CN107085106B - 用于前列腺癌进展预后的检测试剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于前列腺癌进展预后的检测试剂及试剂盒。按照每张临床样本组织切片的剂量，本发明所述的检测试剂包括：内源性过氧化物酶阻断剂50ul；动物非免疫血清50ul；一抗为兔源抗TCF12多克隆抗体1ul；生物素标记的二抗50ul；链霉菌抗生物素蛋白‑过氧化物酶50ul；DAB显色试剂100ul；磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)200ul。本发明所述的检测试剂及检测试剂盒能通过检测TCF12在前列腺癌临床样本中的表达状态而预测前列腺癌进展，可以区分临床前列腺癌患者的不同疾病进展及预后，可用于前列腺癌生化复发、肿瘤转移等预后诊断。

Description

用于前列腺癌进展预后的检测试剂及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及的是一种用于前列腺癌进展预后的检测试剂以及相关试剂盒。
背景技术
北美地区男性恶性肿瘤中，前列腺癌(PCa)依旧是发病率最高的肿瘤，死亡率仅次于肺癌。而我国男性前列腺癌发病率呈明显上升趋势，在男性泌尿生殖系统位居第二位，仅次于膀胱肿瘤。临床治疗前列腺癌有激素、手术、放射等有效治疗方法，但是，仍有许多前列腺癌患者最终都由于前列腺的进展(生化复发、肿瘤转移)而死亡，因此临床医生迫切需要寻找更好的临床进展预后标记物来筛出需要进一步干预治疗的患者，并依此制定出更合适的治疗方案。
转录因子12(Transcription factor 12，TCF12)是helix-loop-helix蛋白家族的一份子，其功能多样化，能在多种组织中表达。能形成二聚体和异二聚体，影响细胞发生发展和分化。在胆管癌、乳腺癌、直肠癌中均有研究表明会影响肿瘤的恶性进展和不良预后，可作为肿瘤的进展及预后的预测因子之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于前列腺癌进展预后的检测试剂，它能通过检测TCF12在前列腺癌临床样本中的表达状态而预测前列腺癌进展，可以区分临床前列腺癌患者的不同疾病进展及预后。
本发明所述的用于前列腺癌进展预后的检测试剂，按照每张临床样本组织切片的剂量，所述检测试剂包括：内源性过氧化物酶阻断剂50ul；动物非免疫血清50ul；一抗为兔源抗TCF12多克隆抗体1ul；生物素标记的二抗50ul；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶50ul；DAB显色试剂100ul；磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)200ul。
本发明的另一目的在于提供前列腺癌进展预后的检测试剂盒，可用于前列腺癌生化复发、肿瘤转移等预后诊断。
本发明所述的用于前列腺癌进展预后的检测试剂盒，包括本发明所述的检测试剂。
本发明所述的用于前列腺癌进展预后的检测试剂及试剂盒具有以下优点：第一次阐述TCF12的表达水平跟前列腺癌患者术后PSA生化复发、肿瘤转移和Gleason(GS)评分存在关系，能为前列腺癌患者的疾病诊治提供了可靠的方法，并且操作简单、快速，无需其他特殊仪器，可应用于一般医院实验室或者病理室，有望成为前列腺癌疾病诊断的新技术。
具体实施方式
以下通过前列腺癌患者临床芯片样本进行TCF12的多克隆抗体染色试验，并结合临床样本数据来进一步证明本发明对预测前列腺癌术后PSA生化复发、肿瘤转移和Gleason评分(GS)的有利效果，证明本发明能有效预测前列腺癌患者的疾病进展。
实验步骤：
1)将临床组织从液氮中取出，将该组织装入包埋盒中保存；
2)用自来水连续冲洗5小时；
3)放入leica自动脱水机中进行组织脱水；
4)进行石蜡包埋组织；
5)将包埋好的石蜡组织块进行连续切片，厚度约为4μm；
6)将切好的片子在60℃的恒温烤箱中放置约2个小时；
7)放入leica自动脱蜡机中进行组织切片脱蜡(包括二甲苯和梯度酒精脱蜡)；
8)蒸馏水冲洗一下，将切片置于枸橼酸抗原修复液中(注意过程中液体量足够以免微波炉加热时烧干)进行抗原修复，微波炉加热3min，拿出来凉一下，再加热1min，再拿出来室温冷却一下，再加热1min，冷却至室温；
9)用阻水笔把切片组织圈住，用PBS浸泡；
10)每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液，以便灭活组织内源性过氧化物酶，室温孵育15分钟；
11)PBS冲洗或浸泡3×3min；
12)甩去PBS液，每张组织切片加50ul的非免疫性动物血清封闭非特异性结合，室温下孵育10-15分钟；
13)甩干血清，每张切片加200ul PBS稀释好的第一抗体(兔源抗TCF12多克隆抗体1ul：PBS缓冲液200ul)；
14)置于孵育盒内，4℃恒温下过夜；
15)第二天将过夜的切片进行室温下复温约30min；
16)PBS冲洗或浸泡3×10min；
17)甩去PBS液，每张切片加50ul生物素标记第二抗体，室温下孵育30min；
18)PBS冲洗或浸泡3×10min；
19)甩去PBS液，每张切片加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育15min；
20)PBS冲洗或浸泡3×3min；
21)甩去PBS液，每张切片加100ul新鲜配制的二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色液，显微镜下观察，看到黄染之后立即将切片浸入蒸馏水中中止染色；
22)将切片放入leica自动病理机上进行苏木素复染及封片(乙醇、二甲苯)；
23)晾干，放置leica光镜下观察；
24)免疫组织化学检测结果判断。
结果判定：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞浆和(或)细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。
先按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分。
针对TCF12评分采用定量的方法，即两者评分相加作为最后的染色评分结果，范围0～7分。
结果显示，在50例接受前列腺癌根治术的患者的标本制成的组织芯片的TCF12免疫评分上，TCF12的蛋白主要在前列腺癌细胞的细胞浆和细胞核中着色，并且与患者的GS评分相关。结合前列腺癌数据库(Taylor Dataset)分析，前列腺癌组织标本的TCF12免疫评分低表达与患者高GS评分、肿瘤转移和PSA生化和不良生化复发生存期相关(所有P值均<0.05)。
将全部患者中TCF12免疫评分分数根据中位数平均分为两组，分别设定为高表达组和低表达组，Kaplan–Meier和Log rank方法分析结果显示TCF12的低表达与患者总体无生化复发生存率有关(P＝0.004)。COX回归模型单因素分析方法分析结果提示，TCF12低表达(P＝0.006)、Gleason高评分(P<0.001)和肿瘤病理高分期(P＝0.0001)可作为预测因子评估前列腺癌患者术后无生化复发生存率；此外，COX回归模型多因素分析结果显示，TCF12低表达(P＝0.046)、Gleason高评分(P<0.001)和肿瘤病理高分期(P＝0.012)同时也是患者术后无生化复发生存率的预测因子，其他指标在模型中均不能成为独立的预后因子。
上述临床验证的结果进一步表明：该试剂和试剂盒可以显示作为判断前列腺癌进展及预后的分子标记物TCF12的表达水平。运用本发明提供的试剂盒，检测人体前列腺组织TCF12的表达水平，根据其表达水平可以方便快捷地为临床前列腺癌患者的肿瘤的恶性进展和预后程度判断提供帮助，并对疾病治疗选择提供帮助。

Claims (2)

1.TCF12作为预测因子在制备用于前列腺癌进展预后的检测试剂或检测试剂盒中的用途，其特征在于，TCF12在前列腺癌组织标本中低表达是患者术后无生化复发生存率的预测因子。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，按照每张临床标本组织切片的剂量，所述检测试剂包括：内源性过氧化物酶阻断剂50ul；动物非免疫血清50ul；一抗为兔源抗TCF12多克隆抗体1ul；生物素标记的二抗50ul；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶 50ul；DAB显色试剂100ul；磷酸缓冲盐溶液200ul。
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