CN104395756A - 头颈癌预断方法 - Google Patents

Abstract

本发明指出用于确定头颈癌病患预断的改善方法。本发明还指出包括有利于确定头颈癌预断的试剂的工具。

Description

头颈癌预断方法

相关申请的交叉引用

本申请“头颈癌预断方法”具有美国序列号（Atty. Docket No.UNC12004usv）,其请求于2012年6月18日海耶斯等人申请的专利申请号为US61/661,060的美国申请的优先权，本文所公开的通过结合参考全部引用于此。

联邦政府赞助的研究或发展

本发明在由美国国立卫生研究院授予的批准号K12-RR-023248的政府支持下做出的。美国政府拥有本发明的某些权利。

本发明领域

本发明一般涉及对用于确定病患具有头颈癌预判的改进方法的探索。本发明也旨在于包括有利于确定头颈癌预断的试剂的工具。

2、本发明背景

2.1 HPV 和头颈癌

头颈部鳞状细胞癌的诊断（HNSCC）约占所有癌症的3-5%，评估2010年在美国有49000例新病例和1100例死亡（杰马勒等人，2010；国立癌症研究院，2005）。最新流行病学数据显示在平常不吸烟且不饮酒的年轻人中发生率增加（库拉多&哈希贝，2009；马茹等人，2010；帕特尔等人，2011；尚茨&于，2002；施博思科等人，2005），这些归因于人类乳头瘤（HPV）病毒感染（查图维迪等人, 2011；达尔斯特兰德 等人, 2004；埃尔-莫福提&陆, 2003;弗兰切斯基等人, 1996；福密斯等人, 2007）。HPV阳性肿瘤通常发现在口咽部，且对治疗（法赫里等人, 2008）具有较好响应和较好疾病结果（昂等人, 2010；哈弗卡姆等人, 2008）。这里对病患HPV状态的知识在疾病管理方面日益发挥作用有重要共识。

但是，在HPV感染的上下文中的风险评估有着持续挑战。可能其中主要挑战是感染诊断测试有局限性，以及次要挑战是对于吸烟似乎降低HPV相关癌症病患良好结果的原因并不清楚。这里有两大类的HPV试验。第一类是对病毒本身包括聚合酶链反应、免疫组织化学(1 hc),和原位杂交的测试。另外，HPV状态可通过在HPV感染设置中通常高度表达的p16生物标识物进行间接评估。HPV检测直接遭受多种局限，包括依赖于设置原因的假阳性和假阴性而进行广泛检查（吉利森等人, 2000;哈等人, 2002;施落耶&格里尔, 1991 ;史蒂文等人, 201 1 ;泰尔米内等人, 2008）。最近，大量临床试验已经解决了假阳性问题，主要通过仅在口咽部评估HPV，假定在口咽部外的最积极测试为假阳性。假阳性的问题已屡次被解决，通过添加与感染高度相关联的生物标识物p16，因其通常被认为HPV原位杂交比p16染色较不敏感而更具有特效性(贝谷姆等人，2007;沙赫等人, 2011;史蒂文等人, 2011)。事实上，最近研究一致显示所述两个生物标识物有良好相关性，几乎所有HPV阳性样本着色p16(贝谷姆等人，2007)。有趣地是，但是p16阳性、HPV阴性的口咽肿瘤也有一致模式，大约20%(昂等人, 2010)。引人注目地是，p16阴性、HPV阳性肿瘤是罕见的，然而，最常见的p16阳性、HPV阴性例子归因于HPV失败测试，诸如HPV亚型的存在不由试验评估。这样的解释未能解决p16在口咽部外经常与HNSCC成阳性的事实，在口咽部外的HPV感染通常被归类为一种罕见时间。有趣的是，p16阳性在口咽部内似乎是良好结果的至少一标识，与HPV样本是否也被着色无关(昂等人, 2010;瑞莫尔斯等人, 2007)。然而在口咽部外p16很少被报告认为是一良好标识（哈里斯等人，2010b）。

另外，涉及肿瘤点（口咽部）和p16生物标识物和/或HPV的复杂情况的事实是风险也因吸烟而改变（昂等人，2010）。具有较大吸烟史的病患似乎明显地相对于不吸烟HPV/p16阳性口咽部病例具有良好结果，原因并未被生物标识物染色解释。昂等人记录具有积极吸烟历史HPV3年的病患至少有30%的死亡机率（昂等人, 2010)。这里几乎没问题，HPV阳性/p16阳性非吸烟病患有较良好结果。但是，在高度或适度吸烟率的病患人群众，这仍然是值得评估病患超越HPV状态生存。

2.2头颈癌分子亚型

与HNSCC相关的风险因素包括吸烟、酒精使用、罕见的胚胎癌综合征、人类乳头瘤（HPV）。尽管肿瘤点、TNM阶段和HPV状态有利于在预断和治疗时分层病患人群（2），显著缺点存在在基于这些因素的病患结果特点。例如，虽然人们普遍认识到HPV+病患比HPV-病患具有较好结果，但该良好状态甚至因适度吸烟史而显著减弱（3）。另外，在HPV-病患中且其具有至少一个阳性淋巴结，整体疾病死亡率可接近50%，很少有可靠生物风险因素将那些好的从不好的中分离（4）。许多最近研究结果显示分子标识物提供有用信息，以补充传统诊断数据。不幸地是，大量的假定标识和通常小样本大小挑战所述领域，识别最相关模式以追求首要目标。

我们组和其他组提出癌症分子亚型作为一种方式，以在一特定肿瘤组中优先主导基因模式（5-7）。主要基于乳腺癌、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、肺癌的基因表达（GE）性能分析的验证性亚型及其他组获得广泛兴趣（5-7）。初步研究工作表明这分子组也在头颈癌中被发现（8），但未有确定的研究完成。一个限制HNSCC调查的问题事实上是在所述亚型情况下被评估的细胞系未能传达准备模型系统。此外,没有数据支持底层特定亚型基因变化，尚未出现去建议基因表达模式的具体病因。尽管这是对HNSCC亚型中的一个有临床优势的建议，但群体很小且所述发现并没有被重复。在我们看来，,对于HNSCC亚型作为一模型向前移动以理解疾病的复杂设置，后续进步是需要的。所述亚型应被统计验证显示，在亚型下的基因改变应被记录，并且至少初步模型系统被建议。

尽管最近进步，癌症治疗的挑战仍旨在于对致病性不同的肿瘤类型进行特定治疗养生法，并为了扩大结果最终将肿瘤个性化治疗。尤其是，当病患一旦被诊断为有癌症，如头颈癌，需要方法允许医生预测预期病程，包括癌症复发可能、病患长期生存等，并且相应选择合适治疗方案。这些方法应明确区分头颈癌好的预断和坏的预断，并且允许识别高风险、早期阶段的头颈癌患者，该患者可能需要积极治疗。

3、本发明小结

尤其是非限制性实施例，本发明提供了一种确定病患头颈癌的预断方法，它包括：（a）获得一个合适的病患样本；（b）测量一核p16表达水平；以及（c）比较核p16表达水平和对照样本的病患样本表达水平，其中核p16表达水平是头颈癌病患的预断标示。

在另一实施例中，本发明提供了一种确定头颈癌病患的预断方法，它包括：（a）获得一个合适的病患样本；（b）测量CCND1水平；以及（c）比较CCND1水平和对照样本的病患的CCND1水平，其中所述CCND1水平是头颈癌病患的预断标示。

在另一实施例中，本发明提供了一种确定实体瘤病患的预断方法，其包括：（a）获得一个合适的病患样本；（b）测量p16和RBI基因型，一CCND1拷贝数（copy number）

和p16核蛋白质表达水平；以及（c）比较p16和RBI基因型、CCD1拷贝数、p16核蛋白质表达水平和相关对照样本的病患样本p16和RBI基因型、CCD1拷贝数、p16核蛋白质表达水平，其中p16和RBI基因型、CCD1拷贝数、p16核蛋白质表达水平是固体瘤病患的预断标示。

本发明也提供了确定一合适放疗和/或化疗方案和癌症复发可能性以及监测头颈癌病患治疗方案进展的方法，其包括：（a）获得一合适病患样本；（b）测量核p16表达水平；（c）比较核p16表达水平和相关对照样本的病患样本表达水平，其中所述核p16表达水平是合适放疗和/或化疗方案、所述癌症复发可能性或监测头颈癌病患治疗方案进展的标识。

本文还提供一用于实践本文所述方法的工具。

4、附图说明

图1：图1A（板A）示出了CDKN2A轨迹和p161NK4a变化率。图 1B（板B）示出了p161NK4a（变异的，甲基化的，RBI变化的或融合）形式间的关系。图1C（板C）示出了K1AA1797和p161NK4a的融合。图1D（板D）示出了p161NK4a、RBI、CDK6、CCND1变化。

图2：头颈鳞状细胞癌p16免疫染色的代表性示例。对头颈鳞状细胞癌p16表达的免疫组织化学染色分别由在不同细胞区间的产品分数（product scores）评估。从上述左边：（板A）p16在细胞核和细胞质中高表达；（板B）p16在细胞核和细胞质中低表达；（板C）高核表达和适度细胞质染色（但是，通过记录最低端仍然合格的“高细胞质”）；（板D）高细胞质表达和低核表达。

图3：染色产品分数p16的分布。

图4A和4B：卡普兰 迈耶依据在整个研究群体中的p16表达，估计总生存（图4A）和无进展生存（progression free survival）（图4B）的p16表达。所有生存评估在60个月审查。缩写：HN,高核,任意细胞质染色,HC,高细胞质、低核染色；LS,低核,低细胞质染色。

图5A-5D：头颈鳞状细胞癌的基因表达亚型。840个分类器基因表达值的热图：图5A（A）和选择基因相关HNSCC图5B（B）为每个亚型表达。在现研究中的表达亚型和来自钟等人图5C(C)和威尔克森等人图5D（D）的质心之间基于质心距离的验证性热图。

图6A-6B:拷贝数在表达亚型中的增益和损耗。在去除平滑和离群值后，在HNSCC表达亚型中的平均拷贝数值的图，均是全基因组（图6A）并用于特定染色体(specific chromosomes of interest)（图6B）.

图7A-7B：通过表达亚型的平均基因表达和拷贝数。扩增子chr3q基因（图7A）和其他地方的基因组（图7B）在HNSCC表达亚型中的平均特定基因拷贝数（CN）和基因表达（GE）值。

图8A-8D：表达亚型中的无复发生存（Recurrence-Free Survival）。卡普兰-迈耶画图且对数秩和检验p值比较在全部表达亚型中无复发生存次数（图8A），HPV+ vs HPV-主体（图8B），在HPV-主体中的所有表达亚型（图8C），以及在HPV主体中的AT vs 非AT（图8D）。

图9A-9D：支持四个表达亚型存在的证据。（图9A）138个主体和2500个变化最大基因（k=4）的共识集群加不相似矩阵（ConsensusClusterPlus dissimilarity matrix）。（图9B）138个主体和2500个变化最大基因的共识集群加追踪图（ConsensusClusterPlus tracking plot）。（图9C)138个主体和840个分类器基因的轮廓图。（图9D）所述表达亚型的所有两两比较的基因调控网络分析工具软件p-值（SigClust p-values）。

图10：CNND1拷贝数增益的卡普兰 迈耶曲线图。卡普兰 迈耶曲线使出了有和没有CCND拷贝数增益的主体的无复发生存次数。

图11：卡普兰·迈耶曲线示出了两组差的生存结果。卡普兰·迈耶曲线示出了互相排斥病患组的无复发生存次数：（1）HPV+主体（HPV+），（2）有CCND1增益的HPV-病患（CCND1增益），（3）无CCND1增益的HPV-病患，该增益是AT（HPV-AT），(4)所有剩余病患（其他）。

图12：在HNSCC细胞系中的全组基因平均拷贝数。基于在癌细胞系百科数据中所述HNSCC样本的每个预测亚型的平均拷贝数值的全基因组图。

5、本发明详细说明

在本发明非限制性实施例中，本发明提供了一种确定头颈癌病患的预断方法，其包括：（a）获得一个合适病患样本；（b）测量一核p16表达水平；以及（c）比较核p16表达水平和对照样本的病患样本表达水平，其中所述核p16表达水平是所述头颈癌病患的预断标识。

在另一实施例中，本发明提供了一种确定头颈癌病患的预断方法，它包括：（a）获得一个合适的病患样本；（b）测量CCND1水平；以及（c）比较CCND1水平和对照样本的病患的CCND1水平，其中所述CCND1水平是头颈癌病患的预断标示。

在另一实施例中，本发明提供了一种确定实体瘤病患的预断方法，其包括：（a）获得一个合适的病患样本；（b）测量p16和RBI基因型，一CCND1拷贝数（copy number）

和p16核蛋白质表达水平；以及（c）比较p16和RBI基因型、CCD1拷贝数、p16核蛋白质表达水平和相关对照样本的病患样本p16和RBI基因型、CCD1拷贝数、p16核蛋白质表达水平，其中p16和RBI基因型、CCD1拷贝数、p16核蛋白质表达水平是固体瘤病患的预断标示。

本发明实施例可进一步包括测量与一典型亚型相关的基因表达。所述实体瘤可以是固体肿瘤上皮起源、鳞状细胞癌、黑色素瘤的实体瘤。

本发明也提供了确定一合适放疗和/或化疗方案和癌症复发可能性以及监测头颈癌病患治疗方案进展的方法，其包括：（a）获得一合适病患样本；（b）测量核p16表达水平；（c）比较核p16表达水平和相关对照样本的病患样本表达水平，其中所述核p16表达水平是合适放疗和/或化疗方案、所述癌症复发可能性或监测头颈癌病患治疗方案进展的标识。

在这些方法中，核p16表达水平可能降低且所述降低量是因为变异或拷贝数损失。所述变异可以是已获得（或细胞体的）变异或者遗传突变。所述表达可因甲基化而降低。所述方法可进一步包括测量RBI和p53的水平，并且RBI或p53减低的水平混合有降低的核p16表达水平显示一差的预断。另外，所述方法可进一步包括测量CCND1水平或与一典型亚型相关的表达水平，其中增加的CCND1水平或与一典型亚型相关的表达水平是一差的预断的标识。所述方法可进一步包括测量细胞质p16表达水平，其中如果核p16表达水平降低，所述细胞质p16水平被评估显示特别差预断。

本发明还包括选择病患进行放疗和化疗的方法。尤其是，低核p16表达水平显示差的预断，因此之前会仅接受放疗作为标准治疗的病患应该都接受放疗和化疗。另外，评估后的核p16表达水平显示好的预断，因此之前都接受放疗和化疗作为标准治疗的病患应该仅接受放疗。

所述表达水平可由mRNA试验或如抗体的蛋白质试验测量。所述病患样本可以是活检样本，一FFPE样本或一淋巴结活检样本。所述头颈癌可能是一鳞状细胞癌（SCC）。所述头颈癌可能是喉咽,喉声门,喉,嘴唇、口腔、鼻咽,唾液腺,窦或声门上型喉癌 （superglottic larynx cancer）。

本发明还包括识别病患特定治疗或选择病患特点治疗是理想的或禁忌的。

上述方法可由参考实验室、医院病理实验室或一医生实现。上述方法可进一步包括一算法。例如一分析核p16、RBI和p53表达水平的算法，或一分析与头颈癌特定亚型相关的表达水平的算法。

本文还提供了实践所述方法的工具。

不同于以前描述的方法，本文所述方法可广泛应用在各种类型的头颈癌。该方法不依赖于吸烟状态或HPV状态。

p16发明

背景：头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的最新管理主要集中在生物标识物，其可能影响结果。人类乳头瘤感染测试，包括病毒和相关肿瘤抑制基因p16的直接评估，被认为是可重复的。来自家族性黑素瘤综合征的肿瘤显示p16核定位在风险分层上进一步发挥作用。我们假设被认为核定位的p16染色有用的，用以在HNSCC肿瘤更广泛设置中预测结果，不限于口咽,HPV状态或吸烟状态。

方法：从2002年至2006年在具有可利用库存组织（banked tissue）的UNC医院治疗HNSCC的病患有资格进行这项研究。组织微阵列(TMA)生成一式三份。p16免疫组织化学（Immunohistochemical）染色分别由核和细胞质染色实现和记录。人类乳头瘤病毒（HPV）染色也是使用单克隆抗体E6H4实现。P16表达、HPV状态和其他临床特征与无进展（PFS）和总生存（OS）相关联。

结果：135名病患有充分样本进行分析。诊断的平均年龄57岁（范围20-82岁），其中有68.9%男性，8.9%不吸烟者和32.6%从不喝酒。三年OS率和PFS率分别为63.0%和54,1%。基于pl6染色分数,病患分为三组:高核、任何细胞质染色组(HN)、低核、低细胞质染色组(LS)和高细胞质和低核染色组(HC)。所述HN和LS组比所述HC组具有显著更好的整体生存，危险比率分别为0.1和0.37，在其他包括HPV状态因素控制后。这两组也比所述HC染色组具有显著更好无进展生存。这个发现与在口咽部外位置一致，并不需要对吸烟状态调整。

结论：不同p16蛋白质定位以一种不需要限制口咽部生物标识物和部需要吸烟状态评估方式下，显示不同生存结果。能更精确捕捉吸烟和肿瘤点的生物学以及结合在HPV染色和p16染色间的频繁差异的生物标识物是受欢迎的。

最近我们组报道p16染色可在一组年轻HNSCC病患中预断，这些病患由PCR和原位杂交确定HPV阴性（哈里斯等人，2010b），使得我们质疑仅p16是否可被扩展用于评估口咽部外的风险。

吸烟和HPV感染是HNSCC中p16变化的两个重要病因。在HPV感染患者中，蛋白质RBI被病毒癌蛋白灭活，导致一高的核定位p16表达（安迪奥等人, 1998;李等人, 2004;马茹等人, 2010;维斯特等人, 2002）。相反地，当p16被保留但发生变异或其他基因事件而变化时，我们可观察适度至高p16表达，但有异常细胞定位。在许多其他吸烟病患中，p16可能通过更多有害遗传或表观遗传变化,如纯合子的删除,无义突变,或者甲基化和基因沉默而损失。在这些病因差异的基础上，我们期望去观察p16 IHC染色的不同模式。在预断角色中的p16相似假设在其他肿瘤类型中被检测。例如，在高级星形细胞瘤中，一研究表明核定位p16与较好疾病结果相联系，当细胞质p16显示最糟病患生存时（阿里芬等人, 2006）。在其他肿瘤类型中，包括子宫内膜癌、黑色素瘤、和星型细胞瘤(阿里芬等人，2006;艾米格等人, 1998;吉尔兹等人2004;米尔德-蓝格仕等人, 2001 ;萨尔韦森等人, 2000;斯特劳默等人2000)的报告也存在与疾病结果相关联的p16定位处。表现为在细胞核内的细胞周期抑制剂的p16蛋白质，我们提出所述核p16染色和细胞质p16染色可对HNSCC有不同预断效果。我们检测基于群体的病患群-头颈癌研究（CHANCE）的假设（We tested this hypothesis in a population-based patient cohort -the Carolina Head and Neck Cancer Study (CHANCE)）。

HNSCC亚型

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是一种异质性疾病，其潜在病因尚未被传统预断因素如肿瘤点、TNM阶段和HPV状态解释。尽管先前的研究已经检测到HNSCC分子亚型,这些亚型尚未独立数据集而被验证或在细胞系中被检测，这种分类方案的好处也没有得到充分实现。我们表明HNSCC分子亚型存在；这些亚型有不同模式的细胞质增益和损耗，一些影响典型癌基因和肿瘤抑制；以及所述亚型在生物学上和临床学上相关。另外，我们在不依赖肿瘤、细胞系和组织微阵列数据集下，验证我们的发现。这些亚型提供HNSCC病因和分类HNSCC肿瘤的有利方法新视角。

本发明生物标识物包括基因和蛋白质。这个生物标识物包括有核酸序列编码生物标识物的全部或部分序列，或者这个序列的补充的DNA。所述核酸生物标识物还包括有任何核酸序列的整个或部分序列的RNA。生物标识物蛋白质是通过或依据本发明DNA生物标识物编码的蛋白质。一生物标识物蛋白质包括任意生物标识物蛋白质或多肽的全部或部分氨基酸序列。生物标识物基因和蛋白质的片段和变异还是由本发明完成。“片段”旨在部分多核苷酸或氨基酸序列的一部分,因此蛋白质编码。多核苷酸是生物标识物核苷酸序列中的片段，其通常包括至少10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1,000, 1,200, 或 1,500 连续核苷酸，或上至存在本文公开的生物标识物多核苷酸整个长度内核苷酸数量。生物标识物的片段将通常编码至少15 , 25, 30, 50, 100, 150, 200, 或 250连续氨基酸，或上至存在在本发明生物标识物蛋白质总长中的总氨基酸长度。“变异”旨在于意味整体上相似序列。通常，本发明特定生物标识码的变异将至少约有40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 或更多由序列排列程序确定的生物标识码的序列识别。

本发明生物标识物包括基因和蛋白质。这个生物标识物包括有核酸序列编码生物标识物的全部或部分序列，或者这个序列的补充的DNA。所述核酸生物标识物还包括有任何核酸序列的整个或部分序列的RNA。生物标识物蛋白质是通过或依据本发明DNA生物标识物编码的蛋白质。一生物标识物蛋白质包括任意生物标识物蛋白质或多肽的全部或部分氨基酸序列。生物标识物基因和蛋白质的片段和变异还是由本发明完成。“片段”旨在部分多核苷酸或氨基酸序列的一部分,因此蛋白质被编码。多核苷酸是生物标识物核苷酸序列中的片段，其通常包括至少10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1,000, 1,200, 或 1,500 连续核苷酸，或上至存在本文公开的生物标识物多核苷酸整个长度内核苷酸数量。生物标识物的片段将通常编码至少15 , 25, 30, 50, 100, 150, 200, 或 250连续氨基酸，或上至存在在本发明生物标识物蛋白质总长中的总氨基酸长度。“变异”旨在于意味整体上相似序列。通常，本发明特定生物标识码的变异将至少约有40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 或更多由序列排列程序确定的生物标识码的序列识别。

一“生物标识物”是一基因或蛋白质，其组织或细胞内的表达水平相较于正常或健康细胞或组织表达水平是变化的。本发明生物标识物是基因和蛋白质，其过表达与癌症相关，尤其是头颈癌，预断。正如在此使用的，“过表达”意味着该表达超过检测为正常、非癌变组织的表达。例如，在癌细胞或组织中过表达的一RNA转录物（transcript）或其表达产物可表达为一高于1.5倍正常、非癌变细胞或组织的水平，如高于2倍、3倍、5倍或更高倍。

在一些实施例中，过表达，如RNA转录物或其表达产物的过表达，通过对参考RNA转录物或其表达产物标准化而确定，其可被全部测量样本中的转录物（或其产物）或者RNA转录物（或其产物）的特定参考设置。标准化被执行以纠正或正常化RNA试验中的差异和所用RNA质量中的变化。因此，试验通常测量并包含某些标准化基因表达，包括已知管家基因，例如，GAPDH和/或肌动蛋白（β-Actin）。另外，标准化可基于被试验生物标识物或大的子集（全球标准化方法）的均值或中位值信号。

在特定实施例中，在病患样本中的一生物标识码或生物标识码混合的选择性过表达是差的癌症预断的标识。通过“差的预断标识”旨在特定生物标识物或标识物混合的过表达，与潜在癌症或肿瘤、转移或死亡复发或再现的可能性增加有关。例如，“差的预断的标识”可指的是潜在癌或肿瘤在十年内，如5年内转移或死亡复发或再现的可能性增加。本发明的另一方面，生物标识物或生物标识物混合的过表达的不存在是好的预断的标识。正如此处使用，“好的预断标识”指的是病患仍无癌的可能性增加。在一些实施例中，“好的预断标识”指的是病患十年仍无癌的可能性增加，如5年。

5.1 样本

在特定实施例中，用于评估头颈癌的预断方法包括收集一有癌细胞或组织的病患身体样本，如头颈癌组织样本或初级头颈肿瘤组织样本。所述头颈样本可以是来自下述三个解剖区域的喉头：（1）声门上喉包括会厌、假声带,心室、杓状会厌襞和杓状软骨;（2）声门包括真正的声带和前、后接合处;以及声门下区域在真正声带低于约1厘米开始并延伸至所述环状软骨或第一个气管环的较低边。所述样本可能是从嘴唇或口腔,例如,颊粘膜、较低齿龈、上齿龈、硬腭、嘴唇、口腔底, 磨牙后三角 （retromolar trigone）或前2/3舌头。所述样本可能是来自口咽部，例如，所述舌根包括咽会厌襞（pharyngoepiglottic folds）与舌会厌襞（glossoepiglottic folds）；所述扁桃体区域包括窝和前后柱；软腭包括悬雍垂或咽壁。

通过“身体样本”旨在于任何细胞、组织或体液取样，其中生物标识物的表达可被检测到。这个身体样本例子包括，但不限于，活检和涂片。本发明中有用的体液包括血液、淋巴、尿液、唾液、乳头送气,妇科液体,或任何其他身体分泌物或衍生物。血液可包括全血、血浆、血清或任何血的衍生物。在一些实施例中，所述身体样本包括头颈细胞，尤其是来自活检的头颈组织，如头颈肿瘤组织样本。身体组织可以通过多种技术从病患处获得，例如，通过刮或擦面积，或使用针吸细胞或体液,或通过移除组织样本(即活检)。收集多种身体样本的方法在现有技术中已知。在一些实施例中，头颈组织样本通过，例如细针穿刺、芯针吸活组织检查或切除活检获得。定色的和染色的方案被应用到保护样本和便于检验的细胞或组织。身体样本，尤其是头颈组织样本，可被转移至载玻片进行放大查看。在一实施例中，所述身体样本是福尔马林固定的（formalin-fixed），石蜡包埋（FFPE）头颈组织样本，尤其是初级头颈肿瘤样本。

5.2成分和工具

本发明提供一种确定宫颈癌病患预断的工具和成分，其包括：（a）测量核p16表达水平的手段；以及（b）比较来自病患样本的核p16表达水平和对照病患样本的核p16表达水平的指令，其中降低的核p16表达水平是头颈癌病患的差的预断的标识。

另外，本发明提供一工具，选自组的试剂包括：（a）能够专门与来自p16的核酸混合的核酸探针；（b）一对能PCR扩增的p16核酸引物；（c）p16特定抗体；（d）用于测量来自头颈癌病患组织样本的核p16表达水平的指令。

本文包含用于检测生物标识物表达的现有技术中任何可用方法。本发明生物标识物的表达可在核酸水平上被检测（如，RNA转录物）或蛋白质水平。通过“检测表达”旨在确定RNA转录物或其生物标识物基因的表达产物的数量或存在。因此，“检测表达”包含一生物标识物被确定不能被表达、不能被检测表达，表达在低水平、表达在正常水平或过表达的实例。为了确定过表达，被检查的所述身体样本能够与相应的来自健康人的身体样本比较。那就是说，所述表达的“正常”水平是生物标识物的表达水平，例如在来自人类主体或未被头颈癌折磨的病患的宫颈组织样本中的生物标识物表达水平。这个样本可以以标准化形式呈现。在一些实施例中，生物标识物过表达的确定需不比较身体样本和相应来自健康人的身体样本。例如，在头颈肿瘤样本中差的预断生物标识物标识的过表达检测可排除与相应来自健康人的头颈组织样本的比较需要。另外，在本发明一些方面中，生物标识物或生物标识物混合的没表达、低表达或正常表达（即过表达缺少）提供了有用信息，关于头颈癌病患预断。

本发明生物标识物表达检测方法，即，基因表达谱，包括基于多核苷酸的杂交分析方法、基于多核苷酸序列方法、免疫组织化学方法以及基于蛋白质组学方法。在现有技术中已知且最常使用用于一样本mRNA表达定量的方法包括北方墨法（northern blotting）原位杂交（帕克和巴恩斯 , 摩尔方法，生物学106:247-83, 1999）RNA保护试验（霍德, 生物学技术 13:852-54, 1992）、基于PCR方法，如反向转录物PCR（RT-PCR）(威尔斯 等人, TIG 8:263-64, 1992)，以及基于阵列方法（思科那 等人, 科学270:467-70, 1995）。另外，抗体可被使用识别特定链体，包括DNA链体、RNA链体和DNA-RNA混合链体、或DNA-蛋白质链体。基于序列的基因表达分析的代表性方法包括基因表达序列分析（SAGE）和通过大规模平行测序技术的基因表达分析。

术语“探针”指的是任何能选择性与一特定目标生物分子联合的分子，例如，通过或给予生物标识物编码的核苷酸转录物或蛋白质。探针由本领域技术人员合成或来自合适生物制品。探针可以被特定设计为被标签的。能够用作探针的分子的示例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。

多核苷酸的杂交分析

在一些实施例中，生物标识物表达在核酸水平被检测。基于核酸技术的评估表达在现有技术中已知，并包括，例如，确定身体样本中生物标识物RNA转录物（即mRNA）的水平。许多表达检测方法使用孤立的RNA。起始材料通常从一身体样本中分离的总RNA，如肿瘤或肿瘤细胞系，以及分别相应的正常组织或细胞系。因此，RNA可从多种初级肿瘤，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、脑、肝、肾、胰腺、脾脏、胸腺、睾丸、卵巢、子宫等,或肿瘤细胞系中分离。如果mRNA的来源是一初级肿瘤，mRNA可例如从冰冻或石蜡包埋的（paraffin-embedded）和固定的（如，福尔马林固定的）组织样本中提取出来。

mRNA提取的通用方法在现有技术中已知且在分子生物学的标准教科中公开，包括奥苏贝尔等，编辑，分子生物学现代实验手册，约翰威立&桑梓，纽约1987-1999.从石蜡包埋的组织中提取RNA方法被公开，例如，在鲁普和洛克 (实验室投资，56:A67, 1987)和德安德斯等人(生物技术18:42-44, 1995)。尤其是，RNA分离可使用来自商业生产商如柯安军（Qiagen）(瓦伦西亚, 加利福尼亚)，的纯化试剂盒、缓冲设置和蛋白酶，依据生产商说明完成。例如，培养中细胞的总RNA可使用柯安军试剂微型柱（Qiagen RNeasy mini-columns）分离。其他商业可利用的RNA分离工具包括MasterPure完整DNA和RNA纯化工具(易普三丘,麦迪逊,威斯)和石蜡块RNA分离工具(阿姆比昂、奥斯汀、特克斯)。来自组织样本的总RNA可被分离，例如，使用RNA Stat-60（泰尔-特斯特,弗伦兹伍德 ,特克斯）。自肿瘤中的RNA可被分离，例如，通过氯化铯密度梯度离心法。另外，大量组织样本可使用本领域技术人员已知技术而被容易地处理，如，匡姆斯克单个RNA分离过程（美国专利号US4,843,155）。

分离的mRNA可被用于杂交或方法试验，其包括，但不限于，南北方分析、PGR分析和探针阵列。检测mRNA水平的一方法包括用核酸分子（探针）接触分离的mRNA，能够与将被检测到的基因编码的mRNA杂交。核酸探针可以是，例如，整长的cDNA，或其部分，如 至少7, 15, 30, 50, 100, 250, or 500 核苷酸长度的 低核苷酸，足以确切地在严格条件下与编码本发明生物标识物的mRNA或基因组DNA杂交。mRNA与探针的杂交显示生物标识物正被表达。

在一实施例中，所述mRNA被固定化在一固体表面并与探针接触，例如通过运转隔离在琼脂糖凝胶上的mRNA并将所述mRNA从所述凝胶上转移至膜，如硝化纤维。在另一实施例中，所述探针被固定化在一固体表面，且所述mRNA与所述探针接触，例如，在一安捷伦基因芯片阵列。技术人员能够容易地将已知mRNA检测方法适用于检测被本发明生物标识物编码的mRNA的水平。

确定样本中生物标识物mRNA水平的另一方法包括核酸方法过程，例如，通过RT-PCR (美国专利号4,683,202), 连接酶链式反应 (巴拉尼, 美国科学院院刊88: 189-93, 1991),自我持续序列复制(瓜特利等人, 美国科学院院刊 87: 1874-78, 1990),转录放大系统 (科娃欧等人, 美国科学院院刊86: 1 1 73-77, 1989), 复制酶 (李查蒂 等人, 生物/科技6: 1197, 1988), 滚环式复制 (美国专利号 US5,854,033), 或任意其他跟随使用本领域技术人员已知技术的放大分子检测的核酸放大方法。这些检测方案对核酸分子检测特别有用，如果这些分子呈现非常低的数字。在本发明特别方面，生物标识物表达被定量荧光RT-PCR评估（即，TaqMan系统）对PCR分析，已知方法在确定用于分析的引物序列中是可利用的。

RNA的生物标识物表达水平使用膜印记（如在杂交分析中使用，如北方、南方、点等），或微波、样品管、凝胶、珠子或纤维(或任何实心载体,包括结合核酸)检测。参见，例如，美国专利号US5,770,722, US5,874,219,US 5,744,305, US5,677,195 and US5,445,934。生物标识物表达检测还可包括使用在解决方案中的核酸探针。

在本发明的一个实施例中，微阵列被用于检测生物标识物表达。微阵列因不同实验间的重现性而特别适合这个目的。DNA微阵列提供一许多基因表达水平同步测量的方法。每个阵列由附着在实体载体上的捕获探针的重现模式组成。标记RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，并之后被激光扫描检测到。在阵列上的每个探针杂交浓度被确定并转化成一量化值，以代表相关基因表达水平。参见，例如，美国专利号US6,040, 138, US5,800,992 、US6,020, 135、US6,033,860, 和 US6,344,316.高浓度低核苷酸阵列特别适用于确定样本中大量RNA的基因表达谱。

使用机械合成方法的这些阵列的合成技术在例如美国专利号US5,384,261中被描述。尽管通常使用平面阵列表面，所述阵列可在事实上任何形状的表面或甚至多重性表面上制造。阵列可以是珠子、凝胶、聚合物表面、纤维（如光纤）、玻璃或任何其他合适基底上的核酸（或肽）。参见，例如，US5,770,358, US5,789, 162, US5,708, 153, US6,040, 193和US5,800,992. 阵列可以是在这种方式下被打包，以允许广泛设备诊断或其他操作。参见，例如美国专利号 US5,856, 174 和 US5,922,591。

在微阵列技术的特定实施例中，cDNA克隆的PCR扩增衬垫被应用到一密集阵列的基底。例如，至少10000核苷酸序列被应用到所述基底。所述微阵列基因，固定在每个10000元件的微芯片上，适用在严格情况下杂交。荧光标记的cDNA探针通过利用从组织中提取RNA反转录物的荧光核苷酸合成来产生。标记cDNA探针被应用到芯片，与在阵列上的DNA每点特异性杂交。经过严格清洗去除非特异性联合探针，所述芯片被共焦激光扫描显微镜或另一探测方法，如CCD照相机扫呗。每个阵列元素的杂交定量允许相应mRNA富度的评估。

具有双重荧光色的，来自两种RNA来源的分别被标记的cDNA探针两两杂交至阵列。来自两种来源的转录物相关富度，依据每个特点基因，而被同步确定。小型规模的杂交为大量基因表达模式提供了方便、快速评估。这些方法被示出以具有探测罕有转录物的所需敏感度,其按每个细胞几份的形式被表达，并重复性地检测至少大约两倍不同的表达水平（思科那等人, 美国科学院院刊93 : 106-49, 1996）。微阵列分析可由商业可利用设备完成，跟随生产商协议，如通过使用艾菲门却克斯（Affymetrix GenChip ）基因芯片技术或者安捷伦喷墨微阵列技术。用于基因表达的大规模分析的微阵列方法的发展使得有可能对多种肿瘤类型的癌症分类和结果预测的分子标识进行系统搜寻。

基因表达序列分析（SAGE）是一不需要为每个转录物提供单个杂交探针，允许大量基因转录物的同步和量化分析的方法。首先，短序列标签（约10-14bp）被产生，包括充足信息去唯一识别一转录物，如果所述标签从在每个转录物中的唯一位置处获得。然后，许多转录物连接起来形成长序列分子，该分子是有序的，同时反映多个标签识别。任何数量的转录物的表达模式能够通过确定单个标签的富度和识别相对于每个标签的基因而被量化评估。参见，威尔克斯库等人（科学270:484-87, 1995; 细胞 88:243-51 , 1997)。

在核酸水平的生物标识物表达分析的另一方法是通过大量平行标记排序（MPSS）的基因表达分析，正如布伦纳等人（国家生物科技，18:630-34, 2000）。这个排序方法将基于非凝胶标记排序与在体外克隆的百万模板在各自5 μΜ直径微珠上结合在一起（ This is a sequencing approach that combines non-gel-based signature sequencing with in vitro cloning of millions of templates on separate 5 μΜ diameter microbeads）。首先，DMA模板的微珠库在体外克隆建立。之后所述模板平面阵列的组装包括在高浓度下的流动细胞中的微珠（通常大于3.0*106微珠/crr）。在每个微珠上的克隆模板的自由端被同步分析，使用基于荧光的标记排序方法，该方法不需要DNA片段分离。

后天修饰

本发明方法还可由检测转录后修饰或后天变化，如乙酰化、甲基化、磷酸化、苏素化（sumoylation）、范素华（ubiquitylation）的方法实现和/或补充。这个后天修饰可出现在蛋白质，如组蛋白乙酰化作用、激酶磷酸化或核酸，如在CpG点的5甲基胞嘧啶或5 羟甲基胞嘧啶的形成。

测量后天变化的方法在现有技术中已知，例如，关于核酸：EP 1488008 B 1(柏林), US7,960,1 12 (布迪曼等人), US7,666,589 (列文森 &歌顿豪斯); US7,611,869 (帆), US7,364,855 (安德森等人) ; PCT公开号WO 2010/086389 (卫豪斯等人); WO 2005/071106 (柏林); WO 2005/033332 (狄思乐); WO 2003/023065 (王等人); WO 1997/046705 (赫尔曼 &贝利); 关于蛋白质美国申请号US 7,074,578 (匡斯莱德和桑托斯-罗纱)。

免疫组织化学

免疫组织化学方法还适用于检测本发明生物标识物的表达水平。在一实施例中，病患头颈组织样本通过，例如现有技术已知的活检收集。样本为后续准备而冰冻或立刻放置在一定影液中。组织样本由试剂，如福尔马林、戊二醛、甲醇或类似包埋在石蜡中被固定治疗。用于为来自福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品的免疫组织化学分析准备滑动的方法在现有技术中已知（Methods for preparing slides for immunohistochemical analysis from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples are well known in the art）。

在一些示例中，样本可被需要去修饰，以使得生物标识抗原能进入抗体联合。例如，组织样本结果的福尔马林固定，在蛋白质广泛交联中，能导致抗原点遮掩或消灭，并随后导致差的抗体染色。正如此处使用，“抗原恢复”或“抗原暴露”是指增加抗原可访问性或修复抗原性，在例如，福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样本中。任何使得抗原能进入抗体联合方法可被用于本发明实践，包括这些在现有技术中已知的抗原恢复方法。参见，例如，哈纳塞克和沃勒萨克合编。（1998）肿瘤标志协议（美国胡马纳出版社有限公司，透透娃N.J）和施等人合编，（2000）抗原恢复技术：免疫组织化学和分子形态学（伊顿出版，纳蒂克，马斯）。

抗原恢复方法包括但不限于蛋白水解酶（例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶 ）或抗原恢复液治疗。抗原恢复液包括，例如，柠檬酸盐缓冲液, pH 6.0, 氨丁三醇缓冲液，pH 9.5,EDTA，pH 8.0, L.A.B.（“释放抗体联合液”，聚合科学，沃林顿，帕），抗原恢复Glyca液（拜尔基因，山雷蒙，卡利夫），柠檬酸盐缓冲液, pH 4.0,Dawn去污剂（普克特 &甘布尔,西西那堤,俄亥俄州）、去离子水以及2%冰醋酸。在一些实施例中，抗原恢复包括将抗原恢复液应用到福尔马林固定的组织样本，并在烤炉（如，在60℃下）、蒸箱（如，在95℃下）或高压柜（如，在120℃下）在特定温度下加热定义时间时期。在本发明其他方面，抗原恢复可在室温下完成。培养时间将随所选的特定抗原恢复液和培养温度变化而变化。例如，抗原恢复液可被用到一样本，至少5、10、20或30分钟或上达整晚时间。确定合适抗原恢复液和优化培养时间盒温度的试验设计在本领域普通技术人员常规能力中是标准的、良好的。

下述抗原恢复，样本使用合适阻滞剂被阻滞（例如，过氧化氢）。指向生物标识物的抗体之后被用于足够时间允许抗原抗体联合的样本培养。在特定实施例中，至少指向五个不同生物标识物的五个抗体被用于评估头颈癌病患的预断。超过一个抗体被使用的地方，这些抗体可被连续地增加到单个样本，作为个体抗体试剂或同时作为抗体混合物（antibody cocktail）。另外，每个个体抗体可被增加到来自单个病患样本的独立组织切片，和合并的结果数据。

检测抗体联合技术在现有技术中已知。生物标识物的抗体联合可通过化学试剂的使用而被检测。该试剂根据抗体联合水平和相应地生物标识物蛋白质表达水平，产生一检测信号。例如，抗体联合可通过使用结合到标记聚合物的第二抗体而被检测。标记聚合物的示例包括但不限于聚合物-酶轭合物（polymer-enzyme conjugates）。在这些复合物中轭合物通常被用于在抗原-抗体联合点处催化色原沉积，因此导致对应于生物标识物表达水平的细胞或组织染色。特别轭合物包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。商业抗体检测系统，如，Dako Envision+系统(葛洛斯绰普 , Denmark丹麦)和Biocare Medical's Mach 3 系统（康科德，加利福尼亚），能被用于实践本发明。

所述术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”宽泛地包括了抗体和重组抗体的自然出现形式，如单链抗体，嵌合体,人源化抗体、和前述病痛片段和衍生物相同的多个特定抗体，其片段和衍生物至少有一个抗原联合点。用于本发明实践的抗体，被选择具有生物标识物蛋白质的特异性。用于制造抗体和选择合适抗体的方法在现有技术中已知。参见，例如，细胞，主编（2006）细胞生物学：实验手册，第三版（爱思唯尔学术出版, 纽约）。在一些实施例中，指向特定生物标识物蛋白质的商业抗体被用于本发明中实践。本发明的抗体在基于组织学样本理想染色的基础上被选择。也就是，所述抗体由用于联合特异性的最终样本类型选择（如，福尔马林固定的，石蜡包埋的头颈肿瘤组织样本）。

所述抗体与检测物质相联接便于抗体联合检测。检测物质示例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β 半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶。合适辅基混合物示例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适荧光材料示例包括伞形科（umbeiliferone）、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、dichlorotriazinylamine荧光素、丹磺酰氯和枣红蛋白。发光材料示例为鲁米诺。生物发光材料示例包括荧光素酶、荧光素和发光蛋白质。合适放射性材料示例包括125I、131I、35S和3H。

考虑到在本发明免疫组织化学方法中的抗体染色检测，在现有技术中也存在，用于量化确定在生物样本中的大量多种分子样本的视频-显微镜使用和网络方法由具有特定颜色的代表性染色标记显示，其中每个分子种类存在在生物样本中。这个方法作为比色分析方法在现有技术中已知。这些方法中，视频-显微镜使用被用于提供一生物样本图像，在其被染色以真实显示特别生物标识物的存在后。参考，例如，美国专利号US7,065,236和US7, 133,547，其公开了图像系统及相关软件的使用，以确定基于代表性色彩染色标记存在的每个分子种类相关量，该标记分别由这些色彩染色标记的光学浓度或传导值显示，被图像系统和相关软件确定。这些技术提供了在使用单个视频图像的染色生物样本中的每个分子种类相关量的量化确定，该视频图像被“解构”成其组建颜色部分。

蛋白质组

术语“蛋白质组”被定义为在某一时间点时出现在样本（例如，组织、器官或细胞培养）中蛋白质总量。蛋白质组包括，其中，在样本中蛋白质表达的全球变化研究（也指“表达蛋白质组”）。蛋白质组通常包括以下步骤：（1）通过2-D凝胶电泳（2-D PAGE）或液体/气体色谱分析分离一样本中的个体蛋白质；（2）从凝胶恢复的或在柱部分内获得的个体蛋白质的识别，例如，通过大量光谱测定法或N-端排序，以及（3）使用生物信息学的数据分析。蛋白质组方法是对基因表达谱的其他方法的补充，并被单独或与其他方法结合使用，以检测本发明生物标识物的产物。

工具

进一步提供了实践本发明方法的工具。通过“工具”旨在包括至少一试剂，如核苷酸探针、抗体等，用于特别检测本发明生物标识物表达的任意制造（如包装或容器）。该工具作为实现本发明方法的单元被推广、分配或售出。另外，工具可包括描述所述工具和其使用方法的包装说明书。

在特定实施例中，提供了诊断并评估头颈癌病患的预断的工具，该预断包括检测在核酸水平下的生物标识物过表达。这个工具与手动和自动的核酸检测技术相兼容（例如，基因阵列）。这些工具包括，例如，至少五个核酸探针，其能与五个不同生物标识物核酸或其片段特定联合。

在其他实施例中，提供给了本发明免疫组织化学方法实践的工具。这些工具与手动和自动的免疫组织化学技术相兼容(例如，细胞染色)。这些工具包括至少五个抗体，用于特定检测至少五个生物标识物的表达。每个抗体在所述工具中，作为个体试剂或另外作为包括指向至少五个不同生物标识物的至少五个抗体的抗体混合物被提供。

任何或所有工具试剂可在容器内被提供，保护其免受外界环境，如密封的容器。阳性和/或阴性对照可被包括在工具中，以验证依据本发明应用的试剂的活跃和正确使用。对照可包括样本，如组织部分，固定在载玻片上的细胞、来自组织或细胞系RNA制备等，已知至少五个不同生物标识物的存在为阳性或阴性。对照的设计和使用在本领域普通技术人员常规能力内是标准良好的。

识别预防或治疗头颈癌的混合物方法，所述方法包括步骤：（a）一组织或动物模型与混合物接触；（b）测量核p16表达水平；以及（c）比较在动物模型中的核p16表达水平和与对照相关的水平；以及确定在细菌水平上的混合物功能性作用，因而识别预防或治疗头颈癌的混合物。

在此使用的冠词“一（a）”和“一（an）”指的是一个或读个语法对象。通过例子，“一元素（element）”指的是一个或多个元素。

整个说明中的单词“包括”，或如“包括”或“包括”的变形可被理解成隐含所列元素、整数或步骤、或元素组、整数或步骤的包含，但不限于任何其他元素、整数或步骤、或元素组、整数或步骤的排出。本发明可合适包括，组成或本质组成，在权利要求中描述的所述步骤和/或试剂。

下述例子进一步示出本发明且并不旨在于限制本发明范围。

例子

6.1不同细胞pl61NK4a定位可标志头颈癌的不同生存结果

卡罗莱纳州头颈癌研究（CNANCE）是一对HNSCC事件的基于人群案例的对照研究，其在2002-2006年之间在卡罗莱纳州中部和东北部的46个县建立（Divaris迪瓦瑞斯等人，2010）。来自这个研究的在UNC医院治疗并有可利用库存组织的143个病患的亚群是符合条件的。有全部头颈次位点除了鼻咽（口腔、口咽、后头和下咽部）的癌症患者被包括在内。治疗决定由UNC头颈综合小组建议，且基于病患年龄、肿瘤程度、位点、并存病和表现状态。临床信息从病患表中获取。接受在UNC完整医疗护理的病患之后进行包括消散和死亡结果的医学记录的回顾性调查。在UNC外继续跟随当地指令的病患，之后请求来自当地机构的医学记录，或以防外部指令的信息返回没有，病患死亡由社会安全死亡指标和当地讣，遵照CHANCE研究协议而被询问。没有足够p16染色肿瘤样本的病患被排出，剩下135个病患进行分析。独立的UNC TMA群体可利用对之前在其上报道过我们组的验证(Harris哈里斯等人, 2010a)。

组织微阵列

组织微阵列（TMAs）使用来自福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤块的分数样本而被建立。苏木素和 曙红染色玻片通过两个病理被检查，以确定原始诊断。一毫米微阵列块在来自组织仪器的手动组织微阵列-1上建立（Sun Prairie WI 桑 普雷 威53590）一式三份。四个有序微米部分从每个组织微阵列中切除。载玻片切片（Sectioned slides）在福尔马林下覆盖并值得染色前存储在4℃。第二确定的组织来源还被用于当前分析，其建立和结果之前被报道（哈里斯等人, 2010a). 简单地说，TMA（指为年轻非吸烟口腔群体，YNOCC）以一相似方式被建立，正如上述包括在18-39年龄间的42个HNSCC群体。组织和试剂的处理与当前方法一致。

p16免疫组织化学染色

p16IHC染色依据生产商的IHC协议，在联合自动染色器 (莱卡微系统有限公司, 挪威，马02061) 中实现。放置在60摄氏度烤炉内的载玻片（slides）去除过多石蜡。载玻片之后放置在自动染色器内并在联合脱蜡液中脱蜡（AR9222）且在联合冲洗液中杂交(AR9590)。抗原恢复在联合表位恢复液1（pH 6.0, AR.9961）100°C30分钟下实现。载玻片之后与p16TNK4a抗体（鼠单克隆反p16抗体（MAB4133）培养15分钟，化学国际公司/密理博公司， 特曼库拉CA 92590) 。抗体检测使用联合聚合物限制检测系统实现 (DS9800)。染色玻片被脱水并盖玻片增加，IHC在北卡罗纳莱州临床病理实验室中完成。在IHC完成后，载玻片在实验室室温下存储，且所有TMA玻片的真是扫描复印件进一步作为参考保留。

人类乳头瘤中的HPV

人类乳头瘤中的HPV在染色基准XT自动染色器（Ventana Benchmark XT autostainer）下完成。载玻片脱蜡、调节且与通知HPV III探针16族（INFORM HPV III Family 16 Probe）（碧；染色医疗系统）在自动染色其上，根据生产商协议完成。所述探针与HPV亚型16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 和66有密切关系。载玻片被记录为HPV阳性，如果信号的点状的或扩散模式在肿瘤核内观察到。

p16蛋白质表达

p16表达由哪些对病患临床数据不知情的病理学家评估。两个病理学家阅读，带有第三个病理学家评估的任何不确定分数的CHANCE TMA 和YNOCC TMA。细胞的电子图像使用阿佩里奥扫描系统捕捉（200倍放大）。之前被示为p16过表达（子宫内膜）的组织样本被用作浓度分数的阳性对照。每个样本被给出在0-3范围的细胞质浓度分数和核浓度分数，0分数浓度等于未染色，1为衰弱的或焦点细胞质染色，2为中度扩散染色；3为强度扩散染色。有阳性核的肿瘤细胞百分数由每100个肿瘤细胞记为10微观领域而确定。半定量百分分数是对每个样本的细胞质和核染色，范围从0-100，而产生。TMA的建立是为了获得每病患块的3核心（cores）。不是每个块有足够组织且有些仅有一个或两个核心。对于有多个核心的样本，整个核心的平均浓度或百分分数被用作这个样本的最终浓度或百分分数。一合成产物分数通过将细胞质或核中的平均分数与平均百分分数相乘而计算出来。基于口咽部病患分数的双重分布（图3中暗灰色），核产物100分数被用作核染色的中断（cutoff）。细胞质染色的75%百分率（133.4）被认为是细胞质染色的中断。所有有高核染色的样本还有高细胞质染色，导致总共3个分类。有核产物分数≥100 的病患被认为高核染色（HN）。有产物分数不低于75%细胞核分数(133.4)的病患被认为高细胞质染色（HC),如果他们不在HN组中。无法达到高核或高细胞质分数的标准的病患被分类在低染色组（LS）。基于经验分离，病患被分为三组：高核、任何细胞质染色（HN），高细胞质，低核染色（HC）,低核和细胞染色（LS）。

统计分析

所有统计分析由R 2.9.2 software (http://cran.r-project.org)完成。来自每个组（HN、HC、LS）病患的基本特征使用费希尔精确检验比较分类变量和一变量分析方法（AVOVA）用于连续变量。总生存从诊断时间至死亡时间或最后记录随访时间计算。无进展生存（PFS）从诊断时间至疾病进展时间或最后记录随访时间或任意原因死亡时间被定义。疾病进展被定义为如临床记录显示的任何记录的肿瘤进展（局部或远端）。所有观察进行60个月审查。生存曲线使用卡普兰 迈耶方法计算并使用对数秩测试进行非参数比较。考克斯比例风险模型被用于评估在不同p16染色组中的风险比率，调整病患饮酒状态、肿瘤阶段、肿瘤位点和HPV染色。所有统计测试的两侧有0.05显著水平且所有报告的信赖区间建立在两边95%信赖水平。

结果

病患特征

在研究期间有143名病患被识别，其中135名有足够的p16染色肿瘤样本。这些患者中值随访时间为6.67年,仅有5例5年之前不再跟进。这些病患的基本特征在表一中概括。病患的中值诊断年龄为57岁（范围20-82岁）。68.9%病患为男性，比得上全国平均（里斯 莱格，2007）。大部分病患有吸烟史和/或酒精使用，仅12%（9%）为不吸烟和44%（约30%）不饮酒。另外，123个吸烟者全部，除了两个外，吸烟超过10年。约30%病患接收单个物理治疗，伴随手术或放疗。其他并病患接收混合的不同治疗方法。16名病患（11.9%）被检测为HPV阳性，其中14个有口咽部肿瘤，另外两个在口腔部有肿瘤。

p16表达

p16样本设置中显示每个病患至少有1/3核心的基本细胞质和核染色。P16染色的IHC图像示例在图2中示出。总体上，口咽部癌和HPV-阳性癌均在细胞质和核处相较其他类型肿瘤具有较强p16染色（图3）。中值核产物分数在口咽部肿瘤样本中为22，比较非口咽部样本为0（相等浓度排列测试p-值< 0.001）。中值细胞质产物分数在口咽部肿瘤样本中未150，比较非口咽部样本的中值产物分数38（相等浓度排列测试p-值< 0.001）。九名病患有高核和高细胞质p16染色（HN）,25名病患有高细胞质、低核染色（HC）和101名病患有低p16染色（LS）。在不同染色组间，没有明显的年龄、性别、吸氧状态、T阶段和临床阶段的差异。但是，有高核或细胞质p16染色的病患相较于低p16染色组，有更多口咽部肿瘤和更早节点阶段（N0-N1）。

原位杂交HPV

表二概括了参照HPV阳性和吸烟状态的肿瘤位点分布。总体上，143名中的16名病患染色HPV阳性，其中14名有口咽部肿瘤、2名有口腔部肿瘤。HPV阳性率低于一些临床尝试和其他大学报告（庄等人, 2008;法赫里等人, 2008），由于至少一部分在研究人群中有非常高吸烟率（昂等人，2010；迪索萨等人, 2007）。口咽部肿瘤58%（14/24）在研究中染色HPV阳性，比较之前报告，如迪索萨和同事（迪索萨等，2007），其报告64%在口咽部癌中HPV阳性。在口咽部肿瘤外的HPV阳性染色几乎没有，与口咽部外HPV感染通常低接收率一致（贝谷姆等人, 2007 ）。这些HPV阳性患者绝大部分是严重吸烟者：13/16HPV感染病患有长吸烟史，最少有18年。HPV感染与细胞核和核p16阳性与密切联系。所有除了3名HPV阳性病患被分类为有高核或高细胞质p16表达。

生存分析

在整个群体中，三年总生存（OS）为63.0% (95% CI: 55.3% -71.7 %)和三年无进展生存（PFS）率为54.1% (95% CI: 46.3%-63.2 %)。在跟进器件仅在HN组中出现一死亡。在LS组中，三年OS和PFS通过卡普兰 迈耶方法被评估为65.3% (95% CI: 56.7%-75.3%)和54.5% (95% CI: 45.6%-65.1%)。三年OS和PFS在HC组中分别评估为40% (95% CI: 24.7%-64.6%) 和36% (95% CI: 21.3 %-60.7%)。在HN组中的三年OS和PFS生存为无评估的100%置信区间。OS和PFS结果均在染色组中有显著区别，分别用对数秩测试0.006、0.009p值。在HPV阳性组合HPV阴性组间OS或PFS没有明显不同（p值分别为0.509和0.434）。

考克斯比例风险模型被用于评估每个OS和PFS变量间的关系（表3）。p16表达状态与OS和PFS有明显联系。HN组有最好的总共生存结果和最低的风险率，相较于其他组。相似结果也从无进展生存中获得，尽管差异并不是统计显著。使用HC组作为参考，LS组的风险率为0.50 (95% CI 0.29-0.88) ，HN组风险率为0.10 (95% CI 0.013-0.75) 。相似的，无进展生存的风险率在LS组中为 0.61 (95% CI 0.35-1.04)，在HN染色组中为0.09 (95% CI 0.012-0.67) 。若果我们分别考虑局部复发或远端复发，三年局部复发率（recurrence rate）和远端复发率（relapse rate）分别在HC和LS组中为24%和26.7%，并且三年远端复发率分别在HC和LS组中为16.0%和10.9%。在三年跟进期间内，HN组没复发。当核染色和细胞质染色被分别在其相联系的OS或PFS中考虑，高核染色与PFS(H = 0.13, 95% CI 0.018-0.96)明显相关，而与OS(HR = 0.17, 95% CI 0.024-1.24)不明显相关。细胞质染色与OS或PFS不明显相关。除了p16染色状态外，T3-T4肿瘤阶段与死亡风险(p-值= 0.009)增加明显相关。节点阶段示出影响总生存(p-值= 0.07)的临界意义。没有变量被测试除了p16表达状态，示出了与PFC明显相关。

多变量考克斯比例风险模型示出了p16表达状态仍与OS和PFS（表4）明显相关，在调节肿瘤位点、节点阶段、肿瘤阶段HPV染色和饮酒模式后。LS组合HN染色组比HC染色组具有明显较低风险。进行对口咽部病患的子集分析：在控制肿瘤阶段、HPV染色和饮酒状态后，LS和HN组的OS风险率分别为0.40 (p = 0.18)和0.12 (p = 0.06) ，以及LS和HN组的PFS风险率分别为 0.61 (p = 0.43) 和0.12 (p = 0.06)，使用HC组作为参考。对其他肿瘤位点的子集分析因病患数量小而不进行。

第二群体的独立证实

使用YNOCC TMA数据，我们可在额外的42个样本中获得p16染色，其中30个来自口腔，6个来自口咽部，5个来自喉头和1个来下咽部。这个年轻病患群体为诊断年龄在20岁和39岁之间，其中有23名男性，29名有吸烟史（中值年14.5年）和18名有酒精消耗史。之前，我们报告了关于有p16阳性的病患群体的良好总结果。此刻，我们并未评估核染色独立分布的结果。在此研究中，我们评估病患，通过相同产物分数中断的独立变量。所述病患之后成为为本研究使用相同标注的群组：14名病患设置在HN组，4名病患在HC组和24名病患在LS组。尽管p值并没有因小样本大小而统计明显，突出的是，HN染色组相较其他两组有更优的无进展生存，在CHANCE数据集中的观察有相似量级。在HN组合LS租中恢复的风险率为0.38 (95% CI 0.092 - 1.62)和 0.71 (95% CI 0,20- 2.52)，相较于HC染色组 (p = 0.34)。

讨论

头颈鳞状细胞癌管理似乎在一十字路口，其有该领域可能会改变长期以来基于观察的治疗标准相关的HPV和p16生物标识物的可能。关键研究显著记录了对这些标记病患染色阳性的改善结果，但尚未有终结者着眼于这些生物标识物如何与其他每个相关，激励研究者寻求有利结果联系背后的机理。首先，很清楚，除了HPV感染自身机理外在工作，依照由吸烟引起的风险调整被证明（Firstly, it is clear that mechanisms in addition to HPV infection itself are at work as evidenced by the modulation of risk caused by smoking. ）。这也有旁证，p16变化、独立于HPV可传达一些良好预断，参见不能简单地归结为假阴性HPV试验的HNSCC病患。头颈外肿瘤的证据使得我们将核定位p16作为异常的（novel）生物标识物考虑。在这个报告中，比较p16核定位和p16例子的结果被排除在核进一步研究中。进一步，所述结果可助于显示这个生物标识物的机械作用，其超出了p16作为限于口咽部使用HPV代理的经验观点。

考虑p16状态作为一机械标记需要对p16在癌症中改变的方法检查。就HPV而言，p16过表达式HPV-派生癌蛋白E6和E7的表达结果，能有效灭活p53和pRb肿瘤抑制蛋白，导致p53、pRb分子水平下降调整，p16分子水平强烈上升调整（安迪奥等人, 1998; 李等人, 2004;马茹等人, 2010; 维斯特等人, 2002）。考虑p16表达在HPV感染情况下，作为多种基因类型代理，通常能够有利考虑癌症预断(p53 野型(WT), Rb WT, and pi 6 WT)。但是，在更普通肿瘤设置中，p16低表达，可能通过较少有利的基因或表观遗传变化，如p16纯合型缺失、无义突变或可能甲基化和基因沉默。在这些情况下，哪里有更多有害突变，如Rb缺失或可能细胞周期素扩增（通常在HNSCC），肿瘤可表达没有抑制细胞循环的p16高水平。在这些情况下，核交易可被改变，且高p16表达可显示特别不利的癌症生物。吸烟可以是在不需要p16损耗作为疾病修饰较差结果事件下的，p16下游基因灭活的手段。去评估这个解释，我们尝试在当前样本设置中排序p16和其他目标，但是因在这些石蜡包埋的样本中DNA质量而不成功。

据我们所知，没有在先研究调查p16表达定位与HNSCC中疾病结果相关如何不同，尽管有证据表明差异性染色模式与在其他肿瘤中相关示出描述的相似，包括子宫内膜癌、黑色素瘤和星型细胞瘤（阿里芬等人，2006; 艾米格等人, 1998; 吉尔兹等人2004; 米尔德-蓝格仕等人, 2001 ; 萨尔福森等人, 2000; 斯特劳默等人2000）。最显著的是，家族性黑素瘤的研究强烈支持我们的假设，因相关的点突变和局部p16定位至细胞核失败（吉尔兹等人，2004）。在这个报告中，没有雄性生殖变体的病患显示结合的核和细胞质染色。作者证明p16在黑素瘤中突变，病患可能损坏细胞质-核穿梭，其与BRCA1因核定位信号（NLS）和HN2-终端的变异而移动至细胞核相似（阿里芬等人，2006;法布罗等人，2004；吉尔兹等人，2004）。

本研究包括进一步评估p16核染色的局限性。最显著的是，本研究相当小并包括大量吸烟者。相似的是，因本研究的回顾性质，病患在阶段、位点、治疗和其他因素上不均匀，可能影响风险的方式未被确定（Similarly, due to the retrospective nature of the current study, patients are heterogeneous in stage, site, treatment, and other factors that might impact risk in ways that have not been appreciated）。但是，p16定位的预断效果在对这些因素控制后仍然显著。所述验证群体对我们的结果提供额外支持。我们提供关于YNOCC群体非吸烟者p16使用的证据，但这组并不包括非吸烟的HPV阳性病患的显著数据。但是，因大多数HNSCC病患仍为吸烟者，尽管非吸烟病患的数字在上升，这些数据适应于HNSCC病患较大部分。最终，不同p16组的断点是基于经验观察的口咽部vs 非口咽部样本的p16染色分布。这个断点既不优化也不交叉验证，且不能够直接用于临床设置。

总之，我们对p16核染色在传统生物标识，包括HPV、吸烟、口咽癌、p16非局部染色的复杂设置中作为关键因素，提供了初步调查。这个生物标识物，如果被验证，其广泛利用，并能潜在影响HNSCC临床护理。参照赵等人，2012英国杂志 癌症107 482-490 (于2012.6.26在线公开)，其内容全部结合于此。

表1：p16染色病人特征

*数字因数据丢失而未全部合计。缩写：HN，高核，任何细胞质染色；HC，高细胞质，低核染色；LS，低核，低细胞质染色。

表二：吸烟状态和肿瘤位点的p16表达

缩写：HPV，人类乳头瘤病毒；OC，口腔部；LA喉头；HY，下咽部；OP口咽部；HN，高核，任何细胞质染色；HC，高细胞质，低核染色；LS，低核，低细胞质染色。

表三：对整体或无进展生存预断因素的单变量分析

缩写：PYs:人年数；PFS，无进展生存；OS,整体生存；HR，风险率；CI，置信区间；LS，低核，低细胞核染色；HN高核，高细胞核染色；HC，高细胞质，低核染色。

表四：对生存或无进展生存预断因素的多变量分析

缩写：PFS，无进展生存；OS,整体生存；HR，风险率；CI，风险率的置信区间；HN高核，高细胞核染色；HC，高细胞质，低核染色；LS，低核，低细胞核染色。

6.2参考（章节2.1和6.1）

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6.3头颈癌的鳞状细胞癌中的分子亚型显示染色体增益的不同模式和规范癌症基因的损耗

包括CCND1、CDKN2A和EGFR

此处描述了183HNSCC肿瘤样本的整合基因分析结果，是迄今为止最大的HNSCC研究之一。基因表达 (GE), DNA 拷贝数(CN), 或临床数据可对所有主体适用。多种GE亚型被检测到，结果表达模式与那些之前在HNSCC（8）和肺鳞状细胞癌（LSCC）（7）中发现的相似。所有GE亚型还被宫颈癌细胞系检测到。另外，我们示出一些CN增益和损耗时间对所有亚型来说是常见的，但仅在特定亚型中发现；许多这些基因事件影响已知致癌基因和抑癌基因；并且这些表达模式和基因事件有临床相关性。

结果

HNSCC表达亚型无监管发现

为了解决统计显著的分子亚型是否能在HNSCC中引出的问题，我们使用已建立的目标技术在无监管和无偏方式下执行分层聚类（7）。正如先前钟的著作，我们记录四个基因表达群的存在。共识集群加（9）产生的图（参见图9A和9B）不支持在数据集中的额外明显统计群的存在。为了确认4个群的统计显著性，SigClust基因调控网络分析工具软件 (10) 被应用，使用整个群2500变量基因的无偏设置。亚型所有成对比较使用1000个模拟样本和原始方差估计方法进行检测。用于所有成对比较的SigClust基因调控网络分析工具软件p-值在.05水平明显，在对多种比较应用邦费罗尼校正后 (图 9D)。我们指出表达亚型，如基群(BA),间叶细胞(MS), 非典型 (AT), and 基于下述讨论的生物特征的典型(CL) 。已知基因或被怀疑与头颈癌相关的基因的典型设置被示出(图 5B), 并且关于在数据集中的所有基因与肿瘤亚型相关联的测试统计在表9-12中提供。

临床特征

包括在当前研究中的病患临床特征表示HNSCC病患的宽截面（broad cross section），参见典型临床实践,HNSCC是群体高度表达（表五）。肿瘤亚型与年龄、性别、酒精使用、年或肿瘤大小不相关联。肿瘤亚型与位点统计相关联，尽管所有位点有在每个表达亚型中肿瘤，只有一个例外（BA上示出的下咽部）。另外，没位点贡献超过58%的样本给一表达亚型。没表达亚型由来自单个位点的超过68%的肿瘤构成。因此，不像其他分子标记，如HPV和p16，我们认为表达亚型捕捉生物学维度，其不限于单个组织学位点（11）。肿瘤亚型和HPV状态、治疗、节点状态和总阶段之间有额外统计地明显关联。当统计不明显时，值得注意的是越多BA趋向于被分化，13/16较差分化肿瘤为MS或CL。

表五 临床数据 选择HNSCC表达亚型中的临床协变量的概括

亚型验证

我们之后转向注意至一问题，是否依据钟等人之前报告，在当前数据集中检测无偏集群（the unbiased clusters ）。使用在先发展和在所述方法中充分描述的的群验证技术，我们比较当前研究中每个表达亚型的质心和钟等人的亚型质心。一清晰的相关性被观察到(图5C)，指出BA、MS,、AT和 CL 的表达模式分别与之前钟分类的1、2、3、4相同。

使用独立的和无偏数据集和方法发现四类，我们考虑将验证这四个表达亚型。

已知来自主体不同位点的鳞状细胞癌分担一些但不是全部分子特征，如3p染色体缺失和3q染色体扩增（12,13）。基于在LSCC表达亚型上的最新报告数据（7）,我们假设头颈癌的相关性被观察到。为了调查上呼吸道鳞状细胞癌广泛表型，我们推广质心预测方法和评估来自LSCC和HNSCC的质心相关性(图5D)。显著的是，相关性的清晰模式被观察到，HNSCC的BA、MS、CI亚型分别与威尔克森等人中的基群、分泌腺和典型亚型相关。

影响基因显示在表达亚型中的不同生物过程

亚型展示不同基因表达模式的事实示出了每个亚型有不同生物特征。为了分类这些特点，我们检测在每类不是其他类中高表达的特定基因。

在乳腺癌中（5）最初且也许最好被描述的基群显型，可在其他上皮瘤上看到，尤其是LSCC(7，14)。许多基底标记基因由佩鲁等人发现。（5）在BA中高度表达，包括CDH3, LAM A3和 COL17A1。在BA中高度表达的几个其他基因是重要的，包括转录因子TP63，这个在下述章节讨论。另外，DAVID（15）结果显示KEGG ErbB信号通路充实了在BA中高度表达的基因，包括TGFA, EGFR, MAPK1和MAP2K1。

卡卢里和温伯格 (16)描述了三个生物设置，在其中细胞经受上皮-间质的转变（EMT），其中两个是癌症进展/转移和器官纤维化。这些作者表明癌细胞的老鼠和细胞培养研究，带有间质表型，示出了ACTA2、VIM、DES和TWIST的高表达，上述所有在MS.HGF，使得EMT和HNSCC进展的生长因子中可见（17），其也在MS中高度表达。器官纤维化出现在多种上皮组织中，并被炎症信号的释放和细胞外基质组分驱使。我们的DAVID分析示出，焦点附着的KEGG通路（the Focal Adhesion KEGG Pathway）由在MS中高度表达的基因表现，包括PDGFRA/B和几层粘连蛋白和胶原蛋白亚单位。

可知EGFR表达几乎在HNSCC中普遍（18），但最新未确认的报告出现了口咽部HPV+肿瘤和低EGFR表达之间显示相互作用（19）。我们观察到在AT中低EGFR表达，其显示肿瘤范围广泛，不限于HPV状态或肿瘤位点，库马尔等人。（19）也发现CDKN2A 和EGFR 表达负相关，并且我们指出当与所有其他类比较时，CDKN2A在AT中高度表达。其他在AT中高度表达基因包括RPA2, LIG1和E2F2，由斯法博斯等人（20）发现所有基因在HPV+肿瘤比在HPV-肿瘤中更高度表达。DAVID结果显示在脂肪酸代谢KEGG通路（Fatty Acid Metabolism KEGG pathway）中基因富集，其包括许多在AT中，如ALDH3A1和ALDH9A1，高度表达的醛脱氢酶（ALDH）基因。这些值得注意，因为穆西奥等人（21）显示这些基因和其他ALDHs中增加水平在正常细胞和肿瘤干细胞中发现。

LSCC和正常气道上皮细胞中的研究已检测到与暴露在香烟烟雾相关联的基因表达模式（7, 22, 23）。我们的DAVID分析显示异生物质代谢KEGG通路包含许多在CL中高度表达的基因。其中一些是AKR1C1, AKR1C3和 GPX2，上述所有与吸烟和氧化应激相关联（22,23）。这些发现就事实而言是显著的，在我们群组中最严重的吸烟者在CL中发现，一表型与LSCC相似命名的亚型有明确关联。另外，LSCC最新全面调查发现KEAPl 和NFE2L2在典型亚型中高度表达（14）。在CL中发现相似表达模式，其就事实而言是引人注目的，NFE2L2是一转录因子，管理在异型生物质解毒中的基因。PIK3CA的高表达水平和增加的拷贝数在CL中发现，并且之前研究（24,25）已发现PIK3CA拷贝数增益和吸烟状态之间的关联。

依据亚型的DNA拷贝分析

已建立HNSCC肿瘤亚型统计明显的本质，和其与在肺癌和已知癌基因中相似亚型的关联，我们转移注意到基因变化，可能部分地解释亚型起源。为了调查作为不同基因表达潜在来源的染色体异常的不同，我们形成以基因位置和肿瘤亚型函数的平均CH图（图6）。在其他肿瘤中可见，他们在肿瘤亚型函数（a function of tumor subtype）的基因组关键区域的拷贝数变化都是一致且不同的模式。支持这组肿瘤的共同特性，最显著的观察是在所有亚型中染色体3统计上显著共享变化，包括染色体3p缺失和染色体3q扩增因子的存在，其PIK3CA和SOX2以及在一些亚型中的TP63中包含焦点高水平增益。相反，规范的HNSCC染色体7p扩增是有明显区别的。统计明显的增益在染色体7p整体广泛区域内发现，其包括EGFR和一些在BA、MS和CL中发现的但完全没有在AT中的。

除了广泛基因组事件外，有显著的焦点事件，其中一些是共享的，另一些是特定亚型的。已知chrl lql3.3中的焦点扩增，被观察所有亚型，chrl lql3.3在其他基因中包含CCND1。出乎意料的是，第二焦点扩增仅对BA在chri lq22中北观察。这个事件在多种样本中发现，尽管并没有获得统计显著性。所述轨迹由井本等人（26）对能检测到含有cIAP1/BIRC2的chrl lq22-23中的拷贝数增益的食管鳞状细胞癌研究中预先记录。

总体而言，最显著拷贝数损失在染色体3p、9p和14q中发现。染色体3p统计明显的损耗在整体或每个表达亚型中发现，但染色体9p的统计明显苏浩仅在BA和CL中发现。CDKN2A损耗在两个亚型中可见，但BA示出了在染色体9p广泛区中上的半合子缺失（hemizygous deletions），然而CL有焦点纯合子缺失（focal homozygous deletions）。焦点损耗在MS、AT和CL chrl 4q32.33中可见，并且这些是MS和AT的最显著损耗。这个区域包含miR203，因旨在ΔΝρ63而显著（27）。

依据表达亚型的拷贝数变化整合和规范HNSCC基因的差异表达

依据表达亚型验证区域皆有一致和不一致拷贝数，之后我们考虑在这些区域中的基因表达是否显示与潜在拷贝数改变相符合的变化（图7A）。其中一与鳞状细胞癌相关的典型基因改变是染色体3q扩增。出乎意料地，当所有亚型示出染色体3q扩增，所述3基因有不同微分比例使用，作为目标扩增因子：TP63、PIK3CA和SOX2，被典型讨论。CL和AT亚型示出相对于MS和BA，SGX2更高比例表达，其事实似乎表达比正常扁桃体控制较少SOX2。相比之下，BA亚型似乎表达比其他组显著较高TP63水平。相似地，尽管MS亚型示出染色体3q扩增因子，但没有一个假设目标基因似乎比正常扁桃体更高水平上表达。总之，我们总结认为这些观察增加了HNSCC不均匀性在某种程度上被转录因子（SOX2和TP63）和在染色体扩增因子中的致癌基因的差异使用解释的可能性，所述扩增因子中的致癌基因比之前记录的更为复杂（28）。在染色体7上的EGFR轨迹考虑相似示出，EGFR可比其他与一些亚型有更一致目标(图7B)。这些观察为转录因子和致癌基因差异使用在某种程度上被不同拷贝数改变提高而产生基因表达标记的可能性提供支持，该基因表达标记限于表达亚型。

涉及规范癌症基因的焦点拷贝数事件

在上述章节中我们指出表达亚型示出了拷贝数增益和损耗的不同模式。现在我们关注已知基因在HNSCC-CCND1、CDKN2A和EGFR-中的作用，并且我们考虑在特定基因位点的拷贝数值，不是上述讨论的广泛区域。表六示出了在这些基因处的拷贝数事件与肿瘤亚型或方法显著性统计上相关联，由CCND1焦点扩增存在63%CL样本中而在AT（16%）中明显不常见的事实例证。对于焦点EGFR扩增可见相似结果-增益频率范围从 0% (AT) 至31% (CL)-和CDKN2A损耗-损耗频率范围从10% (MS)至63% (CL)。

过去研究已检测到不同基因事件与这些被提供对潜在生物学或癌症病患临床管理深入了解的发现之间的关联（朱，幸）。在HNSCC中，同步CCND1增益和CDKN2A损耗被那马萨等人（29）和欧卡米等人（30）研究，那马萨等人检测到这些基因组事件间的联系。我们发现CCNDl CN增益与整体亚型的CDNK2A损耗相关联（表七），并且联合事件与表达亚型相关联（表六），从而确认并扩展那马萨等人的结果。

表六 焦点拷贝数事件。对在HNSCC表达亚型中的特定基因的焦点拷贝事件的概括。

表七 CCND1增益和CDKN2A损耗的整体关联 。2X2表示出CCND1增益和CDKN2A损耗，同时有 费希尔精确检验p-值。

依据表达亚型和焦点基因组改变的临床结果

已将接近140HNSCC肿瘤组解析成表达亚型，就已知风险因素如HPV而言，我们考虑病患结果的额外分层是否被示出。我们首先调查钟等人对他们分类1季度的生存优势是否在当前群组中再现。我们不能够确认这个结果，并在当前研究中无复发生存和肿瘤亚型之间没有联系，既在整体（图8A）或当我们限制后阶段病患的时候（未视出）。这些不同由疾病临床异质性，结合肿瘤点分布在两个研究中显著不同的事实解释。

为了弄清已知或疑似混杂因素是否可能影响我们在病患结果中检测特定亚型不同的能力，我们评估了整体生存的HPV阳性作用。因病患整体数量小，我们观察到相对大的但统计不显著的效果。因此我们考虑有理由重新评估已排除的HPV+病患群。HPV+病患的排除反映AT亚组示出了尤其不良结果（图8C），且当与所有其他结合的亚型比较时，这个差异是统计明显的（图8D）。之后我们访问一组独立组织微阵列（TMA）样本，以验证这一发现。去预测每个TMA样本的肿瘤亚型是不可行的，因此我们使用低EGFR和高p16染色作为AT状态的代理（proxy）。尽管生存次数的差异不是统计明显的，当我们限制TMA样本为阴性HPV染色时，我们获得支持以上所述发现的结果（图10）。

我们还调查任意焦点拷贝数事件是否与临床结果相关联。之前研究已检测到CCND1增益和在HNSCC中降低的无复发生存次数之间相关联（31）。当我们检验所有肿瘤样本CN值时（图10），我们获得相似发现，尽管我们结果少量明显（p=.05）。明显少的AT主体表现出CCND1增益，并且这显示了有差诊断结果的病患的两个不同组的存在：有CCND1扩增的和为HPV- 和AT的。图11支持这个结论。

模型系统中的表达亚型

癌症细胞系百科（32）包含900人类基因细胞系上的基因组数据，包括来自17食管和16上消化道细胞系的GE和CN数据。我们将质心检测器应用于这些细胞系并发现所有四中表达亚型示出（表八）。每个预测亚型的CN值的概括图示出许多早起描述的增益和损耗事件，也在所述细胞系中示出（图12）。这些发现尤其显著，就表达亚型临床相关性而言，因为他们为涉及模型系统的未来研究提供了基础。

表八：在HNSCC细胞系中预测的表达亚型。

讨论。

我们初步结果是四种基因表达亚型存在在HNSCC-基底、间质、非典型、典型-并且这些亚型显示了染色体增益和损耗的不同模式。我们还示出了这些亚型有生物和临床相关性，并因此提供了分类HNSCC肿瘤的有用有益方法，该方法对基于组织学和肿瘤位点的现存方法进行补充。公开表达数据集的分析显示了这些亚型在HNSCC（8）再现，且与在LSCC（7）中发现的相似。所有表达亚型在HNSCC细胞系中检测到，这一发现可为未来研究提供了基础。

在亚型中发现的表达模式显示，在相关肿瘤的潜在生物学中存在本质差别。在BA中的基因表达显示了与在来自人类气道上皮基底细胞中发现的标记有强烈相似性，包括与细胞外基质(LAMA3, KRT17)、受体和配体 (EGFR, EREG)相关的基因以及转录因子（TP63）的高表达。MS中的肿瘤通过与EMT，包括间叶细胞的标记（VIM,DES）、相关转录因子（TWIST1）和生长因子（HGF），相关联基因的评估表达而被例证。与通常在HNSCC可见的相对照，在AT中的肿瘤显示无EGFR增益，也几乎没有CCND1增益或CDKN2A损耗。AT肿瘤也有强HPV+标记，由CDKN2A, R.PA2和E2F2高表达所证明。在CL中的肿瘤示出了基因高表达与暴露在香烟烟雾中是相关联的，包括AKRlCl/3 和GPX2，并且还有最严重吸烟史。在CL亚型中的CN增益和损耗易于有更大量级，当与在其他亚型中发现的比较时，其反映了呈现在此类中的染色体不稳定的增长水平（表五）。

所述表达模式的不同在亚型中发现是临床相关联的。TP63产生留个不同蛋白质- ΤΑρ63α/β/γ 和ΔΝρ63α/β/γ - 并且ΔΝρ63 在HNSCC中是最丰富的同种型（33）。杨等人（33）示出ΔΝρ63促进细胞增殖，在一定程度上通过与NF-κΒ蛋白质RelA 和cRel相互作用。查特吉等人（34）指出暴露在铂化合物会导致ΔΝρ63水平降低，因此这个治疗对于BA病患可能尤其有效。巴尔别里等人（35）显示HNSCC细胞系中的TP63损耗供给间质表型的采集，该采集就在MS可见的TP63低表达水平而言是显著的。马汀和卡诺 （36）显示HNSCC细胞系中TWIST1或BMI1的高表达可增加迁移和侵袭的可能性。因为MS肿瘤展现一EMT表型和TWIST1和BMI1的增长表达，这些主题可更有可能发展远端转移。EGFR在大量HNSCC肿瘤中过表达的事实使得EGFR抑制因子是用于此疾病的有吸引力的治疗选择。但是，这些治疗在AT肿瘤中似乎不太有效，因为EGFR表达比其他表达亚型更低。SOX2和ALDH1在AT和CL中高度表达，并且这些基因皆因其对自我更新和多能性表型（37、38）的贡献而为假定肿瘤干细胞标记。PIK3CA的蛋白质产物为p1 10a，其使Akt磷酸化。活化Akt使得肿瘤细胞生存，并因此使致癌性转化（39）。韦斯特等人（40）示出正常肺上皮细胞暴露在尼古丁可便于通过使其依赖PI3K而使Akt活化。这个观察，结合在CL中可见的吸烟高水平，显示PI3致活酶抑制因子为CL肿瘤提供一有吸引力的治疗选择。

本研究有几处局限。首先，我们没有所有研究主体的GE、CN和临床数据，这个限制了我们联合分析这些变量的能力。从某种程度上说这是技术误差存在的结果，使得我们质量控制过程以消除超过20%CN阵列。另外，并不清楚哪个TP63同种型被我们基因表达阵列测定，并且TP63在基底亚型中所起作用，在缺少这些同种型知识下是不能充分理解的。HPV数据的不完整本质也是有问题的。

材料和方法。

肿瘤收集和基因分析。

根据机构审查委员会协议#01-1283，在北卡罗莱纳大学医院收集冰冻的、手术提取的、大量分解的（macrodissected）头颈癌肿瘤。肿瘤RNA被提取，且mRNA表达使用安捷伦44K（Agilent 44K）微阵列被测定。肿瘤DNA被提取，且DNA拷贝数使用艾菲门却克斯全基因组（Affymetrix GenomeWide）SNP 6.0 芯片被测定。

mRNA表达分析。

质量控制过程被应用于微阵列探针-水平浓度文档。将低质量阵列、复制阵列和来自非HNSCC样本的阵列移除后，138肿瘤阵列全部保留。规范经验值背景校正（normexp background correction）和黄土规范化程序（loess normalization procedures）（39）被应用于探针-水平数据。在对数转换后，探针与普通基因数据库相匹配，以产生15597基因的表达值。

无监管表达亚型发现。

在此描述的过程与出现在威尔克森等人的过程相似。在表达值被基因中值定位后，基因变异性使用中值绝对偏差计算。选择2500个最异变基因。共识集群加（Consensus Cluster Plus）被用于对138阵列中的这些基因实现无监管聚集，并之后我们指出为“UNC类”的结果类标记。这个过程使用80%取样比例和距离度量等于1减去皮尔逊相关系数（the Pearson correlation coefficient），由1000随机选择的微阵列样本组完成。

差异表达基因和代谢通路。

差异表达基因被R package samr（42）使用FDR阈值.01检测到。对于UNC类每个而言，我们比较此类中的基因表达值和所有其他类的组合。DAVID（15）之后被用于发现EGG通路，显示在每个类中的高表达基因是富集的。另外，有已知功能类别，例如，转录因子的差异表达基因，在比较所述专用类基因列表和已知基因本体类别时被发现。

公开的表达数据。

由钟等人创造的微阵列探针-水平密度文档经受与上述描述相似的背景校正、标准化和基因水平概括过程。这个产生的基因表达为60个主体和8224个基因值。对出现在（7）中这些60个阵列的类标记被认为“钟类”。

表达亚型检验。

共识聚类（Consensus clustering）给每个阵列分配一类标记。因此，一些阵列可能不是他们类的代表。使用轮廓宽度（silhouette widths）（44），我们验证一组125“核心”样本，其表达模式与亚型成员表达模式的相似性比其表达模式与其他亚型表达模式的相似性更多。ClaNC(45),集运最接近质心的分类方法，之后被应用到来自核心样本的UNC表达数据，以建立一组其表达标记能够被用于分类新样本的分类基因。减小的交叉-验证错误率产生一840分类基因的列表（每类210基因）。

我们检验分类基因，其表达值也出现在钟表达数据组中，并之后使UNC和钟表达数据组限于这些基因。在基因中值分别对每个数据组定位后，我们发现对于每个UNC和钟分类的质心，通过对具有合适类标记的整个阵列上的每个基因计算中值表达值。正如（6），UNC和钟质心间距离使用度量1减去皮尔逊相关系数计算。这个验证过程使用威尔克森等人的LSCC数据进行重复。

DNA拷贝数分析。

CEL文档使用艾菲门却克斯基因分型控制台（the Affymetrix Genotyping Console）经受质量控制过程，并且产生大于默认阈值.4相反QC测量的阵列从随后的分析中去除。在CEL文档中的浓度值之后使用R包裹香气（R package aroma）（46）和正常样本的集中收集被转化为 log_2拷贝数值。总共107阵列保留，在采用手动审查基因组-宽拷贝数配置文件后，其中82有表达类标记（A total of 107 arrays remained after manually reviewing the genome -wide copy number profiles, 82 of which have expression class labels）。缺失值使用来自最近探针的非缺失值被输入。分割使用DNA拷贝（47）实现。复发拷贝数增益和损耗被DiNAMIC（48）检测到，在平滑并中值定位所述拷贝数配置文件后，正如（49）所做。如果结果DiNAMIC p-值小于.05时，增益和损耗被统计明显地分类。有复发CN增益和损耗的区域在使用华特等人（50）的置信区间过程时被发现在.95水平。这个被实现以用于所有107阵列的收集，以及以后所述阵列限于每个四种UNC类。

规范的癌症基因的拷贝数增益和损耗。

基因专用拷贝数，在探针位于所述基因内或立刻与所述基因邻近时，通过计算所有分段拷贝数值的均值而确定。对于每个主题，我们分类一基因有一拷贝数增益（损耗），如果所述基因专用拷贝数大于.35（低于-.35），其近似为2个大于（低于）所有分段拷贝数值平均的标准偏差。

统计分析。

R 2.12.2被用于完成所有数据分析。在所有种类变量间关联的统计显著性由费希尔精确检验或费希尔精确检验的蒙地 卡罗版评估（p-值包括星号）。全球F-检验被用于评估连续变量和表达亚型关联的统计显著性。生存包（survival package）被用于完成所有生存分析。无复发生存（RFS）时间被定义为从手术至死亡、复发或失访的数月时间。

染色体不稳定指数。

对于给定的主体，我们计算每个染色体臂中平滑的分段的拷贝数值的绝对值的中值。该专用臂中值中的中值被定义为染色体不稳定指数，与（49）出现的定义相似。

癌症细胞系数据。

CN和GE数据可利用于18食道和19“上呼吸道”细胞系，其被分类为在CCLE中的鳞状细胞癌。细胞系中的GE数据可利用与分类器中的803/840基因。在限定这些普通基因后，我们对细胞系的GE数据标准化，以使其有和分类器中相同的特定基因手段和标准偏差。我们之后使用上述基于质心方法去预测细胞系的表达亚型。还参见华特等人2013科学公共图书馆（PLOS ONE）8(2) e56823 (2013年2月22在线公开)，所述全部结合于此。

表9-12列出了对不同头颈癌亚型的基因标记。参见基因卡片(www.genecards.org),美国医学国家图书馆，国家生物技术信息中心（NCBI）基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sites/entrez？db=gene) ,或欧洲生物信息研究所(EBI) 和威康信托基金会桑格研究所（the Wellcome Trust Sanger Institute）(VVTSI), Ensembi数据库 (http://useast.ensembl.org/index.html) 或者加州大学圣克鲁兹分校(UCSC) 的布拉特（BLAT）基因组浏览器Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat) for additional information such as sequences, single nucleotide polymorphisms (SNPs)。

表9 与基底、间质、非典型和典型的头颈癌亚型相关联的前20个基因标记。

表10 与基底、间质、非典型和典型的头颈癌亚型相关联的前40个基因标记。

表11 与基底、间质、非典型和典型的头颈癌亚型相关联的前70个基因标记。

表12 与基底、间质、非典型和典型的头颈癌亚型相关联的前421个基因标记。

6.4参考（章节2.2和6.3）

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50. V. 沃尔特, M.D. 威尔克森, D. N. 海耶斯, A. B.诺贝尔, F. A. 赖特, 未公开材料。

可理解的是，当本发明描述与详细说明相结合时，下述说明旨在于示出但不限于本发明范围。本发明其他方面、优点和修改是在下述权利要求的范围内。在这说明中引用的所有公开物、专利和专利申请申请作为参考结合于此，每个公开物或专利申请被具体单独地在结合的参考中提到。

Claims (30)

1.一种确定头颈癌病患预断的方法，其包括：

（a）获得一合适病患样本；

（b）测量一核p16表达水平；以及

（c）比较来自病患样本的核p16表达水平和对照样本的表达水平，其中所述核p16表达水平是头颈癌病患预断的标识。

2.根据权利要求1所述方法，其中核p16表达水平降低，其降低量取决于变异或拷贝数损耗。

3.根据权利要求1所述方法，进一步包括测量RBI和p53水平以及与降低的p16表达水平混合的RBI或p53的降低水平，这示出了差的预断。

4.根据权利要求1所述方法，进一步包括测量CCND1水平，其中CCND1增加的水平是差预断的标识。

5.根据权利要求1所述方法，进一步包括测量与非典型亚型相关表达水平，其中非典型亚型表达是差预断的标识。

6.根据权利要求1所述方法，进一步包括测量细胞质p16表达水平，其中如果核p16表达水平降低，所述细胞质p16表达在尤其差预断的标识中提高。

7.根据权利要求1所述方法，其中核p16表达水平由一mRNA试验测量。

8.根据权利要求1所述方法，其中核p16表达水平由蛋白质试验测量。

9.根据权利要求8所述方法，其中所述核p16表达水平使用抗体测量。

10.根据权利要求1所述方法，其中病患样本是活检样本。

11.根据权利要求10所述方法，其中活检样本是淋巴结活检样本。

12.根据权利要求1所述方法，其中头颈癌是一种鳞状细胞癌（SCC）。

13.根据权利要求1所述方法，其中头颈癌是一种下咽部、声门喉、喉头、嘴唇、鼻咽、口腔、唾液腺、窦或声门上喉癌症。

14.一种确定头颈癌病患预断的方法，其包括：

获得一合适病患样本；

测量一CCND1水平；以及

比较来自病患样本的CCND1水平和来自控制样本的CCND1水平，其中所述CCND1水平是头颈癌病患预断的标识。

15.一种确定实体肿瘤预断的方法，其包括：

获得一合适病患方法；

测量p16和RBI基因型、CCND1拷贝数和p16核蛋白质表达水平；以及

比较来自病患样本的p16和RBI基因型、CCND1拷贝数和p16核蛋白质水平和与控制样本相关联的p16和RBI基因型、CCND1拷贝数、p16核蛋白质表达水平，其中所述p16和RBI基因型、CCND1拷贝数和p16核蛋白质表达水平是实体肿瘤病患预断的标识。

16.根据权利要求13所述方法，进一步包括测量与一非典型亚型相关联的基因表达。

17.根据权利要求13所述方法，其中实体肿瘤是一种皮源性实体肿瘤。

18.根据权利要求13所述方法，其中实体肿瘤是一种鳞状细胞癌或一种黑素瘤。

19.一种确定头颈癌病患适合的放疗和/或化疗方案的方法，其包括：

获得一合适病患样本；

测量一核p16表达水平；以及

比较来自病患样本的p16表达水平和与对照样本相关的水平，其中核p16表达水平是合适放疗和/或化疗方案的标识。

20.一种检验头颈癌病患复发的方法，其包括：

获得一合适病患样本；

测量一核p16表达水平；以及

比较来自病患样本的核p16表达水平和与对照样本相关联的水平，其中所述核p16表达水平是病患头颈癌复发的标识。

21.一种检验头颈癌病患治疗方案进展的方法，其包括：

获得一合适病患样本；

测量一核p16表达水平；以及

比较来自病患样本的核p16表达水平和与一对照样本相关的水平，其中所述核p16表达水平是病患治疗进展的标识。

22.根据权利要求1所述方法，其中所述确定预断的方法由参考实验室完成。

23.根据权利要求1所述方法，其中所述确定预断的方法由医院病理实验室完成。

24.根据权利要求1所述方法，其中所述确定预断的方法由医生完成。

25.根据权利要求3所述方法，进一步包括一分析核p16、RBI和p53表达水平的算法。

26.一种为头颈癌病患选择治疗养生法的方法，其包括：

获得一合适病患样本；

测量一核p16表达水平；

比较来自病患样本核p16的表达水平和对照样本的表达水平，其中所述核p16表达水平是头颈癌治疗养生法的标识；以及

因此为头颈癌病患选择治疗养生法。

27.一种识别头颈癌病患治疗养生法的方法，其包括：

获得一合适病患样本；

测量一核p16表达水平；

比较来自病患样本的核p16表达水平和对照样本的表达水平，其汇总所述核p16表达水平是头颈癌治疗养生法的标识；以及

因此识别病患头颈癌治疗养生法。

28.一种确定头颈癌预断的工具，其包括：

测量核p16表达水平的手段；以及

比较来自病患样本的核p16表达水平和病患对照的核p16表达水平，其中降低的核p16表达水平是头颈癌病患差预断的标识。

29.一工具包括：

（a）一选自组的试剂，包括：

（i）能够特别与p16核酸杂交的核酸探针；

（ii）能p16PGR扩增的一对核酸引物；以及

（iii）专为p16的抗体；以及

（b）用于测量来自头颈癌病患组织样本的核p16表达水平的指令。

30.一种识别预防或治疗头颈癌的混合物的方法，所述方法包括步骤：

（a）一组织或一动物模型与一混合物接触；

（b）测量核p16表达水平；以及

（c）比较在动物模型中的核p16表达水平和与对照相关的水平；以及确定在细菌水平上混合物的功能作用，因此识别预防或治疗头颈癌的混合物。