CN111705134B - 食管癌的分子标志物及其在制备检测食管癌试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了食管癌的分子标志物及其在制备检测食管癌试剂盒中的应用，本发明中通过预先对食管癌病人组织进行RNA测序，筛选与食管癌相关的差异表达的IncRNA，新发现了四个IncRNA在食管癌患者组织中呈现异常表达，建立了四个IncRNA的检测方法，并在食管癌病人血液中验证，表明该四个IncRNA可用于食管癌诊断、治疗效果评估或预后情况评估。

Description

食管癌的分子标志物及其在制备检测食管癌试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子标志物技术领域，具体涉及食管癌的分子标志物及其在制备检测食管癌试剂盒中的应用。

背景技术

食管癌(esophageal cancer,EC)是最常见的恶性肿瘤之一，常发生在消化系统里，是一种原发于食管上皮的恶性肿瘤。此病在我国的发病率和死亡率居于前列，是高发癌症。虽然我国多年极力加强食管癌的预防诊治工作，但不可避免的是一旦确诊为食管癌，90％的患者均为中晚期，5年生存率不足20％，相关研究表明，诱发食管癌发病因素有很多，诸如吸烟、饮酒、微量元素缺乏、遗传等因素都与食管癌发病有关。因此，深入了解肿瘤发生发展的分子机制，补充和完善现有的细胞癌变理论体系，有助于为食管癌的防、诊、治提供重要的理论依据。

近些年由于二代测序技术RNA-seq的快速发展，使人们对非编码RNA有了更深刻的认识，其中包括长链非编码RNA(long non coding RNA，IncRNA)，IncRNA是人们近期研究的热点。其特征很多，诸如长度较长＞200nt，数量众多，二级结构丰富，具有特异性，但不具有蛋白编码能力的转录产物等特征。随着研究水平的提高，学者们发现IncRNA有很强的调控功能。其表达的正常与否和许多疾病密切相关，同时在癌症中发挥着重要的作用。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明提供一种食管癌的分子标志物：所述分子标志物，其基因序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4中的任意一种或几种。

作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的食管癌的分子标志物在制备检测食管癌试剂盒中的应用：所述SEQ ID NO.1，其上下游检测引物分别为5'-cttctcatgctccgtgatgc-3'、5'-tgcccgggaagtatgtagac-3'。

作为本发明所述的食管癌的分子标志物在制备检测食管癌试剂盒中的应用的一种优选方案：所述SEQ ID NO.2，其上下游检测引物分别为5'-ggactacagagccccgaatt-3'、5'-caattctccctgcgtcatgg-3'。

作为本发明所述的食管癌的分子标志物在制备检测食管癌试剂盒中的应用的一种优选方案：所述SEQ ID NO.3，其上下游检测引物分别为5'-gcggctgtctaggttttagc-3'、5'-agaggcctgctgtcatgatt-3'。

作为本发明所述的食管癌的分子标志物在制备检测食管癌试剂盒中的应用的一种优选方案：所述SEQ ID NO.4，其上下游检测引物分别为5'-ttgagccatggtccagaact-3'、5'-agaggattcagggaaagggc-3'

作为本发明所述的食管癌的分子标志物在制备检测食管癌试剂盒中的应用的一种优选方案：所述检测食管癌试剂盒，其检测样本为人血液样本。

作为本发明所述的食管癌的分子标志物在制备检测食管癌试剂盒中的应用的一种优选方案：所述检测食管癌试剂盒，其检测过程为：从待检血液样本中提取RNA；进行逆转录至cDNA；通过qPCR法进行检测。

本发明的有益效果：本发明中通过预先对食管癌病人组织进行RNA测序，筛选与食管癌相关的差异表达的IncRNA，新发现了四个IncRNA在食管癌患者组织中呈现异常表达，建立了四个IncRNA的检测方法，并在食管癌病人血液中验证，表明该四个IncRNA可用于食管癌诊断、治疗效果评估或预后情况评估。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为novel IncRNA_1、2、3和4基因融解曲线图。

图2为novel IncRNA_1、2、3和4在食管癌患者及正常人血液表达情况。

图3为novel IncRNA_1、2、3和4对食管癌诊断的ROC曲线。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明通过预先对食管癌病人组织进行RNA测序，筛选与食管癌相关的差异表达的IncRNA，新发现了四个IncRNA在食管癌患者血清中呈现异常表达。

操作方法：

①获得待检血液样本；

②从待检血液样本中提取RNA；

③对于获得的RNA进行逆转录至cDNA；

④对于获得的cDNA通过qPCR法进行检测。

⑤四条novel IncRNA_1、2、3、4引物序列为：

novel IncRNA_1序列(SEQ ID NO.1)：

gcgcacacccaatgcccgtgagcccagacactggacgctgaacctcgcggacagttaagaacccaggggcctctgcgccctgggcccagctctgtcccacaccgcggtcacatggcaccacctctcttgcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcagccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatctccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtgccacggccggcaagcccccgctccccaggctctcggggtcgcgcgaggatgcttggcacgtaccccgtctacatacttcccgggcacccagcatggaaataaagcacccagcgctgccctgggcccctgcga

novel IncRNA_2序列(SEQ ID NO.2)：

gacgcagccccaccggttgcgcagtccctccccgcccccgctctcccctccgcagcctgcagcccgagacttctgtaaaggactggggccccgcaactggcctctcctgccctcttaagcgcagcgccattttagcaacgcagaagcccggcgccgggaagcctcagctcgcctgaaggtggtaaactatacctactgtccctcaagagaacacaagaagtgctttaagaggcggcggaaggtgatcgaattccggtgatgcgagttgttctccgtctataaatacgcctcgcccgagctgtgcggtaggcattgaggcagccagcgcaggggcttctgctgagggggcaggcggagcttgaggaaaccgcagataagtttttttctctttgaaagatagagattaatacaactacttaaaaaatatagtcaataggttactaagatattgcttagcgttaagtttttaacgtaattttaatagcttaagattttaagagaaaatatgaagacttagaagagtagcatgaggaaggaaaagataaaaggtttctaaaacatgacggaggttgagatgaagcttcttcatggagtaaaaaatgtatttaaaagaaaattgagagaaaggactacagagccccgaattaataccaatagaagggcaatgcttttagattaaaatgaaggtgacttaaacagcttaaagtttagtttaaaagttgtaggtgattaaaataatttgaaggcgatcttttaaaaagagattaaaccgaaggtgattaaaagaccttgaaatccatgacgcagggagaattgcgtcatttaaagcctagttaacgcatttactaaacgcagacgaaaatggaaagattaattgggagtggtaggatgaaacaatttggagaagatagaagtttgaagtggaaaactggaagacagaagtacgggaaggcgaagaaaagaatagagaagatagggaaattagaagataaaaacatacttttagaagaaaaaagataaatttaaacctgaaaagtaggaagcagaagaaaaaagacaagctaggaaacaaaaagctaagggcaaaatgtacaaacttagaagaaaattggaagatagaaacaagatagaaaatgaaaatattgtcaagagtttcagatagaaaatgaaaaacaagctaagacaagtattggagaagtatagaagatagaaaaatataaagccaaaaattggataaaatagcactgaaaaaatgaggaaattattggtaaccaatttattttaaaagcccatcaatttaatttctggtggtgcagaagttagaaggtaaagcttgagaagatgagggtgtttacgtagaccagaaccaatttagaagaatacttgaagctagaaggggaagttggttaaaaatcacatcaaaaagctactaaaaggactggtgtaatttaaaaaaaactaaggcagaaggcttttggaagagttagaagaatttggaaggccttaaatatagtagcttagtttgaaaaatgtgaaggactttcgtaacggaagtaattcaagatcaagagtaattaccaacttaatgtttttgcattggactttgagttaagattattttttaaatcctgaggactagcattaattgacagctgacccaggtgctacacagaagtggattcagtgaatctaggaagacagcagcagacaggattccaggaaccagtgtttgatgaagctaggactgaggagcaagcgagcaagcagcagttcgtggtgaagataggaaaagagtccaggagccagtgcgatttggtgaaggaagctaggaagaaggaaggagcgctaacgatttggtggtgaagctaggaaaaaggattccaggaaggagcgagtgcaatttggtgatgaaggtagcaggcggcttggcttggcaaccacacggaggaggcgagcaggcgttgtgcgtagaggatcctagaccagcatgccagtgtgccaaggccacagggaaagcgagtggttggtaaaaatccgtgaggtcggcaatatgttgtttttctggaacttacttatggtaaccttttatttattttctaatataatgggggagtttcgtactgaggtgtaaagggatttatatggggacgtaggccgatttccgggtgttgtaggtttctctttttcaggcttatactcatgaatcttgtctgaagcttttgagggcagactgccaagtcctggagaaatagtagatggcaagtttgtgggttttttttttttacacgaatttgaggaaaaccaaatgaatttgatagccaaattgagacaatttcagcaaatctgtaagcagtttgtatgtttagttggggtaatgaagtatttcagttttgtgaatagatgacctgtttttacttcctcaccctgaattcgttttgtaaatgtagagtttggatgtgtaactgaggcgggggggagttttcagtatttttttttgtgggggtgggggcaaaatatgttttcagttctttttcccttaggtctgtctagaatcctaaaggcaaatgactcaaggtgtaacagaaaacaagaaaatccaatatcaggataatcagaccaccacaggtttacagtttatagaaactagagcagttctcacgttgaggtctgtggaagagatgtccattggagaaatggctggtagttactcttttttccccccacccccttaatcagactttaaaagtgcttaaccccttaaacttgttattttttacttgaagcattttgggatggtcttaacagggaagagagagggtgggggagaaaatgtttttttctaagattttccacagatgctatagtactattgacaaactgggttagagaaggagtgtaccgctgtgctgttggcacgaacaccttcagggactggagctgcttttatccttggaagagtattcccagttgaagctgaaaagtacagcacagtgcagctttggttcatattcagtcatctcaggagaacttcagaagagcttgagtaggccaaatgttgaagttaagttttccaataatgtgacttcttaaaagttttattaaaggggaggggcaaatattggcaattagttggcagtggcctgttacggttgggattggtggggtgggtttaggtaattgtttagtttatgattgcagataaactcatgccagagaacttaaagtcttagaatggaaaaagtaaagaaatatcaacttccaagttggcaagtaactcccaatgatttagtttttttccccccagtttgaattgggaagctgggggaagttaaatatgagccactgggtgtaccagtgcattaatttgggcaaggaaagtgtcataatttgatactgtatctgttttccttcaaagtatagagcttttggggaaggaaagtattgaactgggggttggtctggcctactgggctgacattaactacaattatgggaaatgcaaaagttgtttggatatggtagtgtgtggttctcttttggaatttttttcaggtgatttaataataatttaaaactactatagaaactgcagagcaaaggaagtggcttaatgatcctgaagggatttcttctgatggtagcttttgtattatcaagtaagattctattttcagttgtgtgtaagcaagtttttttttagtgtaggagaaatacttttccattgtttaactgcaaaacaagatgttaaggtatgcttcaaaaattttgtaaattgtttattttaaacttatctgtttgtaaattgtaactgattaagaattgtgatagttcagcttgaatgtctcttagagggtgggcttttgttgatgagggaggggaaactttttttttttctatagacttttttcagataacatcttctgagtcataaccagcctggcagtatgatggcctagatgcagagaaaacagctccttggtgaattgataagtaaaggcagaaaagattatatgtcatacctccattggggaataagcataaccctgagattcttactactgatgagaacattatctgcatatgccaaaaaattttaagcaaatgaaagctaccaatttaaagttacggaatctaccattttaaagttaattgcttgtcaagctataaccacaaaaataatgaattgatgagaaatacaatgaagaggcaatgtccatctcaaaatactgcttttacaaaagcagaataaaagcgaaaagaaatgaaaatgttacactacattaatcctggaataaaagaagccgaaataaatgagagatgagttgggatcaagtggattgaggaggctgtgctgtgtgccaatgtttcgtttgcctcagacaggtatctcttcgttatcagaagagttgcttcatttcatctgggagcagaaaacagcaggcagctgttaacagataagtttaacttgcatctgcagtattgcatgttagggataagtgcttatttttaagagctgtggagttcttaaatatcaaccatggcactttctcctgaccccttccctaggggatttcaggattgagaaatttttccatcgagcctttttaaaattgtaggacttgttcctgtgggcttcagtgatgggatagtacacttcactcagaggcatttgcatctttaaataatttcttaaaagcctctaaagtgatcagtgccttgatgccaactaaggaaatttgtttagcattgaatctctgaaggctctatgaaaggaatagcatgatgtgctgttagaatcagatgttactgctaaaatttacatgttgtgatgtaaattgtgtagaaaaccattaaatcattcaaaataataaactatttttattagagaatgtatacttttagaaagctgtctccttatttaaataaaatagtgtttgtctgtagttcagtgttggggcaatcttgggggggattcttctctaatctttcagaaactttgt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novel IncRNA_3序列(SEQ ID NO.3)：

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novel IncRNA_4序列(SEQ ID NO.4)：

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实施步骤一 RNA提取

待检血液和组织样本来自于食管癌癌症患者及正常人，血液RNA提取时采用了Trizol法。

待检血液和组织样本中RNA提取步骤为：

(一)血液RNA提取：

(1)3500rpm离心5min，取出上清；

(2)在上清中加1mL RNA Blood,混匀后在冰上静置20-30min；

(3)加200μL氯仿，振荡混匀，冰上静置10min，4℃(提前预冷)离心12,000rpm，10min；

(4)取出上清，加等体积的异丙醇混匀，冰上静置10min后4℃离心12,000rpm，10min；

(5)弃掉上清，加500μL冰乙醇弹洗，4℃离心10,000rpm，5min；

(6)重复(5)实验步骤；

(7)在超净工作台吹干液体，向管中间部位悬空滴加30-100μL RNase-Free H₂O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液；(注：洗脱体积不少于30μL)。

(8)混匀后去测浓度即可，不及时用的放在-80℃冰箱保存。

(二)组织中提取RNA：

(1)匀浆处理：在组织(10-20mg)加裂解液RL300μL，将组织研磨；随后向匀浆中加入RNase-Free H₂O和Proteinase K，分别是590μL和10μL，混匀后56℃处理10-20min；

(2)12,000rpm离心2-5min，取上清进行一下操作；

(3)缓慢加入无水乙醇(0.5倍上清体积)，混匀(可能出现沉淀)，将溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放入收集管)，12,000rpm离心30-60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；

(4)向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1350μL，12,000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(5)DNase I工作液配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL的RDD溶液，轻柔混匀；

(6)向吸附柱CR3中加入80μL DNase I工作液，室温放置15min；

(7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(9)重复(8)步骤；

(10)12,000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余漂洗液；

(11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μL RNase-Free H₂O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液；(注：洗脱体积不少于30μL)。

实施步骤二 逆转录反应体系

逆转录反应体系如下：

逆转录反应体系成分	使用量
		RTmix	4.0μL
总RNA	1μg
		无RNA酶的ddH<sub>2</sub>O	加ddH<sub>2</sub>O至总反应体系为16μL

实施步骤三 qPCR操作反应体系

qPCR操作反应体系如下：

反应体系成分	使用量
		Mix	5.0μL
F	0.5μL
		R	0.5μL
H<sub>2</sub>O	2.0μL
		无RNA酶的ddH<sub>2</sub>O	2.0μL
总体积	10.0μL

逆转录反应条件为：37℃15min、85℃5s、4℃∞；荧光定量PCR反应条件为阶段1：95℃30s，1次循环；阶段2：95℃10s，60℃30s，40次循环；阶段3：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s，1次循环。

实施步骤四 结果验证与分析

数据处理：本发明使用7500PCR仪器最佳PCR程序扩增出目的基因进行数据导出处理得到4个新基因的融解曲线图。利用GraphPad绘制基因表达情况图。所有的统计分析都是在R语言和统计计算环境下完成的(R version 2.15.1；R Foundation for StatisticalComputing)。

本发明操作方法：包括提RNA、所述的引物、逆转录和定量PCR反应条件，检测食管癌患者和正常人血液中novel IncRNA_1、2、3、4的表达情况，获得较好的融解曲线。见图1。图1中A、B、C和D分别为novel IncRNA_1、2、3和4在食管癌患者和正常人血液中的融解曲线。

荧光定量PCR结果显示，与正常组相比，novel IncRNA_1、2在食管癌患者血液中表达量显著升高(P＜0.01)；novel IncRNA_3在食管癌患者血液中表达量显著降低(P＜0.01)，novel IncRNA_4在食管癌患者血液中表达量降低(P＜0.05)。见图2。

SPSS绘制ROC曲线结果显示，novel IncRNA_1、2、3和4基因AUC面积分别是0.73、0.71、0.97和0.90，具有较高的特异性和灵敏度，其中，novel IncRNA_3检测食管癌的敏感性达到97.2％，灵敏度达到97.5％。能够对病人的病情起到一定的预测和诊断。见图3。

本发明具有如下优点：测定novel IncRNA_1、2、3和4基因在食管癌患者和正常人血液中的表达情况，并进一步验证。通过荧光定量PCR最佳体系实现对novel IncRNA_1、2、3和4基因的检测，结果显示novel IncRNA_1、2、3、4具有一定的诊断意义，可用于食管癌诊断、治疗效果评估或预后情况评估。

本发明对与食管癌进展相关的IncRNA进行鉴定并探索其功能与机制，我们收集了19例食管癌患者和10例正常人血液样本，其中食管癌患者的选择标准如下：(1)通过病理检测确诊的患者(患者所有材料都是通过镜检，活组织切片检查或手术得到，并通过显微镜检查确认的)；(2)患者没有其他的肿瘤病史。组织是在患者诊断过程中，且尚未接受任何治疗(手术或化疗)时采集的。本发明的实验方法为对19例食管癌患者和10例正常人血液进行RNA提取、逆转录、荧光定量PCR，并进行验证。对数据结果进行分析发现，与正常组相比，novel IncRNA_1和2在食管癌患者血液中表达量显著上调(P＜0.01)，见图2，novelIncRNA_3在食管癌患者血液中表达量显著降低(P＜0.01)，novel IncRNA_4在食管癌患者血液中表达量降低(P＜0.05)。见图2。总之上述结果说明了novel IncRNA_1、2、3和4基因在食管癌患者血液中表达情况，并可作为食管癌诊断及预后的指标。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 徐州市肿瘤医院

<120> 食管癌的分子标志物及其在制备检测食管癌试剂盒中的应用

<130> 2020072707-zf-wjn

<141> 2020-07-27

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1247

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgcacaccc aatgcccgtg agcccagaca ctggacgctg aacctcgcgg acagttaaga 60

acccaggggc ctctgcgccc tgggcccagc tctgtcccac accgcggtca catggcacca 120

cctctcttgc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga 180

gcacctctgg gggcacagca gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg 240

tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc 300

tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg 360

gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga 420

cagttgagcg caaatgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac 480

cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 540

aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt 600

acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca 660

gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcgtgcacca ggactggctg aacggcaagg 720

agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 780

aaaccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 840

tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatct 900

ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc 960

tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 1020

agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac 1080

agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gagtgccacg gccggcaagc ccccgctccc 1140

caggctctcg gggtcgcgcg aggatgcttg gcacgtaccc cgtctacata cttcccgggc 1200

acccagcatg gaaataaagc acccagcgct gccctgggcc cctgcga 1247

<210> 2

<211> 5340

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacgcagccc caccggttgc gcagtccctc cccgcccccg ctctcccctc cgcagcctgc 60

agcccgagac ttctgtaaag gactggggcc ccgcaactgg cctctcctgc cctcttaagc 120

gcagcgccat tttagcaacg cagaagcccg gcgccgggaa gcctcagctc gcctgaaggt 180

ggtaaactat acctactgtc cctcaagaga acacaagaag tgctttaaga ggcggcggaa 240

ggtgatcgaa ttccggtgat gcgagttgtt ctccgtctat aaatacgcct cgcccgagct 300

gtgcggtagg cattgaggca gccagcgcag gggcttctgc tgagggggca ggcggagctt 360

gaggaaaccg cagataagtt tttttctctt tgaaagatag agattaatac aactacttaa 420

aaaatatagt caataggtta ctaagatatt gcttagcgtt aagtttttaa cgtaatttta 480

atagcttaag attttaagag aaaatatgaa gacttagaag agtagcatga ggaaggaaaa 540

gataaaaggt ttctaaaaca tgacggaggt tgagatgaag cttcttcatg gagtaaaaaa 600

tgtatttaaa agaaaattga gagaaaggac tacagagccc cgaattaata ccaatagaag 660

ggcaatgctt ttagattaaa atgaaggtga cttaaacagc ttaaagttta gtttaaaagt 720

tgtaggtgat taaaataatt tgaaggcgat cttttaaaaa gagattaaac cgaaggtgat 780

taaaagacct tgaaatccat gacgcaggga gaattgcgtc atttaaagcc tagttaacgc 840

atttactaaa cgcagacgaa aatggaaaga ttaattggga gtggtaggat gaaacaattt 900

ggagaagata gaagtttgaa gtggaaaact ggaagacaga agtacgggaa ggcgaagaaa 960

agaatagaga agatagggaa attagaagat aaaaacatac ttttagaaga aaaaagataa 1020

atttaaacct gaaaagtagg aagcagaaga aaaaagacaa gctaggaaac aaaaagctaa 1080

gggcaaaatg tacaaactta gaagaaaatt ggaagataga aacaagatag aaaatgaaaa 1140

tattgtcaag agtttcagat agaaaatgaa aaacaagcta agacaagtat tggagaagta 1200

tagaagatag aaaaatataa agccaaaaat tggataaaat agcactgaaa aaatgaggaa 1260

attattggta accaatttat tttaaaagcc catcaattta atttctggtg gtgcagaagt 1320

tagaaggtaa agcttgagaa gatgagggtg tttacgtaga ccagaaccaa tttagaagaa 1380

tacttgaagc tagaagggga agttggttaa aaatcacatc aaaaagctac taaaaggact 1440

ggtgtaattt aaaaaaaact aaggcagaag gcttttggaa gagttagaag aatttggaag 1500

gccttaaata tagtagctta gtttgaaaaa tgtgaaggac tttcgtaacg gaagtaattc 1560

aagatcaaga gtaattacca acttaatgtt tttgcattgg actttgagtt aagattattt 1620

tttaaatcct gaggactagc attaattgac agctgaccca ggtgctacac agaagtggat 1680

tcagtgaatc taggaagaca gcagcagaca ggattccagg aaccagtgtt tgatgaagct 1740

aggactgagg agcaagcgag caagcagcag ttcgtggtga agataggaaa agagtccagg 1800

agccagtgcg atttggtgaa ggaagctagg aagaaggaag gagcgctaac gatttggtgg 1860

tgaagctagg aaaaaggatt ccaggaagga gcgagtgcaa tttggtgatg aaggtagcag 1920

gcggcttggc ttggcaacca cacggaggag gcgagcaggc gttgtgcgta gaggatccta 1980

gaccagcatg ccagtgtgcc aaggccacag ggaaagcgag tggttggtaa aaatccgtga 2040

ggtcggcaat atgttgtttt tctggaactt acttatggta accttttatt tattttctaa 2100

tataatgggg gagtttcgta ctgaggtgta aagggattta tatggggacg taggccgatt 2160

tccgggtgtt gtaggtttct ctttttcagg cttatactca tgaatcttgt ctgaagcttt 2220

tgagggcaga ctgccaagtc ctggagaaat agtagatggc aagtttgtgg gttttttttt 2280

tttacacgaa tttgaggaaa accaaatgaa tttgatagcc aaattgagac aatttcagca 2340

aatctgtaag cagtttgtat gtttagttgg ggtaatgaag tatttcagtt ttgtgaatag 2400

atgacctgtt tttacttcct caccctgaat tcgttttgta aatgtagagt ttggatgtgt 2460

aactgaggcg ggggggagtt ttcagtattt ttttttgtgg gggtgggggc aaaatatgtt 2520

ttcagttctt tttcccttag gtctgtctag aatcctaaag gcaaatgact caaggtgtaa 2580

cagaaaacaa gaaaatccaa tatcaggata atcagaccac cacaggttta cagtttatag 2640

aaactagagc agttctcacg ttgaggtctg tggaagagat gtccattgga gaaatggctg 2700

gtagttactc ttttttcccc ccaccccctt aatcagactt taaaagtgct taacccctta 2760

aacttgttat tttttacttg aagcattttg ggatggtctt aacagggaag agagagggtg 2820

ggggagaaaa tgtttttttc taagattttc cacagatgct atagtactat tgacaaactg 2880

ggttagagaa ggagtgtacc gctgtgctgt tggcacgaac accttcaggg actggagctg 2940

cttttatcct tggaagagta ttcccagttg aagctgaaaa gtacagcaca gtgcagcttt 3000

ggttcatatt cagtcatctc aggagaactt cagaagagct tgagtaggcc aaatgttgaa 3060

gttaagtttt ccaataatgt gacttcttaa aagttttatt aaaggggagg ggcaaatatt 3120

ggcaattagt tggcagtggc ctgttacggt tgggattggt ggggtgggtt taggtaattg 3180

tttagtttat gattgcagat aaactcatgc cagagaactt aaagtcttag aatggaaaaa 3240

gtaaagaaat atcaacttcc aagttggcaa gtaactccca atgatttagt ttttttcccc 3300

ccagtttgaa ttgggaagct gggggaagtt aaatatgagc cactgggtgt accagtgcat 3360

taatttgggc aaggaaagtg tcataatttg atactgtatc tgttttcctt caaagtatag 3420

agcttttggg gaaggaaagt attgaactgg gggttggtct ggcctactgg gctgacatta 3480

actacaatta tgggaaatgc aaaagttgtt tggatatggt agtgtgtggt tctcttttgg 3540

aatttttttc aggtgattta ataataattt aaaactacta tagaaactgc agagcaaagg 3600

aagtggctta atgatcctga agggatttct tctgatggta gcttttgtat tatcaagtaa 3660

gattctattt tcagttgtgt gtaagcaagt ttttttttag tgtaggagaa atacttttcc 3720

attgtttaac tgcaaaacaa gatgttaagg tatgcttcaa aaattttgta aattgtttat 3780

tttaaactta tctgtttgta aattgtaact gattaagaat tgtgatagtt cagcttgaat 3840

gtctcttaga gggtgggctt ttgttgatga gggaggggaa actttttttt tttctataga 3900

cttttttcag ataacatctt ctgagtcata accagcctgg cagtatgatg gcctagatgc 3960

agagaaaaca gctccttggt gaattgataa gtaaaggcag aaaagattat atgtcatacc 4020

tccattgggg aataagcata accctgagat tcttactact gatgagaaca ttatctgcat 4080

atgccaaaaa attttaagca aatgaaagct accaatttaa agttacggaa tctaccattt 4140

taaagttaat tgcttgtcaa gctataacca caaaaataat gaattgatga gaaatacaat 4200

gaagaggcaa tgtccatctc aaaatactgc ttttacaaaa gcagaataaa agcgaaaaga 4260

aatgaaaatg ttacactaca ttaatcctgg aataaaagaa gccgaaataa atgagagatg 4320

agttgggatc aagtggattg aggaggctgt gctgtgtgcc aatgtttcgt ttgcctcaga 4380

caggtatctc ttcgttatca gaagagttgc ttcatttcat ctgggagcag aaaacagcag 4440

gcagctgtta acagataagt ttaacttgca tctgcagtat tgcatgttag ggataagtgc 4500

ttatttttaa gagctgtgga gttcttaaat atcaaccatg gcactttctc ctgacccctt 4560

ccctagggga tttcaggatt gagaaatttt tccatcgagc ctttttaaaa ttgtaggact 4620

tgttcctgtg ggcttcagtg atgggatagt acacttcact cagaggcatt tgcatcttta 4680

aataatttct taaaagcctc taaagtgatc agtgccttga tgccaactaa ggaaatttgt 4740

ttagcattga atctctgaag gctctatgaa aggaatagca tgatgtgctg ttagaatcag 4800

atgttactgc taaaatttac atgttgtgat gtaaattgtg tagaaaacca ttaaatcatt 4860

caaaataata aactattttt attagagaat gtatactttt agaaagctgt ctccttattt 4920

aaataaaata gtgtttgtct gtagttcagt gttggggcaa tcttgggggg gattcttctc 4980

taatctttca gaaactttgt ctgcgaacac tctttaatgg accagatcag gatttgagcg 5040

gaagaacgaa tgtaacttta aggcaggaaa gacaaatttt attcttcata aagtgatgag 5100

catataataa ttccaggcac atggcaatag aggccctcta aataaggaat aaataacctc 5160

ttagacaggt gggaggtaac agcacaatat ctttgaacta tatacatcct tgatgtataa 5220

tttgtcagga gcttgacttg attgtatatt catatttaca cgagaaccta atataactgc 5280

cttgtctttt tcaggtaata gcctgcagct ggtgttttga gaagccctac tgctgaaaac 5340

<210> 3

<211> 20560

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcactatgt tgttcaggct ggtctcgaac tcctgacctc aggtgatcca cccgcctcgg 60

cttcgcaaag tgctggatta caggtgtgag cccgcgcgtc cggctgtcac tttaaagagt 120

attataagag ggcacttcat aacttgggca ggtattttta gtcatcctga acgtgtcgct 180

gtggactggg tgtcaccgcg ggaccgcaca gacaccttac tgtcgtctgc tgtaaaggac 240

ccattccaac aatctcgtaa aacatggtgg attactatga agttctaggc gtgcagagac 300

atgcctcacc cgaggatatt aaaaaggcat atcggaaact ggcactgaag tggcatccag 360

ataaaaatcc tgagaataaa gaagaagcag agagaaaatt caagcaagta gcggaggcat 420

atgaagtgct gtcggatggt gagtgacagc gagctgctga aggaccctga gcgggcatgc 480

cggaatgcgg agtgggtgtt gggatcctcc tcagggtagc acagtatgga ctcaagtgac 540

ttgtttttga tgcctactgg attttgggcc cttctaagag atttttactt ttctcgtgaa 600

gatttgaatt gatttaggta accacgagtg ctggggagct ccagggcttc tagtagtttc 660

tcctaggatg gctgttttaa aagcgggact agacatcctg ggtttgagga acctgggaga 720

gaggaggttg cgggactcag gtcactgtgc atgtggcgtg cttgcccccg ttgtgtgtga 780

tcattctgac cttgctcacc cccactggct taaacaatac cattccagtg gagtcagctt 840

tactgcttga gaggatgtca ttagttccca aaaagagggg atggaacata cagctaaaat 900

ttagatttcc agtttcaggc ctgttttccc ctcctaggtc tggagcagag gtgttctatg 960

ttactggaag tcagatccat tggcctagtt cacaaatggg tgaggggtca gaggtcagct 1020

gtcgcctaga tgcagtcagg gttccatggg ggaagtaaag gctgtgcatg gggcctgggg 1080

tgggggaaca gtgacagaac tggaaagcca cacagtgccc ctgtctgctg cagtgctggg 1140

tggcctgttg tgagcaaagg ccgaggcttt tccaaggtta gggatggact aactgaaccc 1200

tggaagtggg cacttggtta agtgtatctg catgtggtca ggtaattggc ccttatttac 1260

aacaaaaaaa attttttttt tttttaaaga acccaatttg aggcagaggt tgcagtgagc 1320

cgagattgcg ccactgcact ccagcctggg cgacagtgcg agactgtctc caaaaaacaa 1380

aacaaaacca aaccaatcag aaggaaccca gtgtaagctt gccaccttca acagctacca 1440

gcacaccacc agccttgctt tctctggtga cactgtggcc cacccccttt gttttagagg 1500

aaattccaaa cattttactt caaaaaatat gaaaagacat aaaaacaccg atatttgaag 1560

tcttcttgaa atgtggcatt taaggtcttg aactgttgag cttattcatt ggaaagttta 1620

ttttttttaa agagagagga tcttgctatg tttcctaggg aggccttgaa ctcctgggtt 1680

gaggtgatcg tcctctctcc tcaagttcca agcaccattg cgccaggctt gttcccttag 1740

atttgtgcgc tgggagtgac agaggagggc acaggcctca gtgttaccat cttggtcttc 1800

ggtccttgtt gtttgtgtgc taattcagta ttgccagatt caggatttta gggactagta 1860

acattaggaa aagtgagggc caaaatgaag cttcatattt gatagagcag ctttaaacta 1920

ccacactgaa aagtcgcttg gttcttttgg gaggtgtatg aggtgtgttt ttcatgtcct 1980

tttaggcagc cttcagtgcc agctggagtt gtcttcaaaa catggtcatt gttcttgcca 2040

tggcactggc tacctgaaac tgcttgcaag tggtttgttt ctaagctcgt tttcccattt 2100

tgtggaatgt gagattttct tctacttttt aaaaattgag aaggggtctc actctgttgc 2160

ccaggctgga atgtagtggc atgatcacag ttcgctgcag tcttgacctc ccaggctcaa 2220

gcgattctcc catctcggct tcctgagtaa ctgggaccac gggtgggtgc cactgtgccc 2280

agctaacttt tttgtattgt gtttaaaggt gggattttgc cgtgttgccc aggctggtct 2340

tgaactcctg ggcttaagtg atccaccttc cttgcccacg caaagtgttg ggattatagg 2400

cgttagccac tgcatccagc ctatgagatt ttttgaggaa cgcagatggt gtcatgtcag 2460

aagtaccagt gcttctaatg tcattgtttt tgttctggga tataagtagc atttggaatg 2520

taagtgtgaa gactgtcagt ggagaggggc acactagccc caggccttgc atccgggtgg 2580

tccacttcga gggtgaatga gcctgtaggg tgttaggttg gcgcctttct ggcacatctg 2640

ctttctccca cttgcctagg ccctggcatg tttgttttcg tgctgcagat atggtcctct 2700

aattgggttt ttgtagtaag atggtgcact tctgtggttg caataatctt gtacttggtc 2760

gtgtgatttt aatgtagcat gtctgggctc tgtgcagtag agtgaaagaa acgatctaat 2820

ggaataaaga aaaaaatttt tttttgcttt tgagatggag ttttgctcgt tgcccaggct 2880

tgagtgcaat ggtgcaatct gggctcactg caacttctgc ctcctgggtt caagcgattc 2940

tcctgcttca gtcccctgag tagctgggat cacaggcatg cgccaccatg cctggctaat 3000

tttgtatttt tagtagagac tgggtttctc cgtgttggcc aggctgctct cgaactcctg 3060

acctcaggtg atcggccctt ctcggcctct gaaagtgctg ggattacagg tatgagctac 3120

ctcgcgtggc taagtccccc ccgcgcctac tcttgttgcc caggctggag tgcaatggca 3180

cgatcttggc tcaccacaaa ctccgcctcc cgggttccag ctattctctt gcctcagcct 3240

cctgagtagc tgggattaca agtgcctgcc accacgcctg gctaattatt gtatttttac 3300

aagagatgag gtttcaccat attggccagg ctggtctcaa actcctgacc tcaggtgatc 3360

tgcccacctt ggcctcccaa agtggtggga ttacaggtgt gagccaccat gcctggccgt 3420

aaatacttaa atatttctaa taacttgtaa aaattcaaca tactgaattt tttttgaatt 3480

gtttttcagg agagaggtac agaaagtttt ccctgttgct ttgttttgtt ttaaagaaaa 3540

ggtggccata ctccttgaaa ttcagttgta aaacatcgaa aactgattta caactgggga 3600

aataccttat ctattgaatt aagggtttaa aaggaacttg gccttaccga cttttctttc 3660

aatttttagc taagaaacgg gacatctatg acaaatatgg caaagaagga ttaaatggtg 3720

gaggaggagg tggaagtcat tttgacagtc catttgaatt tggcttcaca ttccgtaacc 3780

cagatgatgt cttcagggaa ttttttggtg gaagggaccc attttcattt gacttctttg 3840

gtaagttaat cacgtgggtt gacttggtgt gtgtccatga cccaaatgag ggcttactta 3900

gtatggcctt tctgttgaat taacattgta ttttaggctg ggcgcggtgg ctcatgcctg 3960

taatcccagc actttgggag cctgaggcgg gcagatcacc tgaggttggg agttcaagac 4020

cagcctgacc aacatggaga agccacgtct ctattaaaat acaaaattag ccgggcatgg 4080

tggcgcatgc ctgtaatccc agctacttgg gaggctgagg caggagaatc acttgaaccc 4140

gggaggcaga ggttgcggtg aactgagatc atgccattgc attgttgtct gggcaacaag 4200

agtgaaactc ctgtctcaaa aaaaaaaaag ttaacattgt attttgtcac gaaactttgt 4260

gtttaaagca gcattggact agcctgaaca acatggtgaa accctgtctc aacaacaaca 4320

aaaaaaatac taaaaattag ctgagtgtgg tggcgtgtgc ctgtggtccc agctacttgg 4380

gaggctgagg tgggaggatt tccttgagcc tgggaggttg agattgggcc actgcactcc 4440

agcttgggtg acagagcaag gccctgtctc aaaaaaataa aacagcacag tagctgtaaa 4500

atcttttctc ttcttcctct ttgaaaattt aagttacagc ttgaaaaatt aaaataataa 4560

agggtttaat gtattttttt ctttgttatg tatggcctta attaacttgc ttttgccctc 4620

agaagagaca gtggtaaggg catgggtgcg agtgtcttgg aaacgttgtt tcccattgaa 4680

caaccaattg gtgtgtgaat ttgccacatc atattcctgg taaaatcatt aagcaccata 4740

gtactgttgg caagaccttt catccgtaaa cattgtgtgt gaggactgtt gttgagagtt 4800

tgcggaaagg cacctctaga gcaagactgc ggaggccttt gctgaggaga gaatggtttt 4860

gttaagggag acagtgctgt tatagctgct gtttgattgt aggaaaatgg atttctcatc 4920

agtggcatct cagtcctgat gcctggtcct aggcgttggt gtatgtcttg ggcacagttt 4980

gggtcaggca cttttgttag ctgtctcctg ttagagtctt ctcaaccact gggacttcct 5040

gagtggtgca ctgggtgacc tgagaggtca ggattaaaca tgtactcctg tagttgtttt 5100

tgtcttttga cttattgaaa gggaaacaca ttgtatgttt acctccttca ttgcctggag 5160

cttgggtgaa gaaactgaac accacctgca actcgaggag ggaaagagaa gagtagttgt 5220

gtctacagat aatacagggg agaaacgtgg agctcctgcc tgccgcaggc acgaagaagc 5280

ataatcactc tcatatctgg taggtcttgg gccttttgca tggtgcagtt cttcagtgtg 5340

tctcaaatgg ggattcaaag aggttgttct tacaccttat tatgggctgg ctggcttgaa 5400

gagagcccct ttctgaggga ggaaggacag tcagtggcct caagcatttt cagggaaact 5460

gaagctgagc aggcgatttc cgattagggg accgggagac tggcgtgctc atcgtttaag 5520

tgcatttgct gtaatcactg ctgccatcag cagaaacaga gctcaagaaa gaaccatgtt 5580

tacatccgtc cttcatcaac cctcacaggc aagaaatatt tctctaagaa aaataattta 5640

cggattgatc tctgtcttaa aaatgacctt tgcatcttgc tgtagccttc agcaaactgc 5700

atttgttgct ttgcaggaca gggcagtgtt tgggttgaag tcctgtgttc tgatcggtga 5760

ttctcatggt gaccaagcga ggaagaaggc ccgctcttcc aacaccatgg cttctcttct 5820

ggggcacacg aggtgaaacg ggctgtcctc gtgatgtctg agaccgggcg tcttcaacag 5880

gccctgctta acattatgat taaacagggc tttcttacca ttattattaa acaggccgtt 5940

tctcaacatt attattaaat aggccccttc ttaacattgt tattaaagag gccctttctt 6000

cacattatta ttaaacaggc cccttcttaa cattattatt aaacaggcct ttcataacgt 6060

tattattaaa cgggcccctt cttcacatta ttattaaaca ggccccttct taacattatt 6120

attaaacagg cctttcataa cattattatt aaacgagccc cttcttaaca tcattattaa 6180

acaggccttt cataacgtta ttattaaacg ggccccttct tcacattatt attaaacagg 6240

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ttcttaagat tattaaacgg gccctttctt aacattatta ttaaacaggc cccttcttaa 6360

cattattatt aaagaggccc tttcttaaca ttattattaa acaggtcttt cataacgtta 6420

ttattaaacg ggccccttct taacattatt attaaacagg ccccttctta acattattat 6480

taaatgggac ccttcttaag attattaaac gggccccttc ttaacattat tattaaacag 6540

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tttcttaaca ttattattaa accggccttt cattaacgtt attattaaat gggccccttc 6660

ttaacattat tattaaacgg gccccttctt aacattatta ttaaacaggc cgtttctcaa 6720

catgattatt aaacaggacc ttcttaacat tattattaaa tgggcccttt cttaacatta 6780

tgattaaaca ggtcctttct taacattatg attattattt taattcaaag gggaagggtc 6840

ccttagtgac tgaattgtag ctaatttttg ttttccttgg ggaaaataat ctgatacacc 6900

aagccataga gcaattactt gtaaagaagg tatagagatc taattagatg tgagtgaata 6960

agtgagtttt tacccctagt ccaaggagag aggtgctagt cttactgaag cgctttactg 7020

ttaaatgctc cattttacat gcagacctat tttaagacca ggtaccctgt gtttcccatg 7080

attagtgtgg cagtgatact tgttcattcc gttcttatag gtgttctaga tgacttccat 7140

tttcaggctc tcaggattta cacactgggg aagctgctgc tccatggctg ctatatgtat 7200

gtagtcactg agcagcctgc tgacggtatg tttaatgtag atgggtgtgg atgcagagcc 7260

agagggattt ccgcttattc atgatgtagt tcaggggtca acaccctggt ctgtggcctg 7320

ttacgaactg gcctgttggg aacaggaggt gagcggcgcg caggcaggca agcattactg 7380

cctgagcccc acctcctatc agctcagtgg cagcattgga gtctcataag ggcacaaacc 7440

ctattgtgaa ctgcacacgc gagggaccta ggttgcgcat tcctcatcag aatccagtat 7500

ctgaaaccat ccccctaccc caacccatca cccactgtgt ggaagaattg tcttccatga 7560

aaccagtccc tggtggcaaa aaggttgggg accgctgttg acaaatcata tttactagac 7620

ctggtgtact ttccacgtga cgaaaaagta gtttaaaatg tgctgtaaga tatttccgag 7680

ctgcacttta catttatcag aatgcagaac ccctgctgta cttcagacct ccctcatgat 7740

aggtggggaa gggtgaaggg gtgccggatg ttggacacat ggtatgcagg tctgtgcctg 7800

agcaccaggc agtgctcact gtcacactgt ggccaaggag acttgggcct ggggcctgcg 7860

gtgtggaacc cgtcctttac agaagaagcc ctcccaggag aggtcgcgga ggcggattct 7920

aacaccagcc tggaaggaat gctgcctctg aattggaggg gtacaatcaa aactgctgag 7980

gctaggtgac tgtcgaaatt tccagaatgt ggagcacatg caaatgagct cttgtcgaaa 8040

tgttaattgg aaaatattaa taggcagtgg acttatttga attaggatgc tctctttatt 8100

ttattattag aggaccctat tgctcagtga aatgatgttc tgagatagga aagaaagggt 8160

acctgataat agtgcctttt gatcccatta gtcacagcag gcattacatc tgggaaaagc 8220

ctgtgggttt aacttcacat tttatttata ttcttggaaa accaaagcga acctttaagg 8280

tttccagaga ggccttttat tttagcagtg cagcaagttt ttcctttgta aagcatcact 8340

gtggtacgaa tgatgctctg tagcaataga ggaggagtcc tgtggtatgt agaaccaagg 8400

aaagcagact tcttgcagga aaaatgagtg cattgaggat agtaacctga ctttctgacc 8460

tgtgattaaa ttatgatagt agtcagtcat tttactctcc cagggtttga ggaagtggcc 8520

ggtgaggact tggagcctag tgaggagtta gtagagctgc ccagggtgga ggaggccaca 8580

gaggacagcc ctggtgaaga gaacagtgag gccttggatg tgttgatatc cagcaaggac 8640

ctggcactgt ctagtgagga cgaggcctgc acaggatgta actggggcct gggcgagccc 8700

ttcagcgagg agctggggct catatccagc gaggacgggg ccagccctgg ggacgtagag 8760

gagctcggcg aggagtgcga ggagccgctg agtgaggagg agcacagcgg gccagagctg 8820

gggcgctgcc ggcaccacca taaagtgtca aggagctgcc cgagtgggac tgacttaaaa 8880

cagtgtatct agaataaaat ggtttcctct agtgccttga tactgtcctt ggtcagacga 8940

cctcagctgc cttggagata gaactgaaga agcaagagag ggaggtggca gccctgaagc 9000

acaggccggg cgtctcgtag gctctttccc tagaagccag agcacagacc ctgaagacag 9060

ccttgagttt gatccgtacc acaaaccggg ggcttaaact accaaaatgt accatctccc 9120

agtcctggag gctggccatg tgagacccag gtattgcagg gctggttgct tctgaggctg 9180

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cggatggccc atccgatgtt gacatcatct cctttgtgtc tgtctctgtg tccattggat 9300

ttaatgtttt agagacagat ttcactgtgt tgcttaggct ggcctccaac cgctaggctc 9360

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agccacaagt tccccctttt tataaggaca tcatttatat tggcttagtg cccactgtaa 9480

tgatttcatc ttaacttgat aatctataaa gagcctgttc ccagtaaggt cacattcaca 9540

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aaattttgaa aggtgaaagg aggaggaacc tttaaagtta gacatgtgcc ctcacccctc 9720

gctctgagac agagttttgc tctgtcaccc aggctggagt gcagtggcac agtctcagct 9780

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gggatttcag gtacccacca ccacacctgg ctaatgtttg tgtttttagt agagacggag 9900

tttcaccatg ttggccaggc tagtctcgaa cttctgacct caggtcatct gcctgccttg 9960

gcctcccgaa gtgctgggat tacatgcgtg agccaccatg cctggccaaa gttagatgtg 10020

ttaatgagag ctagaagtta ggggtcaagt acaggcatgg gagtggcaca gcagattgga 10080

tcggtgtgtg ctggtgacct ggacccacta tcattacacg gcgctacagc agtttgtttg 10140

taatgagtgt tctttgatta ctttggacag agttcataca caggcacacc tacacacagg 10200

tcacttagaa gaagttaagg agtcttttta aatacacata aaaacatcac atactaagcc 10260

aggcatggtg gtgtacccct gtaatgccag ctactgggga ggctgaggta ggagattcct 10320

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catccccacg cgctcttcct ctcatctggt gagagtttct tggagaacat gccaaactca 10560

tgtatggttg tgtgcgtatt tgagaactcc tcgtgttgag atggagctgt tttttggaag 10620

tatctcattt tttttgagat ggagtctcac tctgtcgccc agctggagtg cagtggcgtg 10680

atctcggctc actgcaacct gtacctcccg ggttcaagtg attctcctgc cttagcctcc 10740

caagtagcgg ggattacaga catgtgccac cgcgcccggc taattttgta tttttatgag 10800

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tttctactga aaattatcct ggctagtgag gatgggtgcc atgttagtga tctgcgattc 10980

ttttgtgctg tttttcagta catacttggt cgtttcagga cctttgtttc ctctgacgtc 11040

ctcccttaaa tagggagagg aaatggttcc tggaaacggt cattttgaga attttctgtg 11100

ctgtgagaac tgaggctctg gctacccctc taaaaggctt gagccatgct gtaagagttt 11160

gtgggcagtg tttctgtggt gtttcctccc ttgtattttg tggtgttggt ccccctaaca 11220

ggtctttgta tagtgtttgg ttcacattgt tggcatgaca gtcacctgag caagacgttg 11280

cctgagtcct ttgtcagttt gggttttcgc atcatctgtt tccagtggga ttttggtccc 11340

tggtcaactt gtggacaact ccagagattg agatagttgc cgtatcctta gtgctcccag 11400

ggggagatgt tctgggactg taggtgcaag atgtaggaag agtgatttaa acttgaggct 11460

gcaggcagac ctgatactgt gttgggcttt gacaggttta gggaatacca gtatttatag 11520

gcagtatgat agtgtagggg gacagtgagg tggaaggtgt gatggtggag gaaagatgaa 11580

tcggccatct gcgagtaggg ctcagaaaag agcctggagc ctgctgctgt tctggtggtt 11640

tcttccctga gcaatgagga ctgtggttgg gaagaggccc attcctcctg acgccagagt 11700

tcctcatctc atgttggctc ttttgtattt gaaatagaat aatttgattg cagtgtattg 11760

tggattcttt gacttcgata gatttttgta acttttggga aacagattac tctaaccaga 11820

cctgggaagt agctagaaat tatacttgta ataaaaaaca attatatggg aagctgaaaa 11880

tggtggtgtt catttaacaa atatggcgtg cctgctgttt agtgccaggc actattctag 11940

gtgctggttt ggcagtggag agaaacactg aagccctgtt ctcagggcgt gcacttcagg 12000

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cagttaggtt atttgctact tctgaaaatg tgagttgtaa taaatgagtg cctggttttg 12120

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tttgttccag cttttctgtg cacttgggga attgacagtg ggtcctgaaa tcatgacagc 12360

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gagatgaacg tggttggtgg gaatcccttc gcttcgttgt gaagctgttc ctgttccatc 12480

aggttctcat gcttggtaaa gctcagagaa aatgtgtggg tttaaaacat gttctccact 12540

tcctcagtgt tcttcaagtt tgtatgtggg taaatgtttg ttacatgtgt tttgtggtca 12600

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ttagatagtc agtttagtat cttgttaatg ttatgggccc cttaatgcat tggtcttagt 12720

attcctcagg gaatagcatg atattgcaaa attttaaaga agctcttgct atacgatgcc 12780

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aacatgtgtc caagtggtca gggtgcagct tggtttatac attataggga ggcatgagac 12960

atcaatcaga tcataacctg taatccctgc actttgggag gctgaggcgg atggatcgct 13020

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taaaaaaatt agccaggcgg ggtggcaggc acctgtaatc ccagctactt gggaggctga 13140

ggcaggagaa ctgcttgacc tgggaggcag aggttgcagt gagccaagat cgcgccacta 13200

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ggtgaatgaa aacattttct ggttgacaat tggttgagtt tgtctaaaga cctgggatca 13380

tagaaaaaaa atgttcaggt taagataaaa gatcgtggag atgaaggttc ctttgaagtc 13440

tcatagtggc tgcccttaga gacaatagat gacaaatgtt tccttttcag acctttaaca 13500

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ccatgttaat aagactgttc acagatgcac atttccccca caaaggatgg ctttgcagga 13620

caatttcaaa tggtttgtag ggcatgactc cccagacccc ttaggtagga atttgggcaa 13680

gataaaaaat cagaactcag tcctcaagag ttaaatccta atgctgtttc aagtaatgtt 13740

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gaaacgtgta ttacaaggaa ggtgctcacg actctaaccc tcaccactgt ggaagctagc 13920

cagtaaaatc tgtcaggact ggagcagtct cctcccccgg ggtgggatgg tgtggggtgg 13980

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taccagtctc ctgatccaaa tgctaatctc atccagaatc acccagaagg atgttcggct 14100

caatatttgg gaactctgtg catggcccag ttaacctgaa catgaaatca accacatgtc 14160

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gagggcaaga acaaggtcat agccacctaa cacgatccac tatcccacag acaaccaaca 14280

gtgcactagc cccttgccca gcgcaggtca cgttctcctg tgatgtttac ggttctcctt 14340

gatacggggt aacttaatag gcaatatgtg tgtattacat aagaggataa gagagggaag 14400

aaaactgcta tgtgcctaaa tataacatgc atagattata tatgacaagt attggtcaca 14460

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tggttgtggt tctttctggt gaggtaaagt aaaaaagaag ttggtagcac atttgattaa 14640

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gttgtagcgt gcgctgtata gttgtgatgc ccacaggctt ccttgcattt ctctccagct 14940

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taaatattat aaattttgaa attattttaa tgtttcttag cactgtttct gttacaaatg 15300

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gactgtggaa tgtgggcagt aacttgcaca gtcagtaacc gtttgagtaa cttcttgttg 16920

gcatccccat tctggcactc ctcctctagg tctccacctc acacgctggt ttgtgggcgg 16980

aggggcaggt tggtgcgtgg ggtgtccggg cactggctgt gcatgccttc ttcctcttct 17040

gtctcttggc caccttttcc aaaaagtcac cagtgaccaa ttctcccagt gtttctttgg 17100

gactcaatgc cttgggcttg gcattgggta aagccaactg gccagtttca ttctgacgag 17160

ctctatagta gtccggtgtg gacctctgcc ctccctgctc tgcggaagct tcctcagcct 17220

ttgcttctca ctatttacta tttgcgggtc ctgggggtac ccagcgtctc agggttttgg 17280

ctgcccacct gtacgtcggt cctttcaaac tgtggtcaga gtcaacctca ggtgctgctt 17340

ttctctagtc actgcatttt ttttttttag tagagacaaa gtcttgctgt gttgtccagc 17400

ctggattcaa actcctgagc tcaaggaatc ctcccactca gcctccagag tagctggatc 17460

aagtcactct tgttcataac ctcagttgct tcatgaatct cgatttctgc ttgatttcag 17520

tgcttgctgt tgtatccttg tgtgctgcag tatttattgt taacatttgt gactcaaatg 17580

tatccactcc ctgctttggt tgctctggcc tgcaagtagg ccgtactaat tctgtagttg 17640

gtcctagctt gcctttgtct ttaccttgca tgcgtttatg tcttaatgca cctattagga 17700

ttccttgctt ttatcacagg tttcccattt ttctgaaaaa attacagtaa ttattaacgc 17760

agaacccagg taaattaaaa aggtttgtat gctttatgaa tttttagtaa gtactcattg 17820

attgataaca gcaacagagg aaaacaaaac ggtcagttcc gatcttgatt tccaggagca 17880

ctttgtgttt ccacttggca gcgtgatgct tcctcatgtc ggtgattttc tgttgagaca 17940

tcttcaagca tcatcttacg tctgcttgtt aacatttgtt cagatttgat ttcagctaat 18000

ccttaaaagt tttttgagac atcaaactta gaataaaagg aatttccttt gccgagattc 18060

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agaagaccct tttgaggact tctttgggaa tcgaaggggt ccccgaggaa gcagaagccg 18660

agggacgggg tcgtttttct ctgcgttcag tggatttccg tcttttggaa gtggattttc 18720

ttcttttgat acaggattta cttcatttgg gtcactaggt cacgggggcc tcacttcatt 18780

ctcttccacg tcatttggtg gtagtggcat gggcaacttc aaatcgatat caacttcaac 18840

taaaatggtt aatggcagaa aaatcactac aaagagaatt gtcgagaacg gtcaagaaag 18900

agtagaagtt gaagaagatg gccagttaaa gtccttaaca ataaatggtg tggccgacga 18960

cgatgccctc gctgaggagc gcatgcggag aggccagaac gccctgccag cccagcctgc 19020

cggcctccgc ccgccgaagc cgccccggcc tgcctcgctg ctgagacacg cgcctcactg 19080

tctctctgag gaggagggcg agcaggaccg acctcgggca cccgggccct gggaccccct 19140

cgcgtccgca gcaggattga aagaaggtgg caagaggaag aagcagaagc agagagagga 19200

gtcgaagaag aagaagtcga ccaaaggcaa tcactagacc ggacttgagg cacgcggtgc 19260

acccccagac gctggcgctc caccgtgctc ggcatgcggt cgtgcacacg cgctaggtag 19320

cagcgtcggt caggactgtc tcgaggccac actcgctcgg caggattatg cgatcacgga 19380

tcagtcagag cagggtcagg agacggggct gacggcacgg gtggcgggga cagacgtttg 19440

ggacttggcc gcgactctct gcttctctcc agctctcaat ctgctgcatt ttcctctagt 19500

gcttccggat cctcttcatt cttttcggct actcaaccac tccgcatgct gctggaatat 19560

ttctggcttt agaagtacag gagggcgcag atggctaact gagtaacatt catgaaatga 19620

ggctttctgt ggcggcgtag tgtttggaat tagaaggtaa ttcagtagag tgtaacttag 19680

agaatattgc aagtgacaca ttgaatcctg cccgtcaggg caccttttcc tcagagcaat 19740

ccggccacac gaatagaagg ctgtcgtgaa tcacatcaga tgtaaaatca ttccttctgt 19800

ttactctttt aattttcatc ctttgcaggt agtgcaaatt caacttcaaa tatggtgtag 19860

gttttgctag attccatatt tttttcttgg atttttgcta attattttta gcaaaaaatt 19920

tttgctcagt ggcactctcc ctagtgtcca tgggttaggg ccatgctggg gaaaacgggc 19980

cggtatttac acacgcgcaa aacacccaga gacggcacaa ggaggttgaa ctcatgtttc 20040

agttcgcgaa cattgactcc ttacgaaagt cacttcattc taactagatg cgcccacttc 20100

cggtcattat ttcgtttgca tgatgtattg cttcttcacg ttttgttttt attgagcacg 20160

gagtagaatt ccagggctgc cttgacttct tccctgcatg ctccctccca gtgactttcc 20220

ttccctttca catgaggatc tgccgttcat gttgctttct cctttgtcct cttggacttg 20280

agggcattgt gaaaagcttt gctgtgattt aaaaatgcca gcaattttaa tctagcagtg 20340

ttgaagctgg gaattttttg gcgcaatcca tgtagcagtg acccaggctt gggagccaga 20400

aacaagtgtg acctgggatt ttatttaaca caactgttgc caaagagttg gctttgttta 20460

tttggttttg gcggggagag gagtggtatt tgatgctttc tgtggacaat gtaaccctaa 20520

acacatcatg tattttaaat gccacctaca taaataaaac 20560

<210> 4

<211> 2401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtagcatct tagctgcttc cggccgctgg tcgcagggct gcgggactac aatcttcgca 60

tgaaatggaa gagagggtgg tgcggatagc ttgaggaagg tacggatacc ttgagggagg 120

tatggatacg ttgagggagg tacggatacg ttgagggagg ttacggatac gttaagggag 180

gtacagcagc ggtgcgcgcc ttgcagggca tgctgagagg aacagttttt taactgcttc 240

tggctgttgg tggcagagct gcgggactac aatcccagta tgctacggga gtggggatga 300

tgctggtccc ttgagggggg ggggcagcgc ggtgccctcc tgccgggcat gctggtaata 360

gtgtcttagc tgcttccggc cgttggtcgc agggctatgg gactacagtc tcagcatgcg 420

cagggttcaa gggtgttgcg cagccccgca gggaggggca gggcggtgtt gacctctgtt 480

tccaaaccca tgctggctac tgaatctgtg ccacccctgg ctaaggggag tgagtccata 540

gagggacttg aagggcaggt ctgggctggg cagtgaggag agtatgatac tgcaaagtgc 600

gcctcgcctt tgccaaaatc ggtcgggtct caggctcacc ccacctcccg ctgctcagtt 660

ccgtttccct ccagagcatc aagcctcctc ccgcccaggg ggcctcctgc tttcctaagc 720

tgctgtggaa tcggcctgag gtcccagacg ctgtccattg tgctgctgct ctctgctttc 780

tccagccaga gtgccagttc atccgctttt gggagaactc cgccgcctgg cctgcccgcg 840

gaaaaggtca cagctttgca gggggtgaca tgggctatgg cttcctggaa atgtcaccct 900

cactagcgcc ttttagatag atgtgaattt tgagacatga gggagagtaa ttattggttt 960

acccaggaga tgctaagagc agaggagaaa accctaattt ccaggcatgt gtcctgagcc 1020

agggacaggc tggccagacc ctaagccccc agtgccgcca gagagcagcc tactgccctg 1080

atttgtgtgg aatccccttc gtgctgctgg gccttagcgt cagggacagc ccagtcaggt 1140

gaaggtgggg atgacccatg ggcttctgga agtgggttgg tggtcctggg agggccagcc 1200

catcccccct tggagagggt ctttgtgctg aaggatgccc acagaggcct gggtaccagg 1260

aacactgctc taggcaaggt gcctttcttc cagatttggc tgaaaggaag gaagacttgg 1320

tcagcttttc cacccagcca tctggccctt acagggctgc tccccatgga cctgggtttg 1380

tagagtcctc cagggctttg tgtggcccac tagttctgat actgaggaca cccctgcagg 1440

ctgttaattt cagaacaagg ggtgtgtgca gactggggca tgggtgctgt cagggtaccc 1500

caggctgctc cagggacggt accccagtgt tcaacttggc ttggggcccc ctgcctcatg 1560

cccttactcc agggctgctt ggcctgggct tgagccatgg tccagaactc aggtggcccc 1620

attgccacct aatataaggg cctgtctcca cagtgggtga gacgcccctg ggcactgggc 1680

tcttcagtca tccagggcta tccactccat ggcatgagtt cccacattca gctgaactct 1740

gtctggctct ggactggggt ccctcctgtg ccctttccct gaatcctctc tgggtccgag 1800

acactgatcc tcttcactct ctggcttaag gcttgttctc ctgacctcct tggaggggtg 1860

ctcaggattg aggacccctg ctgttctctg gggctgttgg tactcggagg tgtgggtgtt 1920

ggcttgcact gagaagtcca accccttcag tgcccttcag gggtccttta agagcaggag 1980

tgatagggtg tgggggagtg ccttagaggg gtcttgccct catcccctgc cctgtctctg 2040

agacgtgtcc agtaaacctg aggtcagcac ctcaggaatg aaataatgtc ttttgcagca 2100

acttgaatga agctggaggc cattattcca agtgaaataa ctcaggaatt aaaaatcaaa 2160

tgccatatgt tctcacttat aagttggagc taagccatgc gtatgcaaag gcatgcgggg 2220

tgacataatg gactttggag actcagacat gagggtggca ggtggatgaa ggatgaaaaa 2280

actacctgtt gagtacaata tatactactc aggtgacaag tgcactaaaa tctcagaatc 2340

caacactata taattcattc atgtaaccaa aaaccacttg tacccaaatg atattgacat 2400

t 2401

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttctcatgc tccgtgatgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

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<400> 6

tgcccgggaa gtatgtagac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

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<400> 7

ggactacaga gccccgaatt 20

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 8

caattctccc tgcgtcatgg 20

<210> 9

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<212> DNA

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<400> 9

gcggctgtct aggttttagc 20

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agaggcctgc tgtcatgatt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgagccatg gtccagaact 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaggattca gggaaagggc 20

Claims (2)

1.一种检测食管癌的分子标志物的引物对在制备检测食管癌试剂盒中的应用，其特征在于：所述分子标志物的基因序列为SEQ ID NO.3；所述引物对为：上游 引物：5'-gcggctgtctaggttttagc -3'、下游引物：5'-agaggcctgctgtcatgatt -3'；所述检测食管癌试剂盒，其检测样本为人血液样本。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测食管癌试剂盒，其检测过程为：从待检血液样本中提取RNA；进行逆转录至cDNA；通过qPCR法进行检测。

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