JP7227254B2

JP7227254B2 - 頭頸部癌を検出するための組成物および方法

Info

Publication number: JP7227254B2
Application number: JP2020533716A
Authority: JP
Inventors: ジェラルドジェイ．ウォールウェーバー，
Original assignee: ラボラトリーコーポレイションオブアメリカホールディングス
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: US20240125785A1; JP2023054051A; CN111868261A; US11933784B2; US20190187143A1; JP2024040515A; JP2021506298A; EP3728641A1; CA3084826C; WO2019126249A1; CA3211135A1; AU2018393024A1; CA3084826A1; JP7441346B2

Description

関連出願
本出願は、２０１７年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／６０８，２９６号に基づく優先権を主張する。米国仮特許出願第６２／６０８，２９６号の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

背景
頭頸部癌は一般的な疾患である。頭頸部癌の大部分は、組織学的には扁平上皮細胞型に属しているため、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に分類される。ＨＮＳＣＣは、世界で６番目に多く見られる癌であり、発展途上国では３番目に多い。

ＨＮＳＣＣの背後にある生物学的機構は不明であり、この状態の信頼できる指標をもたらすバイオマーカーは、たとえあったとしてもごく少数である。それでも、症状の発症の誘発および／または疾患のさらなる進行の促進を回避するためにライフスタイルを調整することはＨＮＳＣＣに罹りやすい個体にとって助けとなるであろう。したがって、ＨＮＳＣＣに対するバイオマーカーを開発し評価することが必要とされている。

要旨
本開示は、多様な方法で具体化され得る。

一実施形態では、個体から試料を得るステップと；試料において表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定するステップとを含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出する方法が開示される。一実施形態では、個体から試料を得るステップと；試料において以下の遺伝子：ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つの発現量を測定するステップとを含む、個体においてＨＮＳＣＣに関連するバイオマーカーを検出する方法が開示される。もう一つの実施形態では、個体から試料を得るステップと；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６またはＥ７遺伝子の少なくとも１つの、少なくとも１つの発現量を測定するステップとを含む、個体においてＨＮＳＣＣに関連するバイオマーカーを検出する方法が開示される。さらに、かつ／または代わりに、本方法には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子の測定が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１であってよい。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＲＰＬ３０または別の標準化遺伝子であってよい。あるいは、これらの遺伝子の様々な組合せの発現の測定が実行されてよい。

一実施形態では、開示される複数のバイオマーカーのパネルが使用される。一実施形態では、本開示は、表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子、および／またはＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つ、および／またはＨＰＶＥ６およびＥ７遺伝子の少なくとも１つの発現レベルを定量化する試薬を含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出するための組成物を含む。さらに、かつ／または代わりに、本組成物には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１であってよい。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＲＰＬ３０または別の標準化遺伝子であってよい。この組成物は、特定の実施形態では、これらの遺伝子のいずれか１つのプライマーおよび／またはプローブを含むことができ、該プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に記載される検出可能部分で標識される。

その他の実施形態は、本明細書に開示される方法を実行する、かつ／または本明細書に開示される組成物を使用するためのシステムを含む。

本明細書の開示のその他の特徴、対象、および利点は、続く詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明白である。しかし、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、開示される方法、組成物およびシステムの実施形態を示しているが、限定ではなく例示のみを目的として提供されることは当然理解される。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者に明白となる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出する方法であって、
前記個体から試料を得るステップと；
表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子からの発現産物の量を測定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
ＨＰＶＥ６遺伝子および／またはＨＰＶＥ７遺伝子のうちの少なくとも１つからの発現産物の前記量を測定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
標準化遺伝子の前記量を測定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記測定するステップが、ｍＲＮＡを測定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記測定するステップが、イムノアッセイを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記遺伝子のうちの少なくとも４つの前記発現を測定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記試料が、血清、組織、ＦＦＰＥ、唾液または血漿を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に対する易罹患性を検出する方法であって：
前記個体から試料を得ることと；
表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの発現産物の前記量を測定することと；
前記試料における前記表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の前記発現と、前記遺伝子の前記発現産物の対照値を比較するステップとを含み、前記個体における遺伝子発現と前記対照値との間の差異は、前記個体がＨＮＳＣＣを有している可能性があるか、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、ＨＮＳＣＣのリスクが高い）ことを示す、方法。
（項目１０）
前記遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
少なくとも１つのＨＰＶＥ６および／またはＥ７遺伝子の少なくとも１つの発現産物の前記量を測定することと；前記試料における前記少なくとも１つの前記ＨＰＶＥ６および／またはＥ７遺伝子の発現を発現の対照値と比較することとをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
標準化遺伝子の前記量を測定することをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記測定することが、ｍＲＮＡの測定を含む、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記測定することが、タンパク質の測定を含む、項目９に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも４つの前記遺伝子の前記発現を測定することを含む、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記試料が、血清組織、ＦＦＰＥ、唾液または血漿を含む、項目９に記載の方法。
（項目１７）
表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の前記発現レベルを定量化する試薬を含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出するための組成物。
（項目１８）
前記少なくとも１つの遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
ＨＰＶＥ６および／またはＥ７の少なくとも１つの前記発現レベルを定量化する少なくとも１つの試薬をさらに含む、項目１７に記載の組成物。
（項目２０）
少なくとも１つの標準化遺伝子をさらに含む、項目１７に記載の組成物。
（項目２１）
前記試薬がｍＲＮＡを検出する、項目１７に記載の組成物。
（項目２２）
前記試薬が、これらの遺伝子のいずれか１つの少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを含み、前記少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブが検出可能部分で標識される、項目１７に記載の組成物。
（項目２３）
前記試薬がタンパク質を検出する、項目１７に記載の組成物。
（項目２４）
表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の前記発現レベルを定量化する試薬を含む、キット。

本発明は、以下の限定されない図面を参照することによって、より良く理解され得る。

図１は、ＴＣＧＡデータセットおよびランダムフォレスト分析を使用して、本開示の実施形態に従ってＨＮＳＣＣで差次的に発現した遺伝子を識別した実験の結果を示す。

図２は、複数のマーカーを含む遺伝子パネルの評価が、本開示の様々な実施形態に従ってアッセイ性能を改善し得ることを示す。

図３は、正常組織とＨＮＳＣＣ組織の両方における本開示の４つのマーカー（ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＣＡＢ３９Ｌ、ＮＲＧ２およびＡＤＡＭ１２）の部位別遺伝子発現を示す。図３において、各プロットについて、ｘ軸の左端にある３つのデータセット（喉頭、口腔および中咽頭（Ｏｒｏｐｈａｒｙｘ））は正常組織からのもので、ｘ軸の右端にある４つのデータセット（下咽頭、喉頭、口腔および中咽頭（Ｏｒｔｈｏｐｈａｒｙｎｘ））は、ＨＮＳＣＣ組織からのものである。

図４は、本開示の様々な実施形態による、正常組織とＨＮＳＣＣ組織の両方における、本開示の４つの追加のマーカー（ＬＯＸＬ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＨＳＤ１７Ｂ６およびＧＲＩＮ２Ｄ）の部位別遺伝子発現を示す。図４において、各プロットについて、ｘ軸の左端にある３つのデータセット（喉頭、口腔および中咽頭（Ｏｒｏｐｈａｒｙｘ））は正常組織からのもので、ｘ軸の右端にある３つのデータセット（下咽頭、喉頭、口腔および中咽頭（Ｏｒｔｈｏｐｈａｒｙｎｘ））は、ＨＮＳＣＣ組織からのものである。

図５は、本開示の実施形態による、すべてのデータについてのＨＮＳＣＣ試料と正常の、ならびに口腔（ＯＣ）または中咽頭（ＯＰ）でのＨＮＳＣＣと正常の、すべてのＨＮＳＣＣマーカーの比較を示す。

図６、パネルＡ（すなわち、図６Ａ）は、本開示の実施形態によるＴＣＧＡ遺伝子セットの差次的発現を示す。パネルＢ（すなわち、図６Ｂ）は、本開示の様々な実施形態を用いるランダムフォレスト分析から３６個の遺伝子の中央値ランク（図中の色が濃い記号）を示す。ＨＮＳＣＣにおける遺伝子発現の増加の場合、カットオフはＨＮＳＣＣの５パーセンタイルおよび正常の９５パーセンタイルである（例えば、図６Ｂ、ＧＲＩＮ２Ｄについての挿入図）。図６、パネルＡ（すなわち、図６Ａ）は、本開示の実施形態によるＴＣＧＡ遺伝子セットの差次的発現を示す。パネルＢ（すなわち、図６Ｂ）は、本開示の様々な実施形態を用いるランダムフォレスト分析から３６個の遺伝子の中央値ランク（図中の色が濃い記号）を示す。ＨＮＳＣＣにおける遺伝子発現の増加の場合、カットオフはＨＮＳＣＣの５パーセンタイルおよび正常の９５パーセンタイルである（例えば、図６Ｂ、ＧＲＩＮ２Ｄについての挿入図）。

図７は、本開示の様々な実施形態による、文献検索から識別された差次的に発現したマーカー（図中の色が濃い記号）を示す。

図８は、本開示の様々な実施形態による、文献検索からの標準化マーカーを示す図である。

図９パネルＡ（すなわち、図９Ａ）は、ＴＣＧＡデータセットを使用する標準化遺伝子の識別を示す。左のパネルはデータセット全体を示す。中央のパネルは、正常と癌の間の遺伝子発現の倍率変化中央値が＜２［正または負］で、四分位範囲（ＩＱＲ）が＜２である遺伝子を示す（ＩＱＲ＝７５パーセンタイルの発現／２５パーセンタイルの発現）。右のパネルは、本開示の様々な実施形態に従って、関心対象のパネルに類似する発現レベルの中央値を有する遺伝子を識別するために、ＴＣＧＡデータベースの遺伝子の正常とＨＮＳＣＣにおける発現レベルを示す。パネルＢ（すなわち、図９Ｂ）は、本開示の様々な実施形態による、ＫＨＤＲＢＳ１のディファレンシャルプロットを示す。図９パネルＡ（すなわち、図９Ａ）は、ＴＣＧＡデータセットを使用する標準化遺伝子の識別を示す。左のパネルはデータセット全体を示す。中央のパネルは、正常と癌の間の遺伝子発現の倍率変化中央値が＜２［正または負］で、四分位範囲（ＩＱＲ）が＜２である遺伝子を示す（ＩＱＲ＝７５パーセンタイルの発現／２５パーセンタイルの発現）。右のパネルは、本開示の様々な実施形態に従って、関心対象のパネルに類似する発現レベルの中央値を有する遺伝子を識別するために、ＴＣＧＡデータベースの遺伝子の正常とＨＮＳＣＣにおける発現レベルを示す。パネルＢ（すなわち、図９Ｂ）は、本開示の様々な実施形態による、ＫＨＤＲＢＳ１のディファレンシャルプロットを示す。

図１０は、本開示の様々な実施形態による、正常組織（すなわち、口腔粘膜）と比較した、癌組織（すなわち、舌扁平上皮癌）における潜在的なマーカー遺伝子、ＡＤＡＭ１２およびＳＨ３ＢＧＲＬ２の遺伝子発現のレベルについての、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）データと、ＴＣＧＡＲＮＡＳｅｑデータの比較を示す。

図１１は、ｄｄＰＣＲを使用した３つのホルマリン固定パラフィン包埋患者試料（ＤＡ１０８１９８３；ＤＲ１０４１６８６；ＤＡ００６３５９５）と１つのＵＲＮＡ対照試料（細胞培養癌組織に由来）のさらなるｄｄＰＣＲデータを示す。本開示の様々な実施形態による、二通りかまたは三通りのいずれかのサンプリングが実行された。

図１２は、本開示の様々な実施形態による、１コピー／μＬのアッセイ限界まで比較的一定の比率（点線）を示す、３つの異なる患者試料（ＲＮＡ１、３および５）およびＵＲＮＡ対照におけるＫＨＤＲＢＳ１（×）（潜在的な標準化遺伝子）の発現と比較した、ＳＨ３ＢＧＲＬ２（潜在的な癌マーカー）（・）の発現の濃度依存性を示す。

図１３は、本開示の様々な実施形態による、ＵＲＮＡ対照（左のパネル）と比較した、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料における潜在的な癌マーカーＳＨ３ＢＧＲＬ２の発現；癌と正常組織でのＳＨ３ＢＧＲＬ２／ＫＨＤＲＢＳ１のｄｄＰＣＲ産物の比率（中央パネル）；そして、ＴＣＧＡデータベースの、これらの２つのマーカーについて報告された遺伝子発現の分布（右のパネル）を示す。この図中、ｘは癌患者由来の試料であり、円（白または黒）は正常組織の試料である。

図１４は、本開示の様々な実施形態による、シングルプレックスアッセイ形式（シングル）（すなわち、ＳＨ３ＢＧＲＬ２プライマーだけを含有）かまたはデュプレックスアッセイ形式（デュプレックス）（ＳＨ３ＢＧＲＬ２およびＫＨＤＲＢＳ１プライマーを含有）のいずれかを使用した、ＳＨ３ＢＧＲＬ２の様々な患者試料の分析を示す。

図１５は、本開示の様々な実施形態による、２２個の良性（円）および８個の癌腫（ｘ）ＦＦＰＥ試料からの、デュプレックスｄｄＰＣＲによる５つのバイオマーカー（ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１、ＬＯＸＬ２およびＡＤＡＭ１２）とハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１の発現を示す。

図１６は、本開示の様々な実施形態による、２２個の良性および８個の癌腫ＦＦＰＥ試料由来のハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１への標準化後の、５つのバイオマーカーのｄｄＰＣＲによる発現（左のパネル）を、同じバイオマーカーおよびハウスキーピング遺伝子のＨＮＳＣＣＴＣＧＡからのＲＮＡＳｅｑデータ（右のパネル）と比較し、要約された各バイオマーカーについての発現の倍率変化中央値（表）と共に示す。この図では、Ｎ＝正常組織、Ｃ＝癌組織。

図１７は、本開示の様々な実施形態による、癌を正常ＦＦＰＥ試料と区別するために使用される標準化ｄｄＰＣＲ発現のｄｄＰＣＲスコアアルゴリズム結果（左のパネル）と受信者動作特性（ＲＯＣ）分析（右のパネル）を示す。

図１８は、本開示の様々な実施形態による、ｐ１６陽性ＦＦＰＥＨＮＳＣＣ試料（上のパネル）と、ｐ１６陰性ＦＦＰＥＨＮＳＣＣ試料（下のパネル）におけるｄｄＰＣＲによるＥ６およびＥ７ＨＰＶ１６の発現の相関；およびｐ１６陽性試料からのＥ６およびＥ７の標準化されたｄｄＰＣＲ発現レベル（右のプロット）を示す。

図１９は、本開示の様々な実施形態による、１５の唾液試料からのＲＮＡ収率（μｇＲＮＡ／２ｍＬ唾液）およびＡ２６０／Ａ２８０の比率を表形式（左の表）および箱ひげ図（右のプロット）に示す。

図２０は、本開示の様々な実施形態による、１５の唾液試料からの５つのバイオマーカー（ＬＯＸＬ２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＣＲＩＳＰ３、ＥＭＰ１、およびＫＲＴ４）ならびにハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３０のデュプレックスｄｄＰＣＲによる発現（左側のプロット）と、５つのデュプレックスｄｄＰＣＲ反応からのハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３０の発現（右のプロット）を別々に示す。

図２１は、本開示の様々な実施形態による、１５の唾液試料からハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３０に標準化した後の５つのバイオマーカーのｄｄＰＣＲによる発現（左パネル）を、同じバイオマーカーのＨＮＳＣＣＴＣＧＡからのＲＮＡＳｅｑデータ（右パネル）と比較し、要約された各バイオマーカーのＬＯＸＬ２に対する発現の倍率増加の中央値（表）と共に示す。

詳細な説明
用語および定義
本開示がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。以下の用語およびその他の用語のさらなる定義は明細書全体にわたって記載されている。

本開示の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体例に記載される数値は可能な限り正確に報告されている。しかし、数値には、それぞれの試験測定で見出された標準偏差から必然的に生じる特定の誤差が本質的に含まれる。さらに、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に包括されるありとあらゆる下位範囲を包含すると理解される。例えば、述べられた範囲の「１～１０」は、最小値１と最大値１０の間の（最大値と最小値を含む）ありとあらゆる下位範囲を含むとみなされるべきである；つまり、全ての下位範囲は１またはそれを超える最小値（例、１～６．１）で始まり、１０またはそれ未満の最大値（例、５．５～１０）で終わる。さらに、「本明細書に組み込まれる」として言及されるいずれの参考文献も、その全文が組み込まれていると理解されるべきである。

さらに留意されたいのは、本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、１つの指示対象に明示的かつ明確に限定されている場合を除いて、複数の指示対象が含まれることである。用語「および／または」は、少なくともどちらか一方をさすために通常使用される。一部の例では、用語「および／または」は、用語「または」と同義的に使用される。用語「含む」は、「含むがこれらに限定されない」という語句を意味するために本明細書において使用され、これと同義的に使用される。用語「例えば～など」は、語句「例えば～などであるがこれらに限定されない」という語句を意味するために本明細書において使用され、これと同義的に使用される。

別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。専門家は、当分野の定義および用語に関して、特にＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を対象とする。

抗体：本明細書において、用語「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片を実質的にコードする１または複数のポリペプチドからなるポリペプチドをさす。認識された免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は一般にκかまたはλに分類される。重鎖は一般にγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これは次に免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含むことが公知である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００～１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を定義する。用語「軽鎖可変鎖」（ＶＬ）および「重鎖可変鎖」（ＶＨ）とは、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をさす。抗体は、特定の抗原に特異的であり得る。抗体またはその抗原は、分析物または結合パートナーのいずれかであり得る。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼによる消化によって産生された多数の十分に特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ－ＣＨ１に連結された軽鎖であるＦａｂの二量体である、Ｆ（ａｂ）’２を産生するために、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏和な条件下で還元されてヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それにより（Ｆａｂ’）２二量体はＦａｂ’モノマーに変換され得る。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部分を有するＦａｂである（その他の抗体断片のより詳細な説明については、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照）。様々な抗体断片が無傷の抗体の消化に関して定義されているが、当業者であれば、そのようなＦａｂ’断片が、化学的にまたは組換えＤＮＡ法を利用することによって新規に合成され得ることを理解する。したがって、用語「抗体」は、本明細書において、全抗体の修飾によって作製されたかまたは組換えＤＮＡ法を使用して新規に合成された抗体断片も含む。一部の実施形態では、抗体は一本鎖抗体、例えば重鎖可変鎖と軽鎖可変鎖が（直接またはペプチドリンカーを介して）一緒に結合し、連続したポリペプチドを形成する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である。単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合により結合したＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体であり、直接結合しているかまたはペプチドをコードするリンカーによって結合しているＶＨ－およびＶＬ－をコードする配列を含む核酸から発現され得る。（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３を参照）。自然に凝集したが化学的に分離された軽および重ポリペプチド鎖を、抗体Ｖ領域から、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造に折り畳まれたｓｃＦｖ分子に変換するための構造は、いくつか存在する。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号を参照されたい。

用語「抗体」には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体およびキメラ抗体、例えば、コンビナトリアル変異誘発およびファージディスプレイによって生成されたものが含まれる。用語「抗体」には、抗体のミメティクスまたはペプチド模倣体も含まれる。ペプチド模倣体は、ペプチドおよびタンパク質に基づくか、またはそれに由来する化合物である。本開示のペプチド模倣体は、一般に非天然アミノ酸を使用する既知ペプチド配列の構造修飾、立体配座の制限、等配電子置換などによって得ることができる。

対立遺伝子：本明細書において使用される、用語「対立遺伝子」とは、同じ遺伝子座（例、遺伝子）のヌクレオチド配列の異なるバージョンをさす。

対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）：本明細書において、用語「対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）」とは、対応するＤＮＡ配列とハイブリダイズし、かかるプライマーの３’末端ヌクレオチドの成功したハイブリダイゼーションに応じて伸長されるプライマーを用いる変異検出方法をさす。一般に、標的配列との完全な一致を形成する３’末端ヌクレオチドを有する伸長プライマーを伸長させて伸長産物を形成する。改変されたヌクレオチドは、伸長産物に組み込まれることができ、そのようなヌクレオチドは検出目的で伸長産物を効果的に標識することができる。代わりに、伸長プライマーは、標的配列とミスマッチを形成する３’末端ヌクレオチドを代わりに含むことがある。この場合、伸長に使用されるポリメラーゼが不注意にエキソヌクレアーゼ活性を有していない限り、プライマー伸長は起こらない。

増幅：本明細書において、用語「増幅」とは、標的核酸をコピーし、それによって選択された核酸配列のコピー数を増加させるための当分野で公知の方法をさす。増幅は、指数関数的であっても直線的であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡかまたはＲＮＡのいずれかであってよい。一般に、この方法で増幅された配列は、「アンプリコン」を含む。増幅は様々な方法で達成されてよく、それにはポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、転写に基づく増幅、等温増幅、ローリングサークル増幅などが含まれるがこれらに限定されない。増幅は、二本鎖アンプリコンを生成するために、プライマー対の各プライマーの比較的類似した量で実行されてよい。しかし、当技術分野で周知のように非対称ＰＣＲを用いて主にまたは排他的に一本鎖産物を増幅させてもよい（例えば、Ｐｏｄｄａｒ、Ｍｏｌｅｃ．ＡｎｄＣｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ１４：２５－３２（２０００））。これは、プライマーの各対を使用して、対の一方のプライマーの濃度をもう一方のプライマーと比べて大幅に低下させることによって実現され得る（例えば、１００倍の差）。非対称ＰＣＲによる増幅は、通常、線形である。当業者であれば、異なる増幅方法を一緒に使用してよいことを理解する。

動物：本明細書において、用語「動物」とは、動物界のあらゆるメンバーをさす。一部の実施形態では、「動物」とは、あらゆる発生達段階のヒトをさす。一部の実施形態では、「動物」とは、あらゆる発生達段階の非ヒト動物をさす。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または蠕虫が含まれるがこれに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物、および／またはクローンであってよい。

およそ：本明細書において、関心対象の１または複数の値に適用される、用語「およそ」または「約」とは、述べられた基準値に類似する値をさす。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」とは、述べられた基準値のいずれの（より大きいまたはより小さい）方向にも２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る値の範囲を、特に明記しない限り、または文脈から明白な場合を除いて（そのような数が可能な値である１００％を超えない限り）さす。用語「約」は、装置の固有の誤差の変動、値を決定するために用いられている方法、または試料間に存在する変動が値に含まれることを示すために使用される。

関心対象の症状群または疾患に関連している：本明細書において、「関心対象の症状群または疾患に関連している」とは、非症候性または非疾患対照よりも関心対象の症状群または疾患を有する患者にバリアントが多く見出されることを意味する。一般に、そのような関連の統計的有意性は、複数の患者をアッセイすることによって決定することができる。

生物学的試料：本明細書において、用語「生物学的試料」または「試料」は、生物学的起源から得たあらゆる試料を包含する。生物学的試料には、限定されない例として、血液、羊水、血清、血漿、液体または組織生検、尿、糞便、上皮試料、皮膚試料、頬スワブ、精子、羊水、培養細胞、骨髄試料および／または絨毛膜絨毛が含まれ得る。簡便な生体試料は、例えば、頬側口腔の表面から細胞を擦り取ることによって得ることができる。生体試料という用語は、本明細書に記載の検出のために核酸またはタンパク質を放出するか、またはそれらを利用可能にするように処理されている試料を包含する。生物学的試料という用語には、試料（例えば、血漿または羊水）中に存在し得る無細胞核酸も含まれる。例えば、生体試料には、生体試料中の細胞からのＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡが含まれてよい。生体試料は、胎児、若年成人、成人などの人生の段階から得られてもよい。固定または凍結された組織も使用されてよい。

バイオマーカー：本明細書において、用語「バイオマーカー」または「マーカー」とは、単独でまたは他のバイオマーカーと組み合わせて、関心対象の疾患または症状群を診断するため、あるいはその診断または予後を助け；関心対象の疾患または症状群の進行をモニターし；かつ／あるいは関心対象の症状群または疾患の治療の有効性をモニターするために使用されることのできる、１または複数の核酸、ポリペプチドおよび／またはその他の生体分子（例えば、コレステロール、脂質）をさす。

結合剤：本明細書において、用語「結合剤」とは、第２の（すなわち異なる）関心対象分子と特異的かつ選択的に結合することのできる分子をさす。相互作用は、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電もしくは疎水性相互作用の結果として非共有結合性であってもよいし、あるいはそれは共有結合性であってもよい。用語「可溶性結合剤」とは、固体支持体に結合していない（すなわち共有結合または非共有結合している）結合剤をさす。

保因者：用語「保因者」とは、症状はないが、その子供に受け継がれる変異を保有している人をさす。一般に、常染色体劣性遺伝障害に関して、保因者は、突然変異を引き起こす疾患を含む１つの対立遺伝子と、正常または疾患に関連しない２番目の対立遺伝子を有する。

コード配列と非コード配列：本明細書において、用語「コード配列」とは、転写および／または翻訳されて、ポリペプチドまたはその断片のｍＲＮＡおよび／あるいはポリペプチドまたはその断片を生成することができる核酸またはその相補体の配列、あるいはその一部をさす。コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未成熟一次ＲＮＡ転写物にエクソンを含み、それらは細胞の生化学的機構により一緒に接続されて成熟ｍＲＮＡをもたらす。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コードされる配列はそこから推定することができる。本明細書において、用語「非コード配列」とは、インビボでアミノ酸に転写されない核酸またはその相補体の配列またはその一部、あるいはｔＲＮＡがアミノ酸を配置するよう相互作用しないかまたは配置しようとしない配列をさす。非コード配列には、ゲノムＤＮＡまたは未成熟一次ＲＮＡ転写物中の両方のイントロン配列、および遺伝子付随配列、例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー等が含まれる。

相補体：本明細書において、用語「相補体」、「相補的」および「相補性」とは、ワトソン／クリックの対合規則に従うヌクレオチド配列の対合をさす。例えば、配列５’－ＧＣＧＧＴＣＣＣＡ－３’は、５’－ＴＧＧＧＡＣＣＧＣ－３’の相補的配列を有する。相補的配列は、ＤＮＡ配列と相補的なＲＮＡの配列でもあり得る。天然の核酸に一般に見出されない特定の塩基が、イノシン、７－デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）をはじめとするがこれらに限定されない相補的核酸の中に含まれていることがある。相補性は完全である必要はない；安定した二本鎖が、ミスマッチ塩基対、変性したまたはマッチしていない塩基を含有していることもある。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度ならびにミスマッチ塩基対の発生率をはじめとする多数の変数を考慮して、二本鎖安定性を経験的に決定することができる。

保存された：本明細書において、用語「保存された残基」とは、同じ構造および／または機能を有する複数のタンパク質の中で同じであるアミノ酸をさす。保存された残基の領域はタンパク質の構造または機能に重要であり得る。したがって、三次元タンパク質において特定される隣接する保存された残基は、タンパク質の構造または機能に重要であり得る。保存された残基、または３Ｄ構造の保存された領域を見つけるために、異なる種からの、または同じ種の個体からの同じまたは類似のタンパク質の配列の比較を行うことができる。

対照：本明細書において、用語「対照」は、結果を比較する標準物質であるという、その技術分野で理解されている意味を有する。一般に、対照は、かかる変数について結論を出すために変数を分離することによって実験の整合性を増大させるために使用される。一部の実施形態では、対照は、比較基準を得るために試験反応またはアッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。一つの実験では、「試験」（すなわち試験される変数）が適用される。第２の実験では、「対照」、すなわち試験される変数は適用されない。一部の実施形態では、対照は歴史的対照である（すなわち、以前に実施された試験またはアッセイ、あるいは、以前に公知の量または結果の対照）。一部の実施形態では、対照は、印刷されたかまたはそうではなく保存された記録であるか、またはそれを含む。対照は、陽性対照であっても陰性対照であってもよい。

バイオマーカーの「対照」または「所定の基準」とは、健康な被験体におけるバイオマーカーの発現のレベル、または同じ被験体からの非罹患組織もしくは非症候性組織における前記バイオマーカーの発現レベルをさす。所与バイオマーカーの対照または所定の基準発現レベルまたはタンパク質の量は、日常的な実験のみを使用する、前向きおよび／または後ろ向きの統計研究によって確立され得る。そのような所定の基準発現レベルおよび／またはタンパク質レベル（量）は、当業者によって周知の方法を使用して決定することができる。陽性対照は、所定量の測定されるシグナルを提供する試料（または試薬）である。

粗製の：本明細書において、用語「粗製の」は、生体試料に関連して使用される場合、実質的に未精製状態である試料をさす。例えば、粗製試料は、細胞溶解物または生検組織試料であり得る。粗製試料は、溶解状態で存在してもよいし、乾燥製剤として存在してもよい。

欠失：本明細書において、用語「欠失」は、天然に存在する核酸から１または複数のヌクレオチドを除去する突然変異を包含する。

関心対象の疾患または症状群：本明細書において使用される、関心対象の疾患または症状群は頭頸部癌であり、一部の実施形態では、より具体的にはＨＮＳＣＣである。

検出：本明細書において、用語「検出」、「検出された」または「検出すること」には、「測定」、「測定された」または「測定すること」が含まれ、逆もまた同じである。

検出可能部分：本明細書において、用語「検出可能部分」または「検出可能生体分子」または「レポーター」とは、定量的アッセイで測定され得る分子をさす。例えば、検出可能部分は、基質を測定され得る生成物（例えば、可視生成物）に変換するために使用されてよい酵素を含むことがある。または、検出可能部分は、定量化され得る放射性同位元素であってよい。または、検出可能部分は、フルオロフォアであってよい。または、検出可能部分は、発光分子であってよい。または、その他の検出可能な分子が使用されてもよい。

エピジェネティック：本明細書において使用される、エピジェネティックな要素は、基本的なＤＮＡ配列の変化以外の機構によって遺伝子発現を変化させ得る。そのような要素には、パラミューテーション、インプリンティング、遺伝子サイレンシング、Ｘ染色体不活性化、位置効果、再プログラミング、トランスベクション、母性効果、ヒストン修飾、およびヘテロクロマチンを調節する要素が含まれ得る。

エピトープ：本明細書において、用語「エピトープ」とは、特定の抗体または抗体様タンパク質に接触する分子または分子化合物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質複合体）の断片または部分をさす。

エクソン：本明細書において、エクソンは、ＲＮＡのその他の部分（例えば、イントロンとして公知の介在領域）がＲＮＡスプライシングによって除去された後に、成熟ＲＮＡまたは処理済みＲＮＡの状態で見出される核酸配列である。したがって、エクソン配列は、通常、タンパク質またはタンパク質の部分をコードする。イントロンは、ＲＮＡスプライシングによって周囲のエクソン配列から除去されるＲＮＡの部分である。

発現および発現ＲＮＡ：本明細書において、発現ＲＮＡは、タンパク質またはポリペプチドをコードするＲＮＡ（「コーディングＲＮＡ」）、転写されているが翻訳されていない任意のその他のＲＮＡ（「ノンコーディングＲＮＡ」）である。用語「発現」は、本明細書において、ＤＮＡからポリペプチドが生成されるプロセスを意味するために使用される。このプロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびこのｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を伴う。使用される文脈に応じて、「発現」はＲＮＡ、タンパク質、またはその両方の産生をさすことがある。

タンパク質の量および／または本開示のバイオマーカーの発現の測定は、転写された分子またはその対応するタンパク質の発現を検出するための幅広い種類の周知の方法のいずれかによって評価され得る。そのような方法の限定されない例としては、分泌タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、および核酸増幅法が挙げられる。特定の実施形態では、マーカー遺伝子の発現は、マーカー遺伝子に対応するタンパク質、例えば、マーカー遺伝子に対応するオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質、またはその通常の翻訳後修飾のすべてまたは一部を受けたタンパク質などと特異的に結合する抗体（例えば、放射標識、発色団標識、フルオロフォア標識、または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば、基質と、またはタンパク質－リガンド対のタンパク質またはリガンドと結合した抗体複合｛例えば、ビオチン－ストレプトアビジン｝）、あるいは抗体断片（例、一本鎖抗体、単離された抗体超可変ドメインなど）を使用して評価される。特定の実施形態では、試薬は、検出可能な物質で直接にまたは間接的に標識されてよい。検出可能な物質は、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、および酵素補因子からなる群から、例えば選択されてよい。抗体を標識する方法は、当技術分野で周知である。

別の実施形態では、マーカー遺伝子の発現は、試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写ポリヌクレオチド）を調製すること、ならびにマーカー遺伝子およびその断片を含むポリヌクレオチドの相補体である基準ポリヌクレオチドとｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをハイブリダイズさせることによって評価される。ｃＤＮＡは、必要に応じて、基準ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に、多様なポリメラーゼ連鎖反応法のいずれかを使用して増幅させることができる；好ましくは、それは増幅されない。

家族歴：本明細書において、用語「家族歴」とは、一般に、両親および兄弟姉妹を含む個体の肉親に関連するイベントの発生（例えば、疾患関連障害または突然変異保因者）をさす。家族歴には、祖父母およびその他の親類も含まれてよい。

フランキング：本明細書において、用語「フランキング」は、プライマーが、標的上で増幅させようとする関心対象領域に隣接している標的核酸とハイブリダイズすることを意味する。好ましいプライマーは、ヌクレオチドが適したＤＮＡポリメラーゼによってプライマーの３’末端に付加されるように、標的二本鎖ＤＮＡ分子の各鎖に１つずつ、関心対象領域から５’（上流）にハイブリダイズするプライマーの対であることを当業者は理解するであろう。例えば、変異配列に隣接するプライマーは、実際には変異配列にアニールするのではなく、変異配列に隣接する配列にアニールする。一部の例では、エクソンをフランクするプライマーは、通常、エクソン配列にアニールするのではなく、エクソンに隣接する配列（例えば、イントロン配列）にアニールするように設計されている。しかし、一部の例では、増幅プライマーは、エクソン配列にアニールするように設計されていることがある。

遺伝子：本明細書において、遺伝子は遺伝の単位である。一般に、遺伝子はタンパク質または機能ＲＮＡをコードするＤＮＡの一部である。遺伝子は、遺伝の単位に対応するゲノム配列の配置可能な領域である。遺伝子は、調節領域、転写領域、およびまたはその他の機能配列領域に関連し得る。

遺伝子型：本明細書において、用語「遺伝子型」とは、生物の遺伝子構成をさす。より具体的には、この用語は、個体に存在する対立遺伝子の同一性をさす。個体またはＤＮＡ試料の「遺伝子型判定」とは、既知の多型部位で個体が所有する２つの対立遺伝子の性質を、ヌクレオチド塩基に関して特定することをさす。

遺伝子調節エレメント：本明細書において、遺伝子調節エレメントまたは調節配列は、転写因子などの調節タンパク質が結合して遺伝子発現を調節するＤＮＡのセグメントである。そのような調節領域は、多くの場合、調節される遺伝子の上流にある。

健康な個体：本明細書において、用語「健康な個体」または「対照」とは、関心対象の症状群および／または疾患と診断されていない被験体をさす。

ヘテロ接合：本明細書において、用語「ヘテロ接合」または「ＨＥＴ」とは、同じ遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を保有する個体をさす。本明細書において、用語「ヘテロ接合」は、「複合ヘテロ接合」または「複合ヘテロ接合変異体」を包含する。本明細書において、用語「複合ヘテロ接合」とは、２つの異なる対立遺伝子を保有する個体をさす。本明細書において、用語「複合ヘテロ接合変異体」とは、対立遺伝子の２つの異なるコピーを保有する個体をさし、そのような対立遺伝子は遺伝子の変異形として特徴付けられる。

ホモ接合：本明細書において、用語「ホモ接合」は、同じ対立遺伝子の２つのコピーを保有する個体をさす。本明細書において、用語「ホモ接合変異体」は、同じ対立遺伝子の２つのコピーを保有する個体をさし、そのような対立遺伝子は遺伝子の変異形として特徴付けられる。

ハウスキーピング遺伝子または標準化遺伝子：本明細書において、「ハウスキーピング遺伝子」は、すべての細胞型の維持に必要な基本的な機能を提供するため、一般にすべての細胞で構成的に発現する遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子または「標準化遺伝子」は、試料間の変動による変動を説明するために、関心対象の遺伝子と同時に測定される。そのような試料間変動は、限定されるものではないが、ＲＮＡ単離、逆転写、ＰＣＲ効率などの実験変数の変動を反映し得る。標準化には、関心対象の遺伝子とハウスキーピング遺伝子との比率を報告することが含まれる。例えば、Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．ら、２００９．ＴｈｅＭＩＱＥｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：ｍｉｎｉｍｕｍｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｏｒｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ，Ａｐｒ；５５（４）：６１１－６２２を参照されたい。

ハイブリダイズ：本明細書において、用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」とは、２つの相補的な核酸鎖が適切にストリンジェントな条件下で互いとアニールするプロセスをさす。ハイブリダイゼーションに適したオリゴヌクレオチドまたはプローブは、一般に１０～１００ヌクレオチド長（例えば、１８～５０、１２～７０、１０～３０、１０～２４、１８～３６ヌクレオチド長）を含有する。核酸ハイブリダイゼーション技術は当技術分野で周知である。当業者は、少なくとも望ましいレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイズし、一方、より低い相補性を有する配列がそうしないようにハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをどのように推定し調整するかを理解している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９４，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊ．
を参照されたい。

同一性または同一パーセント：本明細書において、用語「同一性」または「同一パーセント」とは、２つのアミノ酸配列間または２つの核酸配列間の配列同一性をさす。同一性パーセントは、２つの配列を整列させることによって決定することができ、比較される配列によって共有される位置の同一残基（すなわちアミノ酸またはヌクレオチド）の数をさす。配列アライメントおよび比較は、当技術分野において標準的なアルゴリズムを使用して（例えば、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２－４８９；ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３；ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８）、またはＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡとして公開されているこれらのアルゴリズムのコンピュータ版によって（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅＲｅｌｅａｓｅ７．０，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）実行されてよい。また、メリーランド州ベセスダの米国国立衛生研究所を通じて利用可能なＥＮＴＲＥＺを配列比較に使用してもよい。その他の例では、市販のソフトウェア、例えばＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔなどを使用して同一性パーセントを決定してもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴＮ；米国国立バイオテクノロジー情報センターのインターネットサイトで入手可能）を使用することができる。一実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、それが２つの配列間の単一のアミノ酸ミスマッチであるかのように各アミノ酸ギャップが重みづけされるように、ギャップウェイトが１のＧＣＧを使用して決定することができる。または、ＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用してもよい。

本明細書において使用される、それと少なくとも９０％同一という用語には、指示された配列と９０～１００％の同一性の範囲にある配列が含まれ、その間の全ての範囲が含まれる。したがって、それと少なくとも９０％同一という用語には、指示された配列に対して９１、９１．５、９２、９２．５、９３、９３．５、９４、９４．５、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９、９９．５パーセント同一である配列が含まれる。同様に、「少なくとも７０％同一」という用語には、７０～１００％同一の範囲の配列が含まれ、その間の全ての範囲が含まれる。同一性パーセントの決定は、本明細書に記載されるアルゴリズムを使用して決定される。

挿入または付加：本明細書において、用語「挿入」または「付加」とは、天然に存在する分子と比較して、それぞれ１または複数のアミノ酸残基またはヌクレオチドの付加をもたらすアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化をさす。

インビトロ：本明細書において、用語「インビトロ」は、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば試験管または反応容器、細胞培養などで発生するイベントをさす。

インビボ：本明細書において、用語「インビボ」とは、ヒトまたは非ヒト動物などの多細胞生物内で発生するイベントをさす。

単離された：本明細書において、用語「単離された」とは、（１）最初に作成された時に関連付けられていた要素（自然界にあろうと、かつ／または実験環境にあろうと）の少なくとも一部から分離された物質および／または実体、ならびに／あるいは（２）人の手によって生成、調製、および／または製造された物質および／または実体をさす。単離された物質および／または実体は、最初に関連付けられていたその他の要素の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、または１００％から分離されていてよい。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％よりも高く、実質的に１００％、または１００％純粋である。本明細書において、物質は、その他の要素を実質的に含まない場合に「純粋」である。本明細書において、用語「単離された細胞」とは、多細胞生物に含まれていない細胞をさす。

標識された：用語「標識された」および「検出可能な薬剤または部分で標識された」は、本明細書において同義的に使用されて、実体（例えば、核酸プローブ、抗体など）が、例えば別の実体（例えば、核酸、ポリペプチド等）と結合した後にラベルの検出（例えば、放射能などの視覚化された検出）によって測定され得ることを明示する。検出可能な薬剤または部分は、測定されることができ、その強度が結合した実体の量に関連する（例えば比例する）シグナルを生成するように選択されてよい。タンパク質およびペプチドを標識および／または検出するための幅広い種類の系が当技術分野で公知である。標識されたタンパク質およびペプチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段により検出可能な標識の組み込みまたは結合によって調製することができる。標識または標識部分は、直接に検出可能であってもよいし（すなわち、検出可能になるためにさらなる反応または操作を必要としない、例えば、フルオロフォアは直接検出可能である）、間接的に検出可能であってもよい（すなわち、検出可能な別の実体との反応または結合によって検出可能になる、例えば、ハプテンは、フルオロフォアなどのレポーターを含む適切な抗体との反応後の免疫染色によって検出可能である）。適した検出可能な薬剤としては、放射性ヌクレオチド、フルオロフォア、化学発光剤、微粒子、酵素、比色ラベル、磁気ラベル、ハプテン、分子ビーコン、アプタマービーコンなどが挙げられるがこれに限定されない。

マイクロＲＮＡ：本明細書において使用されるマイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の転写後調節に関与する、短い（２０～２４ヌクレオチド）非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の両方に影響を与える可能性がある。例えば、マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲで相補的配列と結合し、遺伝子サイレンシングを引き起こすことができる。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、タンパク質をコードするかまたはコードしないかのいずれかであり得る、キャップされポリアデニル化された一次転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）の一部として転写される。一次転写産物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて、およそ７０ヌクレオチドのステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を生成することができ、このｍｉＲＮＡは細胞質ダイサーリボヌクレアーゼによってさらに切断されて、成熟ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスｍｉＲＮＡスター（ｍｉＲＮＡ^＊）産物を生成することができる。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれることができ、ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対形成を通じて標的ｍＲＮＡを認識することができ、最も一般的には、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害または不安定化をもたらす。

マルチプレックスＰＣＲ：本明細書において、用語「マルチプレックスＰＣＲ」とは、別個のプライマー対を使用して各々プライミングされた２またはそれを超える領域の同時増幅をさす。

マルチプレックスＡＳＰＥ：本明細書において、用語「マルチプレックスＡＳＰＥ」とは、遺伝子多型を検出するためにマルチプレックスＰＣＲと対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）を組み合わせたアッセイをさす。一般に、マルチプレックスＰＣＲは、ＡＳＰＥプライマーの標的配列として機能するＤＮＡの領域を最初に増幅するために使用される。対立遺伝子特異的プライマー伸長の定義を参照されたい。

突然変異および／またはバリアント：本明細書において、突然変異およびバリアントという用語は、核酸またはタンパク質配列の変化を記述するために同義的に使用される。用語「変異体」とは、本明細書において、変異しているか、または潜在的に機能しない形態の遺伝子をさす。

核酸：本明細書において、「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドである。この用語は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ならびにヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体から作成されたＲＮＡおよびＤＮＡを含むために使用される。

取得するまたは取得：本明細書において、用語「取得する」または「取得」には、直接手に入れることまたは間接的に（すなわち、第三者から）受け取ることが含まれる。

ポリペプチドまたはタンパク質：本明細書において、用語「ポリペプチド」および／または「タンパク質」とは、特定の長さではなく、アミノ酸のポリマーをさす。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドおよび／またはタンパク質の定義の中に含まれる。「ポリペプチド」および「タンパク質」は、部分的または全長タンパク質を含み得るタンパク質分子を記述するために本明細書において同義的に使用される。用語「ペプチド」は、文脈がそうでないことを示していない限り、全長よりも短いタンパク質または非常に短いタンパク質を示すために使用される。

当技術分野で公知のように、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」は、そのα炭素が、１つのアミノ酸のα炭素のカルボキシル基と、もう１つのアミノ酸のα炭素のアミノ基との間の縮合反応によって形成されたペプチド結合によって連結されている、アミノ酸（一般にＬ－アミノ酸）の鎖である。一般に、タンパク質を構成しているアミノ酸は、順番に番号が付けられていて、アミノ末端残基から始まり、タンパク質のカルボキシ末端残基の方向に向かって増加している。アミノ酸残基の略語は、２０個の一般的なＬ－アミノ酸の１つをさすために当技術分野で使用される標準的な３文字および／または１文字のコードである。

本明細書において、ポリペプチドまたはタンパク質の「ドメイン」は、独立した単位を含むポリペプチドまたはタンパク質に沿った領域を含む。ドメインは、構造、配列および／または生物活性に関して定義され得る。一実施形態では、ポリペプチドドメインは、タンパク質の残部から実質的に独立した方法で折り畳まれるタンパク質の領域を含み得る。ドメインは、これらに限定されないが、ＰＦＡＭ、ＰＲＯＤＯＭ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＳＢＡＳＥ、ＩＳＲＥＣＰＲＯＦＩＬＥＳ、ＳＡＭＲＴ、およびＰＲＯＣＬＡＳＳなどのドメインデータベースを使用して特定されてよい。

プライマー：本明細書において、用語「プライマー」とは、核酸試料中の相補的配列とハイブリダイズする能力がある短い一本鎖オリゴヌクレオチドをさす。一般に、プライマーは、鋳型依存性のＤＮＡ合成の開始点として機能する。デオキシリボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマーに付加され得る。一部の実施形態では、プライマーへのそのようなデオキシリボヌクレオチドの付加も、プライマー伸長として公知である。本明細書において、プライマーという用語には、ペプチド核酸プライマー、ロックド核酸プライマー、ホスホロチオエート修飾プライマー、標識されたプライマーなどをはじめとする、合成され得る全ての形態のプライマーが含まれる。ＰＣＲ反応のための「プライマー対」または「プライマーセット」とは、一般に「フォワードプライマー」および「リバースプライマー」を含むプライマーのセットをさす。本明細書において、「フォワードプライマー」とは、ｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖にアニールするプライマーをさす。「リバースプライマー」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖にアニールする。

遺伝子多型：本明細書において、用語「遺伝子多型」とは、遺伝子またはその部分の２以上の形態の共存をさす。

部分および断片：本明細書において使用される、用語「部分」および「断片」は、ポリペプチド、核酸、またはその他の分子構築物をさすために同義的に使用される。

試料：本明細書において、用語「試料」とは、個体または被験体または患者から得られる材料を指す。試料は、すべての体液（例えば、全血、血漿、血清、唾液、眼の水晶体液、汗、尿、乳など）、組織または抽出物、細胞、無細胞核酸、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織などを含む、あらゆる生物学的起源に由来し得る。

センス鎖とアンチセンス鎖：本明細書において、用語「センス鎖」とは、機能タンパク質のコード配列の少なくとも一部分を含む二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の鎖をさす。本明細書において、用語「アンチセンス鎖」とは、センス鎖の逆相補鎖であるｄｓＤＮＡの鎖をさす。

有意差：本明細書において、用語「有意差」は、十分に当業者の知識の範囲内であり、各々の特定バイオマーカーを参照して経験的に決定される。例えば、健康な被験体と比較した、関心対象の疾患または症状群を有する被験体におけるバイオマーカーの発現の有意差は、統計学的に有意なタンパク質量の差である。

類似またはホモログ：本明細書において、アミノ酸またはヌクレオチド配列に言及する際の用語「類似」または「ホモログ」は、野生型アミノ酸配列とある程度の相同性または同一性を有するポリペプチドを意味する。相同性の比較は、目で、またはより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つまたはそれを超える配列間の相同性パーセントを計算することができる（例えば、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：７２６－７３０）。例えば、相同配列は、代替実施形態において、互いに少なくとも７０％同一、７５％同一、８０％同一、８５％同一、９０％同一、９５％同一、９７％同一、または９８％同一であるアミノ酸配列を含むと解釈され得る。

特異的：本明細書において、用語「特異的」とは、オリゴヌクレオチドプライマーに関連して使用される場合に、適切なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で、関心対象の標的とハイブリダイズする能力があり、関心対象でない核酸と実質的にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドまたはプライマーをさす。より高いレベルの配列同一性が好ましく、それには、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性が含まれる。一部の実施形態では、特異的オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、オリゴヌクレオチドと核酸を整列させた場合、ハイブリダイズまたは増幅させる核酸の一部分と少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０塩基またはそれを超える配列同一性を含む。

当技術分野で公知のように、核酸配列を互いにハイブリダイズさせるための条件は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまでの範囲として記載され得る。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、高温の低塩緩衝液でハイブリッドを洗浄することをさす。ハイブリダイゼーションは、０．５ＭＮａＨＰＯ_４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの当技術分野で標準的なハイブリダイゼーション溶液を使用して、６５℃で結合したＤＮＡを濾過し、０．２５ＭＮａＨＰＯ_４、３．５％ＳＤＳで洗浄し、それに続いてプローブの長さに応じて、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで室温から６８℃の範囲の温度で洗浄することであり得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４^ｔｈＥｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ２，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．参照）。例えば、高ストリンジェンシー洗浄は、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中で、１４塩基のオリゴヌクレオチドプローブについて３７℃で、または１７塩基のオリゴヌクレオチドプローブについて４８℃で、または２０塩基のオリゴヌクレオチドプローブについて５５℃で、または２５塩基のオリゴヌクレオチドプローブについて６０℃で、または約２５０ヌクレオチド長のヌクレオチドプローブについて６５℃で洗浄することを含む。核酸プローブは、例えば、［γ－^３２Ｐ］ＡＴＰによる末端標識によって放射性ヌクレオチドで、またはランダムプライマー標識によって［α－^３２Ｐ］ｄＣＴＰなどの放射標識ヌクレオチドの組み込みによって、標識されてよい。代わりに、プローブは、ビオチン化またはフルオレセイン標識ヌクレオチドの組み込みによって標識され、プローブはストレプトアビジンまたは抗フルオレセイン抗体を使用して検出されてよい。

ｓｉＲＮＡ：本明細書において、ｓｉＲＮＡ（低分子阻害ＲＮＡ）は、約２０の相補的ヌクレオチドからなる本質的に二本鎖のＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、より大きな二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子の分解によって作成される。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとｍＲＮＡとの相互作用によってその対応するｍＲＮＡを本質的に２つに分割し、ｍＲＮＡの分解を引き起こすことによって遺伝子発現を抑制し得る。また、ｓｉＲＮＡは、ＤＮＡと相互作用して、クロマチンのサイレンシングとヘテロクロマチンの拡大を促進することもできる。

被験体：本明細書において、用語「被験体」とは、ヒトまたは任意の非ヒト動物をさす。被験体は患者であり得、これは疾患の診断または治療のために医療提供者を受診するヒトをさす。ヒトには、出生前および出生後の形が含まれる。また、本明細書において、用語「個体」、「被験体」または「患者」には、全ての温血動物が含まれる。一実施形態では、被験体はヒトである。一実施形態では、個体は、ＨＮＳＣＣを発症するリスクが増大している被験体である。

実質的に：本明細書において、用語「実質的に」とは、関心対象の特徴または特性の全体またはほぼ全体の範囲または程度を示す定性的な状態をさす。生物学分野の当業者は、生物学的および化学的現象が、仮にあるとしてもめったに完了することはなく、かつ／または完全に進行することはなく、または絶対的な結果を達成するかまたは回避することはめったにないことを理解するであろう。そのため、用語「実質的に」は、本明細書において、多くの生物学的および化学的現象に固有の、潜在的な完全性の欠如を捕らえるために使用される。

実質的に相補的な：本明細書において、用語「実質的に相補的な」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることのできる２つの配列をさす。当業者は、実質的に相補的な配列は、その全長にわたってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。一部の実施形態では、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、少なくとも以下と同程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件をさす：５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および５ＸＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液中４２℃で一晩のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いる４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いる４５℃での洗浄。一部の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２０の近接するヌクレオチドの範囲で２塩基よりも多く異なる２つの核酸のハイブリダイゼーションを可能にさせるべきではない。

置換：本明細書において、天然に存在する分子と比較して、用語「置換」とは、１または複数のアミノ酸またはヌクレオチドの、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチド
による置換をさす。

～に罹患している：疾患、障害、および／または状態「に罹患している」個体は、疾患、障害、および／または状態と診断されているかまたはその１または複数の症状を示している。

罹患しやすい：疾患、障害、および／または状態に「罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／または状態と診断されていない。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または状態の症状を示していない可能性がある。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発症するであろう。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発症しないであろう。

固体支持体：用語「固体支持体」または「支持体」は、生体分子がその上に結合され得る基板を提供する構造を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイのウェル（すなわち、マイクロタイタープレートなど）であってもよいし、固体支持体は、アレイ上の位置、またはビーズなどの可動支持体であってもよい。

上流および下流：本明細書において、用語「上流」とは、分子がタンパク質である場合には２番目の残基のＮ末端である残基、または分子が核酸である場合には２番目の残基の５’にある残基をさす。また、本明細書において、用語「下流」とは、分子がタンパク質である場合には２番目の残基のＣ末端である残基、または分子が核酸である場合には２番目の残基の３’にある残基をさす。本明細書に開示されるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は全て、Ｎ末端のアミノ酸からＣ末端の酸まで記載され、本明細書に開示される核酸配列は全て、分子の５’末端から分子の３’末端まで記載されている。

概要
本明細書の開示は、関心対象の疾患および／または症状群の遺伝子に関連し、関心対象の遺伝子および／または症状群に関連する障害のより正確な診断に使用され得る、特定の遺伝子において識別された新規な変異を提供する。

一部の実施形態では、試料は核酸を含有する。一部の実施形態では、試験ステップは塩基配列決定を含む。一部の実施形態では、試験ステップはハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、関心対象のバイオマーカーの領域に特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプローブを使用して実施される。一部の実施形態では、突然変異の検出のために、ハイブリダイゼーションは、１つのヌクレオチドのミスマッチも認めないほど十分にストリンジェントな条件下で実施される。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションはマイクロアレイを用いて実施される。一部の実施形態では、試験ステップは制限酵素消化を含む。一部の実施形態では、試験ステップはＰＣＲ増幅を含む。一部の実施形態では、試験ステップは逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）を含む。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅は、デジタルＰＣＲ増幅である。一部の実施形態では、試験ステップはプライマー伸長を含む。一部の実施形態では、プライマー伸長は一塩基プライマー伸長である。一部の実施形態では、試験ステップは、マルチプレックス対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）を実施することを含む。

一部の実施形態では、試料はタンパク質を含有する。一部の実施形態では、試験ステップはアミノ酸塩基配列決定を含む。一部の実施形態では、試験ステップは、関心対象のバイオマーカーを特異的に認識する１または複数の抗体を使用するイムノアッセイを実施することを含む。一部の実施形態では、試験ステップは、プロテアーゼ消化（例えば、トリプシン消化）を含む。一部の実施形態では、試験ステップは、２Ｄゲル電気泳動を実施することをさらに含む。

一部の実施形態では、試験ステップは、質量分析を使用して１または複数のバイオマーカーの存在を決定することを含む。一部の実施形態では、質量分析フォーマットは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、ＩＲ－ＭＡＬＤＩ、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、フーリエ変換、およびそれらの組み合わせの中から選択される。

一部の実施形態では、試料は、細胞、組織（例えば、ＦＦＰＥ組織）、全血、口腔洗浄薬、血漿、血清、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜試料、絨毛膜試料培養、羊水、羊水培養、経頸管洗浄液、またはそれらの組み合わせから得られる。特定の実施形態では、試料は、液体または組織生検のいずれかであってよい。一部の実施形態では、試料は、血液、血漿、血清または羊水などの生物学的試料に存在し得る無細胞核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。

一部の実施形態では、試験ステップは、バイオマーカーの所定の位置でのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の同一性を決定することを含む。一部の実施形態では、変異の存在は、所定の位置のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の同一性を対照と比較することにより決定される。

実施形態では、この方法は、複数の個体においてアッセイ（例えば、核酸塩基配列決定法）を実施して、関連の統計的有意性を決定することを含み得る。

別の態様では、本開示は、これらに限定されないが、バイオマーカー（例えば、ＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ、タンパク質中の突然変異）に特異的に結合する核酸プローブ、あるいはバイオマーカーに特異的に結合する１または複数のプローブを含有するアレイなどの関心対象のバイオマーカーを検出するための試薬を提供する。一部の実施形態では、本開示は、バイオマーカーに特異的に結合する抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、１または複数のそのような試薬を含むキットを提供する。一部の実施形態では、１または複数の試薬は、マイクロアレイの形態で提供される。一部の実施形態では、キットは、プライマー伸長のための試薬をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、健康な個体を示す対照をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、関心対象のバイオマーカーに基づいて、個体が関心対象の症状群または疾患を有するかどうかを決定する方法に関する説明書をさらに含む。

一部の例では、１または複数のバイオマーカーの量は、特定の実施形態では、（ａ）前記１または複数のバイオマーカーによって調節されるポリペプチドまたはタンパク質の量を検出すること；（ｂ）前記バイオマーカーを調節するポリペプチドまたはタンパク質の量を検出すること；あるいは（ｃ）バイオマーカーの代謝産物の量を検出すること、によって検出され得る。

さらに別の態様では、本明細書の開示は、バイオマーカーの検出に対応する情報をコードするコンピュータ可読媒体を提供する。

ＨＮＳＣＣを診断するための方法および組成物
本開示の実施形態は、ＨＮＳＣＣの存在またはこれを発症するリスクの増加を診断するための方法および組成物を含む。本開示の方法および組成物を使用して、被験体から遺伝情報を得るかまたは提供し、その被験体またはその他の被験体に関して、ＨＮＳＣＣの存在またはそれを発症するリスクの増加を客観的に診断することができる。本方法および組成物は、多様な方法で具体化され得る。

一実施形態では、個体から試料を得るステップと；試料において表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定するステップとを含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出する方法が開示される。一実施形態では、個体から試料を得るステップと；試料において以下の遺伝子：ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つの発現量を測定するステップとを含む、個体においてＨＮＳＣＣに関連するバイオマーカーを検出する方法が開示される。一実施形態では、個体から試料を得るステップ；および少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６またはＥ７遺伝子の発現量を測定するステップを含む、個体においてＨＮＳＣＣに関連するバイオマーカーを検出する方法が開示される。あるいは遺伝子の様々な組合せが評価されてよい。これらの遺伝子のいずれかの発現の測定値は、特定の実施形態では、対照値と比較され得る。様々な実施形態では、個体における遺伝子の発現と対照値との間の差異は、その個体がＨＮＳＣＣを有し得る（すなわち、存在の診断である）か、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す。対照値は、正常（非癌性組織）の１つまたは複数の試料に由来し得るか、または正常（非癌性）母集団に由来し得る。さらに、かつ／または代わりに、本方法には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子の測定が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１であってよい。その他の実施形態では、ＲＰＬ３０または他の標準化遺伝子が使用され得る。

さらに、かつ／または代わりに、個体から試料を得ることと；試料において表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子からの発現産物の量を測定することと；試料における表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現を発現の対照値と比較することとを含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に対する易罹患性を検出する方法が開示される。様々な実施形態では、個体における遺伝子の発現と対照値との間の差異は、その個体がＨＮＳＣＣを有し得る（すなわち、存在の診断である）か、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す。対照値は、正常（非癌性組織）の１つまたは複数の試料に由来し得るか、または正常（非癌性）母集団に由来し得る。さらに、かつ／または代わりに、本方法には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子の測定が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１であってよい。その他の実施形態では、ＲＰＬ３０または他の標準化遺伝子が使用され得る。

さらに、かつ／または代わりに、個体から試料を得ることと；試料においてＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの発現産物の量を測定することと；試料におけるＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つの発現を、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の各々の発現の対照値と比較することとを含む、個体においてＨＮＳＣＣに対する易罹患性を検出する方法が開示される。さらに、かつ／または代わりに、個体から試料を得ることと；試料におけるＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７の少なくとも１つを含む遺伝子からの少なくとも１つの発現産物の量を測定することと；試料におけるＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７発現産物の少なくとも１つの発現をＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７の各々の発現の対照値と比較することとを含む、個体においてＨＮＳＣＣに対する易罹患性を検出する方法が開示される。様々な実施形態では、個体における遺伝子の発現と対照値との間の差異は、その個体がＨＮＳＣＣを有し得る（すなわち、存在の診断である）か、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す。対照値は、正常（非癌性組織）の１つまたは複数の試料に由来し得るか、または正常（非癌性）母集団に由来し得る。さらに、かつ／または代わりに、本方法には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子の測定が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１であってよい。その他の実施形態では、ＲＰＬ３０または他の標準化遺伝子が使用され得る。

特定の実施形態では、測定することは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を測定することを含む。または、測定することは、イムノアッセイを含み得る。

場合によっては、バイオマーカーの数を増やすと、この方法の統計的検出力が向上する。例えば、特定の実施形態では、この方法は、少なくとも２、３、４、５つまたはそれを超えるバイオマーカーの発現を測定することを含み得る。一部の例では、少なくとも４つのバイオマーカーが測定される。

多様な試料がアッセイされてよい。特定の実施形態では、試料は、血清、血漿、唾液または組織（例えば、ＦＦＰＥ組織）を含む。

開示される方法には、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）において発現が増加または減少しているが、正常対照と比較してＨＮＳＣＣ疾患では発現していない少なくとも１つのマーカーを識別することを含む、個体において、ＨＮＳＣＣに関連するマーカーを識別する方法も含まれる。本明細書において開示されるように、そのような方法には、正常組織と比較してＨＮＳＣＣにおける差次的発現を示すマーカーの統計的評価が含まれ得る。または、この方法には、他の生物学的基準に基づいて、正常と比較してＨＮＳＣＣを判別するバイオマーカー（例えば、変異遺伝子、コピー数の相違および転座、ＤＮＡメチル化、および／またはマイクロＲＮＡ）が含まれ得る。または、バイオマーカーの他の生物学的態様が評価されてもよい。

本明細書に開示されるように、多様な方法を使用して関心対象のバイオマーカーを測定することができる。一実施形態では、測定することは、ｍＲＮＡの測定を含む。一実施形態では、測定は、ペプチドまたはポリペプチドバイオマーカーを測定することを含む。例えば、一実施形態では、測定は、イムノアッセイを含む。または、測定は、フローサイトメトリーを含み得る。または、本明細書において詳細に考察されるように、核酸法を使用してもよい。

さらに他の実施形態では、ＨＮＳＣＣを処置する方法が開示される。処置する方法は、個体から試料を得ることと；試料において表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子からの発現産物の量を測定することと；試料における表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現を発現の対照値と比較することと；個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有し得る（すなわち、存在の診断である）か、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す場合に、個体をＨＮＳＣＣについて処置することとを含み得る。対照値は、正常（非癌性組織）の１つまたは複数の試料に由来し得るか、または正常（非癌性）母集団に由来し得る。さらに、かつ／または代わりに、本方法には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子の測定が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１であってよい。その他の実施形態では、ＲＰＬ３０または他の標準化遺伝子が使用され得る。

例えば、特定の実施形態では、処置する方法は、個体から試料を得ることと；試料においてＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの発現産物の量を測定することと；試料におけるＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つの発現をＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の各々の発現の対照値と比較することと；個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有し得る（すなわち、存在の診断である）か、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す場合に、個体をＨＮＳＣＣについて処置することとを含み得る。

処置する方法は、試料においてＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７の少なくとも１つを含む遺伝子からの少なくとも１つの発現産物の量を測定することと；試料におけるＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７発現産物の少なくとも１つの発現をＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７の各々の発現の対照値と比較することと；個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有し得る（すなわち、存在の診断である）か、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す場合に、個体をＨＮＳＣＣについて処置することをさらに含み得る。

処置する方法の様々な実施形態では、対照値は、正常（非癌性組織）の１または複数の試料に由来し得るか、または正常な（非癌性）母集団から誘導され得る。さらに、かつ／または代わりに、本方法には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子の測定が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１であってよい。その他の実施形態では、ＲＰＬ３０または他の標準化遺伝子が使用され得る。

上記のように、さらに他の実施形態は、個体においてＨＮＳＣＣに関連するバイオマーカーを検出するための組成物を含む。特定の実施形態では、組成物は、生物学的試料中の少なくとも１つの開示されるバイオマーカーのレベルを定量化する試薬を含む。例えば、本明細書において詳細に記載されるように、組成物は、ｍＲＮＡを測定するための試薬を含み得る。または、組成物は、ペプチドまたはポリペプチドのバイオマーカーを測定するための試薬を含み得る。一実施形態では、組成物は、イムノアッセイを実施するための試薬を含む。または、組成物は、フローサイトメトリーを実施するための試薬を含んでよい。または、本明細書に詳細に記載されるように、組成物は、特定の配列の存在および／または核酸の発現レベルを決定するための試薬を含んでよい。本明細書に詳細に記載されるように、試薬は、検出可能部分で標識され得る。

したがって、本開示の他の態様は、表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを定量化する試薬を含む、個体においてＨＮＳＣＣに関連するバイオマーカーを検出するための組成物を含む。さらに、かつ／または代わりに、本開示の他の態様は、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つの発現レベルを定量化する試薬を含む、個体においてＨＮＳＣＣに関連するバイオマーカーを検出するための組成物を含む。さらに、かつ／または代わりに、本開示の態様は、ＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７の少なくとも１つの発現レベルを定量化する試薬を含む、個体においてＨＮＳＣＣに関連するバイオマーカーを検出するための組成物を含む。さらに、かつ／または代わりに、本組成物には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子を検出するための試薬が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１であってよい。その他の実施形態では、ＲＰＬ３０または他の標準化遺伝子が使用され得る。例えば、一部の実施形態では、試薬はｍＲＮＡを検出する。または、試薬はタンパク質を検出し得る。

したがって、組成物は、特定の実施形態では、これらの遺伝子のいずれか１つのプライマー（例えばプライマー対）および／またはプローブを含むことができ、該プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に記載される検出可能部分で標識される。さらに、かつ／または代わりに、プライマーおよび／またはプローブは、プライマーおよび／またはプローブが表面に固定化されるアレイも含み得る。他の実施形態では、試薬は、開示される遺伝子から発現したペプチドおよび／またはタンパク質を測定するための試薬を含み得る。例えば、組成物は、イムノアッセイを実行するための試薬を含み得る。一部の実施形態では、これらの試薬は、本明細書に詳細に記載されるアレイを含み得る。本明細書に詳細に記載されるように、試薬は、検出可能部分で標識され得る。

その他の実施形態は、本明細書に開示される方法を実行する、かつ／または本明細書に開示される組成物を使用するためのシステムを含む。例えば、本開示の他の態様は、本開示の組成物を含むキット、または本開示の方法を実行するためのキットを含む。例えば、他の実施形態には、少なくとも一部の本明細書に開示される組成物および／または本明細書に開示される方法を実行するための試薬を含有するキットなどのシステムが含まれる。そのようなシステムまたはキットには、方法を実行するための、かつ／または本開示の組成物を使用するための説明書および／またはその他の情報を含むコンピュータ可読媒体が含まれ得る。

本明細書に開示される方法、組成物またはシステムのいずれにも、様々な種類の試料が使用され得る。特定の実施形態では、試料は、血清、血漿、唾液または組織（例えば、ＦＦＰＥ組織）を含む。または、他の試料種が使用されてよい。

ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質アッセイ
特定の実施形態では、関心対象のバイオマーカーは、タンパク質レベル（またはペプチドまたはポリペプチドレベル）で検出される、つまり、遺伝子産物が分析される。例えば、タンパク質またはその断片は、アミノ酸塩基配列決定法、あるいは、関心対象のバイオマーカー上に存在する１または複数のエピトープを特異的に認識するかまたは一部の例では関心対象の突然変異に特異的な１または複数の抗体を使用するイムノアッセイによって分析され得る。タンパク質は、プロテアーゼ消化（例えば、トリプシン消化）によって分析され得、一部の実施形態では、消化されたタンパク質産物は２Ｄゲル電気泳動によってさらに分析され得る。

抗体に基づく検出方法
関心対象のバイオマーカーを認識する特異的抗体は、当分野で公知の多様な方法のいずれかで用いることができる。特定のエピトープ、ポリペプチド、および／またはタンパク質に対する抗体は、当分野で公知の多様な方法のいずれかを使用して生成することができる。例えば、それに対する抗体が望まれるエピトープ、ポリペプチド、またはタンパク質を産生し、動物、一般に哺乳動物（例えばロバ、マウス、ウサギ、ウマ、ニワトリなど）に注射し、動物によって産生された抗体を動物から収集することができる。モノクローナル抗体は、不死化細胞株で関心対象の抗体を発現するハイブリドーマを生成することによっても生成することができる。

一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載される検出可能部分で標識される。

抗体検出方法は当技術分野で周知であり、それには酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびウェスタンブロットが挙げられるがこれらに限定されない。一部のそのような方法は、アレイ形式で実施するのに適している。

例えば、一部の実施形態では、関心対象のバイオマーカーは、バイオマーカーを特異的に認識する第１の抗体（または抗体断片）を使用して検出される。抗体は、検出可能部分（例えば、化学発光分子）、酵素、または第２の結合剤（例えば、ストレプトアビジン）で標識されてよい。または、当技術分野で公知のように第２の抗体を使用して第１の抗体を検出してもよい。

特定の実施形態では、この方法は、捕捉支持体を追加することをさらに含んでよく、捕捉支持体は、バイオマーカーを捕捉支持体上に固定化するようにバイオマーカーを認識し結合する、少なくとも１つの捕捉支持体結合剤を含む。この方法は、特定の実施形態では、捕捉支持体上の複数の結合剤分子および／またはバイオマーカーの少なくとも一部を特異的に認識し結合することができる第２の結合剤を追加することをさらに含んでよい。一実施形態では、捕捉支持体上の複数の結合剤分子および／またはバイオマーカーの少なくとも一部を特異的に認識し結合することができる結合剤は、可溶性結合剤（例えば、二次抗体）である。酵素の基質を添加して、形成された生成物の量を定量化することによって、関心対象のバイオマーカーの結合が測定されるように、第２の結合剤を（例えば、酵素で）標識してもよい。

一実施形態では、捕捉固体支持体は、アッセイウェル（すなわちマイクロタイタープレートなど）であってよい。または、捕捉固体支持体は、アレイ上の位置、またはビーズなどの可動支持体であってよい。または捕捉支持体はフィルターであり得る。

一部の例では、バイオマーカーは、第１の結合剤（例えば、バイオマーカーに特異的であり、検出可能部分で標識された一次抗体）および第２の結合剤（例えば、一次抗体を認識する二次抗体または第２の一次抗体）と複合体化させることができ、第２の結合剤は第３の結合剤（例えば、ビオチン）と複合体を形成し、第３の結合剤は次に、捕捉支持体と連結された第３の結合剤を認識する試薬（例えば、ストレプトアビジン）を有する捕捉支持体（例えば、磁性ビーズ）と相互作用することができる。複合体（標識された一次抗体：バイオマーカー：第２の一次抗体－ビオチン：ストレプトアビジン－ビーズ）は、次に、複合体の量を測定するために、磁石（例えば、磁気プローブ）を使用して捕捉される。

多様な結合剤を本開示の方法で使用してよい。例えば、捕捉支持体、または第２の抗体に結合した結合剤は、バイオマーカーを認識する抗体かまたは抗体断片のいずれかであってよい。または、結合剤は、非タンパク質標的に結合するタンパク質（すなわち、小分子バイオマーカーに特異的に結合するタンパク質、またはタンパク質に結合する受容体など）を含んでよい。

特定の実施形態では、固体支持体は、不動態化剤で処理されてよい。例えば、特定の実施形態では、関心対象のバイオマーカーは、不動態化された表面（すなわち、非特異的結合を減らすように処理された表面）で捕捉され得る。そのような不動態化剤の１つがＢＳＡである。さらに、かつ／または代わりに、使用される結合剤が抗体である場合、固体支持体は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または結合剤（例えば、抗体）と高い親和性で結合する別の薬剤でコーティングされていてよい。これらのタンパク質は、抗体のＦｃドメインに結合する、したがって関心対象の１または複数のタンパク質を認識する抗体の結合を方向付けることができる。

核酸アッセイ
特定の実施形態では、本明細書に開示されるバイオマーカーは、核酸レベルで検出される。一実施形態では、本開示は、被験体において関心対象の症状群または疾患（例えば、ＨＮＳＣＣ）の存在またはこれを発症するリスクの増加を診断するための方法を含む。

この方法は、被験体由来の組織または体液試料から核酸を取得するステップ、およびアッセイを行って関心対象の遺伝子の過剰発現があるかどうかを識別するステップを含み得る。例えば、特定の遺伝子産物の過剰発現は、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて定量化され得る。または、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用され得る。

または、この方法は、被験体由来の組織または体液試料から核酸を取得するステップ、およびアッセイを行って被験体の核酸にバリアント配列（すなわち、突然変異）があるかどうかを識別するステップを含み得る。特定の実施形態では、この方法は、バリアントを、関心対象の症状群または疾患に関連する既知のバリアントと比較すること、およびバリアントが、関心対象の症状群または疾患に関連していると以前に識別されたバリアントであるかどうかを決定することを含み得る。または、この方法は、バリアントを以前に特徴付けられていない新しいバリアントとして識別することを含み得る。このバリアントが新しいバリアントである場合、この方法は、突然変異が、遺伝子の発現および／または遺伝子にコードされるタンパク質の機能に有害であると予期されるかどうかを決定するための分析を実施することをさらに含み得る。本方法は、バリアントプロファイル（すなわち、被験体において識別された突然変異の編集）を使用して、関心対象の症候群または疾患の存在、または関心対象の症候群または疾患を発症するリスクの増加を診断することをさらに含み得る。

核酸分析は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、および／またはｃＤＮＡで実施することができる。また、様々な実施形態において、核酸は、遺伝子、ＲＮＡ、エクソン、イントロン、遺伝子調節エレメント、発現したＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはエピジェネティック要素を含む。また、スプライス部位、転写因子結合、Ａ－Ｉ編集部位、マイクロＲＮＡ結合部位、および機能的ＲＮＡ構造部位を含む調節エレメントが、突然変異（すなわち、バリアント）について評価され得る。したがって、本開示の方法および組成物の各々について、バリアントは、以下のうちの少なくとも１つを包含する核酸配列を含み得る：（１）Ａ－ｔｏ－Ｉ編集部位；（２）スプライス部位；（３）保存された機能的ＲＮＡ構造；（４）有効な転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）；（５）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位；（６）ポリアデニル化部位；（７）既知の調節エレメント；（８）ｍｉＲＮＡ遺伝子；（９）ＲＯＩにコードされた核小体低分子ＲＮＡ遺伝子；および／または（１０）胎盤哺乳動物全体の超保存エレメント。

多くの実施形態において、核酸は生体試料から抽出される。一部の実施形態では、核酸は増幅されずに分析される。一部の実施形態では、核酸は、当技術分野で公知の技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅されるｃＤＮＡの生成など）を使用して増幅され、増幅された核酸は、その後の分析に使用される。プライマー対の複数のセットを使用して数個のアンプリコン（例えば、異なるゲノム領域由来のもの）を一度に増幅する、マルチプレックスＰＣＲを用いてよい。例えば、核酸は、塩基配列決定、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、制限酵素消化、プライマー伸長、例えば一塩基プライマー伸長またはマルチプレックス対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）など、あるいはＤＮＡ塩基配列決定によって分析され得る。一部の実施形態では、核酸は、野生型対立遺伝子の増幅産物のサイズが突然変異対立遺伝子のサイズと異なるように増幅される。したがって、特定の突然変異対立遺伝子の有無は、例えば電気泳動ゲル上で、増幅産物のサイズの違いを検出することにより決定することができる。例えば、遺伝子領域の削除または挿入は、サイズに基づくアプローチの使用に特に適していることがある。

特定の例となる核酸分析法は、下に詳細に説明されている。

ｍＲＮＡの分析
特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法および／または市販の試薬および／またはキットを使用して、リアルタイムおよび／または逆転写酵素ＰＣＲを使用して分析される。「リアルタイムＰＣＲ」またはｒＰＣＲは、ＰＣＲの開始前の鋳型核酸の量に比例する、ＰＣＲの各サイクル中に生成された生成物を検出および測定するための方法である。増幅曲線などの得られた情報を使用して、標的核酸の存在を決定し、かつ／または標的核酸配列の初期量を定量化することができる。用語「リアルタイムＰＣＲ」は、ＰＣＲ反応全体を通して、またはリアルタイムで、ＰＣＲ産物の検出を可能にするＰＣＲ技術のサブセットを表すために使用される。

一部の例では、ｒＰＣＲは、リアルタイム逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲ（ｒＲＴ－ＰＣＲ）である。または、ドロップレットデジタルＰＣＲが使用され得る。逆転写酵素ＰＣＲは、出発物質がＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡである場合に使用される。ＲＮＡは最初に逆転写酵素によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写される。ｒＲＴ－ＰＣＲでは、次にｃＤＮＡをｑＰＣＲ反応の鋳型として使用する。ｒＲＴ－ＰＣＲは、逆転写酵素をＤＮＡポリメラーゼとともに使用して、単一のチューブおよびバッファー内で逆転写とＰＣＲを組み合わせる一段階法で実行することができる。一段階ｒＲＴ－ＰＣＲでは、ＲＮＡ標的とＤＮＡ標的の両方が、配列特異的標的を用いて増幅される。用語「定量的ＰＣＲ」は、最初に存在する標的核酸配列の定量的または半定量的決定を可能にするすべてのＰＣＲに基づく技術を包含する。

リアルタイムＰＣＲ（ｒＰＣＲ）の原理は、一般に、例えば、Ｈｅｌｄら、“ＲｅａｌＴｉｍｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ” ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ６：９８６－９９４（１９９６）に記載される。一般に、ｒＰＣＲは各増幅サイクルでシグナルを測定する。一部のｒＰＣＲ技術は、あらゆる増殖サイクルの完了時にシグナルを発するフルオロフォアに依存している。そのようなフルオロフォアの例は、二本鎖ＤＮＡに結合すると、所定の波長で蛍光を発する蛍光色素、例えばＳＹＢＲグリーンなどである。したがって、各増幅サイクル中の二本鎖ＤＮＡの増加は、ＰＣＲ産物の蓄積による蛍光強度の増加につながる。ｒＰＣＲでの検出に使用されるフルオロフォアの別の例は、この文書の他所に記載される、配列特異的蛍光レポータープローブである。そのようなプローブの例は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである。配列特異的レポータープローブの使用は、標的配列の高い特異度での検出をもたらし、非特異的ＤＮＡ増幅が存在する場合でも定量化を可能にする。蛍光プローブは、異なる色で標識した特定のプローブに基づく、同じ反応で数個の遺伝子を検出するためのマルチプレックスアッセイでも使用することができる。例えば、マルチプレックスアッセイは、限定されるものではないが、ＦＡＭ、ＪＡ２７０、ＣＹ５．５、およびＨＥＸをはじめとする多様なフルオロフォアで標識した数個の配列特異的プローブを同じＰＣＲ反応混合物中で使用することができる。

ｒＰＣＲは、ＰＣＲ反応の過程での、蛍光などの測定可能なパラメータの検出に依存する。測定可能なパラメータの量は、ＰＣＲ産物の量に比例し、それにより、ＰＣＲ産物の増加を「リアルタイム」で観察することができる。一部のｒＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応の観察可能な進行状況に基づく、入力ＤＮＡ鋳型の定量化を可能にする。データの分析および処理は、以下で考察される。核酸増幅アッセイの文脈における「成長曲線」または「増幅曲線」は、関数のグラフであり、独立変数は増幅サイクルの数であり、従属変数は、増幅の各サイクルで測定される増幅依存の測定可能なパラメータ、例えばフルオロフォアによって放出される蛍光などである。上で考察されるように、増幅された標的核酸の量は、フルオロフォア標識プローブを使用して検出することができる。一般に、増幅依存性の測定可能なパラメータは、ハイブリダイゼーション時に、または核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によるプローブの加水分解時に、プローブによって放出される蛍光の量である。蛍光発光の増加はリアルタイムで測定され、標的核酸増幅の増加に直接関連している。一部の例では、蛍光の変化（ｄＲ_ｎ）は、式ｄＲ_ｎ＝Ｒ_ｎ＋－Ｒ_ｎ－を使用して計算され、Ｒ_ｎ＋は各時点での生成物の蛍光発光であり、Ｒ_ｎ－はベースラインの蛍光発光である。ｄＲ_ｎ値は、サイクル数に対してプロットされ、増幅プロットになる。典型的なポリメラーゼ連鎖反応では、成長曲線には、指数関数的な成長のセグメントとそれに続くプラトーが含まれており、その結果、線形スケールを使用すると、Ｓ字型の増幅プロットが得られる。成長曲線は、「クロスポイント」値または「Ｃ_ｐ」値を特徴とする。これは、「閾値」または「サイクル閾値」（Ｃ_ｔ）とも呼ばれ、所定の大きさの測定可能なパラメータが達成されるサイクル数である。例えば、フルオロフォア標識プローブを用いる場合、閾値（Ｃ_ｔ）は蛍光発光（ｄＲ_ｎ）が選択された閾値を超える時点のＰＣＲサイクル数であり、それは一般にベースラインの標準偏差の１０倍である（ただし、この閾値レベルは所望に応じて変更することができる）。Ｃ_ｔ値が低いほど増幅の完了がより速く、Ｃ_ｔ値が高いほど増幅の完了がより遅くなる。増幅の効率が類似している場合、Ｃ_ｔ値が低いほど標的核酸の出発量が多いことを反映し、Ｃ_ｔ値が高いほど標的核酸の出発量が少ないことを反映している。既知濃度の対照核酸を使用して、「標準曲線」または対照核酸の様々な既知濃度での「対照」Ｃ_ｔ値のセットを生成する場合、標的核酸と対照核酸のＣ_ｔ値を比較することにより、試料中の標的核酸の絶対量を決定することが可能になる。

対立遺伝子特異的増幅
一部の実施形態では、例えば、関心対象の疾患および／または症状群のバイオマーカーが突然変異である場合、バイオマーカーは、対立遺伝子特異的増幅アッセイを使用して検出される。このアプローチは、特異的対立遺伝子のＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ）（Ｓａｒｋａｒら、１９９０Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６：６４－６８）、対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）（Ｏｋａｙａｍａら、１９８９Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１４：１０５－１１３）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）（Ｗｕら、１９８９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：２７５７－２７６０）、および増幅不応性変異系（ＡＲＭＳ）（Ｎｅｗｔｏｎら、１９８９ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：２５０３－２５１６）と様々に呼ばれる。これらの参考文献の各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。この方法は、一塩基置換ならびに微小欠失／挿入に適用可能である。

例えば、ＰＣＲに基づく増幅方法に関して、増幅プライマーは、異なる対立遺伝子間（例えば、野生型対立遺伝子と突然変異対立遺伝子間）を区別することができるように設計され得る。したがって、増幅産物の有無を用いて、遺伝子突然変異が所与核酸試料に存在するかどうかを決定することができる。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーは、増幅産物の存在が遺伝子の突然変異を示すように設計され得る。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーは、増幅産物の不在が遺伝子の突然変異を示すように設計され得る。

一部の実施形態では、２つの相補的な反応が使用される。一つの反応は、野生型対立遺伝子に特異的なプライマーを用い（「野生型特異的反応」）、もう一方の反応は、突然変異対立遺伝子のプライマーを用いる（「変異特異的反応」）。２つの反応は、共通の第２プライマーを使用してもよい。特定の対立遺伝子（例えば、野生型対立遺伝子または突然変異対立遺伝子）に特異的なＰＣＲプライマーは、通常、標的の１つの対立遺伝子バリアントと完全に一致するが、他の対立遺伝子バリアント（例えば、突然変異対立遺伝子または野生型対立遺伝子）とは一致しない。ミスマッチは、プライマーの３’末端に／その近くに位置することがあり、完全に一致した対立遺伝子の優先的な増幅を導く。増幅産物が一方または両方の反応から検出され得るかどうかは、突然変異対立遺伝子の有無を示す。野生型特異的反応のみから増幅産物が検出されると、野生型対立遺伝子のみの存在（例えば、野生型対立遺伝子のホモ接合性）が示される。変異特異的反応のみから増幅産物が検出されると、変異対立遺伝子のみの存在（例えば、突然変異対立遺伝子のホモ接合性）が示される。両方の反応から増幅産物が検出されると（例えば、ヘテロ接合体）を示す。本明細書において、このアプローチは、「対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）」とも呼ばれる。

対立遺伝子特異的増幅はまた、ジャンクションを横切って部分的にハイブリダイズするプライマーを使用することによって、重複、挿入、または転位を検出するために使用することができる。ジャンクションのオーバーラップの範囲は、特異的増幅を可能にするために変えることができる。

増幅産物は、当分野で公知の方法によって検査することができ、それには、サイズによって核酸を分離するためにゲルを通して（例えば、電気泳動により）移動した核酸のバンドを（例えば、１または複数の色素で）視覚化することが含まれる。

対立遺伝子特異的プライマー伸長
一部の実施形態では、遺伝子の突然変異を検出するために対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）アプローチが使用される。ＡＳＰＥは、対立遺伝子を（例えば、突然変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子を）区別することができる対立遺伝子特異的プライマーを伸長反応に用いるので、伸長産物は、特定の対立遺伝子（例えば、突然変異対立遺伝子または野生型対立遺伝子）の存在下でのみ得られる。伸長生成物は、例えば標識されたデオキシリボヌクレオチドを伸長反応に用いることによって検出可能であり得るか、または検出可能にすることができる。多様な標識のいずれも、これらの方法での使用に適合し、それには放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識などが含まれるがこれに限定されない。ヌクレオチドは実体で標識されていて、この実体は次に、検出可能な標識、例えばストレプトアビジン結合蛍光色素に結合され得るビオチン分子によって（直接または間接的に）結合され得る。一部の実施形態では、反応は多重に、例えば同じ伸長反応で多くの対立遺伝子特異的プライマーを使用して、行われる。

一部の実施形態では、伸長産物は、数ある中でも固体または半固体の支持体、例えばビーズ、マトリックス、ゲルなどにハイブリダイズされている。例えば、伸長産物は特定の核酸配列（例えば、対立遺伝子特異的プライマーの一部として含まれる）でタグ付けされてよく、固体支持体に「抗タグ」（例えば、伸長産物中のタグに相補的な核酸配列）を取り付けてもよい。伸長産物は、固体支持体上で捕捉され、検出され得る。例えば、ビーズは選別されて検出され得る。

単一ヌクレオチドプライマー伸長
一部の実施形態では、プライマーが１つのヌクレオチドだけを伸長させるように設計されている、単一ヌクレオチドプライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）アッセイが使用される。そのような方法において、プライマーの３’末端のすぐ下流のヌクレオチドの同一性は既知であり、野生型対立遺伝子と比較して突然変異対立遺伝子が異なる。ＳＮｕＰＥは、唯一の特定の種類のデオキシヌクレオチドが標識されている（例えば、標識ｄＡＴＰ、標識ｄＣＴＰ、標識ｄＧＴＰ、または標識ｄＴＴＰ）伸長反応を使用して実施することができる。したがって、検出可能な伸長産物の存在は、関心対象の位置（例えば、プライマーの３’末端のすぐ下流の位置）のヌクレオチドの同一性の指標として使用することができ、したがって、その位置での突然変異の有無の指標として使用することができる。ＳＮｕＰＥは、米国特許第５，８８８，８１９号；米国特許第５，８４６，７１０号；米国特許第６，２８０，９４７号；米国特許第６，４８２，５９５号；米国特許第６，５０３，７１８号；米国特許第６，９１９，１７４号；Ｐｉｇｇｅｅ，Ｃ．ら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ７８１（１９９７），ｐ．３６７－３７５（“ＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＫｎｏｗｎＰｏｉｎｔＭｕｔａｔｉｏｎｓｂｙＳｉｎｇｌｅ－ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｉｍｅｒＥｘｔｅｎｓｉｏｎａｎｄＬａｓｅｒ－ＩｎｄｕｃｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ”）；Ｈｏｏｇｅｎｄｏｏｒｎ，Ｂ．ら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）１０４：８９－９３，（“ＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｂｙＰｒｉｍｅｒＥｘｔｅｎｓｉｏｎａｎｄＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”）に記載されるように実施することができ、その各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、突然変異の有無を正確かつ迅速に検出するために、プライマー伸長を質量分析と組み合わせることができる。Ｈａｆｆらに対する米国特許第５，８８５，７７５号（質量分析法による一塩基多型分析の分析）；Ｋｏｓｔｅｒに対する米国特許第７，５０１，２５１号（質量分析に基づくＤＮＡ診断）を参照されたい；これらの両方の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。適した質量分析フォーマットとしては、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、ＩＲ－ＭＡＬＤＩ、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、フーリエ変換、およびそれらの組み合わせが挙げられるがこれに限定されない。

オリゴヌクレオチド連結アッセイ
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（「ＯＬＡ」または「ＯＬ」）が使用される。ＯＬＡは、標的分子の一本鎖の隣接配列にハイブリダイズできるように設計された２つのオリゴヌクレオチドを用いる。一般に、一方のオリゴヌクレオチドはビオチン化されていて、もう一方は、例えば、ストレプトアビジン結合蛍光部分で検出可能に標識されている。正確な相補的配列が標的分子に見出されると、オリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接するようにハイブリダイズし、捕捉され検出され得るライゲーション基質を作成する。例えば、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９２３－８９２７，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７－１０８０および米国特許第４，９９８，６１７号を参照されたい。その内容全体は参照により全文が本明細書に組み込まれる。

ハイブリダイゼーションアプローチ
一部の実施形態では、核酸は、関心対象のバイオマーカーに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチドプローブを使用し、単一ヌクレオチドのミスマッチを許容しないほど十分にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイゼーションによって分析される。特定の実施形態では、適した核酸プローブは、正常な遺伝子と変異遺伝子を区別することができる。したがって、例えば、当業者は、本発明のプローブを使用して、特定の対立遺伝子について個体がホモ接合かヘテロ接合かを決定することができる。

核酸ハイブリダイゼーション技術は当技術分野で周知である。当業者は、少なくとも望ましいレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイズし、一方、より低い相補性を有する配列がそうしないようにハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをどのように推定し調整するかを理解している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９４，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。

一部の実施形態では、変異体または野生型配列にハイブリダイズするプローブ分子は、液相またはより好ましくは固相ハイブリダイゼーションにより増幅産物中のそのような配列を検出するために使用することができる。固相ハイブリダイゼーションは、例えば、プローブをマイクロチップに接着することにより達成することができる。

核酸プローブは、リボ核酸および／またはデオキシリボ核酸を含み得る。一部の実施形態では、提供される核酸プローブは、オリゴヌクレオチド（すなわち「オリゴヌクレオチドプローブ」）である。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、関心対象の遺伝子の相同領域に特異的に結合するのに十分な長さであるが、プローブと試験される核酸試料との間の１ヌクレオチドの違いがハイブリダイゼーションを中断するほど短い。一般に、オリゴヌクレオチドプローブのサイズは、およそ１０から１００ヌクレオチドまで変動する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、１５～９０、１５～８０、１５～７０、１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１８～３０、または１８～２６ヌクレオチド長である。当業者に理解されるように、オリゴヌクレオチドプローブの最適な長さは、オリゴヌクレオチドプローブが用いられ得る特定の方法および／または条件に依存し得る。

一部の実施形態では、核酸プローブは、例えば、核酸増幅および／または伸長反応の、プライマーとして有用である。例えば、特定の実施形態では、バリアントについて評価される遺伝子配列は、エクソン配列を含む。特定の実施形態では、エクソン配列および追加のフランキング配列（例えば、ＵＴＲおよび／またはイントロン配列の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５またはそれを超えるヌクレオチド）がアッセイで分析される。または、イントロン配列または他の非コード領域は、潜在的に有害な突然変異について評価され得る。または、これらの配列の部分を使用してもよい。そのようなバリアント遺伝子配列には、本明細書に記載される突然変異の少なくとも１つを有する配列が含まれ得る配列。

本開示のその他の実施形態は、関心対象の症状群および／または疾患に関連する突然変異を含有する単離された遺伝子配列を提供する。そのような遺伝子配列は、被験体に関してＨＮＳＣＣの存在またはそれを発症するリスクの増加を客観的に診断するために使用され得る。特定の実施形態では、単離された核酸は、非バリアント配列またはいずれか１つまたはそれらの組合せのバリアント配列を含有し得る。例えば、特定の実施形態では、遺伝子配列は、エクソン配列を含む。特定の実施形態では、エクソン配列および追加のフランキング配列（例えば、ＵＴＲおよび／またはイントロン配列の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５またはそれを超えるヌクレオチド）がアッセイで分析される。または、イントロン配列またはその他の非コード領域を使用してもよい。または、これらの配列の部分を使用してもよい。特定の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に開示されるバイオマーカー遺伝子の少なくとも１つからのエクソン配列を含む。

一部の実施形態では、核酸プローブは、本明細書に記載される検出可能部分で標識される。

アレイ
本明細書において言及される様々な方法は、単一の実験でバイオマーカーのセットを分析および／または検出することを可能にするアレイとしての使用に適合させることができる。例えば、バイオマーカーを含む複数の突然変異を同時に分析することができる。特に、核酸試薬（例えば、プローブ、プライマー、オリゴヌクレオチドなど）の使用を伴う方法は、アレイに基づくプラットフォーム（例えば、マイクロアレイ）への適合に特に適している。一部の実施形態では、アレイは関心対象のバイオマーカーにおける突然変異を検出するのに特異的な１または複数のプローブを含有する。

一実施形態では、開示される複数のバイオマーカーのパネルが使用される。一実施形態では、本開示は、表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子、および／またはＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つ、および／またはＨＰＶＥ６およびＥ７遺伝子の少なくとも１つの発現レベルを定量化する試薬を含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出するための組成物を含む。さらに、かつ／または代わりに、本組成物には、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子が含まれ得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１および／またはＲＰＬ３０または他の標準化遺伝子であってよい。この組成物は、特定の実施形態では、これらの遺伝子のいずれか１つのプライマーおよび／またはプローブを含むことができ、該プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に記載される検出可能部分で標識される。

ＤＮＡ塩基配列決定
特定の実施形態では、関心対象のバイオマーカーの診断は、塩基配列決定によって、核酸または核酸のパネルの配列、ゲノム位置または配置、および／またはゲノムコピー数の変動を検出することによって行われる。

一部の実施形態では、この方法は、少なくとも１つの遺伝子の試料核酸配列を取得するために、被験体由来の組織または体液試料から核酸を取得し、核酸の少なくとも一部分を配列決定することを含み得る。特定の実施形態では、この方法は、バリアントをＨＮＳＣＣに関連する既知のバリアントと比較し、そのバリアントがＨＮＳＣＣに関連すると以前に識別されたバリアントであるかどうかを判定することを含み得る。または、この方法は、バリアントを以前に特徴付けられていない新しいバリアントとして識別することを含み得る。バリアントが新しいバリアントである場合、または一部の例では以前に特徴付けた（すなわち識別した）バリアントの場合には、この方法は、突然変異が遺伝子の発現および／または遺伝子によってコードされるタンパク質の機能に有害であると予測されるかどうかを決定するための分析を実施することをさらに含み得る。この方法は、バリアントプロファイル（すなわち、被験体において識別されたバリアントの編集）を使用して、ＨＮＳＣＣの存在またはＨＮＳＣＣを発症するリスクの増加を診断することをさらに含み得る。

例えば、特定の実施形態では、次世代（超並列シークエンシング）を使用してよい。または、サンガー塩基配列決定法を使用してもよい。または、次世代（超並列シークエンシング）とサンガー塩基配列決定法の組合せを使用してもよい。さらに、かつ／または代わりに、塩基配列決定は、少なくとも１つの単一分子合成時解読法を含む。したがって、特定の実施形態では、複数のＤＮＡ試料がプール内で分析されて、変動を示す試料が識別される。さらに、かつ／または代わりに、特定の実施形態では、複数のＤＮＡ試料が複数のプールで分析されて、少なくとも２つのプールにおいて同じ変動を示す個々の試料が識別される。

塩基配列決定を実施する従来の方法の一つは、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，７４：５４６３－６７に記載されるように、連鎖停止とゲル分離によるものである。別の従来の塩基配列決定法は、核酸断片の化学分解を伴う。Ｍａｘａｍら、１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５６０－５６４を参照されたい。また、ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定に基づく方法が開発された。例えば、Ｈａｒｒｉｓら、米国特許出願公開第２００９０１５６４１２号を参照されたい。これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に全文が組み込まれる。

その他の実施形態では、核酸の塩基配列決定は、ＰＣＲなどの方法による増幅による、単一分子または単一分子に由来するほぼ同一の分子の群の超並列シークエンシング（「次世代シークエンシング」としても公知）によって達成される。超並列シークエンシングは、例えばＬａｐｉｄｕｓら、米国特許第７，１６９，５６０号、Ｑｕａｋｅら、米国特許第６，８１８，３９５号、Ｈａｒｒｉｓ、米国特許第７，２８２，３３７号およびＢｒａｓｌａｖｓｋｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），１００：３９６０－３９６４（２００３）に示されており、その各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

次世代シーケンシングでは、分析に十分な量の核酸を取得するために、ＰＣＲまたは全ゲノム増幅が核酸に実行され得る。次世代シーケンシングの一部の形式において、この方法は増幅されていないＤＮＡからＤＮＡ配列を評価することが可能であるため、増幅は必要ではない。決定されると、試験試料由来の核酸の配列および／またはゲノム配置および／またはゲノムコピー数は、試料が採取された時にＨＮＳＣＣに罹患していることが分からなかった１または複数の個体から得た標準参照と比較される。試験試料および標準参照由来の核酸の、配列および／またはゲノム配置および／またはゲノム配置および／またはコピー数の間の全ての違いは、バリアントとみなされる。

次世代（超並列シークエンシング）では、関心対象の全ての領域が一緒に配列決定され、読み取られた各配列の起源が参照配列との比較（アラインメント）によって決定される。関心対象の領域は、１つの反応で一緒に濃縮することも、別々に濃縮した後に塩基配列決定の前に組み合わせることもできる。特定の実施形態では、そして本明細書の実施例でより詳細に記載されるように、アッセイに含まれる遺伝子のコーディングエクソンに由来するＤＮＡ配列は、無作為に断片化されたゲノムＤＮＡの特異的ＲＮＡプローブへのバルクハイブリダイゼーションによって濃縮される。同じアダプター配列は全ての断片の末端に結合し、１つの反応で１つのプライマー対を用いるＰＣＲによる、全てのハイブリダイゼーションで捕捉された断片の濃縮を可能にする。ハイブリダイゼーションによってあまり効率的に捕捉されなかった領域は、特異的プライマーを用いるＰＣＲによって増幅される。さらに、特異的プライマーを用いるＰＣＲは、同様の配列（「偽エクソン」）がゲノムの他の場所に存在するエクソンを増幅するために使用され得る。

超並列シークエンシングが使用される特定の実施形態では、ＰＣＲ産物は連結されてＤＮＡの長いストレッチを形成し、それは短い断片にせん断される（例えば、音響エネルギーによる）。このステップにより、断片の末端が関心対象の領域全体に確実に分散される。その後、ｄＡヌクレオチドのストレッチを各断片の３’末端に付加する、これにより、断片はオリゴ（ｄＴ）プライマーでコーティングされた平面に結合することができる（「フローセル」）。次に、各断片は、蛍光標識されたヌクレオチドを有するオリゴ（ｄＴ）プライマーを伸長させることによって配列決定することができる。各シークエンシングサイクルの間、１種類のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣ）のみが追加され、鎖終結ヌクレオチドを用いて１つのヌクレオチドのみが組み込まれる。例えば、１回目のシークエンシングサイクルの間に、蛍光標識されたｄＣＴＰが付加され得る。このヌクレオチドは、次のヌクレオチドとしてＣを必要とする、成長する相補的なＤＮＡ鎖にのみ組み込まれる。各シークエンシングサイクルの後、フローセルの画像を撮影して、どの断片が伸長したかを決定する。Ｃを組み込んだＤＮＡ鎖は光を発し、一方でＣを組み込まなかったＤＮＡ鎖は暗く見える。連鎖停止を逆転させて、成長するＤＮＡ鎖を再び伸長可能にし、このプロセスを合計１２０サイクル繰り返す。画像は、一般に「読み取りデータ」と呼ばれる塩基の文字列に変換され、各断片の３’末端の２５～６０塩基を再現する。次に、読み取りデータを、分析されたＤＮＡの参照配列と比較する。２５塩基の任意の文字列は、通常、ヒトゲノムで１回だけ発生するため、ほとんどの読み取りデータは、ヒトゲノムの特定の１つの場所に「アライン」することができる。最後に、各ゲノム領域のコンセンサス配列が利用可能な読み取りデータから構築され、その位置での参照の正確な配列と比較され得る。コンセンサス配列と参照との差を配列バリアントと呼ぶ。

検出可能部分
特定の実施形態では、本発明に従って使用される、かつ／または本発明により提供される特定の分子（例えば、核酸プローブ、抗体など）は、１または複数の検出可能な実体または部分を含む、すなわち、そのような分子はそのような実体または部分で「標識」されている。

幅広い種類の検出可能な薬剤のいずれかを本開示の実践に使用することができる。適した検出可能な薬剤としては、これらに限定されないが：様々なリガンド、放射性核種；蛍光色素；化学発光剤（例えばなど、例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）；生物発光剤；スペクトル分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）；微粒子；金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金など）；ナノクラスター；常磁性金属イオン；酵素；比色標識（例えば、色素、コロイド金など）；ビオチン；ジオキシゲニン；ハプテン；およびそれに対する抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質が挙げられる。

一部の実施形態では、検出可能部分はビオチンである。ビオチンはアビジン（例えばストレプトアビジンなど）と結合することができ、それは一般にそれ自体が検出可能なその他の部分（例えば、蛍光部分）に（直接または間接的に）結合する。

以下に、使用され得る一部の検出可能部分の一部の限定されない例を記載する。

蛍光色素
特定の実施形態では、検出可能部分は蛍光色素である。幅広い種類の化学構造および物理的特性をもつ多数の既知の蛍光色素が、本開示の実践での使用に適している。蛍光検出可能部分は、レーザーによって刺激され、放射光が検出器によって捕捉される。検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）またはその強度を記録する共焦点顕微鏡であり得る。

適した蛍光色素としては、これらに限定されないが、フルオレセインおよびフルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭなど）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリトリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチルローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリンおよびクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、Ｑ－ＤＯＴＳ．オレゴングリーン色素（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４など）、テキサスレッド、テキサスレッド－Ｘ、ＳＰＥＣＴＲＵＭＲＥＤ、ＳＰＥＣＴＲＵＭＧＲＥＥＮ、シアニン色素（例えば、ＣＹ－３、ＣＹ－５、ＣＹ－３．５、ＣＹ－５．５など）、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ色素（例えば、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ３５０、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５３２、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５４６、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５６８、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５９４、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６３３、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６６０、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６８０など）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、ＢＯＤＩＰＹＲ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅｓ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００など）などが挙げられる。蛍光色素をタンパク質およびペプチドなどのその他の化学物質と結合するのに適した蛍光色素および方法のより多くの例としては、例えば、「ＴｈｅＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ」第９版、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，オレゴン州ユージーンを参照されたい。蛍光標識剤の好ましい特性としては、高いモル吸収係数、高い蛍光量子収率、および光安定性が挙げられる。一部の実施形態では、標識フルオロフォアは、スペクトルの紫外域（すなわち４００ｎｍ未満）ではなく可視域（すなわち４００～７５０ｎｍの間）で吸収および発光波長を示す。

検出可能部分には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）におけるものなどの複数の化学物質が含まれ得る。共鳴伝達は、発光強度の全体的な向上をもたらす。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｕら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：４３４７を参照されたい。共鳴エネルギー移動を達成するために、第１の蛍光分子（「ドナー」蛍光体）は光を吸収し、それを励起電子の共鳴を通じて第２の蛍光分子（「アクセプター」蛍光体）に移動させる。一つのアプローチでは、ドナー色素とアクセプター色素の両方を一緒に連結してオリゴプライマーに結合させることができる。ドナー色素とアクセプター色素を核酸と連結するための方法は、例えば、Ｌｅｅらに対する米国特許第５，９４５，５２６号に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。使用することのできるドナー／アクセプター色素対としては、例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹＦＬ／ＢＯＤＩＰＹＦＬ、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。例えば、Ｌｅｅらに対する米国特許第５，９４５，５２６号を参照されたい。これらの色素の多くは、例としてＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．（オレゴン州ユージーン）より市販もされている。適したドナーフルオロフォアとしては、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’－クロロ－７’－フェニル－１，４－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）などが挙げられる。

酵素
特定の実施形態では、検出可能部分は酵素である。適した酵素の例としては、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡで使用される酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。その他の例としては、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのリンカー基を使用して分子に結合させることができる。

放射性同位元素
特定の実施形態では、検出可能部分は放射性同位元素である。例えば、分子は同位体標識されていてよく（すなわち、通常自然界に見出される原子量または質量数とは異なる原子量または質量数を有する原子で置き換えられた１または複数の原子を含んでよく）、あるいは同位元素は分子に接着していてよい。分子に組み込むことのできる同位元素の限定されない例としては、水素、炭素、フッ素、リン、銅、ガリウム、イットリウム、テクネチウム、インジウム、ヨウ素、レニウム、タリウム、ビスマス、アスタチン、サマリウム、およびルテチウムの同位元素（すなわち３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉ、１３５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８７Ｒｅ、２０１Ｔ１、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１ｌＡｔ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ）が挙げられる。

デンドリマー
一部の実施形態では、シグナル増幅は、標識されたデンドリマーを検出可能部分として使用して達成され（例えば、ＰｈｙｓｉｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓ３：９３－９９、２０００参照）、その内容全体は参照により全文が本明細書に組み込まれる。蛍光標識されたデンドリマーは、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ（ニュージャージー州モントベール）より入手可能である。これらは当分野で公知の方法によってオリゴヌクレオチドプライマーに化学的に結合させることができる。

システム
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される方法を実行するための、かつ／または本明細書に記載される組成物を使用するためのシステムを提供する。特定の実施形態では、システムはキットを含み得る。または、システムは、本明細書に開示される方法を実行するためのコンピュータ化された指示および／または試薬を含み得る。

キット
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される方法および組成物に従って用いるキットを提供する。一般に、キットは、関心対象のバイオマーカーを検出する１または複数の試薬を含む。適した試薬には、核酸プローブおよび／または抗体またはその断片が含まれ得る。一部の実施形態では、適した試薬は、マイクロアレイなどのアレイまたは突然変異パネルの形態で提供される。キットは、関心対象のバイオマーカー（すなわち、遺伝子）の陽性対照として機能する試薬をさらに含み得る。

一実施形態では、開示される複数のバイオマーカーのパネルが使用される。一実施形態では、本開示は、表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子、および／またはＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つ、および／またはＨＰＶＥ６およびＥ７遺伝子の少なくとも１つの発現レベルを定量化する試薬を含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出するためのキットを含む。さらに、かつ／または代わりに、キットは、少なくとも１つの標準化（例えば、ハウスキーピング）遺伝子および／またはそのようなハウスキーピング遺伝子を検出するための試薬を含み得る。一実施形態では、標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１および／またはＲＰＬ３０または他の標準化遺伝子であってよい。一部の実施形態では、キットは、開示されるバイオマーカーおよび／または標準化遺伝子のいずれかの陽性対照を含み得る。

一部の実施形態では、提供されるキットは、本明細書に記載される様々な検出方法（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、塩基配列決定法、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、マルチプレックスＡＳＰＥ、イムノアッセイなど）を実行するための試薬をさらに含む。例えば、キットは、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、プライマー指向性増幅を介して核酸を増幅するため、ＥＬＩＳＡ実験を実行するためなどに、本明細書に記載される方法で用いる緩衝液、酵素、および／または試薬を必要に応じて含んでよい。このキットは、特定の実施形態では、これらの遺伝子のいずれか１つのプライマーおよび／またはプローブを含んでよく、該プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に記載される検出可能部分で標識される。

一部の実施形態では、提供されるキットは、健康な個体を示す対照、例えば、関心対象の疾患および／または症状群を有していない個体由来の核酸および／またはタンパク質試料をさらに含む。あるいは、キットは、測定される既知量の１つの（またはそれを超える）バイオマーカー遺伝子を含む陽性対照を含み得る。キットには、個体が関心対象の疾患および／または症状群を有しているか、または関心対象の疾患および／または症状群を発症するリスクがあるかを決定する方法についての説明書も含まれてよい。

一部の実施形態では、関心対象のバイオマーカーに対応する情報をコードするコンピュータ可読媒体が提供される。そのようなコンピュータ可読媒体は、本発明のキットに含められてよい。

ＨＮＳＣＣマーカーを識別する方法
データマイニング
本開示の特定の実施形態では、バイオマーカーは、データマイニングアプローチを用いて識別される。例えば、一部の例では公共データベース（例えば、ＰｕｂＭｅｄ、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ））を、特定の疾患に（直接または間接的に）関連付けられていることが示された遺伝子および／または正常組織と比較して癌において差次的に発現した遺伝子について検索することができる。次に、そのような遺伝子をバイオマーカーとして評価することができる。

分子
特定の実施形態では、本開示は、関心対象の症状群または疾患のバイオマーカー（すなわち、統計的に有意な方法でＨＮＳＣＣに関連付けられている核酸配列中のバリアント）を識別する方法を含む。例えば、関心対象の遺伝子および潜在的な標準化遺伝子は、頭頸部癌を有する患者から単離された組織試料での遺伝子発現をランダムフォレスト分析（例えば、Ｌ．Ｂｒｅｉｍａｎ，”ＲａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔｓ”ＭａｃｈｉｎｅＬｅａｒｎｉｎｇ，２００１，４５：５－３２参照）を使用して、本明細書で詳細に考察されるように評価することにより識別され得る。この手法において、ランダムフォレストは、各ツリーが独立にサンプリングされたランダムベクトルの値に依存し、フォレスト内のすべてのツリーに対して同じ分布を有するような、ツリー予測子の組合せである。

あるいは、新しいマーカーについてアッセイされる遺伝子および／またはゲノム領域は、関心対象の症状群および／または疾患に対する遺伝的連鎖および／または生物学的因果関係を示す生化学経路におけるそれらの重要性に基づいて選択され得る。または、マーカーについてアッセイされる遺伝子および／またはゲノム領域は、家族においてＨＮＳＣＣの遺伝に遺伝的に関係があるＤＮＡ領域との遺伝的連鎖に基づいて選択され得る。または、マーカーについてアッセイされる遺伝子および／またはゲノム領域は、まだ評価されていない染色体の特定の領域を網羅するために系統的に評価され得る。

その他の実施形態では、新しいマーカーについて評価される遺伝子またはゲノム領域は、関心対象の症状群および／または疾患（例えば、ＨＮＳＣＣ）の発症に関連している可能性のある生化学経路の一部であり得る。バリアントおよび／またはバリアントの組合せが、１または複数の以下の方法に基づいて、その臨床的有意性について評価され得る。バリアントおよび／またはバリアントの組合せが、関心対象の症状群および／または疾患を有さない被験体よりも、それを有する被験体由来の核酸において、より頻繁に発生することが報告されているかまたは公知である場合、それは関心対象の症状群および／または疾患に少なくとも潜在的に罹患しやすいとみなされる。バリアントおよび／またはバリアントの組合せが、関心対象の症状群および／または疾患を有する個体に排他的にまたは優先的に伝達されることが報告されているかまたは公知である場合、それは関心対象の症状群および／または疾患に少なくとも潜在的に罹患しやすいとみなされる。逆に、バリアントが両方の集団に同様の頻度で見出されるならば、関心対象の症状群および／または疾患の発症に関連している可能性は低い。

バリアントまたはバリアントの組合せが、タンパク質または生物学的系の機能を測定するために適切な実験モデル系においてこのタンパク質またはこの生物学的系の機能に全体的に有害な影響を及ぼすことが報告されているかまたは公知である場合、さらに、このバリアントまたはバリアントの組合せが、関心対象の症状群および／または疾患に関連していることが公知の１または複数の遺伝子に影響を及ぼす場合、それは関心対象の症状群および／または疾患に少なくとも潜在的に罹患しやすいとみなされる。例えば、バリアントまたはバリアントの組合せが、タンパク質または遺伝子発現に全体的に有害な影響を及ぼす（すなわち、ナンセンス変異、フレームシフト変異、またはスプライス部位変異、さらにはミスセンス変異をもたらす）ことがタンパク質または核酸の配列および／または構造への予測される作用に基づいて予測されている場合、さらに、このバリアントまたはバリアントの組合せが、関心対象の症状群および／または疾患に関連していることが公知の１または複数の遺伝子に影響を及ぼす場合、それは関心対象の症状群および／または疾患に少なくとも潜在的に罹患しやすいとみなされる。

また、特定の実施形態では、バリアントの総数が重要であり得る。試験試料において、個別にまたは組み合わせて、少なくとも関心対象の症状群および／または疾患に関連している可能性があると評価される、１つまたは数個のバリアントが検出される場合、その遺伝物質においてこのバリアントまたはこれらのバリアントが検出された個体は、関心対象の症状群および／または疾患に罹患しているかまたはそれを発症するリスクが高いと診断され得る。

例えば、本明細書の開示は、被験体においてＨＮＳＣＣの存在またはそれを発症するリスクの増加を診断するための方法を提供する。そのような方法には、組織または体液の試料由来の核酸を得ることが含まれ得る。この方法は、正常組織と癌組織の両方における少なくとも１つの遺伝子の発現を決定して、関心対象の潜在的なバイオマーカーを識別することを含み得る。この方法には、核酸配列またはゲノム配置またはコピー数に１または複数のバリアントがあるかどうかを検出するために、核酸を配列決定することまたは検出する核酸のゲノム配置またはコピー数を決定することがさらに含まれ得る。この方法には、１または複数のバリアントの臨床的有意性を評価するステップがさらに含まれ得る。そのような分析には、罹患集団（すなわち、疾患を有する被験体）におけるバリアント配列の関連の程度の評価が含まれてよい。そのような分析には、突然変異が遺伝子発現および／またはタンパク質機能に及ぼし得る影響の程度の分析も含まれてよい。この方法には、評価に基づいてＨＮＳＣＣの存在またはそれを発症するリスクの増加を診断することも含まれてよい。

以下の実施例は、本開示の特定の態様を説明する働きをする。これらの実施例は、決して限定を意図するものではない。

実施例１－潜在的なＨＮＳＣＣマーカーの文献に基づく識別
予備文献検索を実行してＨＮＳＣＣに関連するマーカーを識別した。表１は、見つかったマーカーの種類およびマーカーの数を示し、表２は、識別された潜在的なバイオマーカーを示す。

この最初の検索に基づいて、差次的な遺伝子発現に関連するマーカーを追跡することが決定された。

実施例２－ＴＣＧＡデータベースを使用するバイオマーカーの識別
癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データベースのデータを、ＨＮＳＣＣにおいて差次的発現を示すマーカーを識別するために使用した。ＴＣＧＡデータベース（ＲＮＡＳｅｑＶ２）には、差次的発現に使用可能な１８，３７９個の遺伝子に関するデータが含まれる。データには、臨床情報（例えば、年齢、喫煙、ステージ、処置および生存）；コピー数；メチル化；遺伝子発現；突然変異、マイクロＲＮＡ発現に関する情報が含まれる。

ＨＮＳＣＣデータは、４つの腫瘍部位由来の５３０の試料からなる：口腔ｎ＝３２０；６０．４％）、中咽頭（ｎ＝８２；１５．５％）、喉頭（ｎ＝１１７；２２．１％）および下咽頭（ｎ＝１０；１．５％）。追加の４４試料は、隣接する正常組織に由来する。合計５３０試料のうち、７０はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性であり、２７９はＨＰＶ陰性であり、１８１は、不明または未決定のＨＰＶステータスを有する。

ランダムフォレスト分析を実行して、正常試料からＨＮＳＣＣを分類するための強い予測子である遺伝子を識別した。この分析では、報告価値のあるデータをもつ試料の５０％を有し、発現の変化が２倍未満（Ｗｉｌｃｏｘ試験、調整済みｐ値＜０．００１）の遺伝子は破棄された。分析の各ラウンドでは、試料の７５％がトレーニングセットとして使用され、試料の２５％が試験セットとして使用された。データはカッパに最適化され、１０倍交差検証が実行された（１０回繰り返され、性能が平均された）。上位２０の強い予測が識別され、プロセス全体が４回繰り返された。各実行から得られた遺伝子リストを表３に示し、３６個の特有の遺伝子の組合せを表４に示す。表３のデータは、最高ランク（２０）から最低（１）の順に示される。

次に、４つの分析の各々から上位４つの遺伝子が選択されて、表５にリストされている８つの特有の遺伝子の初期候補リストが得られた。

個々の遺伝子のいくつかの統計分析の結果（すなわち、精度、カッパ、感度および特異度）も、特異度の順に記載されて図１に示される。

実施例３－遺伝子パネル
分析を実行して、遺伝子パネルの使用がアッセイ性能を改善すると予想されるかどうかを決定した。図２に示されるように、４つまたは５つの遺伝子パネルの使用は、遺伝子性能を著しく改善するはずである。パネルは、最も情報価値のあるマーカー（ＣＡＢ３９Ｌ）を次に最も情報価値のあるマーカー（ＡＤＡＭ１２）に加えて２マーカーパネルを形成した後、次に最も情報価値のあるマーカー（ＮＲＧ２）を追加して３マーカーパネルを形成することによって構築された。次に、他の６つのマーカーを各々追加し、予測された性能を評価した（図２、上の表）。結果は、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＮＲＧ２およびＧＲＩＮ２Ｄの４つのマーカーパネルが、最高レベルの精度、カッパ値、感度、および特異度を提供することを示した。５遺伝子パネルの結果を下の表（図２）に示す。４～５個を超える遺伝子の追加による改善は最小であることがわかった（例えば、図２のグラフ）。それでも、上位４～５個のマーカーの１つであると識別されたマーカーの１つに技術的な課題がある場合に、そのようなパネルは有用であり得る。

実施例４－腫瘍部位別の遺伝子発現
ほとんどのＨＮＳＣＣは、口腔（口）かまたは中咽頭（咽頭）のいずれかに見られる。全ＨＮＳＣＣデータセットを使用して開発された同じ遺伝子パネルが、口腔または中咽頭のＨＮＳＣＣを正常組織から区別するためにも使用できるかどうかを判断するための分析が実施された。結果は図３および図４に、８つのマーカー、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２（図３）；ならびにＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２およびＨＳＤ１７Ｂ６（図４）について示し；口腔および中咽頭を含むＴＣＧＡデータセットをＴＣＧＡ試料の過半数（合計５３０の試料のうち、ＨＮＳＣＣ口腔（３２０）と正常な中咽頭（８２）＝４０２（４０２／５３０＝７６％）、および、４４の試料合計のうち、正常な口腔（３０）と中咽頭（３）＝３３（３３／４４＝７５％））として使用する。

両方の部位、そして喉頭に関して、マーカーは正常組織と癌組織で非常に異なるレベルの発現を示すことがわかった。図３および図４において、ｘ軸の左端の３つのデータセット（喉頭、口腔、中咽頭）は正常組織の発現レベルであり、ｘ軸の右端の４つのデータセット（下咽頭、喉頭、口腔、中咽頭）は、下咽頭のデータを組み合せた、癌組織の発現レベルである。類似した分布が正常部位とＨＮＳＣＣ部位にあったことがわかる（すなわち、正常のレベルは組織に関係なく類似しており、ＨＮＳＣＣのレベルは組織に関係なく類似していた）。例えば、ＣＡＢ３９Ｌは、喉頭、口腔、中咽頭について正常組織よりもＨＮＳＣＣでそれぞれ有意に低いレベルで発現しているのに対し、ＡＤＡＭ１２は、正常組織よりもＨＮＳＣＣで有意に高いレベルで発現することがわかる。口腔および中咽頭由来の試料と比較した、すべてのＨＮＳＣＣ試料のマーカーによる結果を示すデータの統計編集を図５に示す。すべての試料を口腔および中咽頭と比較すると、精度、感度、および特異度の変化は最小であった。８つのマーカーすべてについて、試料セットは約２５％減少し、遺伝子発現レベルの中央値の変化は最小であり、分布には有意差がある（ＨＮＳＣＣと正常）。どちらのセットでも、マン－ホイットニーのｐ値は０．０００１未満であった。

実施例５－発現における重複率と比較した倍率発現中央値についてのＴＣＧＡ遺伝子セットの差次的発現の分析。
図６Ａ上部のグラフは、ランダムフォレスト分析によって最初に選択された表４の３６個の遺伝子由来のマーカーが、マーカーのランクの中央値（区別する能力）と比較した４つのランダムフォレスト分析の繰り返しから識別された回数を示す。ランダムフォレスト分析からマーカーが繰り返し識別された回数の増加に伴い、ランクの中央値が増加する傾向があることがわかる。グラフの下の４つの表は、ランダムフォレスト分析からマーカーが繰り返し識別された回数によってグループ化されたマーカーとランクの中央値を一覧表にしたものである。グラフと表を合わせると、ランダムフォレスト分析から識別された表４の３６個の遺伝子の優先順位付けを、最初は繰り返された回数で、次にランクの中央値で、可能にすることのできる測定値が得られる。

図６Ｂの左側のグラフは、ＴＣＧＡＨＮＳＣＣ遺伝子セット全体と比較した、本開示の特定の選択されたＨＮＳＣＣマーカーの差次的発現の分析を示す。ｘ軸は、発現の倍率変化中央値を、遺伝子発現の増加（データポイントが０の右側）または遺伝子発現の減少（データポイントが０の左側）のいずれかとして示す。ｙ軸は、ＨＮＳＣＣと正常組織における遺伝子発現における重複率を示す。開示された表４のマーカー（ｎ＝３６）は、遺伝子発現の大幅な増加または減少のいずれかを示し、データベース中の他の遺伝子と比較して非常に低い重複率を示すことがわかる。ＴＣＧＡＨＮＳＣＣ遺伝子セット全体は、表される試料の８０％を超える遺伝子を使用したＲＮＡＳｅｑデータである（すなわち、ＨＮＳＣＣおよび正常な試料に対して、１８，３７９の遺伝子のうち１６，１６１（８８％）に報告価値があった）。ｘ軸は、倍率変化中央値（＝ＨＮＳＣＣ／正常）を示す。ＨＮＳＣＣでは正常と比較して８，３５２個（５２％）の遺伝子が増加し、７，８０９個（４８％）の遺伝子が減少し、１，３８７個の遺伝子（８．６％）が２倍超増加し、１，７０１個（１０．５％）が２倍超減少したことが見出された。ＨＮＳＣＣにおける遺伝子発現の増加の場合、カットオフはＨＮＳＣＣの５パーセンタイルおよび正常の９５パーセンタイルである（例えば、図６Ｂ、ＧＲＩＮ２Ｄについての挿入図）。

図６Ｂのグラフを横切る点線は、ランダムフォレスト分析から４回繰り返された９つのマーカーの発現における重複率が２０％未満（０～１９％の範囲）であったことを示す（すなわち、これらのマーカーは点線の下にある）。さらに、図６Ｂのグラフを横切る点線は、表４の３６個の特有のマーカーのうち２３個、つまり２３／３６＝６４％は、マーカーが点線の下に集まるため、発現における重複率が２０％未満であることを示す。表６には、ランダムフォレスト分析によって識別されない発現における重複率が２０％以下である、４５個の追加遺伝子が記載されている。図６Ｂで識別されたＧＬＴ２５Ｄ１などの発現における重複率が２０％以下である遺伝子は、ＨＮＳＣＣの正常試料からの分類に役立つ追加のバイオマーカーと見なすことができる。

図６Ｂのデータは、図７および図８のデータと比較することができる。図７は、ＴＣＧＡＨＮＳＣＣＲＮＡＳｅｑデータからの倍率発現中央値と発現における重複率の同様の分析を示し、この例は、グラフ上で強調表示された文献検索によって識別された組織マーカーおよび唾液マーカーを示す。上および下のパネルは、組織（上のパネル）と唾液（下のパネル）の両方で識別されたマーカーの結果を示す。図７の特定の文献マーカーは差次的発現のいくつかの証拠を示すが、ほんの一部のマーカーのみが低い重複率で高レベルの差次的発現を示す。この分析に基づいて、マーカーＭＡＬ、ＭＭＰ１、ＣＥＰ５５、ＣＥＮＰＡ、ＡＵＲＫＡおよびＦＯＸＭ１は、最も情報価値のある追加のバイオマーカーであると思われ、開示される方法および組成物に含められ得る。

図８は、ＴＣＧＡＨＮＳＣＣＲＮＡＳｅｑデータからの倍率発現中央値と発現における重複率の分析の同様の分析を示し、この例は、文献検索によって識別された組織（上のパネル）および唾液（下のパネル）で使用された標準化マーカーを示す。これらのマーカーは発現にほとんど変化を示さず、ＨＮＳＣＣと正常とに有意な重複があることがわかる。理想的な標準化マーカーは、最小の変動、および関心対象の遺伝子パネルと同様の発現レベルを有する必要がある。

実施例６－潜在的な標準化遺伝子またはハウスキーピング遺伝子の識別
ＴＧＣＡデータベースを分析して、３つの判定基準を使用して潜在的な標準化遺伝子を識別した。（１）ＨＮＳＣＣと正常組織との間の発現の変化倍率の最小中央値；（２）ＨＮＳＣＣと正常の両方での最小四分位範囲（ＩＱＲ）（ＩＱＲは、７５四分位の遺伝子発現／２５四分位の遺伝子発現として定義される）；および（３）潜在的な候補遺伝子発現と標準化遺伝子の間の実験的比較を容易にするための、関心対象の遺伝子パネルに近い発現レベルの中央値。

分析を図９Ａに要約する。左のパネルは、ＨＮＳＣＣと正常における遺伝子発現の倍率変化中央値（ｘ軸）の、正常細胞と癌細胞の両方に対する平均ＩＱＲ（＝［ＨＮＳＣＣＩ．Ｑ．Ｒ．＋正常Ｉ．Ｑ．Ｒ］／２）（Ｙ軸）に対するプロットを示す。この図では、ｘ軸の正の数は、正常と比較して癌細胞における遺伝子発現の増加に対応し、負の数は、正常と比較して癌細胞における遺伝子発現の減少に対応する。合計１６，１６１個の遺伝子からのデータを分析した（左パネル）。これは、ＴＣＧＡデータベースで正常とＨＮＳＣＣの両方のデータを有するすべての遺伝子に一致し、したがって、ＴＣＧＡデータベースの遺伝子の総数の８８％（１６，１５１／１８，３７９）に一致する。この場合もやはり、ＨＮＳＣＣでは正常と比較して８，３５２個（５２％）の遺伝子が増加し、７，８０９個（４８％）の遺伝子が減少し、１，３８７個の遺伝子（８．６％）が２倍超増加し、１，７０１個（１０．５％）が２倍超減少したことが見出された。

最も関心のある潜在的な標準化遺伝子は、倍率変化（ｘ軸）が０、平均ＩＱＲが１（プロット上の円で囲まれた領域）の遺伝子である。中央のプロットは、倍率変化中央値が２未満、平均ＩＱＲが２未満の遺伝子のデータを示す（ｎ＝７，９４９遺伝子）。右のパネルは、７，９４９個の候補標準化遺伝子の遺伝子発現のデータを示す。発現中央値の遺伝子が最も関心が高いと考えられた。この分析に基づいて、ＫＨＤＲＢＳ１（ＫＨドメインを含有する、ＲＮＡ結合、シグナル伝達関連タンパク質１）が関心対象の標準化遺伝子として識別された。いくつかの他のより一般的な標準化遺伝子、例えばＲＰＬＰＯ、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ３０、ＧＡＰＤＨなどが中央のパネルで識別される。ＫＨＤＲＢＳ１についてのＴＣＧＡデータベースのデータを以下の表６に示す。図９Ｂは、ＫＨＤＲＢＳ１が多くの癌型にわたって同様の特徴（低倍率変化の発現および低ＩＱＲ）を示したことを示す。

発現の平均レベル１１．６０～１１．９０は、１．５２（ＨＮＳＣＣではＮＲＧ２）～１１．４４（正常ではＳＨ３ＢＧＲＬ２）の範囲の提案されたパネルマーカーよりも高い。それでも、これは癌特異的マーカーの範囲内であるので、良好な標準化遺伝子であるはずである。実質的に分解されたＲＮＡを含み得るＦＦＰＥ試料には、１００ｂｐ未満のアンプリコン長が好ましいことに注意すること。

これらのデータは、周知のハウスキーピング（標準化遺伝子）ＧＡＰＤＨのデータと比較され得る（表７）。１６．３～１６．５０の発現の中央値は、上で考察された候補パネルで最高レベルの発現を示す遺伝子（ＳＨ３ＢＧＲＬ２）よりも約３０倍高い。したがって、ＧＡＰＤＨは、上で考察された本開示のＨＮＳＣＣパネルのマーカーとしてあまり有用ではない可能性がある。

実施例７－発現アッセイの評価
ＴＣＧＡデータベースのデータから決定された発現レベル（遺伝子発現のＲＮＡＳｅｑ評価）を、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して測定した発現レベルと比較する実験を行った。結果を図１０に示す。この図は、舌扁平上皮癌（ＳＣＣ）および正常組織（口腔粘膜）における、ｄｄＰＣＲによるＡＤＡＭ１２およびＳＨ３ＢＧＲＬ２のｄｄＰＣＲ分析の再現性を示すデータを示す（図１０の上の表）。正常組織と比較した、癌におけるＡＤＡＭ１２およびＳＨ３ＢＧＲＬ２の遺伝子発現レベルに関するｄｄＰＣＲデータ（下の表）とＴＣＧＡＲＮＡＳｅｑデータ（中央の表）の比較も示す。両方の手法で測定すると、正常と比較して癌でのＡＤＡＭ１２の発現が大幅に増加し、正常と比較して癌でのＳＨ３ＢＧＲＬ２の発現が大幅に減少していることがわかる。これらの実験では、同じ試料からの２つのアリコートを分析した。頬側試料に関して、試料のうちの１つに、低すぎて正確に測定できない発現レベルがあった。ｄｄＰＣＲ値は一般にＴＣＧＡＲＮＡＳｅｑデータよりも低かったが、傾向は両方のマーカーで同じであった（図１０を参照）。再現性は１コピー／μＬまで良好であった。

図１１は、３つのホルマリン固定パラフィン包埋患者試料（ＤＡ１０８１９８３；ＤＲ１０４１６８６；ＤＡ００６３５９５）と、細胞培養癌組織に由来する１つのＵＲＮＡ対照試料のさらなるデジタルＰＣＲデータを示す。ＵＲＮＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ（カタログ番号７４００００）から取得可能なユニバーサルヒト参照ＲＮＡである。これは、標準的なデータセット比較の一貫した対照として機能する１０のヒト癌細胞株で構成されている。二通りかまたは三通りのいずれかのサンプリングが本開示の実施形態に従って実行された。この場合もやはり、正常と比較して、癌におけるＳＨ３ＢＧＲＬ２発現の実質的な減少があることが見出された。ＵＲＮＡ対照からの１ｕＬあたりのコピー数は、おそらく単離されたＲＮＡのインタクトな性質のために、ＦＦＰＥ試料由来の架橋された、そしておそらく断片化されたＲＮＡと比較して、はるかに大きいことがわかる。

図１２は、ｄｄＰＣＲと、マーカーＳＨ３ＢＧＲＬ２（ＦＡＭで標識）およびＫＨＤＲＢＳ１（ＨＥＸで標識）を使用したＲＮＡ滴定実験を示す。この実験では、ＦＦＰＥ試料からＲＮＡを単離し（またはＵＲＮＡを陽性対照として使用し）、２または１０倍に希釈した。標準的な技術を使用してｃＤＮＡを生成し、ｄｄＰＣＲを使用して、バイオマーカーＳＨ３ＢＧＲＬ２（ＦＡＭで標識された増幅配列）またはハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１（ＨＥＸで標識）の存在を検出した。３つの試料（＃１、＃３、または＃５）の結果を示す。非常に希薄な試料（すなわち、１コピー／μＬに近づくか、またはそれ未満）を除いて、様々な濃度のマーカーとハウスキーピング遺伝子の比率間には良好な相関関係があることがわかる。これは、このアッセイ手法を使用して測定できる試料濃度の範囲が適切であることを示している。

図１３は、陽性対照であるＵＲＮＡと比較した、ＦＦＰＥ試料中のバイオマーカーＳＨ３ＢＧＲＬ２およびハウスキーピングＲＮＡＫＨＤＲＢＳ１の相対的な存在量（左パネル）、正常細胞およびＵＲＮＡと比較した、癌細胞におけるバイオマーカーＳＨ３ＢＧＲＬ２／ＫＨＤＲＢＳ１の比率（中央パネル）、および、ＲＮＡＳｅｑを使用して測定した、癌および正常細胞におけるＳＨ３ＢＧＲＬ２に対するＫＨＤＲＢＳ１の相対量（右パネル）を示す。この場合もやはり、バイオマーカーの測定方法に関係なく、バイオマーカーに一貫したパターンが見られる（絶対値は異なる場合がある）。

図１４は、シングルプレックスアッセイとして測定されたＳＨ３ＢＧＲＬ２の測定を示す（すなわち、ＳＨ３ＢＧＲＬ２とＫＨＤＲＢＳ１の両方が測定されたデュプレックス反応と比べて、ＰＣＲによって生成されたＳＨ３ＢＧＲＬ２－ＦＡＭのみを、正常または癌由来の試料のいずれかで測定した）。結果は、全体的に非常に類似している。

実施例８－ｄｄＰＣＲによるＦＦＰＥ組織試料における差次的発現
図１５は、２２個の良性および８個の頭頸部癌腫ＦＦＰＥ試料からの５つのバイオマーカーとハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１の測定を示す。ＲＮＡは、ＲｏｃｈｅＨｉｇｈＰｕｒｅＦＦＰＥＴＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔを基本的に製造プロトコルに従って使用して、ＦＦＰＥ組織から抽出した。５つのパネルは、２２個の良性、８個の頭頸部癌腫ＦＦＰＥ試料由来の５つのバイオマーカー（ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１、ＬＯＸＬ２およびＡＤＡＭ１２）とハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１のデュプレックスｄｄＰＣＲからのコピー数／μＬを示す。ＫＨＤＲＢＳ１は、すべての試料とすべてのアッセイにわたって非常に類似した分布パターンおよびコピー数／μＬを示した。対照的に、バイオマーカーは、＞３－ｌｏｇ_１０コピー数／μＬで様々な分布を示した。１つのＨＮＳＣＣ試料が、すべてのアッセイにわたってバイオマーカーとＫＨＤＲＢＳ１の両方で「コールなし」となった。

図１６の左のグラフは、ＫＨＤＲＢＳ１に標準化された５つのバイオマーカーの発現を示す。バイオマーカーコピー数／ｕＬをハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１のコピー数／ｕＬでデュプレックスｄｄＰＣＲ反応から除算すると、各試料のバイオマーカーの標準化または比率が得られる。図１６の右のグラフは、ＨＮＳＣＣＴＣＧＡデータセットからの同じバイオマーカーのＲＮＡＳｅｑ発現データである。表は、ＴＣＧＡデータと比較した、ｄｄＰＣＲ実験からの各バイオマーカーの発現の倍率変化中央値を示す。両方のデータセットは、癌で下方制御された同じ遺伝子（ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＫＲＴ４およびＥＭＰ１）と、癌で上方制御された同じ遺伝子（ＬＯＸＬ２およびＡＤＡＭ１２）を示す。ｄｄＰＣＲの結果はＴＣＧＡデータセットと一致しているが、変化の大きさは異なる。

図１７、ｄｄＰＣＲスコアは、（上方制御された遺伝子の合計ログ）－（下方制御された遺伝子の合計ログ）の差を求めることによって癌を正常な試料から分離するために開発され、バイオマーカーを加えると、式は（ｌｏｇＬＯＸＬ２＋ｌｏｇＡＤＡＭ１２）－（ｌｏｇＳＨ３ＢＧＲＬ２＋ｌｏｇＥＭＰ１＋ｌｏｇＫＲＴ４）になる。左側のパネルは、正常な試料のｄｄＰＣＲスコアの横にプロットされた癌試料のｄｄＰＣＲスコアを示す。ｄｄＰＣＲカットオフスコア＞０．２４である場合、アッセイの特異度は９５．４％、感度は８５．７％である右側のプロットは、受信者オペレーター特性（ＲＯＣ）分析を示し、ＡＵＣは０．９６１、ｐ＝０．０００３である。ｄｄＰＣＲからの特異度はＴＣＧＡデータセット（図２を参照）と同様であるが、感度は、おそらく試料サイズおよび遺伝子選択の違いに起因して、ｄｄＰＣＲからのほうがＴＣＧＡよりも低い。

実施例９－ＦＦＰＥＨＮＳＣＣ組織試料におけるＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７発現
図１８は、Ｅ６およびＥ７ＨＰＶ１６発現と、ＦＦＰＥＨＮＳＣＣ組織試料からのｐ１６との間の相関を示す。上の表は、４つのｐ１６陽性試料から取得した、ＨＰＶ１６Ｅ６、Ｅ７およびハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１のｄｄＰＣＲコピー数／ｕＬを示す。下の表は、１０のｐ１６陰性試料と、ＨＰＶ１６Ｅ６、Ｅ７、ハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１のｄｄＰＣＲコピー数／ｕＬの結果を示す。右側のプロットは、４つのｐ１６陽性試料について、バイオマーカーの標準化されたｄｄＰＣＲ比率をハウスキーピング遺伝子ＫＨＤＲＢＳ１で除算したものを示す。ＨＰＶ１６Ｅ６とＥ７の両方の報告価値のあるコピー数／ｕＬが「コールなし」よりも大きい試料の２つは、Ｅ６より約５倍大きいＥ７の標準化されたｄｄＰＣＲ発現を示した。さらに、すべてのｐ１６陰性試料も、調製および複製の両方で、ｄｄＰＣＲによるＥ６およびＥ７発現が陰性（コールなし）であった。ＩＨＣによるｐ１６と、ｄｄＰＣＲによるＥ６またはＥ７発現との間には、非常に良好な全体的な一致がある（コーエンのカッパ＝０．８１）。

実施例１０－ＲＮＡの単離および唾液試料における遺伝子発現
場合によっては、唾液を生物学的試料として使用することができる。図１９は、唾液からのＲＮＡの収量を示す。唾液試料は、ＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋＣＰ－１９０ヒトＲＮＡ収集装置を使用して収集された。試料収集の後、各試料を完全に混合し、５０℃で２時間インキュベートし、処理されるまで試料を－２０℃で保管した。処理する唾液の各アリコートに、試料量の１／１０のＤＮＡＧｅｎｏｔｅｋ中和剤溶液（カタログ番号ＲＥＬＯＮＮ－５）を加えた。ＲｏｃｈｅＨｉｇｈＰｕｒｅＲＮＡパラフィンキット（カタログ番号０３２７０２８９００１）を使用してＲＮＡを精製した。左側の表は、１５の唾液ＲＮＡ試料と、２５０μＬの唾液試料調製から計算した、μｇＲＮＡ／２ｍＬ唾液と、各唾液試料からのＡ２６０／Ａ２８０比を示す。単離されたＲＮＡのμｇの中央値は５．８μｇであり、Ａ２６０／Ａ２８０比の中央値は２．０５であった。右側の散布図は、同じデータを箱ひげ形式で示し、ひげは最大と最小で、７５パーセンタイルおよび２５パーセンタイルの周りのボックスと中央値を通る線で示される。

図２０は、図１９の１５の唾液ＲＮＡ試料からの５つのバイオマーカーとハウスキーピング（ＨＫ）遺伝子ＲＰＬ３０の測定を示す。左のパネルは、１５の唾液試料からの５つのバイオマーカー（ＬＯＸＬ２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＣＲＩＳＰ３、ＥＭＰ１、およびＫＲＴ４）とハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３０のデュプレックスｄｄＰＣＲからのコピー数／μＬを示す。バイオマーカーの分布は、０．３８から６５０コピー／μＬの範囲であった。右側のパネルは、各デュプレックスｄｄＰＣＲのハウスキーピング遺伝子であるべきである。ハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ３０）は平均して８～１７０コピー／μＬであり、ＣＶ％は５種類のデュプレックスｄｄＰＣＲ反応全体で６～２７％であった。１つの試料は平均して１．３コピー／μＬ、ＣＶ％は５７％であった。

図２１は、ＴＣＧＡＲＮＡＳｅｑと比較した、唾液からの標準化されたｄｄＰＣＲを示す。左のグラフは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３０に標準化されたバイオマーカーの発現を示す。バイオマーカーのコピー数／μＬをハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３０のコピー数／μＬでデュプレックスｄｄＰＣＲ反応から除算すると、各試料のバイオマーカーの標準化または比率が得られる。ＨＫ遺伝子の平均が１．３コピー／ｕＬである１つの試料、およびバイオマーカーが「コールなし」または１コピー／ｕＬ未満の試料は除外される。標準化されたｄｄＰＣＲ発現の範囲は０．０１８～９．７＝５４０倍であった。図２１の右のグラフは、ＨＮＳＣＣデータセット中の「正常」からの同じバイオマーカーのＲＮＡＳｅｑ発現データである。表は、ＴＣＧＡデータと比較したｄｄＰＣＲ実験からの各バイオマーカーのＬＯＸＬ２に対する発現の倍率増加中央値を示す。ｄｄＰＣＲによる唾液からの発現の倍率増加中央値は、ＴＣＧＡ（組織）データセットに類似する傾向があるが、変化の大きさは様々である。

実施例１１－実施形態
本開示には、限定されるものではないが、以下の実施形態が含まれる。

Ａ．１個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出する方法であって、
個体から試料を得るステップと；
表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子からの発現産物の量を測定するステップと
を含む、方法。

Ａ．２遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．３遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つを含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．４ＨＰＶＥ６遺伝子および／またはＨＰＶＥ７遺伝子のうちの少なくとも１つからの発現産物の量を測定することをさらに含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．５遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つ、ならびにＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７遺伝子の少なくとも１つからの発現産物からなる、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．６ＫＨＤＲＢＳ１、またはＲＰＬ３０などの標準化遺伝子、または別の標準化遺伝子の量を測定することをさらに含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．７測定するステップが、ｍＲＮＡを測定することを含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．８測定するステップが、イムノアッセイを含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．９遺伝子のうちの少なくとも４つの発現を測定することを含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．１０試料が、血清、組織、ＦＦＰＥ、唾液または血漿を含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．１１発現レベルを正常な集団からの対照値と比較することを含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ａ．１２個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有する可能性がある（すなわち、診断である）、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す、前述の段落のいずれかに記載の方法。

Ｂ．１頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）において発現が増加または減少しているが、正常対照と比較してＨＮＳＣＣ疾患では発現していない少なくとも１つのマーカーを識別することを含む、個体においてＨＮＳＣＣに関連するマーカーを識別する方法。

Ｂ．２遺伝子が表４および／または表６中の遺伝子の１つの少なくとも１つ、および／またはＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、Ｂ．１に記載の方法。

Ｂ．３遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つを含む、Ｂ．１～Ｂ．２のいずれかに記載の方法。

Ｂ．４ＨＰＶＥ６遺伝子および／またはＨＰＶＥ７遺伝子のうちの少なくとも１つからの発現産物の量を測定することをさらに含む、Ｂ．１～Ｂ．３のいずれかに記載の方法。

Ｂ．５遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つ、ならびにＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７遺伝子の少なくとも１つからの発現産物からなる、Ｂ．１～Ｂ．４のいずれかに記載の方法。

Ｂ．６ＫＨＤＲＢＳ１、またはＲＰＬ３０などの標準化遺伝子、または別の標準化遺伝子の量を測定することをさらに含む、Ｂ．１～Ｂ．５のいずれかに記載の方法。

Ｂ．７測定するステップが、ｍＲＮＡを測定することを含む、Ｂ．１～Ｂ．６のいずれかに記載の方法。

Ｂ．８測定するステップが、イムノアッセイを含む、Ｂ．１～Ｂ．７のいずれかに記載の方法。

Ｂ．９遺伝子のうちの少なくとも４つの発現を測定することを含む、Ｂ．１～Ｂ．８のいずれかに記載の方法。

Ｂ．１０試料が、血清、組織、ＦＦＰＥ、唾液または血漿を含む、Ｂ．１～Ｂ．９のいずれかに記載の方法。

Ｂ．１１個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有する可能性がある（すなわち、診断である）、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す、Ｂ．１～Ｂ．１０のいずれかに記載の方法。

Ｃ．１個体から試料を得ることと；
表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの発現産物の量を測定することと；
試料における表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現と、遺伝子の発現産物の対照値を比較することと
を含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に対する易罹患性を検出する方法。

Ｃ．２遺伝子がＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、Ｃ．１に記載の方法。

Ｃ．３遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つを含む、Ｃ．１～Ｃ．２のいずれかに記載の方法。

Ｃ．４ＨＰＶＥ６遺伝子および／またはＨＰＶＥ７遺伝子のうちの少なくとも１つからの発現産物の量を測定することをさらに含む、Ｃ．１～Ｃ．３のいずれかに記載の方法。

Ｃ．５遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つ、ならびにＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７遺伝子の少なくとも１つからの発現産物からなる、Ｃ．１～Ｃ．４のいずれかに記載の方法。

Ｃ．６ＫＨＤＲＢＳ１、またはＲＰＬ３０などの標準化遺伝子、または別の標準化遺伝子の量を測定することをさらに含む、Ｃ．１～Ｃ．５のいずれかに記載の方法。

Ｃ．７測定するステップが、ｍＲＮＡを測定することを含む、Ｃ．１～Ｃ．６のいずれかに記載の方法。

Ｃ．８測定するステップが、イムノアッセイを含む、Ｃ．１～Ｃ．７のいずれかに記載の方法。

Ｃ．９遺伝子のうちの少なくとも４つの発現を測定することを含む、Ｃ．１～Ｃ．８のいずれかに記載の方法。

Ｃ．１０試料が、血清、組織、ＦＦＰＥ、唾液または血漿を含む、Ｃ．１～Ｃ．９のいずれかに記載の方法。

Ｃ．１１個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有する可能性がある、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す、Ｃ．１～Ｃ．１０のいずれかに記載の方法。

Ｄ．１表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを定量化する試薬を含む、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出するための組成物。

Ｄ．２少なくとも１つの遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、任意のＤ．１に記載の組成物。

Ｄ．３少なくとも１つの遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つを含む、Ｄ．１～Ｄ．２に記載の組成物。

Ｄ．４少なくとも１つのＨＰＶＥ６および／またはＥ７の発現レベルを定量化する少なくとも１つの試薬をさらに含む、Ｄ．１～Ｄ．３のいずれかに記載の組成物。

Ｄ．５少なくとも１つの遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つと、少なくとも１つのＨＰＶＥ６および／またはＥ７からなる、Ｄ．１～Ｄ．４のいずれかに記載の組成物。

Ｄ．６ＫＨＤＲＢＳ１、またはＲＰＬ３０などの少なくとも１つの標準化遺伝子、または別の標準化遺伝子を測定するための少なくとも１つの試薬をさらに含む、Ｄ．１～Ｄ．５のいずれかに記載の組成物。

Ｄ．７試薬がｍＲＮＡを検出する、Ｄ．１～Ｄ．６のいずれかに記載の組成物。

Ｄ．８試薬がタンパク質を検出する、Ｄ．１～Ｄ．７のいずれかに記載の組成物。

Ｄ．９試薬が、これらの遺伝子のいずれか１つの少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを含み、少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブが検出可能部分で標識される、Ｄ．１～Ｄ．８のいずれかに記載の組成物。

Ｄ．１０個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有する可能性がある（すなわち、診断である）、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す、Ｄ．１～Ｄ．９のいずれかに記載の組成物。

Ｅ．１前述の段落のいずれかに記載の組成物を含むキット。

Ｅ．２少なくとも１つの遺伝子を測定するための、かつ／または値が対照値と異なるかどうかを決定するための説明書をさらに含む、Ｅ．１に記載のキット。

Ｅ．３ＫＨＤＲＢＳ１、またはＲＰＬ３０などの少なくとも１つの標準化遺伝子、または別の標準化遺伝子の少なくとも１つの陽性対照を含む、Ｅ．１～Ｅ．２のいずれかに記載のキット。

Ｅ．４表４および／または表６中の遺伝子のいずれか１つの少なくとも１つの陽性対照をさらに含む、Ｅ．１～Ｅ．３のいずれかに記載のキット。

Ｅ．５少なくとも１つの遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、Ｅ．１～Ｅ．４のいずれかに記載のキット。

Ｅ．６少なくとも１つの遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つを含む、Ｅ．１～Ｅ．５のいずれかに記載のキット。

Ｅ．７少なくとも１つの遺伝子が、少なくとも１つのＨＰＶＥ６および／またはＥ７を含む、Ｅ．１～Ｅ．６のいずれかに記載のキット。

Ｅ．８少なくとも１つの遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つと、少なくとも１つのＨＰＶＥ６および／またはＥ７からなる、Ｅ．１～Ｅ．７のいずれかに記載のキット。

Ｅ．９試薬が、これらの遺伝子のいずれか１つの少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブを含み、少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブが検出可能部分で標識される、Ｅ．１～Ｅ．８のいずれかに記載のキット。

Ｅ．１０個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有する可能性がある、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す、Ｅ．１～Ｅ．９のいずれかに記載のキット。

Ｆ．１個体から試料を得ることと；
試料において表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子を含む遺伝子からの発現産物の量を測定することと；
試料における表４および／または表６中の少なくとも１つの遺伝子の発現を発現の対照値と比較することと；
個体における遺伝子発現と対照値との間の差異が、個体がＨＮＳＣＣを有し得る（すなわち、存在の診断である）か、またはＨＮＳＣＣを発症しやすい（すなわち、リスクが高い）ことを示す場合に、個体をＨＮＳＣＣについて処置することと
を含む、ＨＮＳＣＣを処置する方法。

Ｆ．２遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１またはＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも１つを含む、Ｆ．１に記載の方法。

Ｆ．３遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つを含む、Ｆ．１～Ｆ．２に記載の方法。

Ｆ．４ＨＰＶＥ６遺伝子および／またはＨＰＶＥ７遺伝子のうちの少なくとも１つからの発現産物の量を測定することをさらに含む、Ｆ．１～Ｆ．３のいずれかに記載の方法。

Ｆ．５遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＳＨ３ＢＧＲＬ２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１およびＨＳＤ１７Ｂ６の少なくとも４つ、ならびにＨＰＶＥ６および／またはＨＰＶＥ７遺伝子の少なくとも１つからの発現産物からなる、Ｆ．１～Ｆ．４のいずれかに記載の方法。

Ｆ．６ＫＨＤＲＢＳ１、またはＲＰＬ３０などの標準化遺伝子、または別の標準化遺伝子の量を測定することをさらに含む、Ｆ．１～Ｆ．５のいずれかに記載の方法。

Ｆ．７測定するステップが、ｍＲＮＡを測定することを含む、Ｆ．１～Ｆ．６のいずれかに記載の方法。

Ｆ．８測定するステップが、イムノアッセイを含む、Ｆ．１～Ｆ．７のいずれかに記載の方法。

Ｆ．９遺伝子のうちの少なくとも４つの発現を測定することを含む、Ｆ．１～Ｆ．８のいずれかに記載の方法。

Ｆ．１０試料が、血清、組織、ＦＦＰＥ、唾液または血漿を含む、Ｆ．１～Ｆ．９のいずれかに記載の方法。

Ｆ．１１発現レベルを正常な集団からの対照値と比較することを含む、Ｆ．１～Ｆ．１０のいずれかに記載の方法。

他の文書、例えば特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどへの参照および引用は、この開示を通して行われた。そのような文書は全て、あらゆる目的のためにその全文が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるものの多様な修正および等価物は、本明細書に引用された科学文献および特許文献への参照を含む、本文書の全内容から当業者に明らかとなるであろう。本明細書の主題は、その様々な実施形態およびその等価物において、本開示の実践に適合させ得る情報、例示、およびガイダンスを含む。

Claims

個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に関連するバイオマーカーを検出する方法であって、
前記個体から得られた試料における、ＳＨ３ＢＧＲＬ２およびＭＭＰ１１からの発現産物の量を測定するステップ
を含む、方法。
前記試料における、表４および／または表６におけるさらなる少なくとも１つの遺伝子からの発現産物の量を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記試料における、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１、ＨＳＤ１７Ｂ６、ＣＡ９、ＬＡＭＣ２、ＦＡＭ１０７ＡまたはＦＡＭ３Ｄ遺伝子の少なくとも１つからの発現産物の量を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記試料における、ＨＰＶＥ６遺伝子および／またはＨＰＶＥ７遺伝子のうちの少なくとも１つからの発現産物の量を測定することをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＨＰＶＥ６遺伝子および／またはＨＰＶＥ７遺伝子のうちの少なくとも１つからの発現産物の測定された量を、対応する発現の対照値と比較することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
標準化遺伝子の量を測定することをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１またはＲＰＬ３０である、請求項６に記載の方法。
前記測定するステップが、ｍＲＮＡを測定することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記測定するステップが、タンパク質を測定することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記測定するステップが、イムノアッセイを行うことを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記測定するステップが、少なくとも４つの遺伝子の発現の量を測定することを含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。
前記試料が、血清、組織、ＦＦＰＥ、唾液または血漿を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも１つの遺伝子の発現を、個体において頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に対する易罹患性を検出する指標とする方法であって：
前記個体から得られた試料における少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの発現産物の量を測定することであって、前記少なくとも１つの遺伝子は、ＳＨ３ＢＧＲＬ２およびＭＭＰ１１を含む、測定することと；
前記試料における前記少なくとも１つの遺伝子の前記発現と、前記遺伝子の前記発現産物の対照値を比較するステップとを含み、前記試料における遺伝子発現と前記対照値との間の差異は、前記個体がＨＮＳＣＣを有している可能性があるか、またはＨＮＳＣＣを発症しやすいことを示す、方法。
前記少なくとも１つの遺伝子は、表４および／または表６における少なくとも１つの遺伝子をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
前記少なくとも１つの遺伝子が、ＣＡＢ３９Ｌ、ＡＤＡＭ１２、ＮＲＧ２、ＣＯＬ１３Ａ１、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＬＯＸＬ２、ＫＲＴ４、ＥＭＰ１、ＨＳＤ１７Ｂ６、ＣＡ９、ＬＡＭＣ２、ＦＡＭ１０７ＡまたはＦＡＭ３Ｄ遺伝子の少なくとも１つをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
前記試料において、少なくとも１つのＨＰＶＥ６および／またはＥ７遺伝子の少なくとも１つの発現産物の量を測定することと；前記試料における前記少なくとも１つの発現産物の測定された発現の量を、対応する発現の対照値と比較することとをさらに含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
標準化遺伝子の量を測定することをさらに含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記標準化遺伝子は、ＫＨＤＲＢＳ１またはＲＰＬ３０である、請求項１７に記載の方法。
前記測定するステップが、ｍＲＮＡを測定することを含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記測定するステップが、タンパク質を測定することを含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも１つの遺伝子は、少なくとも４つの前記遺伝子を含む、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の方法。
前記試料が、血清組織、ＦＦＰＥ、唾液または血漿を含む、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法。