CN109355394A - 癌-睾丸抗原cdca5作为食管鳞癌预后标志物及治疗靶点 - Google Patents

癌-睾丸抗原cdca5作为食管鳞癌预后标志物及治疗靶点 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种癌‑睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物及其治疗靶点，基于GEO、HBM及GTEx等数据库，系统筛选出21个食管鳞癌相关癌睾丸基因，其中，CDCA5表达与食管鳞癌预后显著相关；进一步通过组织生物学和细胞功能学对CDCA5基因的作用机制进行验证分析。本发明首次发现CDCA5为食管鳞癌相关的癌‑睾丸基因，其在食管鳞癌患者癌组织中呈高表达，并与较差的食管鳞癌预后相关，可以作为预测食管鳞癌患者预后的生物标志物；利用shRNA敲降CDCA5基因的表达可以显著抑制食管鳞癌在体内及体外的进展水平，提示CDCA5抗原可以作为食管鳞癌治疗的靶点。

Description

癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物及治疗靶点
技术领域
本发明涉及一种癌-睾丸抗原CDCA5，具体为癌-睾丸抗原CDCA5可作为食管鳞癌预后标志物及其治疗靶点，属于癌-睾丸抗原CDCA5应用领域。
背景技术
食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内，食管癌发病率在所有恶性肿瘤中位居第八位，死亡率位居第六位，每年约有450000人罹患该病。与西方国家不同的是，食管鳞状细胞癌（食管鳞癌）在我国占所有食管癌病例的95%以上。近十余年来，食管鳞癌的综合治疗手段不断进步，但其预后仍不甚理想，其五年总体生存率仅为15%-25%。因此，探索食管鳞癌预后的影响因素，建立相对准确的预后预测模型，以期指导食管癌临床治疗，进而提高患者的治愈率，延长患者生存时间，在我国有着极为重大的临床意义。
目前，临床上常采用第八版TNM分期评估食管鳞癌预后，主要依据食管鳞癌原发灶浸润深度、分化程度、肿瘤部位、有无淋巴结及远处转移等临床因素来预测食管鳞癌患者的远期生存情况。然而，大量研究证实，肿瘤的预后不仅与TNM分期有关，而且受到遗传因素的影响。传统的TNM分期仅考虑临床病理因素，因而无法较为精确地预测食管鳞癌患者的预后。因此，探寻食管鳞癌发生发展过程中的关键预后分子，筛选与食管鳞癌预后有关的分子标志物并作为治疗靶点，继而进行个体化治疗是当今肿瘤研究的热点，也是改善肿瘤患者生存及预后的必经之路。
癌-睾丸基因（Cancer/testis genes，CT基因）是指一类仅在睾丸组织及恶性肿瘤组织中高表达，其它正常组织不表达或低表达的基因。与正常组织不同的是，肿瘤组织中表达的癌-睾丸抗原 (Cancer/testis antigens)具有免疫原性，能够诱导免疫反应，因而可作为恶性肿瘤免疫治疗的靶点。目前，已经有多种以癌-睾丸抗原为靶点的药物正在临床试验阶段，包括以MAGE-A3，PASD1以及MAGE-A1等抗原为免疫治疗靶点的药物。
既往研究已经发现了多个与食管鳞癌发生进展有关的癌-睾丸基因，如MAGE-A4，LAGE1，CT45等。然而，目前尚无研究系统地筛选食管鳞癌相关的癌-睾丸抗原并探索其与食管鳞癌预后的关联。因此，系统筛选食管鳞癌相关癌-睾丸抗原，解析其潜在的生物学机制，并作为预测食管鳞癌预后标志物，指导食管鳞癌患者的个体化治疗，对我国食管鳞癌的临床诊疗具有重大的创新性意义。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物及治疗靶点。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物，包括筛选过程，所述筛选利用GEO，HBM以及GTEx数据库筛选出一个与食管癌预后显著相关的癌睾丸基因，即为CDCA5，具体筛选过程如下：
（1）利用GEO，HBM以及GTEx数据库，对119对食管鳞癌-癌旁组织表达芯片数据进行质控，保留25890个高质量探针；
（2）进一步筛选出其中的编码蛋白基因以及在睾丸组织呈优势表达的基因，保留764个探针，对应690个基因；
（3）基于上述表达芯片数据，进行差异表达分析，筛选出21个食管鳞癌相关癌睾丸基因；
（4）对21个食管鳞癌相关癌睾丸基因进行预后关联分析，筛选出一个癌睾丸基因与食管癌预后显著相关，即为CDCA5。
优选地，所述步骤（1）中保留的高质量探针，在所有组织样本中检出率大于80%；所述步骤（2）中筛选出编码蛋白基因，并且在睾丸组织中呈现优势表达的基因；所述步骤（3）中在癌与癌旁组织中差异性表达基因的筛选采用差异表达分析法，评定标准为FoldChange≥ 2 同时P < 0.05；所述步骤（4）中，预后关联分析采用Cox回归分析法，评定标准为HR ≥1同时P < 0.05。
一种癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物治疗靶点，包括组织生物学检测和细胞功能学检测，所述组织生物学检测包括组织芯片的构建和食管鳞癌及癌旁组织PCR实验，所述细胞功能学检测包括CDCA5基因的表达功能检测、敲降CDCA5基因的表达功能检测和裸鼠荷瘤实验。
优选地，所述组织芯片的构建包括利用苏木精-伊红染色切片选择有代表性的组织区域和利用亲和素-生物素复合物法进行免疫组化分析。
优选地，所述利用苏木精-伊红染色切片选择有代表性的组织区域包括癌组织和癌旁组织，所述癌组织中癌细胞大于80%，所述癌旁组织中不含癌细胞。
优选地，所述食管鳞癌及癌旁组织PCR实验，以GAPDH为内参基因，CDCA5为目的基因，
GAPDH基因引物如下：
上游引物 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’、
下游引物 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；
CDCA5基因引物如下：
上游引物 5’-AGAAAGTCAGGCGTTCCTACAG-3’、
下游引物 5’-GGGAGATTCCAGGGAGAGTCAT-3’；
按照两步法进行Real-Time PCR并绘制熔解曲线，具体实验条件为：95℃ (30s)，95℃(5s，40个循环)，60℃ (30s，40个循环)，95℃ (15s)，60℃ (30s)，95℃ (15s)。
优选地，所述CDCA5基因的表达功能检测采用人类食管鳞状细胞癌细胞系 TE1、Eca109、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYESE450、KYSE510和正常食管上皮细胞HET-1a，
CDCA5基因的引物具体如下：
上游引物：5’- AGAAAGTCAGGCGTTCCTACAG -3’；
下游引物：5’- GGGAGATTCCAGGGAGAGTCAT -3’。
优选地，所述敲降CDCA5基因的功能检测和裸鼠荷瘤实验均采用食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系，所述敲降CDCA5基因的表达检测利用PCR检测CDCA5基因的mRNA表达水平。
所述能够定量CDCA5基因mRNA表达水平的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能，所述PCR方法为常规方法。
本发明用于CDCA5基因表达检测的样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。
本发明的有益效果是：本发明通过分析GEO数据库中中国汉族食管鳞状细胞癌患者队列的转录组芯片数据，筛选出同时满足在食管鳞状细胞癌及睾丸组织中特异性表达且与食管鳞状细胞癌患者预后相关的一个基因，即CDCA5基因。
本发明首次发现CDCA5为一个食管鳞状细胞癌相关的癌-睾丸抗原，并证实了CDCA5可以作为预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物。研究同时发现CDCA5基因在食管鳞状细胞癌患者癌组织中呈高表达，其表达增高能够促进食管鳞状细胞癌的增殖、侵袭和转移，利用shRNA敲降CDCA5基因的表达可以显著抑制食管鳞状细胞癌在体内及体外水平的进展。
附图说明
图1 为利用高通量数据筛选食管鳞状细胞癌患者预后相关的癌-睾丸基因流程图；
图2 (A) 为基于GEO数据库筛选出21个食管鳞癌相关的癌睾丸基因图；
图2 (B) 为基于GEO数据库分析筛选出的21个食管鳞癌相关癌睾丸基因与食管鳞癌预后的关联图；
图3（A）为CDCA5蛋白在食管鳞状细胞癌旁组织中呈阴性表达图；
图3（B）为CDCA5蛋白在食管鳞状细胞癌组织中呈阳性表达图；
图3（C）为PCR检测显示CDCA5 mRNA在食管癌组织中高表达图；
图3（D）为CDCA5蛋白阳性表达的食管癌患者较阴性表达的患者预后差分析图；
图4 为食管鳞癌患者癌组织中CDCA5蛋白阳性与肿瘤侵袭深度、淋巴结转移相关分析图；
图5 为PCR检测CDCA5基因mRNA在9种食管鳞癌细胞系及1种正常食管上皮细胞系中的表达情况图；
图6 为Eca109和KYSE30食管鳞癌细胞系中shRNA敲降CDCA5基因效力检测图；
图7为 CDCA5基因敲降MTT实验结果图；
图8 为CDCA5基因敲降克隆形成实验图；
图9为 CDCA5基因敲降细胞周期检测图；
图10 为CDCA5基因敲降细胞凋亡检测图；
图11 为CDCA5基因敲降细胞侵袭能力检测图；
图12 为CDCA5基因敲降细胞转移能力检测图；
图13 为与CDCA5存在共表达关系的基因网络图；
图14 为与CDCA5存在共表达关系的基因在细胞周期通路中的作用图;
图15 为CDCA5基因敲降后Western blotting检测相关细胞周期蛋白表达情况图；
图16为以Eca109细胞为例CDCA5基因敲降裸鼠体内成瘤实验结果图；
图17为以KYSE30细胞为例CDCA5基因敲降裸鼠体内成瘤实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物的筛选方法，包括以下步骤：
（1）利用GEO，HBM以及GTEx数据库，对119对食管鳞癌-癌旁组织表达芯片数据进行质控，保留25890个高质量探针；
（2）进一步筛选出其中的编码蛋白基因以及在睾丸组织呈优势表达的基因，保留764个探针，对应690个基因；
（3）基于上述GEO数据库表达芯片数据，进行基因差异表达分析，筛选出21个与食管鳞癌相关的癌-睾丸抗原；
（4）开展生存分析，对21个食管鳞癌相关癌睾丸基因进行预后关联分析，筛选出一个癌睾丸基因与食管癌预后显著相关，即为CDCA5。
其中，步骤（1）中筛选出的编码蛋白的基因以及睾丸优势表达的基因在所有组织样本中检出率大于80%；
步骤（2）中筛选出编码蛋白基因，并且在睾丸组织中呈现优势表达的基因；
步骤（3）中在癌与癌旁组织中差异性表达基因的筛选采用差异表达分析法，评定标准为FoldChange ≥ 2 同时P < 0.05；
步骤（4）中，与食管鳞癌患者预后相关的基因分析采用Cox回归分析法，评定标准为HR≥ 1同时P < 0.05。
实施例1 癌-睾丸基因CDCA5筛选方法
请参阅图1，基于前期已发表的中国汉族人群转录组芯片数据，GEO数据库，编号：GSE53625，从芯片32080个原始探针中，去除没有基因名或者转录本ID注释的探针以及在所有119对组织样本中检出率小于80%的探针，剩余25890个探针，从中筛选出编码蛋白的基因以及睾丸优势表达的基因。
具体方法为基于GENCODE v19数据库检索筛选出其中可以编码蛋白的基因；比对我们前期发现的1336个在睾丸组织中呈现优势表达基因，进一步保留764个探针，对应690个睾丸优势表达基因；其中，有21个癌-睾丸基因在食管癌与癌旁组织中存在差异性表达，即FoldChange ≥ 2 & P < 0.05，为本研究发现的21个食管鳞癌相关的癌睾丸基因；同时，Cox回归分析结果显示，21个癌睾丸基因中，仅CDCA5与食管鳞癌患者预后显著相关，即HR≥ 1& P < 0.05，如图2所示。
一种癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物治疗靶点，包括组织生物学检测和细胞功能学检测，所述组织生物学检测包括组织芯片的构建和食管鳞癌及癌旁组织PCR实验，所述细胞功能学检测包括CDCA5基因的表达功能检测、敲降CDCA5基因的表达功能检测和裸鼠荷瘤实验，具体操作方法如下：
实施例2 组织生物学检测
从江苏省人民医院提取118例食管鳞状细胞癌患者癌及癌旁组织，所有入组患者术前均未接受放疗或化疗且有完整的临床、病理资料及预后随访数据。所有组织标本在进行石蜡包埋后首先进行苏木精-伊红染色确认该石蜡组织块为食管鳞状细胞癌或者癌旁组织，并采用免疫组织化学组织芯片法检测该118例原发性食管鳞状细胞癌和癌旁组织中CDCA5蛋白的表达水平，随后切片选取代表性的区域，肿瘤区域癌细胞大于80%，癌旁区域癌细胞为0。
对于每个标本，癌组织或者癌旁组织均进行两次选点，两个中心的样本放置在不同的组织芯片上。
免疫组化结果由两名经验丰富的病理科医师利用显微镜对组织芯片进行盲法检测，综合染色强度及阳性细胞密度判定染色结果，具体方法如下：染色强度分为4个等级，0-无、1-弱、2-中等、3-强；根据阳性细胞密度分为5个等级，其中0代表阳性细胞占比≤10%，1代表阳性细胞占比11-25%，2代表阳性细胞占比26-50%，3代表阳性细胞占比51-75%，4代表阳性细胞占比>75%。将染色强度及阳性细胞密度等级评分相乘，相乘结果小于3的样本判为阴性，相乘结果大于或等于3的样本判为阳性。
请参阅图3A和图3B，组织生物学检测结果显示，CDCA5蛋白主要在肿瘤细胞的细胞核染色，在癌旁组织正常细胞中无表达。由病理科医师对118例食管鳞癌免疫组化结果进行判定，结果显示CDCA5蛋白在42.37%的肿瘤组织呈阳性表达，在癌旁组织中均为阴性表达。
请参阅图3C，收集30例食管鳞癌与癌旁新鲜冰冻组织，进行PCR实验，结果显示CDCA5 mRNA在食管鳞癌中的表达较之癌旁组织上调13.2倍。
从江苏省人民医院收取手术切除的食管鳞癌患者新鲜冰冻的癌与癌旁组织30对，所有入组患者术前均未接受放疗或化疗，手术完毕后一小时内取材并将标本放置在液氮中保存备用。检测前先将组织常温解冻，加入PBS液后研磨成为组织匀浆，离心后弃去上清。震荡仪打散组织后加入蛋白酶孵育过夜，裂解液裂解细胞。利用市售的总RNA提取试剂盒提取组织中的RNA并进行质量鉴定。将提取的RNA利用反转试剂盒生成cDNA，反转完成后，生成的产物用于后续PCR试验或者-20°冰箱保存。PCR引物由广州市锐博生物科技有限公司合成，按照SYBR premix ex taq 6uL、引物mix5 μM0.3uL、cDNA 0.6uL、RNase-Free H2O 5.1uL配置反应体系共12uL。引物序列信息如下：
内参基因GAPDH，
上游引物 TGACTTCAACAGCGACACCCA、
下游引物 CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA；
目的基因 CDCA5，
上游引物 AGAAAGTCAGGCGTTCCTACAG、
下游引物 GGGAGATTCCAGGGAGAGTCAT。
按照两步法进行Real-Time PCR并绘制熔解曲线，具体条件如下：
95℃ 30s
95℃ 5s 40个循环
60℃ 30s
95℃ 15s
60℃ 30s
95℃ 15s
请参阅图3C和图4，利用江苏省人民医院收集的118例食管鳞状细胞癌患者的癌与癌旁组织样本制作组织芯片，进行免疫组织化学染色。结果显示CDCA5在癌旁组织中无表达，在42.37%的食管鳞癌患者癌组织中高表达，其表达与肿瘤侵袭深度、淋巴结转移以及预后不佳有关。
实施例3 CDCA5基因的表达检测
从上海吉凯生物公司购得人类食管鳞状细胞癌细胞系 TE1、Eca109、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYESE450、KYSE510和正常食管上皮细胞HET-1a，进行细胞培养，并对培养后的细胞进行RNA提取和PCR检测。
CDCA5基因的引物由广州RiboBio生物公司设计，具体如下：
上游引物：5’- AGAAAGTCAGGCGTTCCTACAG -3’；
下游引物：5’- GGGAGATTCCAGGGAGAGTCAT -3’。
利用GAPDH mRNA作为内参对照，用2-ΔCt法对靶基因表达水平进行计算。所有样品均在 LightCycler480 PCR仪重复三次。
请参阅图5，PCR结果显示，与正常食管上皮细胞相比，食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系中的CDCA5基因表达量较高。
实施例4 敲降CDCA5基因的表达检测
请参阅图6，利用上海吉凯生物公司设计的三种敲降CDCA5基因表达的shRNA质粒，并用慢病毒包装，将这三种CDCA5基因敲降的慢病毒分别转染食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系，利用PCR检测CDCA5基因的mRNA表达水平，选择其中两种敲降效率较高的慢病毒，其基因序列分别为：5’- AGAAACAGAAACGTAAGAA -3’和5’- GCTTACTAAGGAGGACCTT -3’，再选择一个无义序列5’- TTCTCCGAACGTGTCACGT -3’作为空白对照组。
PCR结果显示，与对照组相比，转染了CDCA5基因敲降慢病毒的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系中，敲降组中CDCA5的表达量显著低于对照组。
请参阅图7和图8，利用上海吉凯生物公司提供的试剂盒，将转染CDCA5基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系细胞分别进行细胞活力检测和细胞克隆实验，检测转染CDCA5基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系细胞中CDCA5基因的表达对细胞活力和细胞克隆的影响。
MTT和克隆形成试验显示，敲低CDCA5基因的表达后，食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系的增殖能力明显降低。
请参阅图9，利用流式细胞仪检测转染CDCA5基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系细胞中CDCA5基因的表达对细胞周期的影响。
流式细胞系检测显示，敲降CDCA5基因的表达后，食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系的细胞周期被阻滞在G2/M期。
请参阅图10，利用美国eBioscience公司提供的Annexin V-APC单染凋亡试剂盒检测转染CDCA5基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系细胞中CDCA5基因的表达对细胞凋亡的影响。
PI单染法显示，敲降CDCA5基因的表达后，食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系的凋亡率明显升高。
请参阅图11和图12，利用美国corning公司提供的细胞侵袭实验试剂盒，采用Transwell细胞迁移实验检测转染CDCA5基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系细胞中CDCA5基因的表达对细胞侵袭和转移能力的影响。
Transwell试验显示，低表达CDCA5基因的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系，其侵袭和转移能力均显著下降。
请参阅图13和图14，基于GEO基因表达芯片数据，筛选出与CDCA5存在共表达关系的基因，相关系数r ≥0.5，绘制CDCA5基因共表达网络图（图13）；其中，CCNA2 (CycA)，CCNB1 (CycB)，CDC25A (Cdc25A) 以及PCNA均属于细胞周期通路，基于KEGG数据库，https://www.genome.jp/kegg/。
请参阅图15，利用Western bloting检测转染CDCA5基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系细胞中CDCA5基因表达对CycA、CycB、PCNA和Cdc25A等细胞周期基因的影响。
Western bloting检测结果显示，敲降CDCA5基因表达后，Eca109和KYSE30细胞系中CycA、CycB、PCNA和Cdc25A蛋白表达水平均有明显下调。
请参阅图16和图17，采用裸鼠荷瘤实验检测转染CDCA5基因敲降慢病毒及空白慢病毒的食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系细胞中CDCA5基因的表达对裸鼠体内成瘤能力的影响。
结果显示，敲降CDCA5基因的表达后，食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系在裸鼠体内成瘤能力明显降低。
以上结果表明，CDCA5基因在食管鳞状细胞癌患者癌组织中呈高表达，其表达增高能够促进食管鳞状细胞癌的增殖、侵袭和转移，利用shRNA敲降CDCA5基因的表达可以显著抑制食管鳞状细胞癌在体内及体外水平的进展。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
本发明的“CDCA5基因”【NC_000011.10 (70078302..70189545)】序列可以在NCBI数据库中进行查询。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物，其特征在于：包括筛选过程，所述筛选利用GEO，HBM以及GTEx数据库筛选出一个与食管癌预后显著相关的癌睾丸基因，即为CDCA5，具体筛选过程如下：
（1）利用GEO，HBM以及GTEx数据库，对119对食管鳞癌-癌旁组织表达芯片数据进行质控，保留25890个高质量探针；
（2）进一步筛选出其中的编码蛋白基因以及在睾丸组织呈优势表达的基因，保留764个探针，对应690个基因；
（3）基于上述表达芯片数据，进行差异表达分析，筛选出21个食管鳞癌相关癌睾丸基因；
（4）对21个食管鳞癌相关癌睾丸基因进行预后关联分析，筛选出一个癌睾丸基因与食管癌预后显著相关，即为CDCA5。
2.根据权利要求1所述的癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物，其特征在于：所述步骤（1）中保留的高质量探针，在所有组织样本中检出率大于80%；所述步骤（2）中筛选出编码蛋白基因，并且在睾丸组织中呈现优势表达的基因；所述步骤（3）中在癌与癌旁组织中差异性表达基因的筛选采用差异表达分析法，评定标准为FoldChange ≥ 2 同时P <0.05；所述步骤（4）中，预后关联分析采用Cox回归分析法，评定标准为HR ≥ 1同时P <0.05。
3.一种癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物治疗靶点，其特征在于：包括组织生物学检测和细胞功能学检测，所述组织生物学检测包括组织芯片的构建和食管鳞癌及癌旁组织PCR实验，所述细胞功能学检测包括CDCA5基因的表达功能检测、敲降CDCA5基因的表达功能检测和裸鼠荷瘤实验。
4.根据权利要求3所述的癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物治疗靶点，其特征在于：所述组织芯片的构建包括利用苏木精-伊红染色切片选择有代表性的组织区域和利用亲和素-生物素复合物法进行免疫组化分析。
5.根据权利要求4所述的癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物治疗靶点，其特征在于：所述利用苏木精-伊红染色切片选择有代表性的组织区域包括癌组织和癌旁组织，所述癌组织中癌细胞大于80%，所述癌旁组织中不含癌细胞。
6.根据权利要求3所述的癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物治疗靶点，其特征在于：所述食管鳞癌及癌旁组织PCR实验，以GAPDH为内参基因，CDCA5为目的基因，
GAPDH基因引物如下：
上游引物 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’、
下游引物 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；
CDCA5基因引物如下：
上游引物 5’-AGAAAGTCAGGCGTTCCTACAG-3’、
下游引物 5’-GGGAGATTCCAGGGAGAGTCAT-3’；
按照两步法进行Real-Time PCR并绘制熔解曲线，具体实验条件为：95℃ (30s)，95℃(5s，40个循环)，60℃ (30s，40个循环)，95℃ (15s)，60℃ (30s)，95℃ (15s)。
7.根据权利要求3所述的癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物治疗靶点，其特征在于：所述CDCA5基因的表达功能检测采用人类食管鳞状细胞癌细胞系 TE1、Eca109、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYESE450、KYSE510和正常食管上皮细胞HET-1a，
CDCA5基因的引物具体如下：
上游引物：5’- AGAAAGTCAGGCGTTCCTACAG -3’；
下游引物：5’- GGGAGATTCCAGGGAGAGTCAT -3’。
8.根据权利要求3所述的癌-睾丸抗原CDCA5作为食管鳞癌预后标志物治疗靶点，其特征在于：所述敲降CDCA5基因的功能检测和裸鼠荷瘤实验均采用食管鳞状细胞癌Eca109和KYSE30细胞系，所述敲降CDCA5基因的表达检测利用PCR检测CDCA5基因的mRNA表达水平。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118187A (zh) * 2020-02-25 2020-05-08 福建医科大学 一种检测食管鳞癌癌组织与癌旁组织差异菌群的引物组、试剂盒和检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010047028A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Oncotherapy Science, Inc. Screening method of anti-lung or esophageal cancer compounds
CN101835893A (zh) * 2007-08-24 2010-09-15 肿瘤疗法科学股份有限公司 癌症相关基因cdca5、epha7、stk31和wdhd1
CN102947325A (zh) * 2010-04-09 2013-02-27 肿瘤疗法科学股份有限公司 Cdca5肽及包含它们的疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101835893A (zh) * 2007-08-24 2010-09-15 肿瘤疗法科学股份有限公司 癌症相关基因cdca5、epha7、stk31和wdhd1
WO2010047028A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Oncotherapy Science, Inc. Screening method of anti-lung or esophageal cancer compounds
CN102947325A (zh) * 2010-04-09 2013-02-27 肿瘤疗法科学股份有限公司 Cdca5肽及包含它们的疫苗

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TINGTING CHEN等: "role of triosephosphate isomerase and downstream functional genes on gastric cancer", 《ONCOLOGY REPORTS》 *
YAO-TSENG CHEN等: "cancer-testis antigen expression in digestive tract carcinomas：frequent expression in esophageal squamous cell carcinoma and its precursor lesions", 《CANCER IMMUNOLOGY RESEARCH》 *
刘艳娇: "食管基底细胞样鳞癌的基因芯片数据分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111118187A (zh) * 2020-02-25 2020-05-08 福建医科大学 一种检测食管鳞癌癌组织与癌旁组织差异菌群的引物组、试剂盒和检测方法

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