KR102226826B1 - 버피 코트 시료에 사용하기 위한 췌장암 진단용 조성물 - Google Patents

버피 코트 시료에 사용하기 위한 췌장암 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

췌장암 진단을 위한 바이오마커, 상기 바이오마커를 검출 가능한 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물, 및 이를 이용한 췌장암 진단 방법에 관한 것으로, 혈액 유래 버피 코트 시료에 사용하기 위한 것을 특징으로 한다.

Description

버피 코트 시료에 사용하기 위한 췌장암 진단용 조성물{Composition for Diagnosing Pancreatic Cancer for Use in Buffy Coat Sample}
췌장암 진단을 위한 바이오마커, 상기 바이오마커를 검출 가능한 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물, 및 이를 이용한 췌장암 진단 방법에 관한 것이다.
바이오마커(Biomarker)란 외부적인 영향으로 인해 생명체 내부에서 유발된 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 암, 신경계 질환 등 각종 질병을 진단하거나 특정 치료제의 효능을 예측하기 위한 용도로 연구가 활발히 진행되고 있다
한편, 췌장(Pancreas)은 위장의 뒤쪽에 위치한 20cm 정도의 길이의 소화액과 호르몬을 분비하는 장기로서, 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관암을 의미하는 것일 수 있다. 췌장암은 서양식 식사가 보편화되면서 점차 증가추세이며, 주로 남자에게서 많이 발생하는 것으로 알려져 있고, 사망률이 높다. 췌장암은 초기에는 증상이 잘 나타나지 않아 조기발견이 어렵고, 흡연, 커피, 음주, 육식위주의 식사습관, 당뇨, 만성 췌장염, 비용종성 대장암 증후군 등의 병력과 베타나프틸아민(Beta-naphthylamine), 벤지딘(Benzidine) 등의 물질이 원인으로 알려져 있다.
췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않으며, 이미 전신전이가 일어난 후에 통증과 체중 감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서, 사망률이 매우 높다.
따라서, 췌장암의 조기진단법의 개발이 요구된다.
일 예는 인터류킨 28 (Interleukin 28; IL-28), 인터류킨 29 (Interleukin 29; IL-29), 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 췌장암 진단을 위한 바이오마커를 제공한다. 상기 바이오마커는 혈액의 버피 코트(buffy coat)에서 검출 또는 분석하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출 가능한 제제를 포함하는, 췌장암 진단용 조성물 또는 췌장암 진단용 키트를 제공한다. 상기 췌장암 진단용 조성물 또는 췌장암 진단용 키트는 혈액의 버피 코트에 사용하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는 대상으로부터 분리된 혈액 시료에서 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하는 단계를 포함하는, 췌장암 진단 방법 또는 췌장암 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 혈액 시료는 혈액의 버피 코트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 검출하는 단계는 혈액 시료에서 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 존재 여부 및/또는 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 보다 상세히 설명한다:
췌장암 진단
본 명세서에서, "췌장암"은 췌장에 생기는 종양을 총칭하는 것으로, 장액성 낭성 종양, 점액성 낭성 종양, 췌관내 유두상 점액 종양, 고형 유두상 종양, 림프 상피성 낭종, 낭종성 기형종 등의 낭성 종양 (물혹)과 같은 양성 종양, 및 췌관 선암종, 선방세포 암종, 신경내분비 종양 등의 악성 종양 등을 예시할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 바이오마커에 의하여 진단 가능한 췌장암은 상기한 췌장암 중에서 선택될 수 있고, 예컨대, 악성 종양 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정, 치료에 대한 암의 반응성 결정, 등)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것) 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 췌장암의 진단은 대상에서의 상기한 췌장암의 발병 여부 및/또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것을 의미할 수 있다.
췌장암 진단을 위한 바이오마커
본 명세서에서, 췌장암 진단을 위한 바이오마커로서, 인터류킨 28 (Interleukin 28; IL-28), 인터류킨 29 (Interleukin 29; IL-29), 또는 이들의 조합이 제공된다. 본 명세서에 기재된 바이오마커는 단백질 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 췌장암 진단을 위한 바이오마커는 인터류킨 28일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 췌장암 진단을 위한 바이오마커는 인터류킨 28 및 인터류킨 29의 조합일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 췌장암 진단을 위한 바이오마커는 인터류킨 29일 수 있다.
상기 바이오마커는 정상 대조군 시료 대비 췌장암 환자 시료에서 발현 수준이 유의하게 높은 것을 특징으로 한다.
"인터루킨 29(Interleukin 29, IL-29)"은 '인터페론 람다-1(Interferon lambda-1)'이라고도 불리며, 염색체 19번에 위치하는 IL-29 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 나선형의 사이토카인 패밀리(helical cytokine family)에 속하며, Ⅲ형 인터페론에 해당한다. 본 명세서에서, IL-29은 인간 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, NCBI Accession No. NP_742152.1 (서열번호 2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. IL-29을 암호화하는 유전자는 인간 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, NCBI Accession No. NM_172140.2로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"인터루킨 28(Interleukin 28, IL-28)"은 2종의 이소폼 IL-28A (또는 Interferon lambda-2(IFNL2)라고도 칭해짐) 및 IL-28B (또는 Interferon lambda-3(IFNL3)라고도 칭해짐)를 가지는 사이토카인의 일종으로, 바이러스 등의 감염에 대한 면역 방어 작용을 한다. 본 명세서에서, IL-28A 및 IL-28B는 인간 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, IL-28A는 NCBI Accession No. NP_742150.1 (서열번호 3) (NM_172138.2)로 표시되고, IL-28B는 NCBI Accession No. NP_742151.2 (서열번호 3) (NM_172139.4)로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. IL-28A 및 IL-28B를 각각 암호화하는 유전자는 인간 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, NCBI Accession No. NM_172138.2 (IL-28A), NCBI Accession No. NM_172139.4 (IL-28B)로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 바로서, IL-28는 IL-28A, IL-28B, 또는 이들 모두를 의미할 수 있으며, 예컨대, IL-28A를 의미할 수 있다.
상기 바이오마커들의 구체적 사항을 아래의 표 1에 예시하였다:
마커 유전자 Accession No. 단백질 Accession No. 아미노산 서열 (N→C) 서열번호
Interleukin 29 NM_172140.2 NP_742152.1 MAAAWTVVLVTLVLGLAVAGPVPTSKPTTTGKGCHIGRFKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELALTLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPTAGPRPRGRLHHWLHRLQEAPKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPEST 1
Interleukin 28A NM_172138.2 NP_742150.1 MKLDMTGDCTPVLVLMAAVLTVTGAVPVARLHGALPDARGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCRCHSRLFPRTWDLRQLQVRERPMALEAELALTLKVLEATADTDPALVDVLDQPLHTLHHILSQFRACIQPQPTAGPRTRGRLHHWLYRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV 2
Interleukin 28B NM_172139.4 NP_742151.2 MTGDCMPVLVLMAAVLTVTGAVPVARLRGALPDARGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCKCRSRLFPRTWDLRQLQVRERPVALEAELALTLKVLEATADTDPALGDVLDQPLHTLHHILSQLRACIQPQPTAGPRTRGRLHHWLHRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV 3
바이오마커의 검출 가능한 제제
본 명세서에서, 바이오마커의 검출은 시료에서의 바이오마커의 존재 여부 및/또는 바이오마커의 수준 (농도)를 측정하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, 바이오마커, 즉, 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출 가능한 제제는 상기 바이오마커에 결합 가능한 모든 소분자 화합물, 단백질, 핵산 분자 들 중에서 선택될 수 있다.
일 예에서, 상기 바이오마커가 인터류킨 28, 및 인터류킨 29로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질인 경우, 상기 바이오마커의 검출 가능한 제제는 상기 단백질에 결합하는 단백질 (예컨대, 항체, 항체의 항원결합단편, 항체의 항원결합단편을 포함하는 항체 유사체, 수용체, 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 등), 소분자 화합물(chemical, small molecule), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 바이오마커가 인터류킨 28 암호화 유전자, 및 인터류킨 29 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자(전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)인 경우, 상기 바이오마커의 검출 가능한 제제는 상기 유전자에 결합 (또는 혼성화) 가능한 핵산 분자 (올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 등; 예컨대, 프라이머, 프로브, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 등), 소분자 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오마커의 검출 가능한 제제는 형광 물질, 발색 물질, 발광 물질, 방사성동위원소, 중금속 등의 통상적인 표지 물질로 표지되거나 표지되지 않은 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 바이오마커가 인터류킨 28, 및 인터류킨 29로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질인 경우, 상기 바이오마커의 검출은 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출 등과 같은 통상적인 단백질 검출(또는 측정 또는 분석) 방법을 통하여 하여 수행될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 마이크로어레이법, 유세포분석법 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 바이오마커가 인터류킨 28 암호화 유전자, 및 인터류킨 29 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자(전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)인 경우, 상기 바이오마커의 검출은 통상의 유전자 검출(또는 측정 또는 분석) 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대 상기 유전자와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 압타머, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법, 구체적으로, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 (PCR; 예컨대 qPCR, real-time PCR, real-time qPCR 등), FISH(fluorescent in situ hybridization), 마이크로어레이법, 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 프라이머는 상기 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000bp 예컨대 10 내지 500bp, 20 내지 200bp, 또는 50 내지 200bp의 유전자 단편을 검출할 수 있는 것으로, 상기 유전자 단편의 3'-말단 및 5'-말단 각각의 연속하는 5 내지 100bp, 예컨대, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 10 내지 25bp 부위와 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적인) 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프로브, 압타머, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 총 길이가 5 내지 1000 bp, 5 내지 500 bp, 5 내지 200 bp, 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp인 것일 수 있으며, HGF을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 1000 bp, 5 내지 500 bp, 5 내지 200 bp, 5 내지 100 bp, 5 내지 50bp, 5 내지 30bp, 또는 5 내지 25bp의 유전자 단편과 결합 가능하거나 혼성화 가능한 (예컨대, 상보적) 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 '결합 가능'하다 함은 상기 유전자의 전부 또는 일부와 공유 결합 등의 화학적 및/또는 물리적 결합에 의하여 결합할 수 있음을 의미할 수 있고, 상기 '혼성화 가능'하다 함은 상기 유전자 부위의 염기서열과 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할 수 있다.
췌장암 진단용 조성물 및 키트
본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단용 조성물은 앞서 설명한 바이오마커의 검출 가능한 제제를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단용 키트는 앞서 설명한 바이오마커의 검출 가능한 제제 또는 이를 포함하는 췌장암 진단용 조성물, 및 상기 검출 수단을 포함하는 것일 수 있다. 상기 검출 수단은 상기 바이오마커의 검출 가능한 제제로 검출한 바이오마커의 존재 여부 및/또는 수준을 정성적 및/또는 정량적으로 분석할 수 있는 수단일 수 있다. 일 예에서, 상기 검출 수단은 앞서 설명한 단백질 및/또는 유전자 검출 방법에 사용하기 위한 수단들 중에서 선택된 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
췌장암 진단 방법
본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단용 조성물 및 진단 방법 (또는 진단에 정보를 제공하는 방법)은 대상으로부터 분리된 혈액 시료에서 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 바이오마커를 검출하는 단계는 상기 시료 내의 바이오마커의 존재 여부 확인, 바이오마커의 수준 (농도) 측정, 또는 이들 모두를 수행하는 단계일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 시료 내에 상기 바이오마커가 존재하거나, 비교대상시료 (대조군)보다 높은 수준으로 존재하는 경우, 상기 시료 또는 상기 시료가 유래한 대상을 췌장암 환자로 진단 (또는 확인 또는 결정)할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단 방법 또는 췌장암 진단에 정보를 제공하는 방법은,
(a) 대상으로부터 분리된 혈액 시료에서 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커를 검출하는 단계, 및
(b) 상기 혈액 시료 내에 상기 바이오마커가 존재하거나, 비교대상시료(정상 시료)보다 높은 수준으로 존재하는 경우, 상기 시료 또는 상기 시료가 유래한 대상을 췌장암 환자로 진단 (또는 확인 또는 결정)하는 단계
를 포함할 수 있다.
또한, 상기 바이오마커의 측정이 시료 내 바이오마커 수준을 측정하는 것인 경우, 상기 방법은,
(a) 대상으로부터 분리된 혈액 시료에서 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계, 및
(b) (i) 상기 혈액 시료에서 측정된 바이오마커 수준을 비교대상시료 내의 바이오마커의 수준과 비교하는 단계,
(ii) 시료에서 측정된 바이오마커의 수준이 비교대상시료보다 높은 경우, 상기 시료 또는 상기 시료가 유래한 대상을 췌장암 환자로 진단 (또는 확인 또는 결정)하는 단계, 또는
(iii) 상기 단계 (i) 및 (ii) 모두
를 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법은 상기, 단계 (b) (단계 (i) 및/또는 (ii)) 이전에, 비교대상시료 내의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서, “바이오마커의 수준이 높다”함은 시료 내 바이오마커의 농도 또는 상기 바이오마커를 발현하는 세포의 수가 비교대상시료 대비 약 1.1배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.8배 이상, 약 2배 이상, 약 2.5배 이상, 약 3배 이상, 약 3.5배 이상, 약 4배 이상, 약 4.5배 이상, 또는 약 5배 이상인 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단 방법 또는 췌장암 진단에 정보를 제공하는 방법은, 상기 검출하는 단계, 비교하는 단계, 또는 진단하는 단계 이후에,
(c) 췌장암 환자로 진단된 대상에게 췌장암 치료를 수행하는 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
상기 췌장암 치료는 췌장암 치료제(예컨대, 항암제: 5-플루오로유라실(5-fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 타르세바(tarceva; erlotinib), 항체 등)의 투여와 같은 화학적 요법, 방사선 치료, 외과적 수술, 또는 이들 중 2 이상의 조합을 의미할 수 있다.
혈액 시료
본 명세서에서 제공되는 췌장암 진단용 조성물, 키트 및 방법의 적용 가능한 진단 대상 시료 또는 혈액 시료는 진단 대상으로부터 얻어진 (또는 분리된 또는 유래한) 액상 생검 (liquid biopsy), 예를 들면, 혈액, 혈청, 혈장, 및/또는 이들로부터 분리된 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 일 예에서, 상기 시료는 진단 대상으로부터 분리된 버피 코트를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 버피 코트 (buffy coat)는 혈액의 원심분리시 상부의 혈장 (plasma) 층과 하부의 적혈구 층 사이에 형성된 전체 백혈구 층을 의미하는 것으로, 혈액에서 혈장과 적혈구를 제외한 성분 (예컨대, 단핵구, 과립구, 림프구 등)들의 혼합물이고, 말초혈액 단핵구 (peripheral blood mononuclear cell; PBMC)와 명확하게 구별되는 의미로 사용된다 (도 3 참조). 본 명세서에서 사용된 혈액 시료는 혈액 유래 버피 코트일 수 있으며, 말초혈액 단핵구로만 이루어진 시료는 아닌 것일 수 있다.
일 예에서, 버피 코트는 혈액을 다음의 조건 (1) 내지 (3) 중 선택된 하나 이상 (1, 2, 또는 3개)의 조건에서 원심분리하여 위에서부터 순차적으로 얻어진 혈장 층 (위), 버피 코트 층(중간), 및 적혈구 층 (아래) 중에서 중간의 버피 코트 층으로부터 얻어진 것일 수 있다:
(1) 온도: 2 내지 10℃, 2 내지 8℃, 2 내지 6℃, 2 내지 5℃, 2 내지 4℃, 3 내지 10℃, 3 내지 8℃, 3 내지 6℃, 3 내지 5℃, 3 내지 4℃, 4 내지 10℃, 4 내지 8℃, 4 내지 6℃, 또는 4 내지 5℃;
(2) 속도: 500g 내지 1000g, 600g 내지 1000g, 700g 내지 1000g, 800g 내지 1000g, 500g 내지 900g, 600g 내지 900g, 700g 내지 900g, 800g 내지 900g, 500g 내지 800g, 600g 내지 800g, 또는 700g 내지 800g; 및
(3) 시간: 5 내지 20분, 7 내지 20분, 9 내지 20분, 5 내지 15분, 7 내지 15분, 9 내지 15분, 5 내지 12분, 7 내지 12분, 또는 9 내지 12분 동안.
본 명세서에서, 진단 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류 중에서 선택될 수 있으며, 췌장암 진단을 필요로 하는 개체일 수 있다.
본 명세서에서, 비교대상시료는 정상 (예컨대, 췌장암을 앓지 않는) 개체로부터 얻어진 (또는 분리된 또는 유래한) 시료로서, 예컨대, 상기 정상 개체는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류 중에서 선택된 것으로 상기 진단 대상과 동종의 개체일 수 있고, 비교대상시료는 상기 비교대상으로부터 이로부터 얻어진 (또는 분리된 또는 유래한) 혈액, 혈청, 혈장, 및/또는 이들로부터 분리된 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 버피 코트를 포함하는 것일 수 있다.
췌장암 치료제의 스크리닝
다른 예에서, 후보 화합물 처리시의 상기 바이오마커의 수준을 측정하여 췌장암 치료 약물의 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 스크리닝 방법은,
생물 시료에 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
상기 생물 시료에서의 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 후보 화합물을 접촉시킨 생물 시료에서의 바이오마커의 수준을 후보 물질을 접촉시키지 않은 생물 시료에서의 유비퀴틴 분해효소 및/또는 이를 암호화하는 유전자의 수준과 비교하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 비교하는 단계는 동일한 생물 시료에 대하여 후보 화합물 접촉(처리) 전 후의 바이오마커의 수준을 각각 측정하여 이를 비교하거나, 생물 시료 중 일부에만 후보 화합물을 접촉시키고, 후보 화합물을 접촉시킨 부분과 후보 화합물을 접촉시키지 않은 부분의 바이오마커의 수준을 각각 측정하여 이를 비교함으로써 수행될 수 있다.
상기 후보 화합물을 접촉시킨 생물 시료에서의 바이오마커의 수준이 후보 물질을 접촉시키지 않은 생물 시료에서의 바이오마커의 수준보다 감소한 경우, 즉 상기 후보 화합물이 생물 시료에서 바이오마커 수준을 감소시키거나 발현을 저해한 경우, 상기 후보 화합물을 췌장암의 예방 및/또는 치료 약물의 후보 물질로 판단할 수 있다.
상기 생물 시료는 생체, 예컨대, 췌장암 환자로부터 얻어진 (또는 분리된 또는 유래한) 혈액, 혈청, 혈장, 및/또는 이들로부터 분리된 세포를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 버피 코트를 포함하는 것일 수 있다.
상기 후보 화합물은 각종 화합물, 예컨대, 소분자 화합물, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 식물 또는 동물의 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것이 수 있다.
상기 생물 시료에서의 바이오마커의 수준 측정은 통상의 유전자 또는 단백질 정량 검출 수단에 의하여 측정하거나, 및/또는 측정된 결과를 평가하여 수행할 수 있다. 그 구체적인 측정 수단은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명을 통하여, 환자 유래 혈액만으로 비침습적이고, 간단하면서도 높은 정확도로 췌장암을 조기에 진단할 수 있으므로, 기존의 조직검사가 필요하여 조기 진단이 어려웠던 문제를 해결할 수 있다.
도 1은 췌장암 환자와 일반인으로부터 얻어진 버피 코트 시료와 PBMC 시료에서의 IL-29의 발현량 차이를 보여주는 그래프이다.
도 2는 췌장암 환자와 일반인으로부터 얻어진 버피 코트 시료와 PBMC 시료에서의 IL-28의 발현량 차이를 보여주는 그래프이다.
도 3은 버피 코트 시료 준비 과정을 PBMC 시료와 비교하여 비교하여 예시적으로 보여주는 모식도이다.
이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
실시예 1: 시료의 준비
1.1. 버피 코트 (buffy coat) 시료의 준비
췌장암에서 췌장암 바이오마커의 발현변화를 확인하기 위하여, 췌장암 환자의 혈액 유래 버피 코트(buffy coat)에서 IL-29, 및 IL-28의 mRNA 발현을 확인하였다. 추가적으로, 대조군으로 췌장암 바이오마커로 이미 알려진 GPC-1(Glypican-1)의 mRNA 발현을 확인하였다. 또한, 비교를 위하여, 췌장암을 앓지 않는 일반인 혈액 유래의 버피 코트에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.
먼저, 췌장암 환자 42명과 췌장염환자 18명, 담도암 환자 18명 및 정상 대조군 24명의 혈액 5 cc를 EDTA 튜브에 채취하여 상온에 보관하였다. 혈액이 든 EDTA 튜브를 4 ℃에서 800g로 10분간 원심분리하였다. 혈장, 버피 코트 그리고 적혈구 순으로 분리된 혈액에서 혈장을 제거하고 버피 코트 250 μl를 회수하여 -80℃에 보관하였다.
NucleoSpin® RNA Blood kit (MACHEREY-NAGEL)를 이용하여 권장하는 프로토콜에 따라, 냉동 보관된 버피 코트 250 μl에서 total RNA를 추출하였다. 1 μl의 RNA를 사용하여 cDNA 합성하였다. cDNA 합성 kit는 GoScript™ Reverse Transcription system kit (Promega)를 사용하였다.
1.2. 말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell,　PBMC) 시료의 준비
췌장암에서 췌장암 바이오마커의 발현변화를 확인하기 위하여, 췌장암 환자의 혈액 유래 말초혈액 단핵구에서 IL-29, 및 IL-28 (IL-28A)의 mRNA 발현을 확인하였다. 추가적으로, 추가적으로, 대조군으로 췌장암 바이오마커로 이미 알려진 GPC-1(Glypican-1)의 mRNA 발현을 확인하였다. 또한, 비교를 위하여, 췌장암을 앓지 않는 일반인 혈액 유래의 말초혈액 단핵구에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다.
먼저, 췌장암 환자 42명과 췌장염환자 18명, 담도암 환자 18명 및 정상 대조군 24명의 혈액 5 cc를 EDTA 튜브에 채취하여 상온에 보관하였다. 혈액의 점도가 높을 경우 단핵구의 분리가 어려우므로, 1X PBS에 1:1로 희석하여 준비하였다. 15ml 코니칼 튜브(conical tube)에 비중차이가 나는 림프구 분리 용액(Lymphosep™, L0560-500, biowest)을 준비하고, 피콜 위에 혈액 샘플이 섞이지 않게 첨가하였다. 가속과 감속을 최소로 하여 800g로 30분 동안 원심분리하면, 비중이 다른 혈장, 말초혈액 단핵구(PBMC), Lymphosep, 과립구와 적혈구 순으로 분리된다. 중간에 흰 세포층(단핵구)을 따로 회수한 뒤 PBS를 첨가하여 400g로 3분 동안 원심분리하며 2회 세척한 후 사용하였으며, 나머지는 -80℃에 보관하였다.
상기와 같이 준비된 PBMC에 Trizol 1 ml을 첨가하여 뭉쳐 있는 세포를 부유 시킨 뒤, chloroform 200 μl을 첨가하여 12,000g에서 15분 동안 원심분리 하였다. 제일 위의 투명한 상층액만 분리하여 상층액과 동일한 양의 isopropanol을 넣고 잘 섞어준 뒤 12,000g에서 15분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 모두 제거하고 75% ethanol 1 ml을 첨가하여 12,000g에서 10분 동안 원심분리하여 세척하였다. 상층액을 모두 제거하고 1시간 동안 충분히 건조 시켰다. Nuclease free water 30 μl를 첨가하여 RNA pellet을 충분히 녹여 RNA 농도를 측정하였고 cDNA 합성에 1 μg의 RNA를 사용하였다. cDNA 합성은 GoScript™ Reverse Transcription system kit (Promega)를 사용하였다.
실시예 2. Real-time qPCR
상기 실시예 1에서 준비된 시료에서의 유전자 발현은 Real-time qPCR으로 측정하였으며, 상기 Real-time qPCR은 probe-based multiplex PCR로 진행하였다. Multiplex PCR을 위해, 마커인 IL-29 (GenBank Accession No. NM_172140.2), 및 IL-28A (GenBank Accession No. NM_172138.2; 이하 IL-28라고 칭함) 각각의 프로브는 FAM dye로 표지하고, 대조군으로 사용하기 위한 GAPDH는 HEX dye로 표지하였다. 프라이머와 프로브는 IDT(Integrated DNA Technologies, Inc.)에서 구매하여 사용하였다.
시료에서 각 유전자 발현을 확인하기 위해, GoTaq® Probe qPCR Master Mix (Promega)의 프로토콜에 따라 최종 볼륨 20 μl에 맞추어 준비하였다. 유전자 발현 시험은 QuantStudio 3, 5 Real-Time PCR 시스템(Applated Biosystems) 장비를 사용하여 수행하였으며, 장비의 소프트웨어에서 제공하는 Standard Cycling 조건 하에 이루어졌다. Real-time qPCR 결과는 시료에서 측정된 IL-29, 및 IL-28의 mRNA 발현 수준인 Ct 값과 GAPDH mRNA 발현 수준 Ct 값을 추출하고, 시료의 IL-29, 및 IL-28 mRNA 발현 수준과 GAPDH mRNA 발현 수준의 차이를 계산하여 얻어진 ΔCt 값으로 나타내었다. mRNA 발현을 비교하기 위한 모든 데이터는 ΔCt를 사용하여 분석하였다.
사용된 프라이머와 프로브의 핵산서열(5'→3')을 다음의 표 2에 나타내었다:
서열(5'→3') 서열번호
IL-29_F primer GGT TCA AAT CTC TGT CAC CAC A 4
IL-29_R primer GAA GAC AGG AGA GCT GCA AC 5
IL-28A_F primer CAG CCT CAG AGT GTT TCT TCT 6
IL-28A_R primer TCC AGT CAC GGT CAG CA 7
GPC-1_F primer GTC ATG AAG CTG GTC TAC TG 8
GPC-1_R primer AGC CCT TGA GCA CAT TTC 9
IL-29_Probe FAM/TCAAGAAGG/ZEN/CCAGGGACGCC/IBFQ 10
IL-28_Probe FAM-TCATGTCTA/ZEN/GTTTCATTCCTGATCTCTGGTCT-IBFQ 11
(상기 표 2에서, 프로브는 5' FAM dye, internal ZEN Quencher, 및 3' Iowa Black® Fluorescent Quencher (IBFQ)를 포함하는 구조임)
실시예 3: 각 시료에서의 마커 발현 측정
상기 실시예 2에서 수행된 Real-time qPCR의 결과를 도 1 및 도 2 에 각각 나타내었다.
도 1은 췌장암 환자와 일반인으로부터 얻어진 버피 코트 시료와 PBMC 시료에서의 IL-29의 발현량 차이를 보여주는 그래프이다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, 버피 코트 시료의 경우, 췌장암 환자에서의 IL-29의 평균 ΔCt 값이 일반인에서와 비교하여 유의하게 감소한 반면, PBMC 시료에서는 췌장암 환자의 IL-29의 평균 ΔCt 값이 일반인 대비 오히려 증가하였으며, 그 차이도 유의미한 정도로 나타나지 않았다. 상기 얻어진 결과로부터, 일반인과 비교하여, 췌장암 환자에서 IL-29의 발현 수준이 유의하게 증가함을 알 수 있고, 이와 같은 췌장암 환자에서의 IL-29 발현 수준 변화 양상은 PBMC 시료와 유의미한 차이를 보이는 것으로 확인되었다.
도 2는 췌장암 환자와 일반인으로부터 얻어진 버피 코트 시료와 PBMC 시료에서의 IL-28의 발현량 차이를 보여주는 그래프이다. 도 3에서 확인되는 바와 같이, 버피 코트 시료의 경우, 췌장암 환자에서의 IL-28의 평균 ΔCt 값이 일반인에서와 비교하여 유의하게 감소한 반면, PBMC 시료에서는 췌장암 환자의 IL-28의 평균 ΔCt 값이 일반인 대비 오히려 증가하였으며, 그 차이도 유의미한 정도로 나타나지 않았다. 상기 얻어진 결과로부터, 일반인과 비교하여, 췌장암 환자에서 IL-28의 발현 수준이 유의하게 증가함을 알 수 있고, 이와 같은 췌장암 환자에서의 IL-28 발현 수준 변화 양상은 PBMC 시료와 유의미한 차이를 보이는 것으로 확인되었다.
상기 결과를 종합할 때, IL-29, 및 IL-28는 모두 췌장암 환자와 일반인 간 발현 수준이 유의한 차이를 보여서 췌장암 마커로서 유용하며, 이들 마커를 사용하는 경우, PBMC 시료와 비교하여 버피 코트 시료로부터 보다 유의성 높은 결과를 얻을 수 있음을 보여준다. 또한, IL-29, 및 IL-28 중에서, 특히 IL-28이 췌장암 환자와 일반인 간 가장 큰 차이를 나타내었다.
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Claims (8)

  1. 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출 가능한 제제를 포함하고,
    혈액 유래 버피 코트(buffy coat)에 사용하기 위한 것이며,
    상기 버피 코트는 혈액의 원심분리시 상부의 혈장 층과 하부의 적혈구 층 사이에 형성된 전체 백혈구 층으로, 혈액을 다음의 조건 (1) 내지 (3) 중 선택된 하나 이상의 조건에서 원심분리하여 위에서부터 순차적으로 얻어진 혈장 층 (위), 버피 코트 층(중간), 및 적혈구 층 (아래) 중에서 중간의 버피 코트 층으로부터 얻어지는 것인, 췌장암 진단용 조성물:
    (1) 온도: 2 내지 10℃;
    (2) 속도: 500g 내지 1000g; 및
    (3) 시간: 5 내지 20분 동안.
  2. 제1항에 있어서, 상기 버피 코트는 혈액을 다음의 조건 (1) 내지 (3) 중 선택된 하나 이상의 조건에서 원심분리하여 위에서부터 순차적으로 얻어진 혈장 층 (위), 버피 코트 층(중간), 및 적혈구 층 (아래) 중에서 중간의 버피 코트 층으로부터 얻어지는 것인, 췌장암 진단용 조성물:
    (1) 온도: 2 내지 8℃;
    (2) 속도: 600g 내지 1000g; 및
    (3) 시간: 7 내지 20분 동안.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 검출 가능한 제제는 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 결합하는 소분자 화합물, 단백질, 펩타이드, 및 핵산 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 췌장암 진단용 조성물.
  4. 제1항의 췌장암 진단용 조성물을 포함하는, 췌장암 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 버피 코트는 혈액을 다음의 조건 (1) 내지 (3) 중 선택된 하나 이상의 조건에서 원심분리하여 위에서부터 순차적으로 얻어진 혈장 층 (위), 버피 코트 층(중간), 및 적혈구 층 (아래) 중에서 중간의 버피 코트 층으로부터 얻어지는 것인, 췌장암 진단용 키트:
    (1) 온도: 2 내지 8℃;
    (2) 속도: 600g 내지 1000g; 및
    (3) 시간: 7 내지 20분 동안.
  6. 대상으로부터 분리된 혈액 시료에서 인터류킨 28, 인터류킨 29, 및 이들의 암호화 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 혈액 시료는 혈액 유래 버피 코트(buffy coat)이며,
    상기 버피 코트는 혈액의 원심분리시 상부의 혈장 층과 하부의 적혈구 층 사이에 형성된 전체 백혈구 층으로, 혈액을 다음의 조건 (1) 내지 (3) 중 선택된 하나 이상의 조건에서 원심분리하여 위에서부터 순차적으로 얻어진 혈장 층 (위), 버피 코트 층(중간), 및 적혈구 층 (아래) 중에서 중간의 버피 코트 층으로부터 얻어지는 것인, 췌장암 진단에 정보를 제공하는 방법:
    (1) 온도: 2 내지 10℃;
    (2) 속도: 500g 내지 1000g; 및
    (3) 시간: 5 내지 20분 동안.
  7. 제6항에 있어서, 상기 검출하는 단계 이후에,
    상기 혈액 시료 내에 상기 바이오마커가 존재하거나, 정상 시료보다 높은 수준으로 존재하는 경우, 상기 시료 또는 상기 시료가 유래한 대상을 췌장암 환자로 확인하는 단계
    를 추가로 포함하는, 췌장암 진단에 정보를 제공하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 버피 코트는 혈액을 다음의 조건 (1) 내지 (3) 중 선택된 하나 이상의 조건에서 원심분리하여 위에서부터 순차적으로 얻어진 혈장 층 (위), 버피 코트 층(중간), 및 적혈구 층 (아래) 중에서 중간의 버피 코트 층으로부터 얻어지는 것인, 췌장암 진단에 정보를 제공하는 방법:
    (1) 온도: 2 내지 8℃;
    (2) 속도: 600g 내지 1000g; 및
    (3) 시간: 7 내지 20분 동안.
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