CN111394454B - 一种免疫相关生物标志物及其在头颈部鳞状细胞癌预后诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免疫相关生物标志物及其在头颈部鳞状细胞癌预后诊断中的应用。该生物标志物包含PVR、TNFRSF12A、IL21R和SOCS1四个免疫相关基因，该生物标志物和Path_N共同构建头颈部鳞状细胞癌预测预后模型。本发明开发一组新的、高敏感性和特异性的免疫相关分子标记物用于HNSCC的预测预后诊断以改善患者结局符合当前的迫切需求。该模型检测方法简单易行，有助于更好地鉴定HNSCC患者，可作为该疾病免疫治疗决策的指导依据。

Description

一种免疫相关生物标志物及其在头颈部鳞状细胞癌预后诊断 中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种免疫相关生物标志物及其在头颈部鳞状细 胞癌预后诊断中的应用。

背景技术

头颈部癌每年有超过630,000例新发病例和超过130,000例死亡病例。头颈部鳞状细胞 癌(HNSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤，起源于口腔、口咽、喉和下咽的鳞状上皮细胞。尽管多学科综合治疗取得了重大进展，但近几十年来，局部晚期HNSCC的5年总生存 率一直保持在50％左右。鉴于发病率的上升和不良的生存结局，当前迫切需要对HNSCC采 取有针对性的预防、筛查和治疗方法。

在面临HNSCC常规治疗效果差、靶向治疗选择少的情况下，免疫治疗是一种通过调节 肿瘤相关微环境来克服耐药的有效方法。最近有报道发现，PD-1阻断等免疫治疗在HNSCC 中已显示出良好的效果，但患者对免疫治疗的反应不一，只有一部分患者获益。这些研究结 果提示个体化免疫治疗的必要性。有研究显示PD-L1，PD-L2和IFN-γ等基因可作为预测免 疫治疗反应的潜在的生物标记物。在HNSCC中，HPV阳性患者抗PD-1治疗的效果通常优 于HPV阴性患者。进一步分析表明，HPV阳性肿瘤倾向于招募更多的M1型巨噬细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞，显示更好的预后，而HPV阴性肿瘤局部富集M2型巨噬细胞，并激活 WNT/TGF-β通路，提示更差的预后。因此，了解肿瘤免疫微环境的分子特征对选择 HNSCC治疗方法及预后分析具有重要意义。

微环境中肿瘤细胞和肿瘤相关细胞的分子表达谱为HNSCC预测预后的生物标志物提供 了有效的候选基因。HNSCC的异质性也表明，基因组的联合检测而非单一标志物检测是准 确检测肿瘤组织类型的保证。为了更好地了解HNSCC抗肿瘤反应的复杂性，有效地指导免 疫治疗，系统地研究HNSCC微环境中的免疫表型是非常必要的。

尽管对HNSCC的生物标志物进行了广泛的研究，但迄今为止，除了HPV状态外，在HNSCC中还缺乏可靠的预测预后的生物标志物，重点关注该疾病微环境中免疫表型的预测预后诊断效果的研究很少。

发明内容

鉴于HNSCC发病率的上升和不良的生存结局，当前迫切需要对HNSCC采取有针对性的预防、筛查和治疗方法。为了更好地了解HNSCC抗肿瘤反应的复杂性，有效地指导免疫 治疗、改善结局，系统地研究鉴定HNSCC微环境中的免疫相关生物标志物是非常必要的。

本发明的目的在于提供一种头颈部鳞状细胞癌预后诊断生物标志物及其应用。在本研究 中，我们通过高通量二代测序，筛选HNSCC免疫相关基因并在TCGA数据库中鉴定预后预 测价值，通过组织芯片及免疫组化方法进行验证。

本发明的另一目的在于提供一种头颈部鳞状细胞癌预后预测模型。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种头颈部鳞状细胞癌预后诊断生物标志物，该生物标志物包含PVR、TNFRSF12A、IL21R和SOCS1四个免疫相关基因。

上述的生物标志物可应用于头颈部鳞状细胞癌预后诊断。

上述的生物标志物可应用于制备头颈部鳞状细胞癌预后诊断试剂盒。

上述的生物标志物可应用于构建头颈部鳞状细胞癌预后预测模型，该模型包含PVR、 TNFRSF12A、IL21R、SOCS1四个免疫相关基因及Path_N。

本发明所述的头颈部鳞状细胞癌预后预测模型，该模型包含PVR、TNFRSF12A、IL21R、SOCS1四个免疫相关基因及Path_N。

上述头颈部鳞状细胞癌预后预测模型，使用组织芯片进行PVR、TNFRSF12A、IL21R、SOCS1四个免疫相关基因的免疫组织化学染色，用H-Score对染色进行评分，按照 中位值分为高低两组进行生存分析，显示PVR、TNFRSF12A为预后危险因素，IL21R、 SOCS1为预后保护因素，四个基因合并Path_N高风险预测值进行头颈部鳞状细胞癌预后预 测。

首先，分析了5对HNSCC患者癌和癌旁组织中差异表达的248个免疫相关基因；然后对这248个基因在TCGA数据库中进行总生存分析，通过弹性净惩罚Cox比例风险模型确 定29个基因与HNSCC患者的不良预后相关。进一步的多变量Cox比例风险回归模型构建 了包含PVR(SEQ ID NO：1)、TNFRSF12A(SEQ ID NO：2)、IL21R(SEQ ID NO：3)、 SOCS1(SEQ IDNO：4)四个免疫相关基因及Path_N的HNSCC预后预测模型；最后，通 过本中心的115个HNSCC患者组成的独立队列进行组织芯片及免疫组化验证。我们建立并 验证了一个包括四个免疫相关基因和Path_N的HNSCC预测预后模型，可有助于更好地鉴 定HNSCC患者，可作为该疾病免疫治疗决策的指导依据。

与现有技术比较本发明的有益效果：

1.HNSCC仍然缺乏有效的特异性分子标志物用于预测及预后评估。本研究开发一组新 的、高敏感性和特异性的免疫相关分子标记物用于HNSCC的预测预后诊断以改善患者结局符 合当前的迫切需求。

2.近年来肿瘤免疫治疗炙手可热，PD-1阻断等免疫治疗在HNSCC中已显示出良好的效 果，但患者对免疫治疗的反应不一，个体化免疫治疗势在必行。了解肿瘤免疫微环境的分子 特征对选择HNSCC治疗方法及预后分析具有重要意义。微环境中肿瘤细胞和肿瘤相关细胞的 分子表达谱为HNSCC预测预后的生物标志物提供了有效的候选基因。

3.尽管对HNSCC的生物标志物进行了广泛的研究，但重点关注该疾病微环境中免疫表 型的预测预后诊断效果的研究很少。在本研究中，我们调查了一组免疫相关基因作为HNSCC 生物标志物的潜在用途，建立并验证了一个包括四个免疫相关基因和Path_N的HNSCC预测 预后模型。该模型检测方法简单易行，有助于更好地鉴定HNSCC患者，可作为该疾病免疫治 疗决策的指导依据。

附图说明

图1为HNSCC免疫相关基因差异表达及基因功能通路富集分析图。

图2为数据收集及处理流程图。

图3为TCGA数据库中HNSCC四个免疫相关基因生存分析以及合并Path_N预测预后能力 分析图。

图4为HPA数据库中四个基因的癌与正常组织中差异表达的免疫组化图。

图5为HNSCC组织芯片中四个基因免疫组化图。

图6为HNSCC组织芯片四个免疫相关基因生存分析以及合并Path_N预测预后能力分析 图。

具体实施方式

实施例1

材料和方法

一、患者样本和公共数据集

我们收集2014年10月份至2015年1月份南京医科大学附属肿瘤医院头颈外科5对HNSCC患者术后新鲜肿瘤组织和配对癌旁正常组织用于RNA测序分析，获取mRNA表达 数据，具体临床病理信息见表1。从癌症基因组图谱(TCGA)数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下载HNSCC患者的全基因组mRNA表达(标准化RPKM)RNA-seq 数据，同时下载了患者的性别、年龄、组织学类型、T、N、M分期和随访结果等临床病理 资料，其中具有完整基因表达数据和TCGA临床信息的416例HNSCC病例作进一步分析。 收集2007年6月到2014年6月南京医科大学附属肿瘤医院头颈外科手术治疗的115例 HNSCC患者肿瘤石蜡包埋组织作免疫组化验证，这些病人均被病理证实为原发性头颈部鳞 癌且在手术之前均未进行包括放化疗在内的抗肿瘤治疗，具体临床病例信息见表2。根据世 界卫生组织确定的标准对肿瘤的组织学类型进行分类。第十版美国癌症联合委员会 (AJCC)肿瘤转移(TNM)系统用于根据临床、放射学和病理学发现进行疾病分期。新鲜 组织被存放在液氮中保存用来提取RNA及转录组测序，石蜡包埋组织用来制作组织芯片及 免疫组织化学染色。本研究按照世界医学会赫尔辛基宣言(2000年10月第5次修订)进 行，并经南京医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。所有研究参与者均提供书面知情同意 书。

二、Illumina HiSeq 2500RNA测序

从上述5例术后HNSCC患者组织样本中提取的RNA(包括成对的肿瘤组织和邻近的正常组织)在CapitalBio Corporation的Illumina Hiseq 2500平台(Illumina，USA)上根据之 前描述的制造商说明进行RNA-seq分析。简而言之，使用用于Illumina的

UltraTM定向RNA文库制备试剂盒(NEB，USA)产生测序文库。使用Illumina Hiseq 2500装置，使用高通量125-bp配对末端模式对文库进行测序。对于数据分析，使用 bcl2fastq2(v2.20.0)执行碱基调用。使用NGSQC-toolkit(v2.3.3)过滤读数，并使用分离 读取对准器TopHat(v2.0.13)与基因组比对，错配设置为2并使用默认参数。

三、生物信息学分析

我们使用limma R包进行转录本差异分析，表达值差异两倍以上并且p值小于0.05被 认为具有显著差异。聚类分析及热图绘制使用clusterProfiler和pheatmap R包进行。基因功 能及通路分析(GO和KEGG)使用Cytoscape软件的GlueGo25软件包进行分析及画图。我们使用弹性网惩罚Cox风险比例模型进行筛选具有最佳预测能力的差异基因。弹性网惩罚Cox风险比例回归模型是桥回归与LASSO回归混合模型，被广泛的用来进行预测因子的筛选，正则化参数λ设置为10，权衡参数α设置为0.5，弹性网惩罚COX回归中系数非0 的基因被用来进行校正年龄、性别、病理分级、TNN分期、病理肿瘤(Path_T)、淋巴结 (Path_N)的多因素COX回归，筛选出来的基因再使用逐步后退法减少基因的数目，最终 筛选的基因被用来进行建立预测模型。

四、免疫组织化学分析

我们使用HPA数据库HNSCC组织和口腔粘膜组织的免疫组织化学染色进行表达差异 分析，把肿瘤组织与粘膜组织中均不能染色或者两者表达无差异的基因去掉，同时我们下载 了免疫相关基因的免疫组织化学染色图片进行差异分析。115例HNSCC患者肿瘤石蜡包埋 组织制作成组织芯片，切成5μm厚，经过梯度脱蜡及再水化后行免疫组织化学染色，其中，所用的抗体为TNFRSF12A(abcam,#ab109365)、PVR(sigma-aldrich,hpa012568-100ul)、IL21R(proteintech,#10533-ap)和SOCS1(CST,#B1254S)。每张芯片染色后均经过3DHISTECH全景扫描仪(匈牙利制造)扫描，然后用HISTECH Quant Center 2.1扫描分析软 件进行H-SCORE评估。H-SCORE＝1×弱染色细胞的百分比+2×中度染色细胞的百分比+3× 强染色细胞的百分比。

五、统计分析

差异基因分析使用配对t检验，调整p值小于0.05并且差异倍数大于2为显著差异基 因。生存分析使用Kaplan-Meier曲线及log-rank检验。TCGA组及组织芯片组临床病理特征 分析使用卡方检验或者Wilcoxon检验。所有的检验都是双向的，除非有特殊说明，p值小于0.05为差异有统计学意义。所有的分析均使用R(version 3.6.1)。

结果

一、HNSCC免疫相关基因差异表达分析。

我们把730个免疫相关基因的表达值从测序结果提出后进行差异分析，按照p<0.05筛 选出248个差异表达基因，热图(图1A)结果显示差异基因按照功能分析主要分为五类:先 天免疫、适应性免疫、一般免疫、体液免疫、炎症相关，一般免疫相关基因占大部分(图 1B)，每个亚类中表达增高与降低的个数无明显差异。火山图(图1C)显示分别有174个上调基因和74个下调基因，其中CXCL5与MAPK3分别是增高和降低最明显的两个基因， 进一步的基因功能及通路富集分析(GO和KEGG)(图1D)显示差异基因主要富集在不 同免疫进程，包括免疫激活反应、适应性免疫调节、免疫效应器调节、T细胞激活调节等功 能及Toll样受体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、JAK-STAT通路、NF-κB通路。失调 的基因表达说明了头颈肿瘤中存在动态、异质性的免疫微环境。

二、HNSCC预后相关的免疫特征

我们首先把年龄、性别、病理分级、TNN分期、病理肿瘤(Path_T)、淋巴结 (Path_N)六个因素进行单因素分析及多因素Cox风险比例回归，可以看到Path_N(HR 1.229,95％CI1.157-1.458)可以作为独立预后因子(p<0.05)(表3)。如图2所示，我们 检索HPA数据库，删除无法染色或者肿瘤组织与正常组织的蛋白表达无差异的127个基 因，剩余的121个基因中差异倍数大于2的72个基因用来进行弹性网惩罚Cox比例风险回 归分析，筛选出29个系数非0的基因；分别把每一个基因用年龄、性别、病理分级、TNM 分期、病理肿瘤(Path_T)和淋巴结(Path_N)校正后，7个基因(PVR、TNFRSF12A、 IL21R、SOCS1、ATP binding cassettesubfamily B member 1(ABCB1)、interleukin 11receptor subunit alpha(IL11RA)和amyloid beta precursor protein(APP))的p值<0.05，被认为可以作为 预后预测因子(表4)；为了进一步减少因子数量，我们使用逐步后退法，根据最小的赤池 信息量准则(AIC，Akaike information criterion)选择PVR、TNFRSF12A、IL21R和SOCS1 四个基因作为预测预后因子建模。首先，使用survminer R包计算出每个基因的最佳临界 值，按照临界值把四个基因表达值分成高表达与低表达两组，四个基因的Kaplan-Meier生存 曲线(图3A-D)可以看出四个基因与HNSCC患者生存预后密切相关，其中，PVR、 TNFRSF12A为预后危险因素，而IL21R,SOCS1为预后保护因素。我们把四个基因与 Path_N联合建立预测模型(图3E)，可以看到高风险因素预后差。我们使用ROC曲线 (图3F)检测各基因及联合预测效能，四个基因加上Path_N的AUC最大，为0.709，说明 这个预测模型对于HNSCC具有比较强的预测能力。

三、使用HPA数据库免疫组织化学染色验证免疫相关基因的表达

为了验证PVR、TNFRSF12A、IL21R和SOCS1四个基因在HNSCC中的表达，我们首 先使用HPA数据库中口腔粘膜及HNSCC组织的免疫组织化学染色结果(图4A-D)。PVR 在正常口腔粘膜中两个均为不能染色(undetectable，100％),而在肿瘤组织中3个标本为中 等染色(medium，75％)、1个标本为不能染色(undetectable，25％)；TNFRSF12在正常 组织中，两个标本均为低表达(low，100％)，肿瘤中一个高表达(high，25％)、两个中 度表达(medium，50％)、一个低表达(low，25％)；IL21R在正常组织中两个均为低表 达(low，100％)，在肿瘤4个标本均为中等表达(medium，100％)；SOCS1在正常组织 中两个均为低表达(low，100％)，肿瘤组织中3个标本为中等表达(medium，75％)、1 个为低表达(low，25％)。总之，虽然因样本量较少而无法做统计学分析，但可以看到四 个基因在肿瘤中表达均高于正常组织。

四、使用独立样本验证免疫相关基因的表达及生存分析

我们使用本单位115例HNSCC病例作为独立样本进行验证。首先，使用组织芯片进行 四个基因的免疫组织化学染色，用H-Score对染色进行评分，每组按照中位值分为高低两组 进行生存分析，与TCGA数据分析一致，Kaplan-Meier生存曲线(图6A-D)显示PVR、TNFRSF12A为预后危险因素，IL21R、SOCS1为预后保护因素，四个基因合并Path_N高风 险预测值显示预后不良(图6E)，ROC曲线(图6F)显示四个基因合并Path_N的AUC值 最大，为0.893，这说明四个免疫相关基因合并Path_N模型能够有效预测HNSCC预后。

表1.HNSCC测序的5个病人的临床病例特征统计

表2.TCGA数据库与TMA验证组临床病例特征统计分析

表3.TCGA数据库HNSCC临床特征与预后相关的单因素及多因素分析结果

表4. 29个基因的单因素分析及多因素COX比例风险回归分析结果

序列表

<110> 江苏省肿瘤防治研究所（江苏省肿瘤医院）

<120> 一种免疫相关生物标志物及其在头颈部鳞状细胞癌预后诊断中的应用

<141> 2019-12-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5792

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agtcacttgt ctggagcttg aagaagtggg tattcccctt cccaccccag gcactggagg 60

agcggccccc cggggattcc aggacctgag ctccgggagc tggactcgca gcgaccgcgg 120

cagagcgagc gggcgccggg aagcgaggag acgcccgcgg gaggcccagc tgctcggagc 180

aactggcatg gcccgagcca tggccgccgc gtggccgctg ctgctggtgg cgctactggt 240

gctgtcctgg ccacccccag gaaccgggga cgtcgtcgtg caggcgccca cccaggtgcc 300

cggcttcttg ggcgactccg tgacgctgcc ctgctaccta caggtgccca acatggaggt 360

gacgcatgtg tcacagctga cttgggcgcg gcatggtgaa tctggcagca tggccgtctt 420

ccaccaaacg cagggcccca gctattcgga gtccaaacgg ctggaattcg tggcagccag 480

actgggcgcg gagctgcgga atgcctcgct gaggatgttc gggttgcgcg tagaggatga 540

aggcaactac acctgcctgt tcgtcacgtt cccgcagggc agcaggagcg tggatatctg 600

gctccgagtg cttgccaagc cccagaacac agctgaggtt cagaaggtcc agctcactgg 660

agagccagtg cccatggccc gctgcgtctc cacagggggt cgcccgccag cccaaatcac 720

ctggcactca gacctgggcg ggatgcccaa tacgagccag gtgccagggt tcctgtctgg 780

cacagtcact gtcaccagcc tctggatatt ggtgccctca agccaggtgg acggcaagaa 840

tgtgacctgc aaggtggagc acgagagctt tgagaagcct cagctgctga ctgtgaacct 900

caccgtgtac taccccccag aggtatccat ctctggctat gataacaact ggtaccttgg 960

ccagaatgag gccaccctga cctgcgatgc tcgcagcaac ccagagccca caggctataa 1020

ttggagcacg accatgggtc ccctgccacc ctttgctgtg gcccagggcg cccagctcct 1080

gatccgtcct gtggacaaac caatcaacac aactttaatc tgcaacgtca ccaatgccct 1140

aggagctcgc caggcagaac tgaccgtcca ggtcaaagag ggacctccca gtgagcactc 1200

aggcatgtcc cgtaacgcca tcatcttcct ggttctggga atcctggttt ttctgatcct 1260

gctggggatc gggatttatt tctattggtc caaatgttcc cgtgaggtcc tttggcactg 1320

tcatctgtgt ccctcgagta cagagcatgc cagcgcctca gctaatgggc atgtctccta 1380

ttcagctgtg agcagagaga acagctcttc ccaggatcca cagacagagg gcacaaggtg 1440

acagcgtcgg gactgagagg ggagagagac tggagctggc aaggacgtgg gcctccagag 1500

ttggacccga ccccaatgga tgaagacccc ctccaaagag accagcctcc ctccctgtgc 1560

cagacctcaa aacgacgggg gcaggtgcaa gttcataggt ctccaagacc accctccttt 1620

catttgctag aaggactcac tagactcagg aaagctgtta ggctcacagt tacagtttat 1680

tacagtaaaa ggacagagat taagatcagc aaagggagga ggtgcacagc acacgttcca 1740

cgacagatga ggcgacggct tccatctgcc ctctcccagt ggagccatat aggcagcacc 1800

tgattctcac agcaacatgt gacaacatgc aagaagtact gccaatactg ccaaccagag 1860

cagctcactc gagatctttg tgtccagagt tttttgtttg tcttgagaca gggtctggct 1920

ctgttggcag actagagtac agtggtgaga tcacagttca ttgcagcctt gacttctcaa 1980

cgccaagtca tcctcccacc tcagcctcct gagtagctat gactacaggt atgtgccacc 2040

acgtctggct aatcttttta ttatttgtaa agtcgaggtt tccctgtgtt gcccaggctg 2100

gtcttgaact cttggctcca agtgatactt ctgccttggc ctcccaaagt gctgaattaa 2160

gcagctcacc atccacacgg ctgacctcat acatcaagcc aataccgtgt ggcccaagac 2220

ccccaccata aatcacatca ttagcatgaa ccacccagag tggcccaaga ctccaagatc 2280

agctaccagg caggatattc caagggctta gagatgaatg cccaggagct gaggataaag 2340

ggcccgatct ttctttgggc aaggttaagc ctttactgca tagcagacca cacagaaggg 2400

tgtgggccac cagagaattt tggtaaaaat ttggcctctg gccttgagct tctaaatctc 2460

tgtatccgtc agatctctgt ggttacaaga aacagccact gaccctggtc accagaggct 2520

gcaattcagg ccgcaagcag ctgcctgggg ggtgtccaag gagcagagaa aactactaga 2580

tgtgaacttg aagaaggttg tcagctgcag ccactttctg ccagcatctg cagccacttt 2640

ctgccagcat ctgcagccag caagctggga ctggcaggaa ataacccaca aaagaagcaa 2700

atgcaatttc caacacaagg gggaagggat gcagggggag gcagcgctgc agttgctcag 2760

gacacgctcc tataggacca agatggatgc gacccaagac ccaggaggcc cagctgctca 2820

gtgcaactga caagttaaaa aggtctatga tcttgagggc agacagcaga attcctctta 2880

taaagaaaac tgtttgggaa aatacgttga gggagagaag accttgggcc aagatgctaa 2940

atgggaatgc aaagcttgag ctgctctgca agagaaaata agcaggacag aggatttgct 3000

ctggacagag atggaagagc cgggaacaga gaagtgtggg gaagagatag gaaccagcag 3060

gatggcaggg gcaaagggct caagggtgag gaggccagtg ggaccccaca gagttgggga 3120

gataaaggaa cattggttgc tttggtggca cgtaagctcc ttgtctgtct ccagcaccca 3180

gaatctcatt aaagcttatt tattgtacct ccagcggctg tgtgcaatgg ggtcttttgt 3240

ggaaatcaag gagcagacag gtttcatgtg tactgtcacc acgtgggatg gaaccagagg 3300

catggaagca agacgctaaa tgaagagggc cataagggct gggattccca ggcaccttag 3360

gaacagcttg tctttttttt tttcctctcc aaaaaaaatg tttaagggac ggtgtctcct 3420

gtcacccagg ctggagtgca atggcacgat catagctcat tgcagcctct aactccgggg 3480

ctcaagcaat cctcccacct cagcctacca agtagctgtg accacagctg cccctcacca 3540

tgctaagcta atttttttaa ttagatagta cataaacgtc ccaaaattag aagataaaaa 3600

gacatgaggg atccattcta atttgtgttt ggagtgtaat ggtccagctc cattcttctg 3660

cacatggata tccagtttta cacaacactg tgaatgtaat gaatgccact gaatcataca 3720

ctcaaaaata gctaaaatgg caaattgtct gttatctctt tttaaccacc atttttgaaa 3780

attaattata ccaaaaaacc attgaatagt gcactttatt tatttattta tttgtttatt 3840

tatttattta ttttagaaat aagagtctca ctttgttgcc caggctggag tgcagtggcg 3900

tgatcatggc tcattgcagc ctcgacctgc tgggctcggg ctatccttcc atctcagcct 3960

cccgagtagc tgggactata ggtgggcgcc accccacctg gctaaatctc tttttaactt 4020

ttgtagagat aggcatctcg ctatgttgcc taggctgggc tggaactcct gggctcaagt 4080

gctcctcctg ccttggcctc ccaaagcgct aggattacag atgtgagcca ccgcgcccac 4140

cctgaacctt actttttttg ctcagtttct ggtaattcag agaatgcctc ctgagttgtt 4200

ctacacccac ctcatattcc atgggagggc tgtacagggc ttttttaacg aggcctctaa 4260

ggacaggcat ttgtatcctt tccagccttt cactattaca atgttgtagt gaataacttt 4320

acacactgtc atttatttta cttttttttt tttttatttt agagaaagga atcttgccat 4380

cttgcccagg ctggtctcaa attcctgggc ccaaacaatc ctcccgcctt ggcctcctaa 4440

agtactggga tttataggca taagccaccg tgcctggcca atgcacactg tcatttagct 4500

catgttaaca cctgagtgta ggacacactc ctggaggtgg aattgctggg ccaaagagta 4560

tgtttcttgt cattgtgata gatattgaca aatgaaccct cacagaagtt gtgctgagtt 4620

ctgttcccac cagcgacgta ggcgatgacc tttttctgga gggagggggc atccttggag 4680

tccacagagc caggaatgga gagtgggccc agaattttgg tataggtgtt gtataaactt 4740

atagtaaggt taagaaaacc gcaactatcc ttatcagaga cttggcgggg ggcagggtat 4800

gatggagatc ataaggaggc taaaacactc cacaccctcc ctctgcattg ctcctgcacg 4860

ggagtcggga atcttttcag gttgatacga tctcaccttg aggagctgtg aggtcccaga 4920

agcctctggg ttgcagattg cttggggtga aaatgtctgt gctactgaaa tctaactttt 4980

tacaaaaaat tacgggctgg gcgcagtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg 5040

ctgcagcggg tggatcactt gaggtaagga gttcaagacc agaccatagt gaaaccgtgt 5100

ctctacaaaa aaaattagcc aggtgtggtg gtgcatgctt gtaatcccag ctactcagaa 5160

ggctgaggtg ggagaatccc ttgaacccgg gaagtggagg ctggagtaaa ccatgatcga 5220

gttactgcac tccagcctgg gtgacaagag tgagactctg tctccaaaaa aaaaaaaaaa 5280

aaaaaaaaaa ctggattgcc tggctctact ccgggcacag catgcaggcc cagttctgct 5340

gctctgctgt ttgttctgct ttcctccaca tattggcatc accctctggt gccaagatgg 5400

ctgctgcatt ccaggcatca catccagact cagacccaga gaagctgccc atccctacct 5460

gggtgagcct ttgtaggaac gagaaaccgc atccagcagc agaaacctca cccagcagcg 5520

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tgggaccgcc tggaaggctg gaccaaacag gacctgccct ctggggctgg ggagaggccc 5640

agatgaaggc tgcaggacag gatggactcc tagacctctg ttaccagcag tgactacctc 5700

tgtctgggtg gttggaacat gtttgaattt tattctaagt actgtctaca agttctgcaa 5760

taaaccttga ctcttctttt aataatgcaa aa 5792

<210> 2

<211> 977

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcagacagcg gcgggcgcag gacgtgcact atggctcggg gctcgctgcg ccggttgctg 60

cggctcctcg tgctggggct ctggctggcg ttgctgcgct ccgtggccgg ggagcaagcg 120

ccaggcaccg ccccctgctc ccgcggcagc tcctggagcg cggacctgga caagtgcatg 180

gactgcgcgt cttgcagggc gcgaccgcac agcgacttct gcctgggctg cgctgcagca 240

cctcctgccc ccttccggct gctttggccc atccttgggg gcgctctgag cctgaccttc 300

gtgctggggc tgctttctgg ctttttggtc tggagacgat gccgcaggag agagaagttc 360

accaccccca tagaggagac cggcggagag ggctgcccag ctgtggcgct gatccagtga 420

caatgtgccc cctgccagcc ggggctcgcc cactcatcat tcattcatcc attctagagc 480

cagtctctgc ctcccagacg cggcgggagc caagctcctc caaccacaag gggggtgggg 540

ggcggtgaat cacctctgag gcctgggccc agggttcagg ggaaccttcc aaggtgtctg 600

gttgccctgc ctctggctcc agaacagaaa gggagcctca cgctggctca cacaaaacag 660

ctgacactga ctaaggaact gcagcatttg cacaggggag gggggtgccc tccttcctag 720

aggccctggg ggccaggctg acttgggggg cagacttgac actaggcccc actcactcag 780

atgtcctgaa attccaccac gggggtcacc ctggggggtt agggacctat ttttaacact 840

agggggctgg cccactagga gggctggccc taagatacag acccccccaa ctccccaaag 900

cggggaggag atatttattt tggggagagt ttggagggga gggagaattt attaataaaa 960

gaatctttaa ctttaaa 977

<210> 3

<211> 4837

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

actctgcaca tgcggctggg tggcagccag cggcctcaga cagacccact ggcgtctctc 60

tgctgagtga ccgtaagctc ggcgtctggc cctctgcctg cctctccctg agtgtggctg 120

acagccacgc agctgtgtct gtctgtctgc ggcccgtgca tccctgctgc ggccgcctgg 180

taccttcctt gccgtctctt tcctctgtct gctgctctgt gggacacctg cctggaggcc 240

cagctgcccg tcatcagagt gacaggtctt atgacagcct gattggtgac tcgggctggg 300

tgtggattct caccccaggc ctctgcctgc tttctcagac cctcatctgt cacccccacg 360

ctgaacccag ctgccacccc cagaagccca tcagactgcc cccagcacac ggaatggatt 420

tctgagaaag aagccgaaac agaaggcccg tgggagtcag catgccgcgt ggctgggccg 480

cccccttgct cctgctgctg ctccagggag gctggggctg ccccgacctc gtctgctaca 540

ccgattacct ccagacggtc atctgcatcc tggaaatgtg gaacctccac cccagcacgc 600

tcacccttac ctggcaagac cagtatgaag agctgaagga cgaggccacc tcctgcagcc 660

tccacaggtc ggcccacaat gccacgcatg ccacctacac ctgccacatg gatgtattcc 720

acttcatggc cgacgacatt ttcagtgtca acatcacaga ccagtctggc aactactccc 780

aggagtgtgg cagctttctc ctggctgaga gcatcaagcc ggctccccct ttcaacgtga 840

ctgtgacctt ctcaggacag tataatatct cctggcgctc agattacgaa gaccctgcct 900

tctacatgct gaagggcaag cttcagtatg agctgcagta caggaaccgg ggagacccct 960

gggctgtgag tccgaggaga aagctgatct cagtggactc aagaagtgtc tccctcctcc 1020

ccctggagtt ccgcaaagac tcgagctatg agctgcaggt gcgggcaggg cccatgcctg 1080

gctcctccta ccaggggacc tggagtgaat ggagtgaccc ggtcatcttt cagacccagt 1140

cagaggagtt aaaggaaggc tggaaccctc acctgctgct tctcctcctg cttgtcatag 1200

tcttcattcc tgccttctgg agcctgaaga cccatccatt gtggaggcta tggaagaaga 1260

tatgggccgt ccccagccct gagcggttct tcatgcccct gtacaagggc tgcagcggag 1320

acttcaagaa atgggtgggt gcacccttca ctggctccag cctggagctg ggaccctgga 1380

gcccagaggt gccctccacc ctggaggtgt acagctgcca cccaccacgg agcccggcca 1440

agaggctgca gctcacggag ctacaagaac cagcagagct ggtggagtct gacggtgtgc 1500

ccaagcccag cttctggccg acagcccaga actcgggggg ctcagcttac agtgaggaga 1560

gggatcggcc atacggcctg gtgtccattg acacagtgac tgtgctagat gcagaggggc 1620

catgcacctg gccctgcagc tgtgaggatg acggctaccc agccctggac ctggatgctg 1680

gcctggagcc cagcccaggc ctagaggacc cactcttgga tgcagggacc acagtcctgt 1740

cctgtggctg tgtctcagct ggcagccctg ggctaggagg gcccctggga agcctcctgg 1800

acagactaaa gccacccctt gcagatgggg aggactgggc tgggggactg ccctggggtg 1860

gccggtcacc tggaggggtc tcagagagtg aggcgggctc acccctggcc ggcctggata 1920

tggacacgtt tgacagtggc tttgtgggct ctgactgcag cagccctgtg gagtgtgact 1980

tcaccagccc cggggacgaa ggaccccccc ggagctacct ccgccagtgg gtggtcattc 2040

ctccgccact ttcgagccct ggaccccagg ccagctaatg aggctgactg gatgtccaga 2100

gctggccagg ccactgggcc ctgagccaga gacaaggtca cctgggctgt gatgtgaaga 2160

cacctgcagc ctttggtctc ctggatgggc ctttgagcct gatgtttaca gtgtctgtgt 2220

gtgtgtgtgc atatgtgtgt gtgtgcatat gcatgtgtgt gtgtgtgtgt gtcttaggtg 2280

cgcagtggca tgtccacgtg tgtgtgtgat tgcacgtgcc tgtgggcctg ggataatgcc 2340

catggtactc catgcattca cctgccctgt gcatgtctgg actcacggag ctcacccatg 2400

tgcacaagtg tgcacagtaa acgtgtttgt ggtcaacaga tgacaacagc cgtcctccct 2460

cctagggtct tgtgttgcaa gttggtccac agcatctccg gggctttgtg ggatcagggc 2520

attgcctgtg actgaggcgg agcccagccc tccagcgtct gcctccagga gctgcaagaa 2580

gtccatattg ttccttatca cctgccaaca ggaagcgaaa ggggatggag tgagcccatg 2640

gtgacctcgg gaatggcaat tttttgggcg gcccctggac gaaggtctga atcccgactc 2700

tgataccttc tggctgtgct acctgagcca agtcgcctcc cctctctggg ctagagtttc 2760

cttatccaga cagtggggaa ggcatgacac acctggggga aattggcgat gtcacccgtg 2820

tacggtacgc agcccagagc agaccctcaa taaacgtcag cttccttcct tctgcggcca 2880

gagccgaggc gggcgggggt gagaacatca atcgtcagcg acagcctggg cacccgcggg 2940

gccgtcccgc ctgcagaggg ccactcgggg gggtttccag gcttaaaatc agtccgtttc 3000

gtctcttgga aacagctccc caccaaccaa gatttctttt tctaacttct gctactaagt 3060

ttttaaaaat tccctttatg cacccaagag atatttatta aacaccaatt acgtagcagg 3120

ccatggctca tgggacccac cccccgtggc actcatggag ggggctgcag gttggaacta 3180

tgcagtgtgc tccggccaca catcctgctg ggccccctac cctgccccaa ttcaatcctg 3240

ccaataaatc ctgtcttatt tgttcatcct ggagaattga agggaggtca agttgtttgt 3300

caatgatttg tcagagaacc tgttgaaatg tgaattaaga agctaagaaa atatttctta 3360

gcaacatttt ctttttcttt tttttttttt tcttttgaga cagagtctca ctctcgtcgc 3420

ccaggctgga atgcagtggt gcgatctcgg ctctctgcaa cctctgtctc ccgggttcaa 3480

gcgatttcct gcgtcagccc cagagtagct ggaattacag gcacacacca ccacgcctgg 3540

ctaatttttg tatttttagt agagctgggg ccaccctggc ccggccccgt cttcctcccc 3600

aaaggtcaga ctgcaggctg cagggctgtg ctggaggagc cagctctagc tcacccatgc 3660

ttttgcaaca gggtcgggtt ggaagtcagc acaggtcagt cctgcggaag gttccttcgt 3720

gactcatctg tgaagtgggg tggttgggag aggtagctga gagaatgcat gagagtcctc 3780

ggtgcctggc aggaggctgg aaggttctag aacactgatg gttataagag tgggactgtg 3840

agcctgggat cggggggtgt gagacttgga tgggagcaca agagtggaaa cacagcttct 3900

gcacggagca ggcgcagccc tcaacacccc gtgcacctgc accctaggga ctcttgggtc 3960

cagatgtgct gtggttttca caccttcttg ggggcaacag gttccaggag ccacctgtgg 4020

gtgccacctg agccacaggc tcccaggaaa gcagcacagc tctcctgcac ccagagcttg 4080

ctgggtggcg gaggggaaca cagatggttg gggaaggcct gaggccagat tgggggactc 4140

tggactgggg cagatgaggc tcctcagaat cccacctttg aagggaactc agcttataaa 4200

cacagaggag caaagttgga gggccgggcg tagtggctca cacctgtgat ctcagcactt 4260

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gtgcttgcct atagtcccag ctactcggga ggctaaggtg ggaggatcgc tggagcccag 4440

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attagtaggt aggagggtgg atggaggatg gatggatgtg tgggtggata ggaagatggt 4620

attaagttgg tgcaaaagtc tttgatatta ctcttaatgg ctttaataaa aagcttgaag 4680

gaagaatgat tggttggata gacagagata aatgcatact ggaaacaaag ataaagataa 4740

aacacaagtt ataccaggcc agcaactcta ttttgttcac tgcctttagt cccagcctgg 4800

cacatagtag gcactcaata aagcctgatt tgtagca 4837

<210> 4

<211> 1216

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggcagctgca cggctcctgg ccccggagca tgcgcgagag ccgccccgga gcgccccgga 60

gccccccgcc gtcccgcccg cggcgtcccg cgccccgccg ccagcgcacc cccggacgct 120

atggcccacc cctccggctg gccccttctg taggatggta gcacacaacc aggtggcagc 180

cgacaatgca gtctccacag cagcagagcc ccgacggcgg ccagaacctt cctcctcttc 240

ctcctcctcg cccgcggccc ccgcgcgccc gcggccgtgc cccgcggtcc cggccccggc 300

ccccggcgac acgcacttcc gcacattccg ttcgcacgcc gattaccggc gcatcacgcg 360

cgccagcgcg ctcctggacg cctgcggatt ctactggggg cccctgagcg tgcacggggc 420

gcacgagcgg ctgcgcgccg agcccgtggg caccttcctg gtgcgcgaca gccgccagcg 480

gaactgcttt ttcgccctta gcgtgaagat ggcctcggga cccacgagca tccgcgtgca 540

ctttcaggcc ggccgctttc acctggatgg cagccgcgag agcttcgact gcctcttcga 600

gctgctggag cactacgtgg cggcgccgcg ccgcatgctg ggggccccgc tgcgccagcg 660

ccgcgtgcgg ccgctgcagg agctgtgccg ccagcgcatc gtggccaccg tgggccgcga 720

gaacctggct cgcatccccc tcaaccccgt cctccgcgac tacctgagct ccttcccctt 780

ccagatttga ccggcagcgc ccgccgtgca cgcagcatta actgggatgc cgtgttattt 840

tgttattact tgcctggaac catgtgggta ccctccccgg cctgggttgg agggagcgga 900

tgggtgtagg ggcgaggcgc ctcccgccct cggctggaga cgaggccgca gaccccttct 960

cacctcttga gggggtcctc cccctcctgg tgctccctct gggtccccct ggttgttgta 1020

gcagcttaac tgtatctgga gccaggacct gaactcgcac ctcctacctc ttcatgttta 1080

catataccca gtatctttgc acaaaccagg ggttggggga gggtctctgg ctttattttt 1140

ctgctgtgca gaatcctatt ttatattttt taaagtcagt ttaggtaata aactttatta 1200

tgaaagtttt tttttt 1216

Claims (2)

1.一种生物标志物在制备头颈部鳞状细胞癌预后诊断试剂盒中的应用，其特征在于，该生物标志物为PVR、TNFRSF12A、IL21R和SOCS1四个免疫相关基因。

2.一种生物标志物在构建头颈部鳞状细胞癌预后预测模型中的应用，其特征在于，该生物标志物为PVR、TNFRSF12A、IL21R和SOCS1四个免疫相关基因。

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