考虑到基因DNA和mRNA水平的影响，增加了筛选的把握度。

利用中国医学科学院肿瘤医院收集的197例食管鳞状细胞癌患者的组织样本制作组织芯片，进行免疫组织化学染色，将染色结果与患者预后状态进行分析，结果发现ANO1及MMP3蛋白在食管鳞状细胞癌癌组织中呈高表达且与患者预后不良相关。联合使用这两个蛋白作为标志物进行预后分析，结果显示ANO1及MMP3蛋白均为阳性的患者预后最差，五年生存率仅为11.1%；一个蛋白阳性的患者预后居中，五年生存率约为27.4%；两者均为阴性的患者预后最好，五年生存率为56.4%。

为避免样本过拟合的可能性，我们选择另一个中心南京医科大学第一附属医院收集的118例食管鳞状细胞癌患者的组织样本对上述预后标志物组合进行了独立验证，结果显示ANO1及MMP3蛋白均为阴性的患者五年生存率为50.7%，每增加一个阳性标志物，生存率下降约25%，验证结果与前一中心类似。将两中心315例患者数据合并后，我们进行了ANO1联合MMP3蛋白预后标志物对食管鳞状细胞癌患者预后预测的效力分析并与目前临床常用的第八版TNM分期的方法进行比较，分析显示ANO1联合MMP3蛋白预后标志物与第八版TNM分期预后预测效力接近，联合使用两种方法可以显著提高食管鳞状细胞癌患者预后预测的可靠性。

本研究首次发现并证实了ANO1联合MMP3蛋白可以作为预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物，其预测效力与目前临床常用的单纯利用临床信息进行预后预测的第八版TNM分期相当，两种方法联合使用能够显著提高食管鳞状细胞癌患者预后预测的准确性。研究同时发现ANO1基因在食管鳞状细胞癌患者癌组织中呈高表达，其表达增高能够促进食管鳞状细胞癌的增殖、侵袭和转移，利用shRNA敲降ANO1基因的表达可以显著抑制食管鳞状细胞癌在体内及体外水平的进展。

附图说明

图1利用高通量数据筛选食管鳞状细胞癌患者预后标志物流程图；

图2-1 ANO1、GAL、MMP3蛋白在食管鳞状细胞癌及癌旁组织中特征性表达的组织切片图；

图2-2 ANO1、GAL、MMP3蛋白在食管鳞状细胞癌及癌旁组织中的特征性表达柱状图，左列为在癌旁组织呈阴性表达，右列为在癌组织中呈阳性表达；

图3利用ANO1和MMP3蛋白免疫组化表达情况将中国医学科学院肿瘤医院收集的197例食管鳞状细胞癌患者划分为不同的预后组别图；

图4联合使用ANO1和MMP3蛋白作为标志物组合将中国医学科学院肿瘤医院的197例食管鳞状细胞癌患者划分为不同的预后组别图；

图5联合使用ANO1和MMP3蛋白作为标志物组合将南京医科大学第一附属医院收集的118例食管鳞状细胞癌患者划分为不同的预后组别图；

图6 ANO1和MMP3蛋白标志物组合的预后预测效力ROC曲线分析图；

图7 ANO1基因mRNA在7种食管鳞癌细胞系及1种正常食管上皮细胞系中的表达情况图；

图8 KYSE410和KYSE30食管鳞癌细胞系中shRNA敲降ANO1基因效力检测图；

图9 ANO1基因敲降MTT实验图；

图10 ANO1基因敲降克隆形成实验图；

图11-1 ANO1基因敲降细胞周期检测实验图；

图11-2 ANO1基因敲降细胞周期检测数据分析图；

图12-1 ANO1基因敲降细胞凋亡检测实验图

图12-2 ANO1基因敲降细胞凋亡检测数据分析图；

图13 ANO1基因敲降细胞侵袭能力检测图；

图14 ANO1基因敲降细胞转移能力检测图；

图15-1 ANO1基因敲降细胞划痕实验图；

图15-2 ANO1基因敲降细胞划痕实验结果分析图；

图16 ANO1基因敲降Western blotting检测p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT和AKT蛋白表达情况图；

图17 ANO1基因敲降裸鼠体内成瘤实验解剖图；

图18 ANO1基因敲降裸鼠体内肿瘤体积变化图；

图19 ANO1基因敲降裸鼠体内肿瘤接种24天肿瘤重量比较图；

表1 中国医学科学院肿瘤医院197例食管鳞状细胞癌患者的单因素及多因素分析表；

表2标志物组合免疫组化表达以及临床病理因素与南京医科大学第一附属医院118例食管鳞状细胞癌患者预后的单因素分析表；

表3 ANO1基因表达与两中心315例食管鳞状细胞癌患者临床病理因素关系表。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”和“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接连接，也可以通过中间媒介间接连接，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物，包括基于公共大数据的预后标志物的筛选、预后标志物的验证和预后标志物的效力检测。

基于公共大数据的预后标志物的筛选包括以下步骤：

实施例1基于公共大数据的预后标志物的筛选

请参阅图1所示，基于前期已发表的中国汉族人群113对食管鳞状细胞癌和癌旁组织DNA样本外显子测序数据（Gao YB, et al. Genetic landscape of esophagealsquamous cell carcinoma. Nature genetics 2014;46: 1097-1102.），研究分析发现其中有87对样本总共包含有3145个DNA拷贝数变异的信息。利用GENCOD V19基因注释工具（http://www.gencodegenes.org/）对这些基因拷贝数变异信息进行确认，发现有1728个拥有蛋白编码功能的基因上呈现拷贝数变异，其中有76个基因在三个及三个以上的组织样本中发现拷贝数变异（高频变异）。

随后我们进一步检索了同一食管鳞状细胞癌患者队列的基因芯片数据信息（GEO数据库，编号GSE53624），分析发现该芯片总共包含了32080个基因探针，其中16812个基因被GENCOD V19注释为蛋白质编码基因，这些基因被纳入进一步分析其在癌与癌旁组织中的差异表达。基于log2-foldchage＞2和P＜2.99×10^-6（0.05/16812）的严格标准，我们共筛选出213个差异表达基因。将RNA水平筛选出来的差异表达基因（213个）与DNA水平筛选出来的高频拷贝数变异基因（76个）进行对比，最终筛选出五个基因ANO1、GAL、MMP1、MMP3、MMP10在DNA和RNA水平同时发生变化。

MMP1、MMP3及MMP10这三个基因均为MMP基因家族成员，生物学功能相似，我们进一步分析发现这三个基因无论是在样本的基因拷贝数变异情况，还是在样本mRNA表达变化趋势上均高度一致，基于MMP3基因在mRNA水平差异性表达最为显著，我们选择了MMP3作为代表进行下一步研究。因此，最终ANO1、GAL和MMP3这三个基因被挑选出来进行下一步的蛋白水平验证研究。

预后标志物的检测包括组织芯片的构建和ANO1、MMP3和GAL基因表达检测，所述组织芯片的构建包括利用苏木精-伊红染色切片选择有代表性的肿瘤区域和利用亲和素-生物素复合物法进行免疫组化分析。

实施例2 预后标志物的验证

1、组织芯片的制作

从中国医学科学院肿瘤医院和南京医科大学第一附属医院组织标本库中分别提取197例和118例食管鳞状细胞癌患者癌及癌旁组织，所有入组患者术前均未接受放疗或化疗且有完整的临床、病理资料及预后随访数据。所有组织标本在进行石蜡包埋后首先进行苏木精-伊红染色确认该石蜡组织块为食管鳞状细胞癌或者癌旁组织，随后切片选取代表性的肿瘤区域（癌细胞>80%）或者癌旁区域（癌细胞为0）。对于每个标本，癌组织或者癌旁组织均进行两次选点，两个中心的样本放置在不同的组织芯片上。

2、苏木精-伊红染色，包括以下步骤：

a、将组织标本切片置于67℃的温箱中烤片60分钟；

b、将烘烤后的切片依次放置在常温的二甲苯溶液中脱蜡三次，每次5分钟，脱蜡完毕后将切片依次置于95%、85%、75%的常温乙醇溶液中水化切片，每次30秒；

c、利用磷酸盐缓冲液对b中水化完成的切片冲洗三次，每次10秒；

d、对c中洗片结束的切片进行苏木精染液染片10分钟，染片结束后用磷酸盐缓冲液水洗片三次，每次10秒；

e、将d中冲洗完毕的切片置于1%盐酸乙醇分化5秒，分化结束后用磷酸盐缓冲液水洗切片三次，每次10秒，；

f、将e中洗片结束的切片置入0.5%氨水中蓝化5秒，蓝化结束后用磷酸盐缓冲液水洗切片三次，每次10秒；

g、对f中洗片结束的切片进行伊红染色5秒，染色结束后分别利用浓度为75%、85%、95%的乙醇溶液逐步脱水，每次30秒；

h、利用二甲苯对g中脱水结束的切片透明两次，每次1分钟，透明结束后进行中性树胶封固。

3、免疫组织化学染色（亲和素-生物素复合物法）

a、将石蜡包埋的TMA在二甲苯中脱蜡，重复一次；

b、梯度酒精(100％,95％,90％,80％,70％)中水化；

c、3％过氧化氢去除组织内源性酶；

d、柠檬酸缓冲液进行抗原修复；

e、正常血清封闭后，ANO1、MMP3或GAL蛋白一抗4℃孵育过夜；

f、磷酸盐缓冲液洗涤数次，与相对应生物素标记的二抗孵育；

g、磷酸盐缓冲液洗涤数次，与辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育；

h、以DAB为底物进行免疫组化的显色；

i、免疫组化结果由两名经验丰富的病理学家利用显微镜对组织芯片进行盲法检测，并进行如下分析：当≥10%的肿瘤细胞的细胞浆、细胞膜或细胞核染色时判定为阳性，＜10%时则判定为阴性。

4、实验结果：

a、ANO1、MMP3和GAL蛋白表达检测

为了检测ANO1、MMP3和GAL蛋白是否可以作为人类食管鳞状细胞癌预后的标志物及其临床意义，我们采用免疫组织化学组织芯片法检测了中国医学科学院肿瘤医院收集的197例原发性食管鳞状细胞癌和癌旁组织中ANO1、MMP3和GAL蛋白的表达水平。

请参阅图2所示，我们首先观察到 ANO1 蛋白主要在肿瘤细胞的细胞膜染色, GAL蛋白在肿瘤细胞的细胞膜和细胞质均有染色, 而MMP3 蛋白主要在肿瘤细胞的细胞质染色。进一步分析显示ANO1蛋白在19.8% (39/197)的肿瘤组织和1%(2/197)的癌旁组织中呈阳性表达。GAL蛋白在58.9%(116/197)的肿瘤组织和2.5%(5/197)的癌旁组织中呈阳性表达。MMP3 蛋白在32%(63/197)的肿瘤组织和3%(6/197)的癌旁组织中呈阳性表达。ANO1、GAL和 MMP3 蛋白在肿瘤组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.001)。

b、ANO1、GAL 和 MMP3蛋白表达水平与食管鳞状细胞癌患者预后分析

前期针对中国医学科学院肿瘤医院入组的197例食管鳞状细胞癌患者，已通过门诊复查及电话随访等方式完成术后调查，获得了完整的临床资料。Kaplan-Meier单因素生存分析表明，ANO1 (P=0.015) 和 MMP3 (P<0.001)蛋白表达情况与患者的预后显著相关，而GAL蛋白的表达水平与食管鳞状细胞癌患者的预后关联未达显著差异 (P=0.091)。随后我们进一步分析了其他临床变量与患者预后的关联，发现年龄 (P=0.007) 、N 分期 (P<0.001) 以及肿瘤分化程度 (P=0.027) 与患者预后显著相关，请参阅表1所示。

利用 Cox 风险回归模型针对单因素分析中获得的有意义的元素进行多因素分析，表1结果显示年龄、N 分期、ANO1 和 MMP3 蛋白表达水平是食管鳞状细胞癌患者预后的独立预测因子。

我们将ANO1和MMP3蛋白表达水平这两个独立的预后预测因子组合在一起作为一个组合对197例食管鳞状细胞癌患者的预后进行预测分析，参阅图3，结果显示，ANO1阴性/MMP3阴性、ANO1阴性/MMP3阳性、ANO1阳性/MMP3阴性、ANO1阳性/MMP3阳性这四组患者的5年生存率分别为56.4%、30%、25.9%、11.1% (P<0.001)。由于ANO1阴性/MMP3阳性与ANO1阳性/MMP3阴性这两组患者5年生存率无明显差异(P=0.542)，我们将这两组合为一组进行分析，参阅图4，结果显示，ANO1/MMP3均阴性的患者5年生存率为56.4%，增加一个阳性的蛋白标志物患者5年生存率为27.4%，ANO1/MMP3均阳性的患者5年生存率为11.1%。

为了避免过拟合的发生，我们选择另外一个中心南京医科大学第一附属医院收集的118例食管鳞状细胞癌患者对这个预后标志物组合进行了验证，参阅图5和表2显示，结果与前一中心类似，ANO1及MMP3均为阴性的患者五年生存率为50.7%，每增加一个阳性标志物，生存率下降约25%(P<0.001)。

c、ANO1/MMP3蛋白预后标志物组合与第八版TNM分期的预后预测效力比较

参阅图6显示，将两中心315例患者信息合并后，我们发现ANO1/MMP3蛋白预后标志物组合与第八版TNM分期对食管鳞状细胞癌患者预后的预测效力接近，联合使用ANO1/MMP3蛋白预后标志物组合与第八版TNM分期这两种方法能够显著提高食管鳞状细胞癌患者预后预测的准确性。

d、ANO1蛋白表达水平与食管鳞状细胞癌患者临床病理指标关系分析

对于已筛选出的食管鳞状细胞癌预后标志物-ANO1及MMP3蛋白，我们通过查阅文献发现MMP3基因在食管鳞状细胞癌中的功能研究已较明确，而ANO1基因的功能尚未进行深入探讨。所以我们将两中心315例患者的临床信息进行合并，将ANO1蛋白表达水平与患者资料信息进行归类分析，请参阅表2，分析显示ANO1蛋白表达水平与食管鳞状细胞癌患者T分期 (P=0.027) 和N分期 (P=0.004)显著相关，请参阅表3。

实施例3 预后标志物的效力检测-ANO1高表达促进食管鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡抵抗、侵袭和迁移

a、细胞培养

从上海吉凯生物公司购得人类食管鳞状细胞癌细胞系 KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE180、KYSE410、ECA109、TE-1和正常食管上皮细胞HET-1a。HET-1a 细胞培养在DMEM培养基中，其他癌细胞培养在含有10%胎牛血清和1%青/链霉素的RPMI-1640培养基中，培养温度为37℃，培养环境中二氧化碳浓度为5%，其中DMEM培养基和RPMI-1640培养基均采购自美国Gibco公司。

b、RNA提取和PCR检测

按照试剂盒说明书要求，利用总RNA提取试剂盒SuperfecTRI从细胞中提取RNA。用NanoDrop2000C分光光度计测定提取的总RNA浓度(A260/A280比率)。利用M-MLV逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，SYBRPrimeScriptRT-PCR试剂盒进行PCR检测，ANO1基因的引物由广州RiboBio生物公司设计，具体如下：

上游引物：5’-GCCACCTCTTCGACAACCCC-3’

下游引物：5’-TTTCCGCTTCCAGTGCTCCA-3’

利用GAPDH mRNA作为内参对照，用2-ΔCt法对靶基因表达水平进行计算。所有样品均在 LightCycler480 PCR仪重复三次。

其中总RNA提取试剂盒SuperfecTRI采购自中国普飞生物技术公司，NanoDrop2000C分光光度计采购自美国Thermo公司，M-MLV逆转录试剂盒采购自中国Promega公司，SYBRPrimeScriptRT-PCR试剂盒采购自日本Takara公司，LightCycler480PCR仪采购自美国罗氏公司。

c、食管鳞状细胞癌细胞中敲降ANO1基因的表达验证实验

为了进一步研究ANO1基因高表达在食管鳞状细胞癌中的作用机制，上海吉凯生物公司设计了三种敲降ANO1基因表达的shRNA质粒，并用慢病毒包装。随后我们将三种ANO1基因敲降的慢病毒分别转染食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系，利用PCR检测ANO1基因的mRNA表达水平，选择其中两种敲降效率较高的慢病毒展开后续功能实验，其基因序列分别为：5’-TCACTAACTTGGTCTCCAT-3’和5’-ACCTGGTCAGGAAGTATTT-3’，另外一个无义序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’被作为空白对照组。

d、细胞活力与克隆形成实验

根据试剂盒（上海吉凯生物公司）说明书要求, 将转染ANO1基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系细胞利用胰酶消化后，培养基完全重悬成细胞悬液，并计数。将细胞密度控制在约2000个细胞/孔铺板，每组3孔重复，检测5天，共铺5张96孔板。统一铺板后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各组的细胞密度，调整各组细胞密度均匀。培养终止前4小时加入20μL 5mg/mL 的MTT于孔中，4小时后完全吸去培养液，加100μL DMSO 溶解甲瓒颗粒。振荡器振荡2-5分钟，酶标仪490/570 nm 检测OD值，检测细胞活力。

克隆形成实验中将转染ANO1基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系细胞利用细胞胰酶进行消化，完全培养基重悬制成细胞悬液，计数并分别接种于6孔板中，每孔约1×10³个细胞，培养液为含10%FBS的DMEM，温度37℃。将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态，实验终止前PBS洗涤细胞1次，每孔加入1mL 4%多聚甲醛，固定细胞30分钟，随后每孔加入洁净、无杂质GIEMSA染液500μL，染细胞10分钟。双氧水洗涤细胞数次，晾干，计算形成的克隆数。所有实验均重复三次。

e、细胞周期与细胞凋亡检测

将转染ANO1基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系细胞接种于6孔板中，待细胞生长至覆盖率约为80%时，胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，收集细胞于5mL离心管中，每组设三个复孔。1300转离心5分钟，弃上清，4℃预冷的D-Hanks（pH=7.2-7.4）洗涤细胞沉淀1次。1300转、5分钟离心，4℃预冷的75%乙醇固定细胞1小时。1300转离心5分钟去固定液，D-Hanks 洗涤细胞再沉淀一次。加入1 mL的细胞染色液重悬，上机检测细胞周期。

将转染ANO1基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系细胞接种于6孔板中，收集上清液，胰酶消化，完全培养基重悬6孔板中细胞成细胞悬液，与上清液一同置于5mL离心管中，每组设三个复孔(上机细胞数数目≥5×10⁵）。1300 转离心5 min，弃上清，4℃预冷的D-Hanks（pH=7.2-7.4）洗涤细胞沉淀。1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，1300转、3分钟离心，收集细胞。200μL 1×binding buffer 重悬细胞沉淀。加入0.5 mL PI/RNase 染色液进行染色，室温避光15分钟。利用PI单染凋亡试剂盒（美国eBioscience公司，型号88-8007）上流式细胞仪检测检测细胞凋亡。

f、细胞侵袭和转移实验

从冰箱 -20 ℃中取出细胞侵袭实验试剂盒（美国corning公司），将小室置于新24孔板中，无菌操作台内放置使其恢复到室温。上、下小室各加500 µL无血清培养基，37℃培养箱中放置2小时使Matrigel基质层再水化。将转染ANO1基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系细胞制备成无血清细胞悬浮液，并计数将细胞数调整为10⁵/孔（24 孔板）。Matrigel 基质层再水化完成后，将小室全部转移至新的孔板中，小心除去上室中培养基并加入500 µL细胞悬液，下室内加入750 µL30% FBS培养基。同时使用该细胞悬液铺一块MTS 96孔板，每孔约接种5000个细胞，接种后即测定OD570。37℃培养箱培养72小时后倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非侵袭细胞，滴2-3滴Giemsa染色液到膜的下表面染色转移细胞3-5 min后，将小室浸泡冲洗数后，空气晾干，计算各组侵袭细胞数。所有实验均重复三次。

取出细胞转移实验试剂盒（美国corning公司），将小室置于新的24孔板中，上室加100 µL无血清培养基，37℃培养箱中放置1小时。将转染ANO1基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系细胞制备成无血清细胞悬浮液，并计数将细胞数调整为10⁵/孔（24孔板）。小心除去上室中培养基并加入100 µL细胞悬液，下室内加入600µL 30% FBS 培养基。同时使用该细胞悬液铺一块MTS 96孔板，每孔约接种5000个细胞，接种后即测定OD570，作为转移参照。37℃培养箱培养72小时后倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞，滴2-3滴Giemsa染色液到膜的下表面染色转移细胞3-5 min后，将小室浸泡冲洗数次后，空气晾干，计算各组转移细胞数。所有实验均重复三次。

g、划痕实验

将转染ANO1基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系的3×10⁴个细胞置入96孔划痕板（美国VPscientific公司）中，直到细胞生长融合。利用划痕仪对准96 孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。37℃、5% CO2 培养箱中继续培养细胞，第0、8和24小时分别观察划痕宽度，计算细胞迁移距离。

h、裸鼠荷瘤实验

将处于对数生长期的转染ANO1基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，使用PBS调整细胞计数为2×10⁷个细胞/ml，使用一次性无菌注射器，吸取细胞，注射至4周龄雌性BALB/c裸鼠的右前肢腋下，每只200ul。每隔三天利用卡尺测量肿瘤大小，24天后处死裸鼠, 切除肿瘤，测量称重。

i、Western blots

以Tubulin为内参，50μg总蛋白经SDS-PAGE分离后，电转移至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的1×TBST室温轻摇封闭1h；加入一抗，4℃过夜；1×TBST洗膜4次，加入二抗，室温孵育1h；1×TBST洗膜4次后，置于Super Signal化学发光试剂中反应2分钟，暗室中使X光片曝光显影定影。

h、统计分析

T检验或Mann-Whitney检验用于连续变量之间的比较，卡方检验用于分类变量之间的比较。使用Kaplan-Meier法计算总体生存率，并绘制生存曲线，组间比较采用log-rank检验。对于单因素分析有意义的因素，进一步利用 Cox 比例风险模型进行多元生存分析确定其是否为独立危险因素。预后预测效力的分析采用受试者特性曲线(ROC)，并计算曲线下面积，以及危险比 (HR)和95%置信区间 (CI)。为了评估预后标志物组合与第八版TNM分期组合后的预后预测效率是否优于这两个单独的指标自身, 我们利用二元逻辑回归方程将预后标志物组合和第八版TNM分期建立为新的变量模型，并用ROC曲线比较三者之间的预后评估效力。P值小于0.05被认为具有统计学差异，统计分析由 SPSS、GraphPad和MedCalc软件完成。

实验结果：

图7PCR结果显示，与正常食管上皮细胞相比，食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系中的ANO1基因表达量较高，被筛选进行下一步功能研究。图8利用慢病毒转染建立稳定低表达ANO1基因的KYSE410和KYSE30细胞系。图9和图10显示，MTT和克隆形成试验结果表明，敲低ANO1基因的表达后，食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系的增殖能力明显降低。图11流式细胞系检测显示，敲低ANO1基因的表达后，食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系的细胞周期被阻滞在G1/S期。此外，图12PI单染法也显示，敲低ANO1基因的表达后，食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系的凋亡率明显升高。图13和图14Transwell试验显示，低表达ANO1基因的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系，其侵袭和转移能力均显著下降。图15划痕实验证明，低表达ANO1基因的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系迁移能力显著下降。图17-图19显示，在进一步的体内实验中，敲低ANO1基因的表达后，食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE30细胞系在裸鼠体内成瘤能力明显降低。

为了进一步深入探讨ANO1基因在食管鳞状细胞癌发生中的具体分子机制, 我们利用Western bloting检测了ANO1基因对肿瘤核心通路MAPK/ERK和AKT信号通路的影响。参阅图16，结果显示，敲低ANO1基因表达后，KYSE410和KYSE30细胞系的总MEK、ERK1/2和AKT蛋白表达水平均未见明显改变，但phosphor-MEK、phosphor-ERK1/2和phosphor-AKT均有明显下调，揭示ANO1基因可能直接或者间接通过调节MAPK/ERK和AKT肿瘤核心信号通路发挥其致癌作用，利用敲降ANO1基因的表达可抑制食管鳞状细胞癌在体内及体外的增殖、侵袭和转移能力。

在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。

本发明的“ANO1基因”【NC_000011.10 (70078302..70189545)】和“MMP3基因”【NC_000011.10 (102835797..102843689, complement)】序列可以NCBI数据库中进行查询。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种ANO1联合MMP3制备预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物的应用，其特征在于所述的AN01和MMP3为基因或其表达的蛋白；其中所述ANO1基因为人第11号染色体的70078302-70189545位，MMP3基因为人第11染色体的102835797 -102843689位。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的ANO1和MMP3是通过公共大数据的预后标志物的筛选、预后标志物的验证和预后标志物的效力检测获得，其中所述基于公共大数据的预后标志物的筛选包括以下步骤：

（2）寻找同时满足在DNA水平基因拷贝数变异频发及mRNA水平癌与癌旁组织表达显著差异的基因，获得两个候选基因ANO1、MMP3。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的预后标志物的检测包括组织芯片的构建和ANO1、MMP3基因表达检测，所述组织芯片的构建包括利用苏木精-伊红染色切片选择有代表性的组织区域和利用亲和素-生物素复合物法进行免疫组化分析。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述代表性的组织区域包括癌组织和癌旁组织，所述癌组织中癌细胞>80%，所述癌旁组织中不含癌细胞。