JP2015521480A - 頭頸部癌予後に関する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年6月18日に出願されたヘイズ(Hayes)ら、「頭頸部癌予後に関する方法(Method for Head and Neck Cancer Prognosis)」と題される代理人整理番号第UNC12004usv号の米国仮特許出願第61/661,060号明細書の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、本明細書によって全体として参照により援用される。
本発明は、米国国立衛生研究所から交付された補助金第K12−RR−023248号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、概して、頭頸部癌患者の予後を判定する改良された方法の発見に関する。本発明はまた、頭頸部癌の予後判定に有用な試薬を含むキットにも関する。
2.1.HPV及び頭頸部癌
頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)診断は癌全体の約3〜5パーセントを占め、米国における2010年の新症例数は49,000例、及び死亡数は11,000例と推定される((非特許文献1);(非特許文献2))。最近の疫学データが示唆するところによれば、往々にして非喫煙者及び非飲酒者である若年者で罹患率が高まりつつあり((非特許文献3);(非特許文献4);(非特許文献5);(非特許文献6);(非特許文献7))、それは高頻度でヒトパピローマウイルス(HPV)感染に起因する((非特許文献8);(非特許文献9);(非特許文献10);(非特許文献11);(非特許文献12)。HPV陽性腫瘍は典型的には中咽頭に認められ、治療反応性がより高く((非特許文献13))、且つ疾患転帰がより良好である((非特許文献14);(非特許文献15))。この疾患の管理においては、患者のHPV状態に関する情報がますます大きな役割を果たすようになるという重要な見解の一致が存在する。
HNSCCに関連するリスク要因には、喫煙、アルコール摂取、まれな生殖系列癌症候群、及びヒトパピローマウイルス(HPV)感染が含まれる。腫瘍部位、TNMステージ、及びHPV状態が、予後及び治療に関する患者集団の層別化において有用であるものの(非特許文献25)、これらの因子のみに基づく患者転帰の特徴付けには重大な欠点が残る。例えば、HPV+患者はHPV−患者と比べて転帰が良好であることが広く認識されているが、例え軽度であれ喫煙歴があると、この有利な状況は大幅に弱まる(非特許文献26)。加えて、HPV−であり且つ少なくとも1つのリンパ節陽性を有する患者では、全疾患死亡率が50%に迫る可能性があり、ここで順調に行く者を順調に行かない者と分ける信頼性のある生物学的リスク要因はほとんどない(非特許文献27)。数多くの最近の研究結果からは、分子マーカーが従来の予後データを補完する有用な情報を提供することが示唆される。残念ながら、多数の推定マーカー及び概して小さいサンプルサイズが、この分野に、重点的に探究するのに最も関連性のあるパターンを同定するという課題をもたらしている。
詳細な非限定的実施形態において、本発明は、頭頸部癌患者の予後を判定する方法を提供し、この方法は、(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、(b)核p16発現レベルを計測するステップと、(c)患者サンプルの核p16発現レベルを対照サンプルの発現レベルと比較するステップとを含み、ここでは核p16発現レベルが、頭頸部癌患者の予後の指標となる。
背景:近年、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の管理ではバイオマーカーに大きな関心が集まっており、バイオマーカーは転帰に影響を与え得るものである。ヒトパピローマ感染症の検査は、このウイルスの直接的な評価並びに関連する腫瘍抑制遺伝子p16を含め、再現性があると考えられている。家族性黒色腫症候群の腫瘍から、p16の核局在化がリスク層別化においてさらなる役割を果たし得ることが示唆されている。本発明者らは、核局在化と考えられるp16染色が、中咽頭に限定されない、HPV状態又は喫煙状態によって制限されない広範な一連のHNSCC腫瘍において転帰の予測に情報を与え得るという仮説を立てた。
頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)は、その根底にある病因が腫瘍部位、TNMステージ、及びHPV状態などの従来の予後因子によって説明されていない異質な疾患である。先行研究においてHNSCCの分子サブタイプが突き止められているが、これらのサブタイプは独立したデータセットでの検証又は細胞株での検出がなされておらず、またかかる分類スキームの利点も完全には実現されていない。本発明者らは、HNSCCの分子サブタイプが存在すること;これらのサブタイプは異なる染色体増減パターンを有し、そのうちあるものはカノニカルな癌遺伝子及び腫瘍抑制因子に影響を及ぼすこと;及びサブタイプが生物学的及び臨床的に有意味であることを示す。加えて、本発明者らは、独立した腫瘍、細胞株、及び組織マイクロアレイデータセットで我々の知見を検証する。これらのサブタイプはHNSCCの病因に関する新しい洞察、並びに有用なHNSCC腫瘍分類方法を提供する。
詳細な実施形態において、頭頸部癌予後を評価する方法は、頭頸部組織サンプル又は原発性頭頸部腫瘍組織サンプルなどの、癌細胞又は組織を有する患者生体サンプルを採取するステップを含む。頭頸部サンプルは、以下の3つの解剖学的領域を含む喉頭由来であってもよい:(i)声門上喉頭には、喉頭蓋、仮声帯、喉頭室、披裂喉頭蓋ヒダ、及び披裂が含まれる;(ii)声門には、真声帯並びに前交連及び後交連が含まれる;及び声門下部は真声帯の約1cm下かを始端として、輪状軟骨下縁又は第1気管輪まで延在する。サンプルは、口唇又は口腔、例えば頬粘膜、下歯肉、上歯肉、硬口蓋、口唇、口腔底、臼後三角、又は舌の前側3分の2に由来してもよい。サンプルは、中咽頭、例えば咽頭喉頭蓋ヒダ及び舌喉頭蓋ヒダを含む舌根;扁桃窩並びに前口蓋弓及び後口蓋弓を含む扁桃部;口蓋垂を含む軟口蓋;又は咽頭壁に由来してもよい。
本発明は、頭頸部癌患者の予後を判定する為の組成物及びキットを提供し、これは、(a)核p16発現レベルを計測する手段と、(b)患者サンプルの核p16発現レベルと患者対照の核p16発現レベルとの比較に関する説明書とを含み、ここでは核p16発現レベルの低下が、頭頸部癌患者の予後不良の指標となる。
一部の実施形態では、目的のバイオマーカーの発現は核酸レベルで検出される。発現を評価する為の核酸ベースの技術は当該技術分野において周知されており、例えば、生体サンプル中のバイオマーカーRNA転写物(即ち、mRNA)のレベルを決定することが含まれる。多くの発現検出方法が単離RNAを使用する。出発物質は、典型的には、生体サンプル、例えば腫瘍又は腫瘍細胞株、及びそれぞれ対応する正常組織又は細胞株から単離された全RNAである。従ってRNAは、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮など、又は腫瘍細胞株を含め、様々な原発腫瘍から単離することができる。mRNAの供給源が原発腫瘍である場合、mRNAは、例えば、凍結又はアーカイブされたパラフィン包埋・固定(例えばホルマリン固定)組織サンプルから抽出することができる。
本発明の方法はまた、アセチル化、メチル化、リン酸化、SUMO化、又はユビキチン化などの翻訳後修飾又は後成的変化を検出する方法が付随し、及び/又はそのような方法によって補足され得る。かかる後成的変化は、ヒストンアセチル化、キナーゼリン酸化など、タンパク質で起こることも、又はCpG部位における5’メチルシトシン又は5’ヒドロメチルシトシン形成など、核酸で起こることもある。
免疫組織化学的方法もまた、本発明のバイオマーカーの発現レベルを検出するのに好適である。一実施形態において、例えば当該技術分野において公知の生検法により、患者頭頸部組織サンプルが収集される。サンプルは後に調製する為凍結されてもよく、又は直ちに固定液中に置かれてもよい。組織サンプルは、試薬、例えば、ホルマリン、グルタルアルデヒド(gluteraldehyde)、メタノールなどで処理して固定し、パラフィンに包埋することができる。ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプルから免疫組織化学分析用のスライドを調製する方法は、当該技術分野において周知されている。
用語「プロテオーム」は、ある時点でサンプル(例えば、組織、生物又は細胞培養物)中に存在するタンパク質の全体性として定義される。プロテオミクスは、とりわけ、サンプルにおけるタンパク質発現の大域的変化の研究を含む(「発現プロテオミクス」とも称される)。プロテオミクスは、典型的には以下のステップを含む:(1)2−Dゲル電気泳動(2−D PAGE)又は液体/ガスクロマトグラフィーによるサンプル中の個々のタンパク質の分離;(2)ゲルから回収された又はカラム画分に含まれた個々のタンパク質の、例えば質量分析法又はN末端シーケンシングによる同定、及び(3)バイオインフォマティクスを使用したデータ解析。プロテオミクス方法は、他の遺伝子発現プロファイリング方法の有用な補足であり、単独で、又は他の方法と組み合わせて使用して、本発明のバイオマーカーの産物を検出することができる。
本発明の方法を実施する為のキットが更に提供される。「キット」とは、核酸プローブ、抗体などの、本発明のバイオマーカーの発現を特異的に検出する為の少なくとも1つの試薬を含む任意の製造物(例えば、パッケージ又は容器)が意図される。キットは、本発明の方法を実施する為のユニットとして宣伝され、流通し又は販売され得る。加えて、キットは、キット及びその使用方法を説明する添付文書を含み得る。
カロライナ頭頸部癌研究(Carolina Head and Neck Cancer Study:CHANCE)は、2002年〜2006年にノースカロライナ州中部及び東部の46郡で実施された偶発HNSCCの集団ベース症例対照研究であった(非特許文献59)。この研究から、UNC病院で治療を受けた者であって、且つバンクに保存された利用可能な組織があった143人の患者のサブコホートを適格とした。鼻咽頭を除くあらゆる頭頸部亜部位(口腔、中咽頭、喉頭及び下咽頭)の癌を有する患者を組み入れた。治療の決定は、患者の年齢、腫瘍範囲、部位、共存症及びパフォーマンスステータスに基づきUNC頭頸部集学的チームによって提言された。臨床情報を患者カルテから抽出した。UNCで完全な医療ケアを受けた患者は、次に再燃及び死亡を含む転帰に関する診療記録の後向きレビューを行った。UNC外部の地域施設で経過観察を受けた患者は、次にその地域施設に診療記録を請求し、又はその外部施設から情報の回答が得られない場合には、CHANCE研究プロトコルに準拠して社会保障死亡指数(Social Security Death Index)及び地域の死亡記事に患者死亡を照会した。p16染色に十分な腫瘍サンプルがない患者は除外し、135人の患者が本分析に残った。バリデーションには独立したUNC TMAコホート(これについては本発明者らのグループが以前報告した(非特許文献60)が利用可能であった。
ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍ブロックからのコアサンプルを使用して、組織マイクロアレイ(TMA)を構築した。ヘマトキシリン・エオシン染色スライドを2人の病理学者が改めて調べ、初期診断を確認した。1mmマイクロアレイブロックを、ビーチャー・インスツルメンツ(Beecher Instruments)(ウィスコンシン州サン・プレイリー(Sun Prairie WI)53590)の手動組織マイクロアレイヤー1においてトリプリケートで構築した。各組織マイクロアレイから連続する4マイクロメートル切片を切断した。切片スライドをパラフィンコーティングし、染色まで4℃で保存した。本分析には第2の確認用組織リソースもまた使用しており、その構築及び結果は既に報告している(非特許文献60)。簡潔に言えば、18〜39歳の42例のHNSCCのコホートを含むTMA(若年非喫煙口腔コホート、YNOCCと命名する)を、上記と同様の方法で構築した。他の点では、組織及び試薬の処理は本方法と一致する。
p16 IHC染色を、ボンド(Bond)自動染色装置(ライカ・マイクロシステムズ・インコーポレイテッド(Leica Microsystems Inc)、マサチューセッツ州ノーウェル(Norwell MA)02061)において製造業者のIHCプロトコルに従い実施した。スライドを60度のオーブンに入れ、過剰なパラフィンを取り除いた。次にスライドを自動染色装置に置き、ボンド(Bond)脱蝋溶液(AR9222)で脱蝋し、ボンド(Bond)洗浄溶液(AR9590)で水和させた。抗原回復を、ボンド(Bond)エピトープ回復溶液1(pH6.0、AR9961)中、100℃で30分間実施した。次にスライドを、p16INK4a抗体(マウスモノクローナル抗p16抗体(MAB4133)、ケミコン(Chemicon)(登録商標)インターナショナルカンパニー/ミリポア・コーポレイション(Millipore Corporation)、カリフォルニア州テメキュラ(Temecula CA)92590)と共に15分間インキュベートした。ボンド(Bond)ポリマーリファイン検出システム(DS9800)を使用して抗体検出を実施した。染色スライドを脱水し、カバーガラスを加えた。UNCのトランスレーショナル病理検査室(Translational Pathology Lab)でIHCを実施した。IHCの完了後、スライドは本発明者らの研究室に室温で保存され、後の参照用に全てのTMAスライドの仮想スキャンコピーを保管されることになる。
ベンタナ(Ventana)ベンチマークXT自動染色装置でHPVインサイチュハイブリダイゼーションを実施した。スライドの脱パラフィン、コンディショニング、及びインフォームHPV IIIファミリー16(INFORM HPV III Family 16)プローブ(B:ベンタナ・メディカル・システムズ(Ventana Medical Systems))による染色を、自動染色装置で製造業者のプロトコルに従い実施した。これらのプローブは、HPVサブタイプ16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58及び66に対して親和性を有する。腫瘍核に点状の又は拡散したシグナルパターンが観察された場合にスライドをHPV陽性としてスコア化した。
患者の臨床データに関して知らされない病理学者によりp16発現を評価した。CHANCE TMA及びYNOCC TMAを2人の病理学者が読み取り、不確定なスコアがあれば第3の病理学者が評価した。アペリオ(Aperio)スキャンスコープ(Scanscope)を使用して細胞のデジタル画像をキャプチャした(倍率200倍)。p16過剰発現体であることが以前示された組織サンプル(子宮内膜)を、強度スコア化用の陽性対照として使用した。各サンプルに0〜3の尺度で細胞質強度スコア及び核強度スコアを付与し、ここで強度は、0は染色なし;1、かすかな又は限局的な細胞質染色;2、中程度の拡散した染色;3、強い拡散した染色でスコア化される。陽性核を有する腫瘍細胞の割合は、各100個の腫瘍細胞の検鏡視野を10視野スコア化することにより決定した。各標本について、0〜100の範囲の細胞質染色及び核染色用の半定量的百分率スコアを作成した。患者ブロック当たり3つのコアを得ることを目標にTMAを構築した。全てのブロックが十分な組織を有したわけではなく、ある場合には1つのみ又は2つのコアとなった。複数のコアを有したサンプルは、全コアにわたる平均強度又は百分率スコアを当該のサンプルの最終的な強度又は百分率スコアとして使用した。細胞質又は核における平均強度スコアと平均百分率スコアとを乗じることにより、複合産物スコアを計算した。中咽頭患者におけるスコアの二峰性の分布に基づき(図3の濃い灰色)、100の核産物スコアを核染色のカットオフとして使用した。細胞質染色の第75百分位数(133.4)が細胞質染色のカットオフであるものと見なした。強度の核染色を有した全てのサンプルが強度の細胞質染色も有し、合計3種類となった。核産物スコア≧100の患者を強度の核染色(HN)と見なした。細胞質スコアの第75百分位数(133.4)以上の産物スコアを有する患者を、その患者がHN群でない場合には、強度の細胞質染色(ITC)と見なした。強度の核スコア又は強度の細胞質スコアのいずれの基準にも達しなかった患者を、軽度の染色群(LS)に分類した。この実験的分離に基づき患者を3群、即ち強度の核染色・任意の細胞質染色(HN)、強度の細胞質染色・軽度の核染色(HC)、及び軽度の核染色及び細胞質染色(LS)に分けた。
全ての統計的分析は、R 2.9.2ソフトウェア(http://cran.r−project.org)を使用して実施した。各群(HN、HC、LS)の患者のベースライン特性を、カテゴリ変数についてはフィッシャーの直接確率検定を使用し、及び連続変数については一元配置分散分析(ANOVA)を使用して比較した。診断日から死亡日又は最後に記録された経過観察日までの時間として全生存(OS)を計算した。無進行生存(PFS)は、診断日から疾患進行日又は最後に記録された経過観察日若しくは任意の原因による死亡日までの時間として定義した。疾患の進行は、診療記録に示されるとおりの任意の記録された腫瘍進行(局所又は遠隔)として定義した。全ての観察を60ヶ月で打ち切った。カプラン・マイヤー法を使用して生存曲線を計算し、ログランク検定を使用してノンパラメトリックに比較した。コックス比例ハザードモデルを使用して異なるp16染色群の間におけるハザード比を推定し、患者の飲酒状態、腫瘍ステージ、腫瘍部位及びHPV染色に関しては調整した。全ての統計的検定は両側で有意水準は0.05とし、全ての報告される信頼区間は両側95%信頼水準で構成された。
患者特性
研究期間中に143人の患者が同定され、そのうち135人がp16染色に十分な腫瘍サンプルを有した。これらの患者の追跡期間中央値は6.67年で、5人の患者のみが5年以上の追跡が不可能であった。これらの患者のベースライン特性を表1に要約する。患者の診断時年齢中央値は57歳(範囲20〜82歳)であった。患者の68.9%が男性で、これは全国平均と同等である(非特許文献61)。ほとんどの患者が喫煙歴を有し及び/又はアルコール飲用者であり、12人(9%)のみが喫煙未経験者及び44人(約30%)が飲酒未経験者であった。更に、2人を除く123人の喫煙者全員が、10パックイヤーを上回る喫煙歴であった。患者の約30%が手術又は放射線単独による単独治療法を受けた。他の患者は異なる治療方法の併用を受けた。16人(11.9%)の患者にHPV陽性が認められ、そのうち14人が中咽頭腫瘍を有し、他の2人が口腔に腫瘍を有した。
サンプル集合では、いずれの患者に関しても3つのコアのうち少なくとも1つでp16がベースライン細胞質及び核染色を示した。p16染色のIHC像の例を図2に示す。全体的に見て、中咽頭癌及びHPV陽性癌が、他の型の腫瘍と比較して細胞質及び核の両方でより強いp16染色を有した(図3)。核産物スコア中央値は、非中咽頭サンプルの0と比較して、中咽頭腫瘍サンプルでは22であった(等密度の並べ替え検定p値<0.001)。細胞質産物スコア中央値は、非中咽頭サンプルにおける38の産物スコア中央値と比較して、中咽頭腫瘍サンプルでは150であった(等密度の並べ替え検定p値<0.001)。9人の患者が強度の核p16染色及び強度の細胞質p16染色(HN)を有し、25人の患者が強度の細胞質染色・軽度の核染色(HC)を有し、101人が軽度のp16染色(LS)を有した。種々の染色群の間で年齢、性別、喫煙状態、Tステージ及び臨床ステージに有意な差はなかった。しかしながら、強度の核又は細胞質p16染色を有する患者は、軽度のp16染色群と比較して中咽頭腫瘍及び初期リンパ節ステージ(N0〜N1)をより多く有した。
表2は、HPV陽性及び喫煙状態に対する腫瘍部位の分布を要約する。全体的に見て、143人中16人の患者がHPV陽性染色を示し、そのうち14人が中咽頭に腫瘍を有し、2人が口腔に腫瘍を有した。HPV陽性率は、少なくとも一部には本発明者らの試験集団における極めて高い喫煙率に起因して((非特許文献14);(非特許文献62))、一部の臨床試験及び他の大学ベースの報告((非特許文献63);(非特許文献13))より低かった。本研究においては中咽頭腫瘍の58%(14/24人)がHPV陽性染色を示し、中咽頭癌において64%のHPV陽性を報告したデスーザ(D’Souza)及び共同研究者ら(非特許文献62)などのこれまでの報告と同等であった。中咽頭腫瘍以外のHPV陽性染色はまれであったが、これは中咽頭以外ではHPV感染率が低いという一般的な理解と一致する(非特許文献21)。これらのHPV陽性患者の圧倒的多数は重度の喫煙者であった:16人中13人のHPV感染患者が、最低でも18パックイヤーの長期喫煙歴を有した。HPV感染は細胞質及び核の両方のp16陽性と強く関連付けられている。3人を除く全てのHPV陽性患者が、強度の核p16発現又は強度の細胞質p16発現を有すると分類された。
全コホートでは、3年全生存(OS)率は63.0%(95%CI:55.3%〜71.7%)であり、3年無進行生存(PFS)率は54.1%(95%CI:46.3%〜63.2%)であった。1例のみの死亡が追跡中にHN群で起こった。LS群では、3年OS及びPFSは、カプラン・マイヤー法を使用して65.3%(95%CI:56.7%〜75.3%)及び54.5%(95%CI:45.6%〜65.1%)と推定された。3年OS及びPFSは、HC群ではそれぞれ40%(95%CI:24.7%〜64.6%)及び36%(95%CI:21.3%〜60.7%)と推定された(図4)。HN群における3年OS及びPFS生存は100%であり、信頼区間は評価不能であった。OS及びPFSの両方の結果が染色群間で有意に異なり、ログランク検定p値はそれぞれ0.006及び0.009であった。HPV陽性群とHPV陰性群との間でOS又はPFSに有意な差はなかった(それぞれp=0.509及び0.434)。
YNOCC TMAのデータを使用して、更に42例のサンプルに関するp16染色を得ることができ、30例は口腔由来、6例は中咽頭由来、5例は喉頭由来及び1例は下咽頭由来であった。これは、20〜39歳で診断を受けた若年患者のコホートであり、23人が男性で、29人が喫煙歴を有し(パックイヤー中央値14.5)、及び18人がアルコール飲用歴を有する。以前、本発明者らは、このコホートにおけるp16陽性患者の全体的転帰が良好であることを報告した。当時、本発明者らは転帰に対する核染色の独立した寄与を評価していなかった。本研究では、独立した検証において同じ産物スコアカットオフによりこれらの患者を評価した。次に本研究に同じ基準を使用して患者を分類した:14人の患者がHN群に入り、4人の患者がHC群に入り及び24人の患者がLS群に入った。サンプルサイズが小さい為p値は統計的に有意でないが、顕著なことに、HN染色群は他の2つの群と比較して、CHANGEデータセットにおける本発明者らの観察と同程度に優れた無進行生存を示した。HN群及びLS群の再発有りのハザード比は、HC染色群と比較して(p=0.34)、0.38(95%CI 0.092−1.62)及び0.71(95%CI 0.20−2.52)である。
頭頸部扁平上皮癌の管理は、バイオマーカーHPV及びp16の染色に関する観察に基づき長年支持されてきたこの分野の治療標準が変わるかもしれない可能性により、岐路に差し掛かっているように思われる。ピボタル試験において、これらのマーカーの染色で陽性を示す患者は転帰が有意に改善されたことが実証されているが、これらのバイオマーカーが互いにどのように関係しているかが詳しく調べられるにつれ、研究者らが動機付けられ、有益な転帰関連性の背後にある機構の調査が進んでいる。第一に、喫煙によって生じるリスクの調節からも明らかなとおり、HPV感染それ自体に加えて機構が働いていることは明らかである。また、HPVと独立したp16の変化が、原因を単にHPV偽陰性アッセイに帰することのできないHNSCC患者に見られる良好な予後の幾らかを担い得るという状況証拠が少なくともある。頭頸部以外の腫瘍によるエビデンスから、p16の核局在化を新規バイオマーカーとして検討することが導かれる。本報告では、p16の核局在化をp16が核から排除されている例と比較した結果が、さらなる研究の必要性をもたらしている。更に、これらの結果は、使用が中咽頭に限定されるHPVの代用としてのp16の経験的な見解に留まらない、このバイオマーカーの機構的役割を示唆することに役立ち得る。
ここで本発明者らは、これまでで最大のHNSCC研究の一つとなる183例のHNSCC腫瘍サンプルの統合ゲノム解析結果について記載する。全ての対象者に関して遺伝子発現(GE)、DNAコピー数(CN)、又は臨床データが利用可能であった。複数のGEサブタイプが検出されたとともに、得られた発現パターンは、これまでにHNSCC(非特許文献31)及び肺扁平上皮癌(LSCC)(非特許文献30)で認められているものと同様である。頭頸部癌細胞株でも全てのGEサブタイプが検出された。加えて、本発明者らは、一部のCN増加及び減少イベントが全てのサブタイプに共通しており、一方で他のものは特定のサブタイプにおいてのみ認められること;複数のこれらのゲノムイベントが既知の癌遺伝子及び腫瘍抑制因子に影響を与えること;及びこれらの発現パターン及びゲノムイベントが臨床的関連性を持つことを示す。
HNSCC発現サブタイプの教師なし発見
統計的に有意な分子サブタイプがHNSCCにおいて導き出され得るかどうかという問題に答える為、本発明者らは、十分に確立された客観的方法を使用して、教師なしの偏りがない形での階層クラスタリングを実施した(非特許文献30)。チャン(Chung)による先行研究にあるとおり、本発明者らは4つの遺伝子発現クラスターの存在を実証する。コンセンサスクラスタープラス(ConsensusClusterPlus)(非特許文献66)により作成されるプロット(図9A及び図9Bを参照)は、このデータセットに更に統計的に有意なクラスターが存在することを支持しない。4つのクラスターの統計的有意性を確認する為、全コホートにわたる2500個の最も変異し易い遺伝子の偏りのない集合を使用して、シグクラスト(SigClust)(非特許文献67)を適用した。1000個の模擬サンプル及びオリジナルの共分散推定法を使用して、サブタイプの全てのペアワイズ比較を調べた。全てのペアワイズ比較のシグクラスト(SigClust)p値が、ボンフェローニの多重比較補正を適用した後0.05水準で有意であった(図9D)。本発明者らは発現サブタイプを、以下で考察する生物学的特性に基づき、基底(BA)、間葉系(MS)、異型(AT)、及び古典的(CL)と称する。頭頸部癌に関連性があることが分かっているか又はそれがあると疑われる遺伝子の代表的な集合を示し(図5B)、及びデータセット中の全ての遺伝子と腫瘍サブタイプとの関連性に関する検定統計量を表9〜表12に提供する。
本研究に含まれる患者の臨床的特徴は、典型的な臨床診療で見られる母集団を高度に代表する幅広い層のHNSCC患者を表す(表5)。腫瘍サブタイプと年齢、性別、アルコール摂取、パックイヤー、又は腫瘍サイズとの相関はない。腫瘍サブタイプは部位と統計的に関連性があったが、しかしながら発現サブタイプの各々で、一つを除く(下咽頭はBAなしを示した)全ての部位が腫瘍を有した。加えて、部位においてその58%より多いサンプルが一つの発現サブタイプに寄与することはなかった。発現サブタイプが68%を超えて単一部位の腫瘍で構成されることはなかった。従って、HPV又はp16などの他の分子マーカーと異なり、発現サブタイプが、単一の解剖学的部位に限定されないバイオロジーの側面を捉えると本発明者らは結論付けた(非特許文献68)。腫瘍サブタイプとHPV状態、治療、リンパ節状態、及び全体的なステージとの間には、さらなる統計的に有意な関連性があった。統計的に有意でないものの、BAが多いほど高分化型となる傾向があった一方、16例中13例の低分化型腫瘍がMS又はCLのいずれかであったことは注目に値する。
サブタイプが異なる遺伝子発現パターンを呈するという事実から、各サブタイプが個別の生物学的特徴を有することが示唆される。それらの特性を明らかにしようと、本発明者らは、各クラスで高発現するが、他のクラスでは高発現しない特異的遺伝子を調べる。
HNSCC腫瘍サブタイプの統計的に有意な性質並びにそれと肺癌における同様のサブタイプ及び既知の癌遺伝子との相関が確立されたことを受けて、本発明者らは、サブタイプの由来を部分的に説明し得るゲノム変化に着目した。示差的遺伝子発現の潜在的な原因としての染色体異常の違いを調べる為、本発明者らは、ゲノム位置及び腫瘍サブタイプの関数としての平均CNのプロットを作成した(図6)。他の腫瘍に見られているとおり、腫瘍サブタイプの関数としてのゲノムの主要領域におけるコピー数変化には、一致したパターンと個別的なパターンとの両方がある。この一組の腫瘍に共通するアイデンティティの裏付けとして、最も際立った観察は、あらゆるサブタイプにおける3番染色体の統計的に有意な共通の変化であり、これには3番染色体短腕の欠失、並びにPTK3CA及びSOX2、及び一部のサブタイプにおけるTP63の限局的な高度の増加を含む3番染色体長腕における広範なアンプリコンの存在が含まれる。対照的に、カノニカルなHNSCC7番染色体短腕増幅には、個別の違いがある。統計的に有意な増加はまた、EGFRを含む7番染色体短腕の広い領域全体にも見出され、これらはBA、MS、及びCLに見られるが、ATでは全く存在しない。
発現サブタイプ別にコピー数が一致した及び不一致の両方の領域を特定したことで、次に本発明者らは、これらの領域における遺伝子の発現が、根底にあるコピー数の変化と合致する変化を示すかどうかを考察した(図7A)。扁平上皮癌と関連性のある典型的なゲノム変化の一つは、3番染色体長腕の増幅である。予想外にも、全てのサブタイプが3番染色体長腕の増幅を示すが、典型的にはアンプリコンの標的として考察される3つの遺伝子:TP63、PIK3CA、及びSOX2の個別的、示差的、比例的な使用があった。CL及びATサブタイプは、MS及びBAと比べて比例的に高いSOX2発現を示し、これらは実際、正常な扁桃腺対照と比べて少ないSOX2を発現するように見える。対照的に、BAサブタイプは、他のどの群と比べても著しく高いレベルのTP63を発現するように見える。同様に、MSサブタイプも3番染色体長腕アンプリコンを呈するが、これらの推定標的遺伝子はどれも、正常扁桃腺より高いレベルでは発現しないように見える。要約すれば、本発明者らは、これまでに報告されているもの(非特許文献85)より複雑な、3番染色体長腕アンプリコンにおける転写因子(SOX2及びTP63)及び癌遺伝子(PIK3CA)の示差的な利用によってHNSCCの不均一性を一部説明し得る可能性が、この観察で高まると結論付ける。7番染色体上のEGFR遺伝子座の考察から、同様に、EGFRが一部のサブタイプによって、他のサブタイプより一貫して標的化され得ることが示唆される(図7B)。これらの観察は、一つには異なるコピー数変化によって促進される、転写因子及び癌遺伝子の示差的な利用が、発現サブタイプを定義付ける遺伝子発現シグネチャーに寄与し得る可能性を支持している。
前節において、本発明者らは、発現サブタイプがコピー数増減の個別的なパターンを呈することを指摘した。ここで本発明者らは、HNSCCにおいて役割を果たすことが知られる遺伝子−CCND1、CDKN2A、及びEGFR−に着目し、上記で考察した広い領域ではなく、特定の遺伝子座におけるコピー数の値を考える。表6は、これらの遺伝子におけるコピー数イベントが腫瘍サブタイプ又は手法の有意性と有意に関連したことを示しており、これは、CLサンプルの63%にCCND1限局的増幅が存在した一方で、ATでは明らかにまれであった(16%)ことによって例証されるとおりである。限局的EGFR増幅(増加の頻度は0%(AT)〜31%(CL)の範囲である)及びCDKN2A減少(減少の頻度は10%(MS)〜63%(CL)の範囲である)に関しても同様の結果が認められる。
癌細胞株百科事典(Cancer Cell Line Encyclopedia)(非特許文献89)は、17個の食道細胞株及び16個の上気道消化管細胞株のGE及びCNデータを含め、900個を超えるヒト癌細胞株のゲノムデータを含む。本発明者らは、これらの細胞株に重心予測器(centroid predictor)を適用し、全4つの発現サブタイプが存在することを見出した(表8)。予測されたサブタイプの各々におけるCN値の概要プロットは、先述した増加及び減少イベントの多くがこれらの細胞株にも存在することを示す(図12)。これらの知見は、発現サブタイプの臨床的意味を考慮すると、モデル系が関わる今後の研究の基礎を発現サブタイプが提供する為、特に説得力がある。
腫瘍収集及び遺伝学的アッセイ
凍結された、外科的に摘出された、マイクロディセクトされた頭頸部腫瘍を、ノースカロライナ大学病院(University of North Carolina Hospital)において施設内審査委員会プロトコル#01−1283に基づき収集した。腫瘍RNAを抽出し、アジレント(Agilent)44Kマイクロアレイを使用してmRNA発現をアッセイした。腫瘍DNAを抽出し、アフィメトリクス(Affymetrix)ゲノムワイド(GenomeWide)SNP6.0チップを使用してDNAコピー数をアッセイした。
マイクロアレイプローブレベル強度ファイルに品質管理手順を適用した。低品質のアレイ、重複アレイ、及び非HNSCCサンプル由来のアレイを取り除いた後、合計138個の腫瘍アレイが残った。プローブレベルデータにnormexpバックグラウンド補正及びloess正規化手法(非特許文献96)を適用した。対数変換後、プローブを一般の遺伝子データベースと照合して15597個の遺伝子の発現値を生成した。
ここに記載する手順は、ウィルカーソン(Wilkerson)らに掲載されるものと同様である。発現値を遺伝子中央値でセンタリングした後、中央値絶対偏差(median absolution deviation)を使用して遺伝子変異性を計算した。2500個の最も変異し易い遺伝子を選択した。コンセンサスクラスタープラス(ConsensusClusterPlus)(非特許文献66)を使用して138個のアレイにおけるこれらの遺伝子の教師なしクラスタリングを実施し、これ以降、本発明者らはこの得られたクラスラベルを「UNCクラス」と称する。1000個の無作為に選択したマイクロアレイサンプル集合で、80%のサンプリング割合及び1−ピアソン相関係数に等しい距離メトリックを使用してこの手順を実施した。
示差的に発現する遺伝子を、Rパッケージsamr(非特許文献98)で0.01のFDR閾値を使用して検出した。UNCクラスの各々について、本発明者らは、そのクラスの遺伝子発現値を、他の全てのクラスを合わせたものと比較した。次にDAVID(非特許文献72)を使用して、各クラスで高発現遺伝子の高濃度化を示すKEGG経路を求めた。加えて、クラス特異的遺伝子リストを既知の遺伝子オントロジー分類と比較することにより、既知の機能分類を有する示差的発現遺伝子、例えば転写因子を見付け出した(非特許文献99)。
チャン(Chung)らによって作成されたマイクロアレイプローブレベル強度ファイルを、上記に記載するものと同様のバックグラウンド補正、正規化、及び遺伝子レベル要約手順に供した。これにより60人の対象者及び8224個の遺伝子についての遺伝子発現値が生成された。(非特許文献30)に掲載されるこれらの60個のアレイのクラスラベルは、「チャン(Chung)クラス」と称する。
コンセンサスクラスタリングによりクラスラベルを各アレイに割り当てる。結果として、一部のアレイはそのクラスを代表しないこともある。シルエット幅(非特許文献100)を使用して、本発明者らは、他のサブタイプと比べてそれ自体のサブタイプのメンバーとの類似性がより高い発現パターンを有する125個の「コア」サンプルの集合を同定した。次に、その発現シグネチャーが新しいサンプルの分類に用いられ得る分類器遺伝子の集合を作成しようと、最近接重心に基づく分類方法であるClaNC(非特許文献101)を、コアサンプルからのUNC発現データに適用した。交差検証誤り率を最小化すると、840個の分類器遺伝子(クラス当たり210個の遺伝子)のリストが生成された。
CELファイルを、アフィメトリクス(Affymetrix)ジェノタイピングコンソール(Genotyping Console)を使用して品質管理手順に供し、0.4の初期閾値を上回るコントラストQC測定値を生成したアレイは、続く分析から外した。次に、Rパッケージaroma(非特許文献102)及びプールされた正常サンプル集合を使用して、CELファイルの強度値をlog_2コピー数値に変換した。ゲノムワイドコピー数プロファイルを手動で見直した後に合計107個のアレイが残り、そのうち82個は発現クラスラベルを有した。欠測値を、最も近いプローブからの非欠測値を使用してインピュテーションにより補完した。DNAコピー(DNAcopy)を使用してセグメント化を実施した(非特許文献103)。(非特許文献105)で行われたようにコピー数プロファイルを平滑化し、且つ中央値でセンタリングした後、DiNAMIC(非特許文献104)で反復性のコピー数増加及び減少を検出した。得られたDiNAMIC p値が0.05未満である場合、増加及び減少は統計的に有意と分類される。反復性のCN増加及び減少を有する領域を、水準0.95でウォルター(Walter)ら(非特許文献106)の信頼区間手順を使用して求めた。これを全107個のアレイの集合について、並びに4つのUNCクラスの各々におけるアレイに限定した後に、実施した。
遺伝子特異的コピー数を、遺伝子の範囲内にある又はそれに直ちに隣接するプローブにおける全てのセグメント化されたコピー数値の平均を計算することにより決定した。各対象者について、本発明者らは、遺伝子特異的コピー数が0.35を上回る(−0.35を下回る)場合に(これは全てのセグメント化されたコピー数値の平均値を約2標準偏差上回る(下回る)値である)、コピー数増加(減少)を有するものとして遺伝子を分類する。
全てのデータ分析を、R 2.12.2を使用して実施した。全てのカテゴリ変数間の関連性の統計的有意性は、フィッシャーの直接確率検定又はモンテカルロ版のフィッシャーの直接確率検定(p値がアスタリスクを含む)で評価した。大域的F検定を使用して、連続変数と発現サブタイプとの関連性の統計的有意性を評価した。全ての生存分析を、生存パッケージを使用して実施した。無再発生存(PFS)時間は、手術から死亡、再発、又は追跡不能までの時間(月単位)と定義した。
所与の対象者について、本発明者らは、各染色体腕における平滑化し、セグメント化したコピー数値の絶対値の中央値を計算する。これらの腕特異的中央値の中央値を染色体不安定性指数と定義し、これは(非特許文献105)に掲載される定義と同様である。
CCLEで扁平上皮癌と分類される18個の食道細胞株及び19個の「上気道消化管」細胞株について、CN及びGEデータが利用可能である。本発明者らの分類器における840個中803個の遺伝子について、細胞株のGEデータが利用可能である。これらの共通遺伝子に限定した後、本発明者らは細胞株のGEデータを、それが本発明者らの分類器と同じ遺伝子特異的平均値及び標準偏差を有するように正規化した。次に上記に記載した重心ベースの方法を使用して細胞株の発現サブタイプを予想した。(非特許文献107)(この内容は、本明細書によって全体として援用される)もまた参照のこと。
Claims (30)
- 頭頸部癌患者の予後を判定する方法であって、
(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、
(b)核p16発現レベルを計測するステップと、
(c)前記患者サンプルの前記核p16発現レベルを対照サンプルの発現レベルと比較するステップと
を含み、前記核p16発現レベルが、前記頭頸部癌患者の前記予後の指標となる、方法。 - 前記核p16発現レベルが低下し、前記低下が突然変異又はコピー数減少に起因する、請求項1に記載の方法。
- RB1及びp53レベルを計測するステップを更に含む、請求項1に記載の方法であって、RB1又はp53レベルの低下が核p16発現レベルの低下との組み合わせで予後不良を示す、方法。
- CCND1レベルを計測するステップを更に含む、請求項1に記載の方法であって、CCND1レベルの増加が予後不良の指標となる、方法。
- 前記異型サブタイプに関連する発現レベルを計測するステップを更に含む、請求項1に記載の方法であって、前記異型サブタイプの発現が予後不良の指標となる、方法。
- 細胞質p16発現レベルを計測するステップを更に含む、請求項1に記載の方法であって、前記核p16発現レベルが低下し、且つ前記細胞質p16レベルが上昇している場合、特に予後不良であることの指標となる、方法。
- 前記核p16発現レベルがmRNAアッセイによって計測される、請求項1に記載の方法。
- 前記核p16発現レベルがタンパク質アッセイによって計測される、請求項1に記載の方法。
- 前記核p16発現レベルが抗体を使用して計測される、請求項8に記載の方法。
- 前記患者サンプルが生検サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 前記生検サンプルがリンパ節生検サンプルである、請求項10に記載の方法。
- 前記頭頸部癌が扁平上皮癌(SCC)である、請求項1に記載の方法。
- 前記頭頸部癌が、下咽頭癌、声門喉頭癌、喉頭癌、口唇癌、鼻咽頭癌、口腔癌、唾液腺癌、副鼻腔癌、又は声門上喉頭癌である、請求項1に記載の方法。
- 頭頸部癌患者の予後を判定する方法であって、
(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、
(b)CCND1レベルを計測するステップと、
(c)前記患者サンプルの前記CCND1レベルを対照サンプルのCCND1レベルと比較するステップと
を含み、前記CCND1レベルが、前記頭頸部癌患者の前記予後の指標となる、方法。 - 固形腫瘍患者の予後を判定する方法であって、
(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、
(b)p16及びRB1遺伝子型、CCND1コピー数、並びにp16核タンパク質発現レベルを計測するステップと、
(c)前記患者サンプルの前記p16及びRB1遺伝子型、前記CCND1コピー数、並びに前記p16核タンパク質発現レベルを、対照サンプルに関連するp16及びRB1遺伝子型、CCND1コピー数、並びにp16核タンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、前記p16及びRB1遺伝子型、前記CCND1コピー数、並びに前記p16核タンパク質発現レベルが、前記固形腫瘍患者の前記予後の指標となる、方法。 - 異型サブタイプに関連する遺伝子の発現を計測するステップを更に含む、請求項13に記載の方法。
- 前記固形腫瘍が上皮起源の固形腫瘍である、請求項13に記載の方法。
- 前記固形腫瘍が扁平上皮癌又は黒色腫である、請求項13に記載の方法。
- 頭頸部癌患者に適切な放射線及び/又は化学療法プロトコルを決定する方法であって、
(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、
(b)核p16発現レベルを計測するステップと、
(c)前記患者サンプルの前記核p16発現レベルを対照サンプルに関連するレベルと比較するステップと
を含み、前記核p16発現レベルが、前記適切な放射線及び/又は化学療法プロトコルの指標となる、方法。 - 患者を頭頸部癌再発に関してモニタする方法であって、
(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、
(b)核p16発現レベルを計測するステップと、
(c)前記患者サンプルの前記核p16発現レベルを対照サンプルに関連するレベルと比較するステップと
を含み、前記核p16発現レベルが、前記患者における頭頸部再発の指標となる、方法。 - 頭頸部癌患者に対する治療プロトコルの進行をモニタする方法であって、
(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、
(b)核p16発現レベルを計測するステップと、
(c)前記患者サンプルの前記核p16発現レベルを対照サンプルに関連するレベルと比較するステップと
を含み、前記核p16発現レベルが、前記患者に対する前記治療の進行の指標となる、方法。 - 前記予後を判定する方法が参照検査室により実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記予後を判定する方法が院内病理検査室により実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記予後を判定する方法が医師により実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記核p16、RB1及びp53発現レベルを解析するアルゴリズムを更に含む、請求項3に記載の方法。
- 治療レジメンに対する頭頸部癌患者を選択する方法であって、
(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、
(b)核p16発現レベルを計測するステップと、
(c)前記患者サンプルの前記核p16発現レベルを対照サンプルの発現レベルと比較するステップであって、前記核p16発現レベルが、前記頭頸部癌治療レジメンの指標となるステップと、
(d)それにより前記頭頸部癌治療レジメンに対する患者を選択するステップと
を含む方法。 - 治療レジメンに対する頭頸部癌患者を同定する方法であって、
(a)好適な患者サンプルを入手するステップと、
(b)核p16発現レベルを計測するステップと、
(c)前記患者サンプルの前記核p16発現レベルを対照サンプルの発現レベルと比較するステップであって、前記核p16発現レベルが、前記頭頸部癌治療レジメンの指標となるステップと、
(d)それにより前記頭頸部癌治療レジメンに対する患者を同定するステップと
を含む方法。 - 頭頸部癌患者の予後判定用キットであって、
(a)核p16発現レベルを計測する手段と、
(b)患者サンプルの前記核p16発現レベルと患者対照の核p16発現レベルとの比較に関する説明書と
を含み、核p16発現レベルの低下が、前記頭頸部癌患者の予後不良の指標となる、キット。 - キットであって、
(a)試薬であって、
(i)p16由来の核酸との特異的なハイブリダイズ能を有する核酸プローブと、
(ii)p16のPCR増幅能を有する一対の核酸プライマーと、
(iii)p16に特異的な抗体と
からなる群から選択される試薬と、
(b)頭頸部癌患者の組織サンプルにおいて核p6発現レベルを計測する際の使用説明書と
を含むキット。 - 頭頸部癌を予防又は治療する化合物を同定する方法であって、
(a)組織又は動物モデルを化合物に接触させるステップと、
(b)核p16発現レベルを計測するステップと、
(c)前記動物モデルの前記核p16発現レベルを対照に関連するレベルと比較するステップ、及び前記化合物が細菌レベルに及ぼす機能的効果を決定するステップであって、それにより頭頸部癌を予防又は治療する化合物を同定するステップと
を含む方法。
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