CN113504370B - Mapk15蛋白在前列腺癌的恶性程度或预后程度预测中的应用 - Google Patents
Mapk15蛋白在前列腺癌的恶性程度或预后程度预测中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及前列腺癌检测技术领域，尤其涉及MAPK15蛋白在前列腺癌的恶性程度或预后程度预测中的应用。本发明公开了检测MAPK15蛋白的分子在制备用于前列腺癌的恶性程度或预后程度预测的试剂盒或检测试剂中的用途。本发明还公开了一种用于前列腺癌的恶性程度或预后程度预测的试剂盒，所述试剂盒包含：内源性过氧化物酶阻断剂、动物非免疫血清、一抗、生物素标记的二抗、链霉菌抗生物素蛋白‑过氧化物酶、DAB显色剂和磷酸缓冲盐溶液。本发明采用MAPK15作为检测前列腺癌术后PSA生化复发、肿瘤转移和Gleason评分(GS)的标志物，为预测前列腺癌进展提供一种切实可行的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及前列腺癌检测技术领域，尤其涉及MAPK15蛋白在前列腺癌的恶性程度或预后程度预测中的应用。
背景技术
在北美地区男性恶性肿瘤中，前列腺癌(PCa)仍然是发病率最高的肿瘤，死亡率仅次于肺癌。而我国男性前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，跃居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第二位，仅次于膀胱肿瘤。虽然目前临床上治疗前列腺癌有激素、手术、放射等有效的治疗方法，但是，仍有许多前列腺癌患者在1～2年内由于前列腺癌的进展(生化复发、术后肿瘤转移)而导致死亡，因此，临床医生迫切需要寻找更好的临床预后标记物，以标记物为基础筛出需要进一步干预治疗的患者，并依此制定出更合适的个体治疗方案。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种MAPK15蛋白在前列腺癌的恶性程度或预后程度预测中的应用。本发明发现MAPK15蛋白可作为前列腺癌恶性程度进展的分子标志物，通过检测该分子标志物能准确判断前列腺癌进展，进而使得医师制定有效的治疗方案。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种检测MAPK15蛋白的分子在制备用于前列腺癌的恶性程度或预后程度预测的试剂盒或检测试剂中的用途。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述试剂盒或检测试剂用于手术切除组织样品或穿刺活检组织样品的检测。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述检测MAPK15蛋白的分子是指能够特异性检测MAPK15蛋白是否表达的分子。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述能够特异性检测MAPK15蛋白是否表达的分子为核酸或蛋白质。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述蛋白质为抗体。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述抗体为兔源抗MAPK15多克隆抗体。
本发明还提供一种用于前列腺癌的恶性程度或预后程度预测的试剂盒，所述试剂盒包括检测MAPK15蛋白的分子。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒包含：内源性过氧化物酶阻断剂、动物非免疫血清、一抗、生物素标记的二抗、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶、DAB显色剂和磷酸缓冲盐溶液。优选地，一抗的稀释倍数为1：1000；二抗的稀释倍数为1：300。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述一抗为兔源抗MAPK15多克隆抗体。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述磷酸缓冲盐溶液为1×PBS缓冲液，浓度为0.01M。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述内源性过氧化物酶阻断剂为质量浓度为3％的过氧化氢溶液。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述动物非免疫血清的质量浓度为5％。
本发明的有益效果：
本发明采用MAPK15蛋白作为检测前列腺癌术后PSA生化复发、肿瘤转移和Gleason评分(GS)的标志物，为预测前列腺癌进展提供一种切实可行的检测方法；本发明的检测试剂盒效果明显，简单实用，特异性强。
附图说明
图1为MAPK15的表达量与患者总体无生化复发生存率的关系图。
具体实施方式
为了准确地帮助临床医生对前列腺癌疾病进行诊疗，本发明提供了一种对前列腺癌进展预测的新技术，具体涉及一种用于前列腺癌进展的检测试剂/试剂盒。本发明优点主要在于：第一次阐述了MAPK15的表达水平跟前列腺癌患者术后PSA生化复发、肿瘤转移和Gleason评分(GS)存在关系，能为前列腺癌患者的疾病诊治提供可靠的方法，并且操作简单、快速，无需其他特殊仪器，可应用于一般医院实验室或者病理室，有望成为前列腺癌疾病诊断的新技术。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于前列腺癌进展的检测试剂盒，其可用于前列腺癌PSA生化复发、肿瘤转移和Gleason评分(GS)诊断检测MAPK15的检测，该试剂盒包括：内源性过氧化物酶阻断剂50ul；动物非免疫血清50ul；一抗为兔源抗MAPK15多克隆抗体1ul；生物素标记的二抗50ul；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶50ul；DAB显色试剂100ul；磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)1000ul。采用上述试剂盒可以检测肿瘤组织MAPK15的表达水平从而诊断前列腺癌患者术后PSA生化复发、肿瘤转移和Gleason评分(GS)的可能性，从而区分临床前列腺癌患者的不同疾病进展及预后诊断。
在一些实施例中，本发明提供一种能检测MAPK15在前列腺癌临床样本中的表达状态而预测前列腺癌进展的检测试剂盒，其试剂组成如下：
内源性过氧化物酶阻断剂(3％过氧化氢溶液，购自贝博生物公司)50ul；动物非免疫血清(5％，购自贝博公司)50ul；一抗为兔源抗MAPK15多克隆抗体1ul，稀释比为1：300；生物素标记的二抗50ul，稀释比为1：300；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶50ul；DAB显色试剂100ul；磷酸缓冲盐溶液(1×PBS缓冲液，0.01M)1000ul。本发明的试剂盒操作简单、快速，检测灵敏度和特异性高，可实现对选定临床样本进行定性及半定量检测，无需其他特殊仪器，临床样本保存时间长，一般医院实验室或者病理室都可以完成；该试剂盒有望成为前列腺癌术后疾病诊断的新技术。
术语定义：
在本发明中，所述MAPK15蛋白也称为丝裂原活化蛋白激酶15(mitogen-activatedprotein kinase 15)，其GenBank号为NC_000008.11。MAPK15蛋白作为MAPK蛋白家族的一份子，其能接受细胞外刺激信号，并能通过磷酸化激活下游信号分子，将细胞外的信号传导到细胞内，影响细胞发生发展和增殖。在胃癌、乳腺癌、白血病中均有研究表明会影响肿瘤的恶性进展和不良预后，可作为肿瘤的进展及预后的预测因子之一。
在本发明中，所述前列腺癌的恶性程度可通过组织学分级进行评估，最常用的是Gleason评分系统，Gleason分级最早是由病理学家Gleason教授于1974年提出的。根据前列腺癌的腺体细胞分化程度的不同，可分为1-5级，并将区域最大这一级别的癌腺泡定为最常见生长型，其次为次常见生长型，二者分值相加即为Gleason评分。依据前列腺癌组织中主要结构区和次要结构区的评分之和将前列腺癌的恶性程度划分为2～10分，分化最好的是1+1＝2分，最差的是5+5＝10分。Gleason分级是一种被广泛采用的前列腺癌组织学分级的方法。由于Gleason分级与生物学行为和预后关联良好，逐渐得到承认，使用日渐广泛，成为制定前列腺癌治疗方案的重要参考指标。20世纪90年代以来，美国癌症综合网推荐的前列腺癌治疗指南中，Gleason分级、前列腺特异性抗原(PSA)水平和肿瘤分期是决定治疗方案的最重要的指标。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中试剂浓度均为质量浓度。如无特别说明，本发明中的试剂或材料均可从市场或其它公开渠道获得。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。
实施例1
本发明的用于检测前列腺癌进展的试剂盒的一种实施例，其组成如下：
内源性过氧化物酶阻断剂(3％过氧化氢溶液，购自贝博生物公司)50ul；动物非免疫血清(5％，购自贝博公司)50ul；一抗为兔源抗MAPK15多克隆抗体(购自美国abcam公司)1ul；生物素标记的二抗50ul；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶50ul；DAB显色试剂100ul；磷酸缓冲盐溶液(1×PBS缓冲液，0.01M)1000ul。
实施例2
本实施例通过前列腺癌患者临床芯片样本进行MAPK15的多克隆抗体染色试验，并结合临床样本数据来进一步证明实施例1的试剂盒对预测前列腺癌术后PSA生化复发、肿瘤转移和Gleason评分(GS)的有利效果，证明本发明试剂盒能有效预测前列腺癌患者的疾病进展。
实施例1的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
1)将临床组织从液氮中取出，将该组织装入包埋盒中保存；
2)用自来水连续冲洗组织5小时；
3)放入leica自动脱水机中进行组织脱水；
4)进行石蜡包埋组织；
5)将包埋好的石蜡组织块进行连续切片，厚度约为4μm；
6)将切好的片子在60℃的恒温烤箱中放置约2个小时；
7)放入leica自动脱蜡机中进行组织切片脱蜡(包括二甲苯和梯度酒精脱蜡)；
8)蒸馏水冲洗一下，将切片置于枸橼酸抗原修复液中(注意过程中液体量足够以免微波炉加热时烧干)进行抗原修复，微波炉加热3min，拿出来凉一下，再加热1min，再拿出来室温冷却一下，再加热1min，冷却至室温；
9)用阻水笔把切片组织圈住，用PBS浸泡；
10)每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液，以便灭活组织内源性过氧化物酶，室温孵育15分钟；
11)PBS冲洗或浸泡3×3min；
12)甩去PBS液，每张组织切片加50ul的非免疫性动物血清封闭非特异性结合，室温下孵育10-15分钟；
13)甩干血清，每张切片加200ul PBS稀释好的第一抗体(兔源抗MAPK15多克隆抗体1ul：PBS缓冲液300ul)；
14)置于孵育盒内，4℃恒温下过夜；
15)第二天将过夜的切片进行室温下复温约30min；
16)PBS冲洗或浸泡3×10min；
17)甩去PBS液，每张切片加50ul生物素标记第二抗体，室温下孵育30min；
18)PBS冲洗或浸泡3×10min；
19)甩去PBS液，每张切片加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15min；
20)PBS冲洗或浸泡3×3min；
21)甩去PBS液，每张切片加100ul新鲜配制的二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色液，显微镜下观察，看到黄染之后立即将切片浸入蒸馏水中中止染色；
22)将切片放入leica自动病理机上进行苏木素复染及封片(乙醇、二甲苯)；
23)晾干，放置leica光镜下观察；
24)免疫组织化学检测结果判定：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞浆和(或)细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，＞50％为3分。针对MAPK15评分采用定量的方法，即两者评分相加作为最后的染色评分结果，范围0～6分。
结果如表1所示，在64例接受前列腺癌根治术的患者的标本制成的组织芯片的MAPK15免疫评分上，MAPK15的蛋白主要在前列腺癌细胞的细胞浆中着色，并且MAPK15的高表达与患者的高GS评分相关(P＝0.038)。同时，结合前列腺癌数据库(TCGA Dataset)分析，前列腺癌组织标本的MAPK15的mRNA高表达与患者高GS评分(P＝0.014)、肿瘤转移(P＝0.001)、病理分期(P＝0.004)、肿瘤切缘阳性(P＝0.019)和PSA生化复发(P＝0.004)相关(参见表1)。
表1 MAPK15的表达量与前列腺癌患者临床指标的相关性
注：“-”代表缺乏相应的数据。
实施例3
根据TCGA数据库，将实施例2中全部患者中MAPK15的mRNA根据中位数平均分为两组，分别设定为高表达组和低表达组，Kaplan–Meier和Log rank方法分析结果(参见图1)，显示MAPK15的高表达与患者总体无生化复发生存率有关(P＝0.0006)。
上述临床验证的结果进一步表明：实施例1的试剂盒可以显示作为判断前列腺癌进展及预后的分子标记物MAPK15的表达水平。运用本发明提供的试剂盒，检测人体前列腺组织MAPK15的表达水平，根据其表达水平可以方便快捷地为临床前列腺癌患者的肿瘤的恶性进展和预后程度判断提供帮助，并对疾病治疗选择提供帮助。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.检测MAPK15蛋白的抗体在制备用于预测前列腺癌术后生化复发情况的试剂盒或检测试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒或检测试剂用于手术切除组织样品或穿刺活检组织样品的检测。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗体为兔源抗MAPK15多克隆抗体。
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