CN111257561A - 一种预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒 - Google Patents

一种预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒 Download PDF

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钟惟德
何慧婵
董卫民
梁宇翔
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Abstract

本发明提供一种预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒，包括与DCTPP1结合的一抗，生物素标记的二抗，链霉菌抗生物素蛋白‑过氧化物酶，显色试剂，磷酸缓冲盐溶液。本发明研究了DCTPP1的表达水平跟前列腺侵袭转移能力和前列腺癌患者术后PSA生化复发、总体生存期和Gleason评分(GS)的关系，发现DCTPP1能作为前列腺癌患者疾病诊疗的新的参考指标，并且采用本发明试剂盒的检测方法操作简单、快速，检测灵敏度和特异性高，可达到对选定临床样本进行定性及半定量检测，无需其他特殊仪器，临床样本保存时间长，一般医院实验室或者病理室都可以完成。该试剂盒有望成为前列腺癌术后疾病诊断的新技术。

Description

一种预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒。
背景技术
前列腺癌(PCa)是北美地区中男性恶性肿瘤发病率最高的，其死亡率仅次于肺癌。我国前列腺癌发病率近年来呈明显上升趋势，在男性泌尿生殖系统肿瘤中位居第二位，仅次于膀胱肿瘤。临床治疗前列腺癌的常见手段有手术、化疗、放疗、内分泌疗法等，但仍有许多前列腺癌患者最终都死于前列腺的进展(生化复发、术后肿瘤转移)，因此临床医生迫切需要寻找更好的临床预后标记物来筛出需要进一步干预治疗的患者，并依此制定出更合适的治疗方案。
DCTPP1(dCTP pyrophosphatase 1)是一种属于all-αNTP-Ppase家族的核苷三磷酸焦磷酸酶。它能分解核苷三磷酸为DNA、RNA提供合成原料，也能清除细胞内的异常核苷酸，在细胞新陈代谢中不可或缺。它在子宫颈癌、结肠癌、肝癌、肺癌、结肠癌、食管癌和乳腺癌中均有研究表明会导致肿瘤的恶性进展和不良预后，可作为肿瘤的进展及预后的预测因子之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒，本发明提供了DCTPP1在制备预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂或试剂盒中的用途。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒，包括与DCTPP1结合的一抗，生物素标记的二抗，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，显色试剂，磷酸缓冲盐溶液。
优选地，所述一抗为兔源抗DCTPP1多克隆抗体。
优选地，所述显色试剂为DAB。
优选地，所述试剂盒还包括内源性过氧化物酶阻断剂。
优选地，所述试剂盒还包括动物非免疫血清。
本发明提供了DCTPP1在制备预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂或试剂盒中的用途。
本发明提供了检测DCTPP1的试剂在制备预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒中的用途。
本发明中的辅助诊断预后是指辅助诊断前列腺癌预后。
本发明试剂盒使用方法如下：
1)将临床组织从液氮中取出，将该组织装入包埋盒中保存；
2)用自来水连续冲洗5小时；
3)放入leica自动脱水机中进行组织脱水；
4)进行石蜡包埋组织；
5)将包埋好的石蜡组织块进行连续切片，厚度约为4μm；
6)将切好的片子在60℃的恒温烤箱中放置约2个小时；
7)放入leica自动脱蜡机中进行组织切片脱蜡(包括二甲苯和梯度酒精脱蜡)
8)蒸馏水冲洗一下，将切片置于枸橼酸抗原修复液中(注意过程中液体量足够以免微波炉加热时烧干)进行抗原修复，微波炉加热3min,拿出来凉一下，再加热1min，再拿出来室温冷却一下，再加热1min，冷却至室温；
9)用阻水笔把切片组织圈住，用PBS浸泡；
10)每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液，以便灭活组织内源性过氧化物酶，室温孵育15分钟；
11)PBS冲洗或浸泡3×3min；
12)甩去PBS液，每张组织切片加50ul的非免疫性动物血清封闭非特异性结合，室温下孵育10-15分钟；
13)甩干血清，每张切片加200ul PBS稀释好的第一抗体(兔源抗DCTPP1多克隆抗体1ul：PBS缓冲液200ul)；
14)置于孵育盒内，4℃恒温下过夜；
15)第二天将过夜的切片进行室温下复温约30min；
16)PBS冲洗或浸泡3×10min；
17)甩去PBS液，每张切片加50ul生物素标记第二抗体，室温下孵育30min；
18)PBS冲洗或浸泡3×10min；
19)甩去PBS液，每张切片加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15min；
20)PBS冲洗或浸泡3×3min；
21)甩去PBS液，每张切片加100ul新鲜配制的二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色液，显微镜下观察，看到黄染之后立即将切片浸入蒸馏水中中止染色；
22)将切片放入leica自动病理机上进行苏木素复染及封片(乙醇、二甲苯)；
23)晾干后放置leica光镜下观察；
24)免疫组织化学检测结果判断结果判定：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞浆和(或)细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分。针对DCTPP1评分采用定量的方法，即两者评分相加作为最后的染色评分结果，范围0～7分。
本发明的有益效果在于：本发明研究了DCTPP1的表达水平跟前列腺侵袭转移能力和前列腺癌患者术后PSA生化复发、总体生存期和Gleason评分(GS)具有正相关，发现DCTPP1能作为前列腺癌患者疾病诊治的新的参考指标，并且采用本发明试剂盒的检测方法操作简单、快速，检测灵敏度和特异性高，可达到对选定临床样本进行定性及半定量检测，无需其他特殊仪器，临床样本保存时间长，一般医院实验室或者病理室都可以完成。该试剂盒有望成为前列腺癌术后疾病诊断的新技术。
具体实施方式
以下通过前列腺癌患者临床芯片样本进行DCTPP1的多克隆抗体染色试验，并结合临床样本数据来进一步证明本发明对预测前列腺癌侵袭转移能力和术后PSA生化复发、总体生存率和Gleason评分(GS)的有利效果，证明本发明能有效预测前列腺癌患者的疾病侵袭转移能力及辅助诊断预后。
实验步骤：
1)将临床组织从液氮中取出，将该组织装入包埋盒中保存；
2)用自来水连续冲洗5小时；
3)放入leica自动脱水机中进行组织脱水；
4)进行石蜡包埋组织；
5)将包埋好的石蜡组织块进行连续切片，厚度约为4μm；
6)将切好的片子在60℃的恒温烤箱中放置约2个小时；
7)放入leica自动脱蜡机中进行组织切片脱蜡(包括二甲苯和梯度酒精脱蜡)
8)蒸馏水冲洗一下，将切片置于枸橼酸抗原修复液中(注意过程中液体量足够以免微波炉加热时烧干)进行抗原修复，微波炉加热3min,拿出来凉一下，再加热1min，再拿出来室温冷却一下，再加热1min，冷却至室温；
9)用阻水笔把切片组织圈住，用PBS浸泡；
10)每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液，以便灭活组织内源性过氧化物酶，室温孵育15分钟；
11)PBS冲洗或浸泡3×3min；
12)甩去PBS液，每张组织切片加50ul的非免疫性动物血清封闭非特异性结合，室温下孵育10-15分钟；
13)甩干血清，每张切片加200ul PBS稀释好的第一抗体(兔源抗DCTPP1多克隆抗体1ul：PBS缓冲液200ul)；
14)置于孵育盒内，4℃恒温下过夜；
15)第二天将过夜的切片进行室温下复温约30min；
16)PBS冲洗或浸泡3×10min；
17)甩去PBS液，每张切片加50ul生物素标记第二抗体，室温下孵育30min；
18)PBS冲洗或浸泡3×10min；
19)甩去PBS液，每张切片加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15min；
20)PBS冲洗或浸泡3×3min；
21)甩去PBS液，每张切片加100ul新鲜配制的二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色液，显微镜下观察，看到黄染之后立即将切片浸入蒸馏水中中止染色；
22)将切片放入leica自动病理机上进行苏木素复染及封片(乙醇、二甲苯)；
23)晾干，放置leica光镜下观察；
24)免疫组织化学检测结果判断结果判定：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞浆和(或)细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分。针对DCTPP1评分采用定量的方法，即两者评分相加作为最后的染色评分结果，范围0～7分。
我们的细胞实验和动物实验结果显示，DCTPP1高表达与前列腺癌高侵袭转移能力有关，而在患者临床数据中DCTPP1高表达组中发生转移的机率更高(所有P值均<0.05)。此外在70例接受前列腺癌根治术的患者的标本制成的组织芯片的DCTPP1免疫评分上，DCTPP1的蛋白主要在前列腺癌细胞的细胞浆和细胞核中着色，并且与患者的GS评分相关。结合前列腺癌数据库(TCGA Dataset)分析，前列腺癌组织标本的DCTPP1免疫评分低表达与患者高GS评分、总体生存率和生化复发生存期相关(所有P值均<0.05)。
将全部患者中DCTPP1免疫评分分数根据中位数平均分为两组，分别设定为高表达组和低表达组，Kaplan–Meier和Log rank方法分析结果显示DCTPP1的低表达与患者总体生存率和无生化复发生存率有关(P<0.001)。
上述临床验证的结果进一步表明：该试剂和试剂盒可以显示作为判断前列腺癌侵袭转移能力及预后的分子标记物DCTPP1的表达水平。运用本发明提供的试剂盒，检测人体前列腺组织DCTPP1的表达水平，根据其表达水平可以方便快捷地为临床前列腺癌患者的肿瘤的转移侵袭能力和辅助诊断预后程度判断提供一个新的参考指标，并对疾病治疗选择提供帮助。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒，其特征在于，包括与DCTPP1结合的一抗，生物素标记的二抗，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，显色试剂，磷酸缓冲盐溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述一抗为兔源抗DCTPP1多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色试剂为DAB。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内源性过氧化物酶阻断剂。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括动物非免疫血清。
6.DCTPP1在制备预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂或试剂盒中的用途。
7.检测DCTPP1的试剂在制备预测前列腺癌侵袭转移能力或辅助诊断预后的试剂盒中的用途。
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