KR102384933B1

KR102384933B1 - 암의 진단용 조성물

Info

Publication number: KR102384933B1
Application number: KR1020200178915A
Authority: KR
Inventors: 이형근; 이동기; 장성일; 김소영; 여아름
Original assignee: (주)아큐레시스바이오
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-04-11
Also published as: KR20210078438A; KR20220045945A

Abstract

본 발명은 암, 특히 췌장암 등을 진단할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 췌장암을 예방 또는 치료할 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

암의 진단용 조성물{Composition for diagnosing cancer}

본 발명은 암, 특히 췌장암 등을 진단할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

현대인의 주요 질환 중에서, 암의 치료방법과 진단방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등을 중심으로 비교적 활발히 진행되고 있다. 그러나, 발병빈도가 낮은 식도암, 대장암, 췌장암 등에 대한 연구는 상대적으로 저조한 실정이다.

특히, 췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않으며, 이미 전신전이가 일어난 후에 통증과 체중감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서, 더욱 치유율이 낮은 편이므로 정기적인 진단이 매우 중요하다. 임상증세는 대부분이 서서히 발병하고, 허약해지기 쉬우며, 식욕감퇴, 체중감소는 가장 흔한 증세이다. 췌장암은 5년 생존율이 1-4%, 중앙생존기간 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 또한, 80-90% 환자에서 진단시 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 불량하고 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로, 그 어떤 인체 암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다.

현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실, 젬시타빈(gemcitabine), 타르세바(tarceva)를 포함한 몇 가지 항암제의 치료 효과는 지극히 저조하며, 항암치료에 대한 반응율은 15% 내외에 불과하고 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있음을 시사한다. 치명적인 췌장암으로 진행되기 전단계인 췌장암의 전구병변에 대한 적절한 진단과 치료가 췌장암 치료 성적 향상에 매우 중요하다.

췌장암 또는 췌장암 전구병변의 진단은 혈액검사(CA19-9), 위, 십이지장의 X선 조영검사, 피부 및 간을 통한 담도촬영과 역행성 내시경 담도촬영술 사용되고 있다. 이들 방법에 의해 질병의 병변을 발견하였으나, 최근에 초음파촬영 및 전산화 단층촬영이 가장 많이 사용된다. 보다 정밀한 조직검사를 수행하여 비교적 정확한 검사결과를 얻을 수도 있다. 그러나, 상기 진단방법은 정확도가 떨어지거나, 환자에게 고통이 따르는 등 그 수행방법이 매우 불편하여 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고 신속하게 췌장암 또는 췌장암 전구병변을 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되어 왔다.

대한민국 특허 제 10-0819122호 및 대한민국 공개특허 제 2012-0082372호에는, 마트릴린(matrilin), 트랜스티레틴(transthyretin), 스트라티핀(stratifin) 등을 포함하는 다양한 췌장암 마커를 이용한 기술을 개시하고 있지만, 마커마다 그 진단 효율 및 정확성에서 큰 차이를 나타내므로, 효과가 더 우수한 마커를 발굴하고 이를 이용한 진단방법을 개발할 필요성이 있다.

본 발명의 일 목적은 췌장암을 간편하고 정확하게 진단할 수 있는 조성물 또는 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 췌장암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 췌장암을 예방 또는 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 췌장암을 진단하기 위한 장치를 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, CSF1R, CXCL16, TNFRSF1B, CX3CR1, CSF3R, TNFRSF14, TNFSF13B, TNF,PPBP, TNFSF10, FLT3LG, TNFRSF8, IL10RA, CKLF, IL12RB1, CXCL10, LTBR, PF4, CD40, IFNGR1, IFNAR1, IL2RG, IL1B, IL15, CD27, EBI3, RETN, IL7R, CCR2, IL16, IL21R, IL2RB, CCR5, IFNAR2, XCL2, IL32, TGFB1, IFNGR2, IL13RA1, CCL3, CD4, TNFSF4, EPOR, TNFRSF17, IL3RA, MIF, CXCR4, TNFRSF18, CMTM6, CMTM7, TNFSF12, IL23A, TGFB3, XCL1, IL27, CXCL3, CCL5, CCL4L2, IL7, HGF, KIT, CD40LG, IL6ST, IL6R, CD70, MST1, CXCL2, TNFSF14, FLT3, IL1R2, TGFBR2, IL6, LIF, CXCR6, CXCL1, CCR7, CXCL11, GDF15, IL1RN, TNFRSF4, CSF1, IL11RA, TNFSF8, IL15RA, CCL2, TNFRSF10A, CXCL8, CCL8, FAS, CCR4, CCL23, ACKR3, TNFSF18, LTA, CCR10, CLCF1, CCL4, IL9R, TGFBR1, TNFRSF10B, CSF2RB, TGFA, CXCL9, TNFRSF1A, OSM, IL4R, PF4V1, PDGFB, CCL20, IL12RB2, CCL25, TGFBR3, IL17RA, IL2RA, TNFRSF10C, CXCR3, IL20RB, CXCL5, IL5RA, CXCR5, TNFRSF11A, IL24, SPP1, CCL22, CCR9, CCL26, CX3CL1, CXCL12, CMTM1, TNFRSF10D, CCR3, CXCR1, CCL3L3, CXCR2, IFNL1, IL18R1, TNFSF15, CCR1, TNFRSF13B, TNFSF13, IL18, FASLG, IFNG, PDGFRB, TNFRSF25, XCR1, IL1R1, TNFRSF9, IL12A, CSF2RA, IL17C, IL2, IL26, IL4, PDGFA, TNFSF11, TNFSF9, CCR6, CCL19, MST1R, TNFRSF11B, IL23R, PDGFRA, CXCL13,EGF, 및 IL13으로 이루어진 군에서 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 췌장암의 진단용 바이오마커, 상기의 군에서 선택된 1종 이상의 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 췌장암의 진단용 조성물; 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand, FLT3LG); 인터루킨-7 수용체(interleukin-7 receptor, IL-7R(IL7R))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 췌장암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "CD27"은 종양 괴사 인자 수용체 패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily)에 속하며, T 세포 면역의 발생 및 장기간 유지와 관련되어 있다. 본 발명에서 상기 CD27은 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand, FLT3LG)"은 FLT3LG 유전자에 의해 코딩되는 것으로, 조혈의 4가지 나선형 번들 사이토카인에 해당한다. 이는 구조적으로 줄기 세포 인자(stem cell factor, SCF) 또는 콜로니 자극 인자 1(colony stimulating factor 1, CSF-1)과 유사하다. 본 발명에서 상기 fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드는 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "인터루킨-7 수용체(interleukin-7 receptor, IL-7R(IL7R))"는 나이브 및 메모리 T 세포 표면에서 발현되는 것으로, 인터루킨-7 수용체-α(CD127) 및 공통-γ 체인 수용체(CD132)의 두 서브유닛으로 구성된다. 본 발명에서 상기 인터루킨-7 수용체는 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 바이오마커 조성물은 인터루킨-32(interleukin-32, IL-32(IL32)) 및 인터루킨-10RA(interleukin-10 receptor alpha, IL-10RA(IL10RA))에서 선택된 1종 이상의 단백질을 더 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 바이오마커 조성물은 예를 들어, 인터루킨-7 수용체(IL-7R) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 및 인터루킨-10RA(IL-10RA) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 조합일 수 있고; 예를 들어, 인터루킨-7 수용체(IL-7R) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 및 인터루킨-10RA(IL-10RA) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 조합일 수 있다.

본 발명에서, 상기 바이오마커 조성물은 개체로부터 유래된 생물학적 시료로부터 수득할 수 있는 것이며, 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질로, 예를 들어, 액체 생검을 의미하며, 예를 들면 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 예를 들어, 상기 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 분리된 단핵구, 특히는 말초혈액 단핵세포(PBMC)일 수 있다.

본 발명에서 상기 "인터루킨-32(interleukin-32, IL-32(IL32))"는 종양 괴사 인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) 또는 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 등과 같은 염증성 사이토카인의 발현을 위해 면역 시스템의 세포를 유도하기 위한 전-염증성 사이토카인에 해당한다. 본 발명에서 상기 인터루킨-32는 서열번호 4로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "인터루킨-10RA(interleukin-10 receptor alpha, IL-10RA(IL10RA))"는 염증성 사이토카인 중 하나로서, 통증과 밀접한 관련성이 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 인터루킨-10RA의 서열정보는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/와 같은 기 공개된 데이터베이스로부터 수득할 수 있다.

본 발명에서 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand, FLT3LG); 또는 인터루킨-7 수용체(interleukin-7 receptor, IL-7R(IL7R))는 개체, 즉 췌장암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체의 생물학적 시료로 액체 생검(liquid biopsy), 예를 들어, 혈액, 혈청 또는 혈장, 예를 들어, 상기 혈액, 혈청 또는 혈장 유래 단핵구, 특히는 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 발현되는 것을 측정할 수 있다.

본 발명에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 췌장암의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)이나, 상기한 췌장암의 병기 또는 분화도, 또는 췌장암 환자의 생존율이나 치료 반응성을 확인하는 것이다.

본 발명에서 상기 "병기(stage)"란 암세포가 퍼진 정도, 암의 진행 단계를 의미하는 것으로, 췌장암의 진행 상황에 따른 국제적 분류는 일반적으로 TNM 병기 분류에 따른다. 여기서 'T(Tumor Size)'는 원발 종양의 크기에 따른 분류이고, 'N(Lymph Node)'은 림프절 전이 정도에 따른 분류이며, 'M(Metastasis)'은 다른 장기로의 전이 여부에 따른 분류에 해당한다. T, N, M에 있어서 상세 분류는 하기 표 1과 같으며 이에 따른 췌장암의 병기 분류는 하기 표 2와 같다.

[표 1]

[표 2]

본 발명에서 상기 "암의 분화도(grade)"란 암 세포의 성숙도 또는 분화한 정도를 나타내는 것으로, 그 분화 정도에 따라 하기 표 3와 같이 Grade 1, Grade 2 및 Grade 3으로 분류 가능하며, 이때 Grade 3의 저분화성 암이 Grade 2 또는 1의 고분화성 또는 중분화성 암에 비하여 종양의 경계가 불분명하므로 전이가 빠르고, 치료 효과가 미비하며, 치료 후에도 예후가 좋지 않게 나타나는 문제점이 있다(Histopathology. 2002 Sep;41(3A):154-61, Nat Genet. 2008 May;40(5):499-507 등).

[표 3]

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암의 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 췌장암의 진단용 조성물은 인터루킨-32(IL-32) 및 인터루킨-10RA(IL-10RA)에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 췌장암의 진단용 조성물은 예를 들어, 인터루킨-7 수용체(IL-7R) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제, 및 인터루킨-10RA(IL-10RA) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 조합일 수 있고; 예를 들어, 인터루킨-7 수용체(IL-7R) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제, 및 인터루킨-10RA(IL-10RA) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 조합일 수 있다.

본 발명에서, 상기 췌장암 진단용 조성물은 개체로부터 유래된 생물학적 시료를 대상으로 하는 것이며, 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질로, 예를 들어, 액체 생검을 의미하며, 예를 들면 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 예를 들어, 상기 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 분리된 단핵구, 특히는 말초혈액 단핵세포(PBMC)일 수 있다.

본 발명에서 상기 CD27, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-7 수용체(IL-7R), 인터루킨-10RA(IL-10RA) 또는 인터루킨-32(IL-32) 단백질 등의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein(1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O(December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 CD27, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-7 수용체(IL-7R), 인터루킨-10RA(IL-10RA) 또는 인터루킨-32(IL-32) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 예를 들어, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.

본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 예를 들어, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 예를 들어, PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy(2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.

본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 상기 CD27, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-7 수용체(IL-7R), 인터루킨-10RA(IL-10RA) 또는 인터루킨-32(IL-32) 단백질이나, 이를 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

본 발명에서 상기 CD27, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-7 수용체(IL-7R), 인터루킨-10RA(IL-10RA) 및 인터루킨-32(IL-32)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은, 개체에서 분리된 생물학적 시료로 액체 생검, 예를 들어, 혈액, 혈청 또는 혈장, 예를 들어, 상기 혈액, 혈청 또는 혈장 유래 단핵구, 특히는 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 대하여 측정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 췌장암의 진단용 조성물을 포함하는 췌장암의 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 진단용 키트를 이용하여 췌장암의 발병 여부 또는 발병 가능성을 예측할 수 있고, 더 나아가서는 상기 췌장암의 경과, 예후 또는 치료 효과에 대하여도 진단할 수 있다.

본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 예를 들어, 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "개체"란 췌장암의 발병 여부가 불확실한 개체로, 췌장암의 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질로, 예를 들어, 액체 생검을 의미하며, 예를 들면 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 예를 들어, 상기 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 분리된 단핵구, 특히는 말초혈액 단핵세포(PBMC)일 수 있다.

종전에는 췌장 질환의 진단을 위하여 바이오마커의 발현 수준을 측정하기 위하여서는 주로 질환의 발생이 예측되는 조직(예를 들면, 췌장 조직)으로부터 세포를 분리한 뒤 상기 세포 내의 바이오마커의 발현 수준을 측정하여 왔다. 하지만, 본 발명에서는 개체로부터 분리된 액체 생검으로 예를 들면 혈액, 혈청 또는 혈장 내에 포함된 단핵구, 특히는 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 대하여 본 발명에 따른 질환 바이오마커의 발현 수준을 측정함으로써 암, 특히는 췌장암의 발병 여부와 발병 가능성을 간단하고 신속하지만 매우 정확하게 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 인터루킨-32(IL-32) 및 인터루킨-10RA(IL-10RA)에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 CD27, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-7 수용체(IL-7R), 인터루킨-10RA(IL-10RA) 또는 인터루킨-32(IL-32) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들어, 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 상기 CD27, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-7 수용체(IL-7R), 인터루킨-10RA(IL-10RA) 또는 인터루킨-32(IL-32) 단백질의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 CD27, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-7 수용체(IL-7R), 인터루킨-10RA(IL-10RA) 또는 인터루킨-32(IL-32) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 상기 CD27, fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG), 인터루킨-7 수용체(IL-7R), 인터루킨-10RA(IL-10RA) 또는 인터루킨-32(IL-32) 단백질을 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 췌장암이 발병하였거나 췌장암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 인터루킨-32(IL-32) 및 인터루킨-10RA(IL-10RA)에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 췌장암이 발병하였거나 췌장암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 측정된 단백질 또는 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 1.2 내지 20배(fold) 이상, 예를 들어, 1.2배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 또는 8배 이상인 경우, 췌장암의 발명 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)의 발현 수준을 하기 식 1에 대입하여 얻어진 LP 값을 하기 식 2에 대입함으로써 췌장암의 발병 가능성을 예측하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다:

[식 1]

LP = A - B X (IL-7R) - C X (FLT3LG) - D X (CD27)

[식 2]

췌장암 발병 확률 = 1 / (1+exp(-LP))

상기 식 1에서,

A는 3 내지 4의 값; B는 0.5 내지 1.5의 값; C는 0.1 내지 0.7의 값; 및 D는 0 초과 0.4 이하 값이며,

IL-7R은 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 IL-7R 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값이고; FLT3LG는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 FLT3LG 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값이며; 및 CD27은 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 CD27 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값일 수 있다.

본 발명에서 상기 식 1에서, 상기 A는 3 내지 4의 값이고, 예를 들어, 3.5 내지 4의 값이며, 예를 들어, 3.7 내지 4.0의 값이고, 예를 들어, 3.8688일 수 있다.

본 발명에서 상기 식 1에서, 상기 B는 0.5 내지 1.5의 값이고, 예를 들어, 0.8 내지 1.3의 값이며, 예를 들어, 0.9 내지 1.1의 값이고, 예를 들어, 1.0342일 수 있다.

본 발명에서 상기 식 1에서, 상기 C는 0.1 내지 0.7의 값이고, 예를 들어, 0.1 내지 0.5의 값이며, 예를 들어, 0.2 내지 0.4의 값이고, 예를 들어, 0.3365일 수 있다.

본 발명에서 상기 식 1에서, 상기 D는 0 초과 0.4 이하의 값이고, 예를 들어, 0.01 내지 0.3의 값이며, 예를 들어, 0.02 내지 0.1의 값이고, 가장 예를 들어, 0.0526일 수 있다.

본 발명에서 상기 식 1에서, 상기 IL-7R은 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 표준화 하우스 키핑(housekeeping) 단백질 또는 유전자에 대한 IL-7R 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값인 △Ct 값일 수 있다.

본 발명에서 상기 식 1에서, 상기 FLT3LG는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 표준화 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 FLT3LG 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값인 △Ct 값일 수 있다.

본 발명에서 상기 식 1에서, 상기 CD27은 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 표준화 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 CD27 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값인 △Ct 값일 수 있다.

여기서 상기 표준화 하우스 키핑 단백질 또는 유전자로는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), CypI(Cyclophilin I), 알부민, 액틴(actin), 튜뷸린(tubulin), HPRT(cyclophilin hypoxantine phosphoribosyltransferase), L32, 28S 또는 18S 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 식 1에서 얻어진 LP 값을 상기 식 2에 대입하여 췌장암 발병 확률을 예측 또는 판정할 수 있다.

본 발명에서 상기 식 2에서 얻어지는 값은 0 내지 1의 이며, 1에 근접할수록 췌장암 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 식 2에서 얻어지는 상기 값이 0.5 이상 1 이하, 0.55 이상 1 이하, 0.6 이상 1 이하, 0.65 이상 1 이하, 0.7 이상 1 이하, 0.75 이상 1 이하, 0.8 이상 1 이하, 0.85 이상 1 이하, 0.9 이상 1 이하, 또는 0.95 이상 1 이하인 경우 췌장암 발병 가능성이 높거나 췌장암이 발병한 것으로 예측할 수 있다.

더 나아가, 본 발명에서 상기와 같이 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 췌장암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측 또는 진단하는 경우, 상기 개체에 대하여 그 질환에 대한 약제 투여(췌장암에 대한 항암제 등), 유전자 치료, 방사선 치료 또는 면역 치료 등 적절한 치료를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 포함하는 데이터에 대하여 췌장암 진단 정보를 판정하는 진단부를 포함하는, 췌장암 진단 장치에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 췌장암 진단 장치의 구조를 개략적으로 도시한 것이다.

본 발명의 췌장암 진단 장치는 개체의 생물학적 시료를 수용하는 시료 수용부(100)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질로, 예를 들어, 액체 생검을 의미하며, 예를 들면 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 예를 들어, 상기 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 분리된 단핵구, 특히는 말초혈액 단핵세포(PBMC)일 수 있다.

본 발명의 췌장암 진단 장치는 상기 시료 수용부에 수용된 생물학적 시료에 대하여 측정된 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준(진단 대상 데이터)을 입력하는 입력부(200)를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 입력부(200)에서는 상기 진단 대상 데이터로, 예를 들어, 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 표준화 하우스 키핑(housekeeping) 단백질 또는 유전자에 대한 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값인 △Ct 값을 입력할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 입력부(200)에서 진단 대상 데이터에 대해 정렬, 정규화 및/또는 스케일링과 같은 전처리 과정을 거치게 하거나, 미리 전처리 과정을 마친 진단대상 데이터를 입력부에 입력할 수 있다.

본 발명에서는 상기 입력부(200)에 개체 한 명에 대해서도 여러 개의 진단 대상 데이터를 입력할 수 있다.

본 발명의 췌장암 진단 장치 중 특히 상기 입력부(200)에 있어서, 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 입력하기 위하여 상기 발현 수준을 측정하는 제제 및 그 방법은 상기 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법에 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 방지하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.

본 발명의 췌장암 진단 장치는 상기 입력부(200)에서 입력된 진단 대상 데이터에 대하여 췌장암 진단 정보를 판정하는 진단부(300)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 진단부(300)는 진단 대상 데이터에 대하여 췌장암의 발병 가능성 또는 췌장암의 발병 여부로, 췌장암 양성 또는 음성을 판정할 수 있다.

본 발명에서 상기 진단부(300)는 상기 입력부(200)에 입력된 진단 대상 데이터로, 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 췌장암의 발병 가능성이 높거나, 췌장암 양성으로 판정할 수 있다.

본 발명에서 상기 진단부(300)는 상기 입력부(200)에 입력된 진단 대상 데이터로, 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)의 발현 수준을 하기 식 1에 대입하여 얻어진 LP 값을 하기 식 2에 대입함으로써 췌장암의 발병 확률을 판정할 수 있다:

[식 1]

LP = A - B X (IL-7R) - C X (FLT3LG) - D X (CD27)

[식 2]

췌장암 발병 확률 = 1 / (1+exp(-LP))

상기 식 1에서,

본 발명에서 상기 식 1에서 얻어진 LP 값을 상기 식 2에 대입하여 췌장암 발병 확률을 예측 또는 판정할 수 있다. 본 발명에서 상기 식 2에서 얻어지는 값은 0 내지 1이며, 1에 근접할수록 췌장암 발병 가능성이 높은 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에서 상기 식 2에서 얻어지는 상기 값이 0.5 이상 1 이하, 0.55 이상 1 이하, 0.6 이상 1 이하, 0.65 이상 1 이하, 0.7 이상 1 이하, 0.75 이상 1 이하, 0.8 이상 1 이하, 0.85 이상 1 이하, 0.9 이상 1 이하, 또는 0.95 이상 1 이하인 경우 췌장암 발병 가능성이 높거나 췌장암 양성으로 판정할 수 있다.

본 발명의 췌장암 진단 장치는 상기 진단부(300)의 진단 결과를 출력하는 출력부(400)를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 출력부(400)는 디스플레이 또는 스피커 등의 출력 수단으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 췌장암 진단 장치는 컴퓨터 시스템 상에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 분리된 생물학적 시료에 췌장암을 유도할 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보 물질이 처리된 생물학적 시료에서 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 췌장암을 유도하는 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 분리된 생물학적 시료는 췌장암이 유발되었거나 유발되지 않은 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 구체적으로는 상기 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질로, 예를 들어, 액체 생검을 의미하며, 예를 들면 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 보다 예를 들어, 상기 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 분리된 단핵구, 특히는 말초혈액 단핵세포(PBMC)일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 후보 물질은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩타이드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 인터루킨-32(IL-32) 단백질 및 인터루킨-10RA(IL-10RA)에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 후보 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료에서 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이, 상기 후보 물질의 처리 전에 비하여 증가된 경우, 상기 후보 물질을 췌장암의 유발제로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 후보 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료에서 상기 인터루킨-32(IL-32) 및 인터루킨-10RA(IL-10RA)에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이, 상기 후보 물질의 처리 전에 비하여 증가된 경우, 상기 후보 물질을 췌장암의 유발제로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바이오마커 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법과, 췌장암 및 진단에 관한 정의는 상기 본 발명의 췌장암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 혼잡을 피하기 위해 이하 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 인터루킨-10RB(interleukin-10 receptor beta, IL-10RB(IL10RB))의 발현 또는 활성을 억제시키는 제제를 유효성분으로 포함하는, 췌장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 "인터루킨-10RB"는 "IL-10RB", "IL10RB", "IL-10R2", 및 "IL10R2"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 "예방"은 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 췌장암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 췌장암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서, 상기 발현 억제제는 인터루킨-10RB 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 이를 포함하는 벡터일 수 있다. 이러한 안티센스올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 활성 억제제는 인터루킨-10RB 단백질의 기능 저하, 바람직하게, 상기 단백질 기능의 탐지가 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하도록 하는 물질을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 활성 억제제는 인터루킨-10RB 단백질과 특이적으로 결합하는 항체; 인터루킨-10RB 단백질 내 특정 단편을 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 이를 포함하는 벡터 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 있어서, 상기 인터루킨-10RB의 발현 또는 활성을 억제시키는 제제는 예를 들어, IL-10RB 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있고, 예를 들어, IL-10RB 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist), 또는 이의 조합일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 내 IL-10RB의 발현 또는 활성을 억제시키는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 췌장암 세포의 성장 또는 증식을 감소시키거나, 췌장암 세포 주변의 임파선을 활성화시키는 것일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.01 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 5회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 그 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 따르면, 종래의 기술에 비해 비침습적인 방법으로 간단하고 신속하지만, 매우 정확하게 췌장암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 췌장암의 조기 진단을 가능하게 함으로써, 췌장암의 전구 병변에 대한 적절한 진단 및 치료에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 췌장암 진단 장치의 구조를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서, 정상 대조군과 췌장암 환자 유래 말초혈액 단핵구 세포에서 IL-7R의 발현 수준을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서, 정상 대조군과 췌장암 환자 유래 말초혈액 단핵구 세포에서 IL-32의 발현 수준을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서, 정상 대조군과 췌장암 환자 유래 말초혈액 단핵구 세포에서 FLT3LG의 발현 수준을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서, 정상 대조군과 췌장암 환자 유래 말초혈액 단핵구 세포에서 IL-10RA의 발현 수준을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 진단에 있어 IL-7R 바이오마커에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 진단에 있어 IL-32 바이오마커에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 진단에 있어 FLT3LG 바이오마커에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 진단에 있어 IL-10RA 바이오마커에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서, 정상 대조군과 췌장암 환자 유래 말초혈액 단핵구 세포에서 IL-7R의 발현 수준을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서, 정상 대조군과 췌장암 환자 유래 말초혈액 단핵구 세포에서 FLT3LG의 발현 수준을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서, 정상 대조군과 췌장암 환자 유래 말초혈액 단핵구 세포에서 CD27의 발현 수준을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 진단에 있어 IL-7R 바이오마커에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 진단에 있어 FLT3LG 바이오마커에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 진단에 있어 CD27 바이오마커에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 췌장암 동물모델을 이용한 췌장암 특이적 바이오마커의 효능 평가 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 17은 본 발명의 췌장암 동물모델에서, 시간의 경과에 따른 종양 조직 및 비장의 중량 변화를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에서, 정상 대조군과 췌장암 동물모델 유래 말초혈액 단핵구 세포에서 시간의 경과에 따른 IL-7R, IL-22R1, 또는 IL-10RB의 발현 수준의 변화를 나타낸 것이다.
도 19는 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종한 후 배양 1 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우 대비 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 20은 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종한 후 배양 2 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우 대비 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 21은 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종한 후 배양 3 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우 대비 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 22는 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종한 후 배양 2 일차에, FACS 분석에 의하여, IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우 대비 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 23은 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종한 후 배양 3 일차에, FACS 분석에 의하여, IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우 대비 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 24는 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(R&D)를 추가 접종하여, 배양 1 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 25는 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(Novus)를 추가 접종하여, 배양 1 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 26은 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(R&D)를 추가 접종하여, 배양 2 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 27은 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(Novus)를 추가 접종하여, 배양 2 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 28은 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(R&D)를 추가 접종하여, 배양 3 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 29는 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(Novus)를 추가 접종하여, 배양 3 일차에, CCK-8 검정 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 30은 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(R&D)를 추가 접종하여, 배양 2 일차에, FACS 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 31는 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(Novus)를 추가 접종하여, 배양 2 일차에, FACS 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 32는 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(R&D)를 추가 접종하여, 배양 3 일차에, FACS 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 33은 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종하고, 일부 실험군에 항-IL-10RB 억제 항체(Novus)를 추가 접종하여, 배양 3 일차에, FACS 분석에 의하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.
도 34는 IL-22 KO 마우스에서 분리한 PBMC의 IL-10RB 발현 수준의 변화를 분석한 그래프이다.
도 35는 IL-22 KO 마우스에서 분리한 췌장암 세포에 침윤된 PBMC의 IL-10RB 발현 수준의 변화를 분석한 그래프이다.
도 36은 IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)에서 분리한 PBMC 중, CD11b로 염색된 세포들 중에서 IL-10RB⁺PBMC 세포 수를 비교한, FACS 분석 결과이다.
도 37은 IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)에 췌장암 세포을 주입한 후, 각 마우스로부터 분리한 PBMC 중, CD11b로 염색된 세포들 중에서 IL-10RB⁺PBMC 세포 수를 비교한, FACS 분석 결과이다.
도 38은 IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)에 췌장암 세포을 주입한 후, 각 마우스로부터 얻어진 췌장암 세포의 크기 변화를 나타내는 이미지이다.
도 39는 IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)에 췌장암 세포을 주입한 후, 각 마우스로부터 얻어진 췌장암 세포의 중량(g) 변화를 나타내는 그래프이다.
도 40은 IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)에 췌장암 세포을 주입한 후, 췌장암 세포 주변의 임파선의 크기 변화를 나타내는 그래프이다.
도 41은 IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)에 췌장암 세포을 주입한 후, 췌장암 세포 주변의 임파선의 회복 정도를 파악할 수 있는, 임파선의 상태를 나타내는 이미지이다.
도 42는 IL-10RB(IL10RB), IL-22R1, TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-6, 또는 IL-22 단백질을 억제시키는 경우의, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석한 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실험예 1] 췌장암 특이적 바이오마커의 확인(1)

1. scRNA-seq 실험

FACS Aria III 유세포 분석기(BD Biosciences)를 이용하여 췌관 선암종(Pancreatic Ductal Adeno Carcinoma, PDAC) 환자의 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMCs)로부터 IL-10RB⁺세포를 농축(enrich) 하였다. 세포의 수를 측정하고 세포 사멸율을 확인하기 위하여, 분리된 세포를 트리판 블루(Trypan blue)로 염색하고 1Х10⁵ 내지 2Х10⁶ 세포/ml의 농도로 희석하였다. 세포 사멸율은 ~90%로 평가되었다. Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2과 함께 Chromium system(10x Genomics)을 사용하여 scRNA-seq 라이브러리를 형성하였다. 세포 부유액을 Chromium Single Cell A Chip에 로딩하여 각 채널 당 5,000 내지 6,000 세포를 포획(capture)하도록 하였다. C1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad)를 사용하여 세포 용해(cell lysis)와 역전사(reverse transcription)을 겔 비드-인-에멀젼(gel bead-in-emulsions, GEMs)에서 수행하였다. 다음의 cDNA 증폭 및 라이브러리 준비를 수행하고, 멀티플렉싱(multiplexing)을 위하여 시퀀싱 라이브러리(Sequencing libraries)를 풀링한 뒤 NovaSeq 6000 platform(Illumina) 상에서 시퀀싱 하였다.

2. scRNA-seq 데이터 분석

디폴트 맵핑 옵션(default mapping options)을 이용하여 로우 FASTQ 파일을 Cell Ranger software suite(v2.2.0)로 가공하였다. STAR(v2.5.1b)를 이용하여 리드(Reads)를 인간 레퍼런스 게놈(GRCh38)에 맵핑한 뒤 Ensembl GTF 파일(release 91)로 정량화 하였다. R의 DropletUtils(v1.2.2) 패키지(DropletUtils (v1.2.2) package of R)의 emptyDrops 기능을 이용하여 FDR < 0.01로 유전자-바이-세포(gene-by-cell) 계수 매트릭스로부터 빈 액적에 일치하는 세포 바코드를 걸러냈다. 미토콘드리아 유전자에 맵핑된 UMIs(unique molecular identifiers)의 10% 이상이거나, 총 UMIs가 1,000 이하이거나, 발현 유전자가 10개 이하인 저품질의 세포는 제외시켰다. R의 스캐터(scater) (v1.10.1) 패키지의 calculateQCMetrics 기능(the calculateQCMetrics function of the scater (v1.10.1) package of R)으로 계산된 모든 품질 관리 메트릭스(quality control metrics)에서 2차원적 주성분 분석(principal component analysis)에서 시각적으로 이상점(outlier)을 조사하여 역치값을 선택하였다. R의 Seurat 패키지의 NormalizeData 기능(the NormalizeData function of the Seurat (v3.0-alpha) package of R)은 각각의 계산 값을 각 세포의 총 계산 값으로 나눈 뒤 10,000 스케일 값을 곱하고, 1의 슈도-계산값(pseudo-count)으로 로그-변형하였다. 각 자료에서, 디폴트 옵션(default options)을 이용하여 Seurat 패키지의 FindVariableFeatures 기능을 이용해 가장 가변적인 상위 2,000개 유전자를 특징 유전자의 서브세트로 선별하였다. 30 정준 상관 벡터(canonical correlation vectors)에서 Seurat 패키지의 FindIntegrationAnchors 및 IntegrateData 기능을 이용해 배치 효과(batch effect)를 제거하였다. Seurat 패키지의 ScaleData 기능을 이용하여 통합 식 매트릭스(integrated expression matrix)를 스케일한 뒤 30 주요 구성(principal components)에서 Seurat 패키지의 RunUMAP 기능을 이용해 2차원 UMAP 플럿으로 시각화하였다. 세포 타입 주석을 위하여, 로우 UMI 계수 매트릭스에서 R의 SingleR package(v.0.2.2)의 CreateSinglerSeuratObject 기능(the CreateSinglerSeuratObject function of the SingleR package(v.0.2.2) of R)을 이용하고 npca=15, min.cells=0, min.genes=0, 및 regress.out=NULL로 설정하였다. P5와 P5(-) 사이에서 다르게 발현되는 유전자 또는 세포 타입 마커 유전자는 Seurat 패키지에서 주어지는 Wilcoxon rank sum test를 사용하여 조절된 P-value < 0.01의 옵션으로 동정하였다.

3. 분석 결과　

상기와 같은 분석을 통해 췌관 선암종 환자의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 중에서도 특히 IL-10RB⁺ 세포에서 정상 대조군에 비하여 유의적으로 발현되는 바이오마커를 분석하여 그 결과를 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다. 한편, 표 5에서 각 바이오마커별 등급은 정상 대조군 대비 환자군의 발현량 변화에 기초하여 A, B, C, D 등급으로 선정하였다.

[표 4]

[표 5]

[실험예 2] 췌장암 특이적 바이오마커의 확인(2)

1. 정상 대조군과 췌장암 환자에서 바이오마커의 발현 수준 비교

정상 대조군(n=31)과 췌장암 환자군(n=38) 유래 혈액 샘플에서 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리하였다. 이로부터 RNA를 분리한 후(Qiagen, USA), PrimeScript RT Master MIX(Perfect Real Time, Takara #RR036A)를 이용하여 cDNA를 제조하고, StepOnePlus(AB사) PCR 기기를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머 서열은 하기 표 6과 같다. 이처럼 qPCR을 이용하여 정상 대조군과 췌장암 환자군 샘플에서 IL-7R, IL-32, FLT3LG, 및 IL-10RA 의 mRNA의 발현 수준을 비교한 결과는 도 2 내지 5에 나타내었다. ΔCt의 감소는 mRNA 발현 수준의 증가를 의미한다.

각 마커별 qPCR 결과를 바탕으로 ROC 커브(Receiver Operating Characteristic curve, ROC curve) 그래프를 활용한 통계 분석을 진행한 결과는 도 6 내지 9에 나타내었고, 각 마커 별 AUC 값과 △Ct의 컷-오프(cut-off) 값에 따른 민감도 및 특이도 값은 하기 표 7 내지 14에 나타내었다.

[표 6]

[표 7]IL-7R 바이오마커

[표 8]IL-7R 바이오마커

[표 9]IL-32 바이오마커

[표 10]IL-32 바이오마커

[표 11]FLT3LG 바이오마커

[표 12]FLT3LG 바이오마커

[표 13]IL-10RA 바이오마커

[표 14]IL-10RA 바이오마커

도 2 내지 5에서 보는 바와 같이, 정상 대조군 대비 췌장암 환자 유래 혈액 샘플에서 채취된 말초혈액단핵세포에서 IL-7R, IL-32, FLT3LG, 및 IL-10RA의 △Ct 값이 낮은 값을 보였는 바, 즉 정상 대조군 대비 췌장암 환자 유래 말초혈액단핵세포에서 IL-7R, IL-32, FLT3LG, 및 IL-10RA의 mRNA 발현 수준이 현저히 증가된 것을 확인할 수 있다.

도 6 내지 9 및 표 7 내지 14에서 보는 바와 같이, 상기 IL-7R, IL-32, FLT3LG, 및 IL-10RA 바이오마커는 췌장암 진단에 있어 높은 민감도 및 특이도를 보였으므로, 췌장암 진단의 통계적 유의성이 있는 것을 알 수 있다.

2. 통계적 분석

상기 1.의 결과를 토대로 각 마커별 또는 마커의 조합별 SAS(version 9.3, SAS Inc., NC, USA), PASS(version 12, NCSS, LLC, Kaysville, Utah, USA)를 이용하여 샤피로-윌크 검정(Shapiro-Wilk test), 콜모고로프-스미르노프 검정(Kolmogorov-Smirnov test), 독립 표본 t-검정(Independent two sample t-test) 및 로지스틱 회귀분석(logistic regression)을 수행하였고, 그 결과는 하기 표 15 내지 17에 나타내었다.

[표 15]샤피로-윌크 검정(Shapiro-Wilk test) 및 콜모고로프-스미르노프 검정(Kolmogorov-Smirnov test)

[표 16]독립 표본 t-검정(Independent two sample t-test)(평균±표준편차)

[표 17]로지스틱 회귀분석(logistic regression)

상기 표 15 내지 17의 결과를 통해, 정규성 검정 결과 상기 IL-7R, IL-32, FLT3LG, 및 IL-10RA 바이오마커는 췌장암 진단에 있어 정규성을 만족하였고, 상기의 마커를 단독으로 측정하는 것보다, IL-7R 및 IL-10RA의 조합을 측정하는 경우, 췌장암 진단 예측력이 더 우수함을 확인하였다.

또한, 상기 IL-7R 및 IL-10RA의 조합의 발현 수준에 따른 췌장암의 발병 가능성을 예측하기 위한 식을 도출하였다.

[식 3]

LP= 3.7068 - 0.9077 X (IL-7R) - 0.8776 X (IL-10RA)

[식 4]

췌장암 발병 확률 = 1 / (1+exp(-LP))

상기 식 3에서, IL-7R 및 IL-10RA 각각은 하우스키핑 유전자(GADPH)에 대한 IL-7R mRNA 및 IL-10RA mRNA 발현 수준의 상대적인 △Ct 값이며, 상기 식 3에서 도출된 LP 값을 식 4에 대입하면 췌장암의 발병 가능성을 예측할 수 있다.

추가하여, 상기 표 15 내지 17의 결과를 이용하여 상기 IL-7R 및 IL-10RA의 컷-오프 값의 조합에 따른 췌장암 진단의 특이도 및 민감도를 분석하여 그 결과를 하기 표 18에 나타내었다. 이때, 환자에서 얻어진 IL-7R 및 IL-10RA의 mRNA 발현 수준에 대한 두 변수 모두 컷-오프 값 보다 클 경우는 0, 둘 중 하나만 컷-오프 값보다 작고 나머지 하나는 클 경우는 1, 두 변수 모두 컷-오프 값보다 작으면 2 점으로 점수(score)를 만든 후 그 점수의 컷-오프 값을 끊어서 각각의 특이도와 민감도를 계산하였다.

[표 18]

상기 표 18에서 보는 바와 같이, IL-7R의 변수가 2.283 미만이고, IL-10RA의 변수가 1.8535 이상인 경우; IL-7R의 변수가 2.283 이상이고, IL-10RA의 변수가 1.8535 미만인 경우; 또는 IL-7R의 변수가 2.283 미만이고, IL-10RA의 변수가 1.8535 미만인 경우; 췌장암 진단의 특이도 및 민감도가 모두 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 3] 췌장암 특이적 바이오마커의 확인(3)

정상 대조군(n=31)과 췌장암 환자군(n=38) 유래 혈액 샘플에서 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리하였다. 이로부터 RNA를 분리한 후(Qiagen, USA), PrimeScript RT Master MIX(Perfect Real Time, Takara #RR036A)를 이용하여 cDNA를 제조하고, StepOnePlus(AB사) PCR 기기를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머 서열은 하기 표 19과 같다. 이처럼 qPCR을 이용하여 정상 대조군과 췌장암 환자군 샘플에서 IL-7R, FLT3LG 및 CD27의 mRNA의 발현 수준을 비교한 결과는 도 10 내지 12에 나타내었다. ΔCt의 감소는 mRNA 발현 수준의 증가를 의미한다.

각 마커별 qPCR 결과를 바탕으로 ROC 커브(Receiver Operating Characteristic curve, ROC curve) 그래프를 활용한 통계 분석을 진행한 결과는 도 13 내지 15에 나타내었고, 각 마커 별 AUC 값과 △Ct의 컷-오프(cut-off) 값에 따른 민감도 및 특이도 값은 하기 표 20 내지 22에 나타내었다.

[표 19]

[표 20]IL-7R 바이오마커

[표 21]FLT3LG 바이오마커

[표 22]CD27 바이오마커

도 10 내지 12에서 보는 바와 같이, 정상 대조군 대비 췌장암 환자 유래 혈액 샘플에서 채취된 말초혈액 단핵 세포에서 IL-7R, FLT3LG 및 CD27의 △Ct 값이 낮은 값을 보였는 바, 즉 정상 대조군 대비 췌장암 환자 유래 말초혈액단핵세포에서 IL-7R, FLT3LG 및 CD27의 mRNA 발현 수준이 현저히 증가된 것을 확인할 수 있다.

도 13 내지 15 및 표 20 내지 22에서 보는 바와 같이, 상기 IL-7R, FLT3LG 및 CD27 바이오마커는 췌장암 진단에 있어 높은 민감도 및 특이도를 보였으므로, 췌장암 진단의 통계적 유의성이 있는 것을 알 수 있다.

2. 통계적 분석

상기 1.의 결과를 토대로 각 마커별 또는 마커의 조합별 SAS(version 9.3, SAS Inc., NC, USA), PASS(version 12, NCSS, LLC, Kaysville, Utah, USA)를 이용하여 맨-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test) 및 로지스틱 회귀분석(logistic regression)을 수행하였고, 그 결과는 하기 표 23 및 24에 나타내었다. 단, 컷-오프 값은 Youden 인덱스, 즉 "민감도(sensitivity) + 특이도(specificity) - 1"이 최대가 되는 점을 적정 컷-오프로 결정하였고, P value가 0.05 미만일 때 유의하다고 판단하였다.

[표 23]맨-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test)

[표 24]로지스틱 회귀분석(logistic regression)

표 23 및 24에서 보는 바와 같이, 상기 IL-7R, IL-32, FLT3LG, IL-10RA 및 CD27 바이오마커는 췌장암 진단에 있어 높은 민감도 및 특이도를 보였으므로, 췌장암 진단의 통계적 유의성이 있는 것을 알 수 있다. 추가하여, 본 실험예를 통해, 상기의 마커를 단독으로 측정하는 것보다, IL-7R, FLT3LG, 및 CD27의 조합을 측정하는 경우, 췌장암 진단 예측력이 더 우수함을 확인하였다.

또한, 상기 표 23 및 24의 결과를 이용하여 상기 IL-7R, FLT3LG 및 CD27의 발현 수준에 따른 췌장암의 발병 가능성을 예측하기 위한 식을 도출하였다.

[식 5]

LP= 3.8688 - 1.0342 X (IL-7R) - 0.3365 X (FLT3LG) - 0.0526 X (CD27)

[식 6]

췌장암 발병 확률 = 1 / (1+exp(-LP))

상기 식 5에서, IL-7R, FLT3LG 및 CD27 각각은 하우스키핑 유전자(GADPH)에 대한 IL-7R mRNA, FLT3LG mRNA 및 CD27 mRNA 발현 수준의 상대적인 △Ct 값이며, 상기 식 5에서 도출된 LP 값을 식 6에 대입하면 췌장암의 발병 가능성을 예측할 수 있다.

또한, 상기 표 23 및 24의 결과를 이용하여 상기 IL-7R, FLT3LG 및 CD27의 컷-오프 값의 조합에 따른 췌장암 진단의 특이도 및 민감도를 분석하여 그 결과를 하기 표 25에 나타내었다. 이때, 환자에서 얻어진 IL-7R, FLT3LG 및 CD27 바이오마커 중 두 바이오마커의 컷-오프 값 보다 클 경우는 0, 셋 중 하나만 컷-오프 값보다 작고 나머지는 클 경우는 1, 셋 중 두 바이오마커가 컷-오프 값보다 작으면 2, 세 바이오마커 모두에 있어서 컷-오프 값보다 작을 때에는 3점으로 점수(score)를 만든 후 그 점수의 컷-오프 값을 끊어서 각각의 특이도와 민감도를 계산하였다.

[표 25]

상기 표 25에서 보는 바와 같이, IL-7R의 발현 수준이 0.7206507 미만이고, FLT3LG의 발현 수준이 0.5926827 이상이며, CD27의 발현수준이 0.7527883 이상인 경우; IL-7R의 발현 수준이 0.7206507 이상이고, FLT3LG의 발현 수준이 0.5926827 미만이며, CD27의 발현수준이 0.7527883 이상인 경우; 또는 IL-7R의 발현 수준이 0.7206507 이상이고, FLT3LG의 발현 수준이 0.5926827 이상이며, CD27의 발현수준이 0.7527883 미만인 경우; 췌장암 진단의 특이도 및 민감도가 모두 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 4] 췌장암 특이적 바이오마커의 임상적 효용성 평가

상기 췌장암 특이적 바이오마커의 임상적 효용성을 평가하기 위하여, 췌장암으로 진단 받은 환자군에 대하여, 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, 0.6cm X 0.64cm 크기의 T1 단계 췌장암으로 판정받은 환자 A, 및 췌장염 진단 후, 추적 관찰에 따라 3개월 후 췌장암으로 판정받고, 이에 대한 수술을 진행한 환자 B를 대상으로, 말초혈액 단핵세포를 분리하였다. 이후, 상기 세포로부터 RNA를 분리하고(Qiagen, USA), PrimeScript RT Master MIX(Perfect Real Time, Takara #RR036A)를 이용하여 cDNA를 제조한 뒤, StepOnePlus(AB사) PCR 기기를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이후, 전술한 실험예와 동일한 방식으로 췌장암 특이적 바이오마커의 발현 수준을 측정하였다.

환자 A에 대한 실험 결과는 하기 표 26 및 27에 나타내었다. 하기 표 26 및 27에서 괄호 안의 값은 정상 대조군에서의 발현 수준에 대한 ΔCt 값을 나타낸 것이다.

[표 26]

[표 27]

상기 표 26에서 보는 바와 같이, T1 단계 췌장암으로 판정받은 환자 A 유래 말초혈액 단핵세포에서는 정상 대조군에 비해 IL-7RA 및 FLT3LG mRNA의 발현이 증가된 반면, 그 외의 마커, 구체적으로 CA19-9, 및 IL-22RA mRNA의 발현은 정상 범위 수준이었다. 또한, 상기 표 27에서 보는 바와 같이, IL-22RA 및 IL-10RB 단백질의 발현 역시 정상 범위 수준임을 확인할 수 있었다.

환자 B에 대한 실험 결과는 하기 표 28 및 29에 나타내었다. 하기 표 28 및 29에서 괄호 안의 값은 정상 대조군에서의 발현 수준에 대한 ΔCt 값을 나타낸 것이다.

[표 28]

[표 29]

상기 표 28에서 보는 바와 같이, 췌장암 진단 시점에서, 환자 B 유래 말초혈액 단핵세포에서는 정상 대조군에 비해 IL-7RA, FLT3LG, 및 CD27 mRNA의 발현 모두가 증가되었으며, 이러한 발현 수준의 증가는 췌장암 수술 이후 모두 정상화 범위로 회복되었다. 또한, 상기 표 29에서 보는 바와 같이, 췌장암 진단 시점에서 IL-22RA 및 IL-10RB mRNA의 발현은 정상 범위 수준임을 확인할 수 있었다.

이러한 실험 결과들을 종합해 보면, 일 실시예에 따른 췌장암 특이적 바이오마커는 다른 바이오마커와는 구별되는 기능을 갖는, 췌장암 진단에 있어서 특이적인 바이오마커로 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.

[실험예 5] 췌장암 동물모델을 통한 췌장암 특이적 바이오마커의 효능 평가

췌장암 동물모델을 이용한 상기 췌장암 특이적 바이오마커의 효능 평가는 도 16에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 구체적으로, 8주령의 야생형(WT) 마우스(C57BL/6, OrientBio)의 췌장에 2x10⁶cells/20μL의 Pan02 PDAC 세포(Pancreatic ductal adenocarcinoma cell line, Pan02)를 직접 이식하여, 동소이식 췌장암 마우스 동물모델을 구축하였다. Pan02 PDAC 세포를 이식한 날로부터 2일, 4일, 5일, 7일, 및 11일째, 상기 동물모델을 희생시키고, 종양 조직 및 비장의 중량을 각각 측정하였다. 이와 함께, 상기 동물모델의 혈액으로부터 말초혈액 단핵세포를 분리한 뒤, IL-7R, IL-22R1, 또는 IL-10RB 특이적 항체(mIL7R, APC(BD, Cat.564175 ), mAR, Percp(R&D, Cat. FAB42941C), mBR, APC(R&D, Cat. FAB53681A))를 사용하여 FACS 분석을 실시함으로써, 말초혈액 단핵세포 표면에 발현된 IL-7R, IL-22R1, 또는 IL-10RB의 수준을 비교하여, 시간의 경과에 따른 발현 변화를 확인하였다. 한편, 본 실험예에서 대조군은 8주령의 야생형(WT) 마우스(C57BL/6, OrientBio)의 췌장에 PBS를 투여한 군으로 설정하였다.

도 17에서 보는 바와 같이, 본 실험예에서 제조된 췌장암 동물모델은 시간의 경과에 따라 종양 조직 및 비장의 중량이 증가하였으며, 이를 통하여, 췌장암 동물모델이 안정적으로 구축되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 18에서 보는 바와 같이, 췌장암 동물모델의 말초혈액 단핵세포는 대조군에 비해 IL-7R, 및 IL-22R의 발현이 유의적으로 증가된 반면, IL-10RB의 발현은 유의적 변화가 관찰되지 않았다. 특히, IL-7R의 발현 양상은 췌장암의 초기 단계(Day 4)부터 유의적인 증가를 나타내었으며, 췌장암이 진행됨에 따라, 상기 IL-7R의 발현 역시 증가되는 경향을 보여주었다.

이러한 실험 결과들을 종합해 보면, 일 실시예에 따른 췌장암 특이적 바이오마커는 췌장암의 조기 진단뿐만 아니라, 췌장암의 진행 또는 예후를 평가하는데 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.

[실험예 6] 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 IL-10RB의 발현과 췌장암세포 증식의 상관관계 확인

1. 재료 및 방법

1-1. CCK-8 검정을 통한 췌장암 세포 증식 분석(Cell Proliferation Assay)

96-웰 플레이트(96-well plate, n=5)의 각 웰에 PanO2 세포(췌장암 세포) 배양액 100 ul(5X10³ 세포/웰)를 접종하여, 가습 배양기(humidified incubator)에서, 37°C, 5% CO₂의 조건으로 전-배양(Pre-incubation) 하였다.

상기 각 웰의 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(conditioned media, CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM) 200 ul를 접종하였다. 또한, 일부 실험군에는 항-IL-10RB 억제 항체(neutralizing Ab) 2 ug/ml(R & D) 또는 1 ug/ml(Novus)를 접종하였다. 그 후, 24시간, 48시간, 또는 72시간 인큐베이션 하였다.

상기 인큐베이션 된 96-웰 플레이트의 각 웰에 CCK-8 용액 10 ul를 접종한 후, 3 시간 동안 인큐베이션 하였고, 그 후, 96-웰 플레이트는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여, 450 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종한 실험군의 흡광도 값을 기준으로, IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종한 실험군의 흡광도 값의 배수 증가를 계산하여, 췌장암 세포의 증식 수준을 분석하였다.

1-2. FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석(cell-counting)을 통한 췌장암 세포 증식 분석(Cell Proliferation Assay)

CellTracker™ Green CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)로 PanO2 세포(3X10⁶)를 라벨링 한 후, 96-웰 플레이트(n=3)의 각 웰에 PanO2 세포 배양액(1X10⁵ 세포/웰)을 접종하였다.

상기 각 웰의 라벨링 된 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM) 또는 IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 1X10⁵ 세포/웰의 농도로 접종하였다. 또한, 일부 실험군에는 항-IL-10RB 억제 항체(neutralizing Ab) 2 ug/ml(R & D) 또는 1 ug/ml(Novus)를 접종하였다. 그 후, 48시간, 또는 72시간 인큐베이션 하였다. 그 후, 혈구계수기(Hemocytometer)를 사용하여, 라벨링 된 췌장암 세포를 카운트하였다.

1-3. 통계적 분석

모든 정량 실험은 적어도 3 회(n=3 또는 n = 5) 수행되었으며, 데이터 값은 평균 ± SD로 나타내었다. 도 19 내지 23에 나타낸 데이터 값은, GraphPad Prism 8.0.2를 사용하여 양측 언 페어드 T 검정(two-tailed unpaired t test)에 의해 분석되었다. 도 24 내지 33에 나타낸 데이터 값은, GraphPad Prism 8.0.2를 사용하여 일원 분산 검정(One-way Anova test)에 의해 분석되었다.

2. PBMC에서 IL-10RB의 발현 증가에 따른 췌장암 세포 증식의 증가 확인(췌장암 세포 증식과 관련된 바이오마커로서 IL-10RB의 기능 확인)

본 실험예에서는, PBMC에서 IL-10RB의 발현 증가에 따른 췌장암 세포 증식의 증가 여부를 확인하기 위해, CCK-8 검정 및 FACS 분석을 통해 췌장암 세포 증식 수준을 분석하였다.

그 결과, 도 19 내지 21에 나타낸 바와 같이, CCK-8 검정 분석에 의하여, 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종하였을 때, IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우 대비 췌장암 세포의 증식이 유의하게 증가함을 확인하였다.

마찬가지로, 도 22 및 23에 나타낸 바와 같이, FACS 분석에 의하여, 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종하였을 때, IL-10RB^-PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우 대비 췌장암 세포의 증식이 유의하게 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 실험예를 통해, PBMC에서 IL-10RB의 발현 수준을 측정함으로써, 췌장암 세포 증식능을 탐지할 수 있고, 이로 인해, IL-10RB는 췌장암 세포 증식능과 관련된 바이오마커로서 기능할 수 있음을 확인하였다.

3. PBMC에서 IL-10RB의 억제에 따른 췌장암 세포 증식의 억제 확인(IL-10RB 억제제의 췌장암 세포 증식 억제 기능 확인)

본 실험예에서는, PBMC에서 IL-10RB의 억제에 따른 췌장암 세포 증식의 억제 여부를 확인하기 위해, CCK-8 검정 및 FACS 분석을 통해 췌장암 세포 증식 수준을 분석하였다.

그 결과, 도 24 내지 33에 나타낸 바와 같이, 췌장암 세포 배양액에 IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우, 배양 시간이 증가할수록, IL-10RB^- PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우 대비 췌장암 세포의 증식이 유의하게 증가하였다. 그러나, IL-10RB 억제제인 항-IL-10RB 억제 항체(neutralizing Ab)까지 추가로 접종한 경우, IL-10RB⁺PBMC 배양액(CM)을 접종한 경우라도, 췌장암 세포의 증식의 증가가 억제되었다.

본 실험예를 통해, PBMC에서 IL-10RB를 억제함으로써, 췌장암 세포 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, PBMC에서 IL-10RB를 억제하는 것은, IL-10RB 단백질의 활성을 억제하거나, IL-10RB를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 따라서, IL-10RB 억제제는 본 실험예에서 사용된 항-IL-10RB 억제 항체(neutralizing Ab)에 제한되지 않고, IL-10RB 단백질의 활성을 억제하거나, IL-10RB를 암호화하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제이면 어느 것이라도 해당될 수 있고, 이러한 IL-10RB 억제제는 췌장암 세포 증식을 억제하여 항암용 치료제로 활용될 수 있다.

[실험예 7] IL-10RB, IL-22, 및 췌장암 세포 증식의 상관관계 확인

1. IL-22 녹아웃(knockout, KO) 시, PBMC에서 IL-10RB 발현의 억제 확인

본 실험예에서는, IL-22 KO 마우스의 PBMC에서 IL-10RB 발현이 억제되는지 확인하기 위하여, IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)의 PBMC를 추출하여, IL-10RB 발현 수준을 측정하였다. 또한, PanO2 세포주(췌장암 세포주)를 IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)의 췌장에 주입한 뒤, 췌장암 세포 주변의 PBMC를 추출하여, IL-10RB 발현 수준을 측정하였다. 참고로 IL-22은 IL-22 유전자에 의해 암호화 되는 시토킨(cytokine)이다. IL-22 자극으로 STAT1, STAT3, 또는 STAT5의 활성화가 나타나지만 IL-22의 생리적 기능에 대해서는 아직도 불명한 것이 많다.

그 결과, 도 34에 나타낸 바와 같이, B6 마우스(WT)와 비교하여, IL-22 KO 마우스에서 IL-10RB⁺PBMC의 세포 수가 현저히 감소하였음을 확인하였다. 특히, 도 35에 나타낸 바와 같이, B6 마우스(WT)에서는 췌장암 세포 주변에 IL-10RB⁺PBMC의 세포 수가 현저히 증가하여 췌장암 세포 내로 침윤된 반면, IL-22 KO 마우스에서는 췌장암 세포 주변에 IL-10RB⁺PBMC의 세포 수가 B6 마우스(WT)와 비교하여 현저히 감소한 것을 확인하였다.

또한, 도 36 및 37에 나타낸 바와 같이, IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)에서 추출된 PBMC 중 CD11b로 염색된 세포들 중에서, B6 마우스(WT)와 비교하여 IL-22 KO 마우스에서 IL-10RB⁺PBMC의 세포 수가 유의하게 감소하였다.

본 실험예를 통해, IL-22 유전자를 완전히 제거하거나, IL-22 유전자의 발현이 억제되는 경우, PBMC에서 IL-10RB이 억제될 수 있음을 확인하였다. 이로 인해, 췌장암 세포 증식이 억제될 수 있으므로, 이러한 IL-22 유전자 억제제는 IL-10RB 억제제와 마찬가지로, 항암용 치료제로 활용될 수 있다.

2. IL-22 녹아웃(knockout, KO) 시, 췌장암 세포 크기 감소 및 정상 면역계 회복 확인

본 실험예에서는, IL-22 KO 마우스에서, 구체적인 췌장암 치료 효과를 확인하기 위하여, PanO2 세포주(췌장암 세포주)를 IL-22 KO 마우스와 B6 마우스(WT)의 췌장에 주입하여, 췌장암 세포 크기 변화 및 췌장암 세포 주변의 임파선(lymph node, LN)의 회복에 대하여 분석하였다.

그 결과, 도 38 및 39에 나타낸 바와 같이, B6 마우스(WT)와 비교하여, IL-22 KO 마우스에서 췌장암 세포의 크기가 유의하게 감소하였음을 확인하였다.

또한, 도 40 및 41에 나타낸 바와 같이, IL-22 KO 마우스에서 췌장암 세포 주변의 임파선이 활성화되어, 제 모습으로 회복되어가는 것을 확인하였다. 반면, B6 마우스(WT)에서는 임파선이 위축되어 있고, 췌장암 세포가 임파선 내로 침윤된 것을 확인하였다.

본 실험예를 통해, IL-22 유전자를 완전히 제거하거나, IL-22 유전자의 발현이 억제되는 경우, 이로 인해, 췌장암 세포 크기가 감소되고, 췌장암 세포 주변의 임파선의 회복을 유도할 수 있음을 확인하였다. 이때, IL-22 유전자가 억제됨으로써, 직접적으로 이러한 효과를 야기하는 것인지, IL-22 유전자가 억제되면, PBMC에서 IL-10RB이 억제되는 것에 의하여, 간접적으로 이러한 효과를 야기하는 것인지에 대하여는 하기에서 입증하였다.

3. IL-22의 억제가 췌장암 세포 증식에 직접적으로 영향을 미치는지 확인하여, IL-22와 IL-10RB의 상관관계 확인

본 실험예에서는, IL-22의 억제가 췌장암 세포 증식에 직접적으로 영향을 미치는지 확인하기 위하여, IL-22 KO 마우스와 같이, IL-22 유전자를 완전히 제거하거나, IL-22 유전자의 발현이 억제되는 경우가 아닌, 이미 발현된 IL-22 단백질의 활성을 억제시켰을 때의 췌장암 세포 증식을 분석하였다. 구체적으로, IL-22 단백질의 활성을 억제시키기 위하여, IL-22 단백질과 결합하는 항- IL-22 차단 항체를 사용하였다.

그 결과, 도 42에 나타낸 바와 같이, IL-22 단백질의 활성을 억제시킨 경우에는, 췌장암 세포의 증식은 감소하지 않은 반면, 항-IL-10RB 억제 항체에 의해 IL-10RB를 억제시킨 경우에는, 췌장암 세포의 증식은 유의하게 감소함을 확인하였다.

따라서, 본 실험예를 통해, IL-22의 억제가, 직접적으로 췌장암 세포에 영향을 미치는 것이 아니고, IL-22의 유전자를 억제시키는 경우에 한 해, PBMC에서 IL-10RB의 억제가 유도될 수 있고, 그 결과, 췌장암 세포 증식이 감소될 수 있음을 확인하였다. 즉, IL-10RB를 조절하는 것이 췌장암 세포에 직접적으로 영향을 미칠 수 있고, IL-22의 유전자를 억제시키는 것은 간접적으로 췌장암 세포에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다. 비록 간접적으로 효과를 유도할지라도, IL-10RB 억제제로서, IL-22의 유전자 억제제가 사용될 수 있고, 결국, IL-22의 유전자 억제제는 간접적으로 췌장암 세포 증식을 억제하여 항암용 치료제로 활용될 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

100: 시료 수용부
200: 입력부
300: 진단부
400: 출력부

<110> ACURASYSBIO Co.,Ltd <120> Composition for diagnosing cancer <130> PN137365KR <150> KR 10-2019-0169813 <151> 2019-12-18 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 260 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr 20 25 30 Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe 35 40 45 Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro 50 55 60 Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His 65 70 75 80 Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys 85 90 95 Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys 100 105 110 Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu 115 120 125 Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His 130 135 140 Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met 145 150 155 160 Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro 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100 105 110 Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser 115 120 125 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp 130 135 140 Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala 165 170 175 Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu 180 185 190 Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Trp Cys Leu His Trp Gln 195 200 205 Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val 210 215 220 Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu His 225 230 235 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln 1 5 10 15 Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp 20 25 30 Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val 35 40 45 Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val 50 55 60 Asn Ile Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala 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Cys Lys 275 280 285 Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu 290 295 300 Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val 305 310 315 320 Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu 325 330 335 Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu 340 345 350 Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser 370 375 380 Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val 385 390 395 400 Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro 405 410 415 Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala 420 425 430 Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala 435 440 445 Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 450 455 <210> 4 <211> 234 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Met Cys Phe Pro Lys Val Leu Ser Asp Asp Met Lys Lys Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Met Val Met Leu Leu Pro Thr Ser Ala Gln Gly Leu Gly Ala Trp 20 25 30 Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly Pro Trp 35 40 45 Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser Ser Gln 50 55 60 His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala Glu Ser 65 70 75 80 Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp Asp Phe 85 90 95 Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu Gln His 100 105 110 Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu Arg Cys 115 120 125 Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys Val Met Arg Trp Phe Gln Ala 145 150 155 160 Met Leu Gln Arg Leu Gln Thr Trp Trp His Gly Val Leu Ala Trp Val 165 170 175 Lys Glu Lys Val Val Ala Leu Val His Ala Val Gln Ala Leu Trp Lys 180 185 190 Gln Phe Gln Ser Phe Cys Cys Ser Leu Ser Glu Leu Phe Met Ser Ser 195 200 205 Phe Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Gly Asp Lys Glu Glu Leu Thr Pro 210 215 220 Gln Lys Cys Ser Glu Pro Gln Ser Ser Lys 225 230 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-7R Forward Primer <400> 5 gtagtcatca ctccagaaag c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-7R Reverse Primer <400> 6 acctggaaga ggagagaata g 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL32 Forward Primer <400> 7 cagagctcac tcctctactt gaa 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL32 Reverse Primer <400> 8 gaaccatctc atgaccttgt cac 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL10RA Forward Primer <400> 9 acttcagcct cctaacctct g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL10RA Reverse Primer <400> 10 agggagatgc actcctcttt ag 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLT3LG Forward Primer <400> 11 tggagcccaa caacctatct 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLT3LG Reverse Primer <400> 12 tagtcagaca gctcacggat tt 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD27 Forward Primer <400> 13 gaaggactgt gaccagcata ga 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD27 Reverse Primer <400> 14 cgaacgagaa gaccagagtt aca 23

Claims

CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand, FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(interleukin-7 receptor, IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암의 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 췌장암의 진단용 조성물은 인터루킨-32(interleukin-32, IL-32) 및 인터루킨-10RA(interleukin-10 receptor alpha, IL-10RA)에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는, 췌장암의 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 췌장암의 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 췌장암의 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 개체의 혈액, 혈청, 혈장, 또는 혈장 유래 단핵구로부터 측정되는 것인, 췌장암의 진단용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 췌장암의 진단용 조성물을 포함하는 췌장암의 진단용 키트.
개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand, FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(interleukin-7 receptor, IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 인터루킨-32(IL-32), 및 인터루킨-10RA(interleukin-10 receptor alpha, IL-10RA)에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 혈장 유래 단핵구를 포함하는 것인, 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서, 상기 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법은, 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 췌장암이 발병하였거나 췌장암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는, 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
제7항에 있어서, 상기 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법은, 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)의 발현 수준을 하기 식 1에 대입하여 얻어진 LP 값을 하기 식 2에 대입함으로써 췌장암의 발병 가능성을 예측하는 단계를 추가로 더 포함하는, 췌장암을 진단하기 위한 정보 제공 방법:
[식 1]
LP= A - B X (IL-7R) - C X (FLT3LG) - D X (CD27)
[식 2]
췌장암 발병 확률 = 1 / (1+exp(-LP))
상기 식 1에서,
A는 3 내지 4의 값; B는 0.5 내지 1.5의 값; C는 0.1 내지 0.7의 값; 및 D는 0 초과 0.4 이하 값이며,
IL-7R은 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 IL-7R 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값이고; FLT3LG는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 FLT3LG 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값이며; 및 CD27은 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 CD27 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값이다.
개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 포함하는 데이터에 대하여 췌장암 진단 정보를 판정하는 진단부를 포함하는, 췌장암 진단 장치.
제12항에 있어서, 상기 췌장암 진단 장치는 개체의 생물학적 시료를 수용하는 시료 수용부를 더 포함하는, 췌장암 진단 장치.
제12항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 또는 혈장 유래 단핵구인, 췌장암 진단 장치.
제12항에 있어서, 상기 췌장암 진단 장치는 상기 생물학적 시료에 대하여 측정된 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 입력하는 입력부를 더 포함하는, 췌장암 진단 장치.
제12항에 있어서, 상기 진단부는 상기 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 췌장암의 발병 가능성이 높거나, 췌장암 양성으로 판정하는, 췌장암 진단 장치.
제12항에 있어서, 상기 진단부는 상기 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)의 발현 수준을 하기 식 1에 대입하여 얻어진 LP 값을 하기 식 2에 대입함으로써 췌장암의 발병 확률을 판정하는, 췌장암 진단 장치:
[식 1]
LP= A - B X (IL-7R) - C X (FLT3LG) - D X (CD27)
[식 2]
췌장암 발병 확률 = 1 / (1+exp(-LP))
상기 식 1에서,
A는 3 내지 4의 값; B는 0.5 내지 1.5의 값; C는 0.1 내지 0.7의 값; 및 D는 0 초과 0.4 이하의 값이며,
IL-7R은 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 IL-7R 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값이고; FLT3LG는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 FLT3LG 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값이며; 및 CD27은 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 하우스 키핑 단백질 또는 유전자에 대한 CD27 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상대적인 발현 수준의 값이다.
CD27; fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand, FLT3LG); 및 인터루킨-7 수용체(interleukin-7 receptor, IL-7R)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 췌장암 진단용 바이오마커 조성물.
제18항에 있어서, 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는, 췌장암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체의 생물학적 시료로 혈액, 혈청, 혈장, 또는 혈장 유래 단핵구에서 발현되는 것인, 췌장암 진단용 바이오마커 조성물.
인터루킨-10RB(interleukin-10 receptor beta, IL-10RB)의 발현 또는 활성을 억제시키는 제제를 유효성분으로 포함하는, 췌장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 20에 있어서, 상기 조성물은 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 내 IL-10RB의 발현 또는 활성을 억제시키는 것인, 췌장암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.