CN111893182A - 柠檬酸合成酶在制备诊断、评估前列腺癌的试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了柠檬酸合成酶在制备诊断、评估前列腺癌的试剂盒中的应用，本发明发现了柠檬酸合成酶可作为前列腺癌诊断标志物，柠檬酸合成酶或其特异性抗体可在制备诊断、评估前列腺癌的试剂盒中应用；本发明首次发现柠檬酸合成酶在前列腺癌中高表达，且柠檬酸合成酶表达增加与病理分期、生化复发显著相关，可作为预测患者术后生化复发风险的独立指标；通过一系列的体外实验和体内异种移植瘤实验，本发明进一步证明柠檬酸合成酶敲低后能够在体外抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，在体内可抑制肿瘤生长；这些发现表明CS在前列腺癌的发生发展中可能起着一个重要的调节作用，有望作为一个新的诊断和预后判断指标，具有重要的医用前景。

Description

柠檬酸合成酶在制备诊断、评估前列腺癌的试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于诊断领域，具体涉及柠檬酸合成酶在制备诊断、评估前列腺癌的试剂盒中的应用。
背景技术
前列腺癌是全世界超过一半的国家的男性中最常被诊断的癌症，也是全球46个国家男性癌症死亡的主要原因。根据美国最新的癌症统计，2019年美国将新增174650例前列腺癌患者，位居男性癌症发病率第一位，同时新增31620例前列腺癌死亡患者，位居男性癌症死亡率第二位。尽管由于对过度诊断和过度治疗的担忧，导致PSA筛查的减少，从而使前列腺癌发病率的逐年下降，但是其发病率的总体下降掩盖了晚期诊断的增加。同时，PSA筛查的减少和晚期诊断的增加也导致前列腺癌死亡率在逐年下降之后的稳定。事实上，我们目前仍然面临着如何可以在癌症早期将中高危、致死性前列腺癌检查出来，又能防止过度诊断和过度治疗的严峻挑战。
癌症代谢目前已成为一个非常热门的研究话题，它能够改善我们对肿瘤发生的机制理解。而前列腺癌从代谢角度来看是一种非常有意义的疾病模型。正常前列腺细胞积聚锌，抑制柠檬酸的氧化和三羧酸循环的代谢。尤其是前列腺外周区的上皮细胞，被编程产生柠檬酸并抑制柠檬酸的氧化。外周区上皮细胞的特殊性具有重要的临床意义因为正是在这个区域是前列腺癌的高发区。癌细胞能够主动氧化柠檬酸并恢复经典的三羧酸循环功能。前列腺正常细胞和癌细胞之间的代谢差异具备临床意义，因为它们具有潜在的治疗靶点。同时，了解良性前列腺与前列腺癌之间的代谢特征差异也能更好地帮助我们理解癌症的发展并开发出新的诊断途径。
在前列腺癌中，PC-3M细胞被证明通过乌头酸酶和脂肪酸合酶代谢细胞质中的柠檬酸以增强自身的转移行为，但关于列腺癌的进展仍需要开展更多的研究。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种可用于预测前列腺癌的发生发展和预后中的新的诊断标记物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：柠檬酸合成酶或其特异性抗体在制备诊断、评估前列腺癌的试剂盒中的应用。
柠檬酸合成酶(CS)几乎存在于所有活细胞中，并且在柠檬酸循环的第一步中作为限速酶存在；本发明首次发现柠檬酸合成酶在前列腺癌中高表达。
通过检测前列腺癌样本中柠檬酸合成酶的蛋白水平，将患者分为正常表达组和高表达组：若相对于正常人，柠檬酸合成酶的蛋白水平升高，则为高表达组，提示肿瘤恶性程度较高，预后较差，易出现术后生化复发或疾病进展；否则为正常表达组；从而实现对前列腺癌患者的预后进行判断并区分恶性程度。
作为本发明的优选实施方式，所述试剂盒通过检测待测样品的柠檬酸合成酶的蛋白水平从而进行前列腺癌的诊断、评估。
本发明还要求保护一种用于诊断或评估前列腺癌的检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测待测样品的柠檬酸合成酶的表达水平的试剂。
所述用于检测待测样品的柠檬酸合成酶的表达水平的试剂包括相关的qPCR引物及试剂、蛋白抗体等。
作为本发明的优选实施方式，所述试剂为特异性抗体。
更优选地，所述特异性抗体为免疫组化用抗体。
作为本发明的优选实施方式，所述待测样品为组织样品。
本发明首次发现了柠檬酸合成酶在前列腺癌中高表达，且柠檬酸合成酶表达增加与病理分期、生化复发显著相关，可作为预测患者术后生化复发风险的独立指标；通过一系列的体外实验和体内异种移植瘤实验，本发明首次证明柠檬酸合成酶敲后低能够在体外抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，同时柠檬酸合成酶的敲低后能够在体内抑制肿瘤生长；这些发现表明柠檬酸合成酶在前列腺癌的发生发展中可能起着一个重要的调节作用，有望作为一个新的诊断和预后判断指标，具有重要的医用前景。
附图说明
图1为人前列腺组织芯片中柠檬酸合成酶蛋白表达水平检测结果；A为前列腺正常组织，B为前列腺癌组织。
图2为柠檬酸合成酶表达情况与前列腺癌患者的生存曲线关系图；A为无生化复合生存率，B为总体生存率。
图3为PC3细胞株中的柠檬酸合成酶敲低效果；A为柠檬酸合成酶mRNA相对表达量；B为柠檬酸合成酶蛋白相对表达量。
图4为柠檬酸合成酶敲低后对细胞增殖的能力的影响结果。
图5为柠檬酸合成酶敲低后对细胞迁移能力的影响结果。
图6为柠檬酸合成酶敲低后对细胞侵袭能力的影响结果。
图7为柠檬酸合成酶敲低后对其成瘤能力的影响结果；A为成瘤重量，B为成瘤体积。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
以手术获取前列腺癌组织作石蜡切片为例，通过免疫组化实验对人前列腺癌组织芯片(PRTMA053，Creative Bioarray)中的柠檬酸合成酶表达水平进行检测；其具体步骤如下：
1.组织包埋，石蜡切片，56℃烘箱中烘烤0.5h-1h；
2.人工操作对烘烤后的切片进行脱蜡水化：二甲苯，6min；二甲苯-2，6min；酒精100％，6min；酒精100％，6min；酒精95％，6min；酒精95％-2，6min；；酒精70％，3min；H2O，3min；H2O，3min。
3.切片置于枸橼酸钠抗原修复液中进行抗原修复，微波炉中加热15min，室温下冷却1-2h。
4.切片置于双蒸水中并在摇床上洗3次，每次3min。
5.切片置于TBST中并在摇床上洗3次，每次6min。
6.切片置于3％H2O2中在摇床上室温孵育15-20min。
7.切片置于双蒸水中并在摇床上洗3次，每次3min。
8.切片置于TBST中并在摇床上洗3次，每次6min。
9.阻水笔把组织圈住，切片加入含Avidin、5％血清的TBST溶液，室温下摇床孵育封闭0.5h。
10.甩去溶液，每张切片分别加柠檬酸合成酶单克隆抗体(BM5202，Boster，1∶200，抗体稀释于混有Biotin、5％血清的TBST溶液)。
11.室温下孵育1h。
12.切片置于TBST中并在摇床上洗3次，每次6min。
13.甩掉溶液，每张切片分别加入羊抗兔二抗(1∶300)，室温下摇床孵育0.5h。
14.切片置于TBST中并在摇床上洗3次，每次6min。
15.甩掉溶液，加入ABC溶液，室温下摇床孵育0.5h。
16.切片置于TBST中并在摇床上洗3次，每次6min。
17.甩掉溶液，每张切片分别滴加刚配制的DAB，镜下观察到样品染色后将切片浸入双蒸水中止反应。
18.切片放入苏木素复染5-10s，温水冲洗干净，碳酸锂浸润再用温水冲洗干净。
19.人工操作复染后的切片进行脱水：酒精95％，浸6下；酒精100％，浸6下；二甲苯，浸10下；二甲苯，浸泡5min。
20.中性树脂封闭切片，于显微镜下观察柠檬酸合成酶蛋白染色情况。
组织芯片免疫组化染色结果如图1(图1A为前列腺正常组织；图1B为前列腺癌组织)。实验结果表明，前列腺癌组织中的柠檬酸合成酶蛋白表达水平高于良性前列腺组织中柠檬酸合成酶蛋白表达水平。
实施例2
使用来自癌症基因组图谱(TCGA)的包含498个前列腺癌的公共数据集(数据来源：https：//www.cancer.gov/tcga)，及其临床信息来分析柠檬酸合成酶的临床相关性和生化无复发生存分析。结果如表1。
表1在前列腺癌TCGA数据库中柠檬酸合成酶表达与临床病理特征的相关性
Figure BSA0000214691040000051
由表1的结果显示，TCGA数据集中，高格里森(Gleason)评分的前列腺癌组织中柠檬酸合成酶的表达水平相对于低高格里森评分的前列腺癌组织明显更高。此外，柠檬酸合成酶表达增加与病理分期(P＜0.001)和生化复发(P＜0.001)显著相关。
进一步地，采用生存分析方法分析柠檬酸合成酶表达水平与无生化复发生存率或总生存率之间的关系：以柠檬酸合成酶表达水平中位数为分界点，将前列腺癌患者分为柠檬酸合成酶高表达组和柠檬酸合成酶低表达组，并统计其生存率；结果如表2、图1。
图2结果显示，柠檬酸合成酶高表达组与柠檬酸合成酶低表达组的前列腺癌患者之间的无生化复发生存曲线差异有统计学意义(P＝0.006，图2A)。相反，两组之间的总体生存曲线无显著性差异(P＝0.288；图2B)。
表2 Cox比例风险模型分析柠檬酸合成酶表达对无生化复发评估的预后价值
Figure BSA0000214691040000061
由表2可得，单变量和多变量Cox比例风险模型也确认了柠檬酸合成酶表达增强与无生化复发生存率之间的显著相关性(单变量：P＝0.003；多变量：P＝0.019。)。
实施例3
通过包装shRNA编码质粒载体pLV.I(购于辉园苑医药科技有限公司，商品名shRNA抑制载体)，包含抗嘌呤霉素元件、抗氨苄青霉素元件和针对柠檬酸合成酶基因(NM_004077)的shRNA编码序列，利用慢病毒转染技术构建了PC3对照组(空载体)和柠檬酸合成酶敲低组(相应的shRNA编码序列为a：GCACAGAGGGTCTGATGAA；b：GGTCTCACAATTTCACCAA；c：CCTGGACTGGTCTCACAAT)的细胞株。
PC3细胞株的敲低效率鉴定结果如图3，图3A为柠檬酸合成酶的mRNA相对水平，图3B为柠檬酸合成酶的相对蛋白表达量。可见shRNA-a和shRNA-c能够显著地降低PC3细胞的表达水平。
选取敲低效率最高的PC3细胞株(CS-sh)，进一步通过细胞增殖实验、细胞迁移和侵袭实验，探究柠檬酸合成酶对前列腺癌细胞生物学功能的影响。
①细胞增殖实验：
主要通过使用CCK-8试剂(MA0218-5000，Meilunbio)，检测细胞的增殖速率的改变，实验选择指数期生长的细胞消化重悬，细胞计数，铺板96孔板，每孔细胞2000个，每小组五个复孔，一共五个时间点(4h、24h、48h、72h、96h)，培养4h-96h后，给每个小组换液，加入配置后的CCK-8稀释液(90％培养基+10％CCK-8)，每个孔100μL，在37℃下孵育2h，在酶标仪450nm波长下检测光密度值(Optical Density，OD)，设立空白对照组(CCK-8稀释液)，以空白对照组的OD值为基准值，比较处理组(CS-sh)和对照组(正常PC3细胞株)之间细胞数量的差异。
实验结果如图4：结果显示，柠檬酸合成酶表达水平敲低的PC3细胞中，细胞增殖的能力相比较对照组细胞明显减弱。
②细胞迁移实验：
主要通过在细胞中划痕，观察细胞的迁移能力的改变，实验第一天选择指数期生长的细胞消化重悬，铺板6孔板，每孔细胞5×105个，第二天细胞汇聚度达到90％，加入无血清培养基饥饿培养24h，用200μL无菌微量吸管在细胞上划痕，每孔3条，确保每条划痕的宽度和笔直度，每12小时在显微镜下观察划痕的愈合程度，保存图像，使用Image J软件进行愈合面积计算，按照愈合比例比较处理组和对照组之间细胞迁移能力的差异。
实验结果如图5：结果显示，相对于对照组细胞，柠檬酸合成酶表达水平敲低的PC3细胞的细胞迁移能力明显减弱。
③细胞侵袭实验：
主要通过Transwell Matrigel胶小室(3422，Corning)，观察细胞的侵袭能力的改变，实验第一天使用Marigel胶铺在24孔板的Transwell小室上，每个小室100μL，选择指数期生长的细胞，加入无血清培养基饥饿培养24h，消化细胞，加入无血清培养基重悬细胞至5×105个细胞/mL，取100μL加入小室上，在小室下加入500μL正常培养基，培养24-48h后，去除小室上的培养基和Marigel胶，将小室置入4％多聚甲醛中，室温下固定细胞1h，去除多聚甲醛，加入0.1％结晶紫稀释液，染色30min，显微镜拍照存图，计算细胞侵袭数目，比较处理组和对照组之间细胞侵袭能力的差异。
实验结果如图6：结果显示，柠檬酸合成酶表达水平敲低的PC3细胞的侵袭能力明显比对照组的侵袭能力变差。
实施例4
利用前面构建的PC3细胞株，通过裸鼠荷瘤实验验证柠檬酸合成酶对体内肿瘤生长的影响。首先选择指数期生长的细胞，消化细胞，与Marigel胶(354234，BD Biosciences)混匀，最终细胞浓度为5×106个细胞/100μL，选取4-6周龄的雄性裸鼠，在双侧腋窝处分别接种对照组和处理组的细胞Marigel胶混悬液，左侧为对照组，右侧为处理组，每三天测量一次小鼠重量和肿瘤体积，待肿瘤生长到合适大小或者裸鼠体重明显下降时，使用CO2窒息处死裸鼠，解剖取下肿瘤组织并称重记录，比较处理组和对照组之间裸鼠移植瘤体积和重量的差异。
实验结果如图7；结果显示，柠檬酸合成酶表达水平敲低的PC3细胞皮下移植瘤的重量比对照组的重量轻，同时柠檬酸合成酶敲低组细胞的裸鼠皮下移植瘤生长速率明显慢于对照组。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.柠檬酸合成酶或其特异性抗体在制备诊断、评估前列腺癌的试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测待测样品的柠檬酸合成酶的蛋白水平。
3.一种用于诊断或评估前列腺癌的检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测待测样品的柠檬酸合成酶的表达水平的试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为柠檬酸合成酶特异性抗体。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性抗体为免疫组化用抗体。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为组织样品。
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