CN108398556A - 用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒 - Google Patents

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刘超群
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Abstract

本发明涉及一种用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒。本发明所述的用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体是选自对于以下蛋白分子标记物的抗体组合：CD68(细胞分化抗原68)，PD‑L1(程序性死亡配体1)。本发明所述的试剂盒采用双抗体结合指标，可以更加精确地反映组织中PD‑L1的表达模式，从而更好地评估患者的预后，帮助医生选择合适的治疗人群和方式，从而为有效诊治提供更加有力的支持。

Description

用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒，具体涉及一种用于检测肝癌组织中PD-L1分子表达模式的双抗体联合荧光检测试剂盒。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(以下简称为肝癌)是我国最常见和预后最差的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的前列。目前治疗肝癌最有效的方法仍是手术切除和肝移植；然而多数患者在确诊时已处于中晚期，不具备手术的指征和条件，加上术后的高复发率，导致肝癌的总体五年生存率仍处于较低水平。近年来的大量临床试验证明，阻断PD-L1/PD-1共抑制信号通路的免疫治疗方法能延长部分晚期肿瘤(包括肝癌)患者的生存，并显示出持久的疗效。同时，新近的临床研究还发现，当肿瘤中存在肿瘤细胞表达PD-L1时，患者能够对治疗具有更好的应答。值得注意的是也有临床研究显示肿瘤中的免疫细胞PD-L1表达时，患者对治疗的响应率更高。然而，目前临床上对PD-L1表达评估方法采用传统免疫组化染色，难以区分肿瘤细胞和免疫细胞的表达情况，因此用于疗效判断的能力有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测肝癌组织中PD-L1分子表达模式的双抗体联合荧光检测试剂盒，它采用双抗体结合指标，可以更加精确地反映组织中PD-L1的表达模式，从而更好地评估患者的预后，帮助医生选择合适的治疗人群和方式，从而为有效诊治提供更加有力的支持。
本发明所述的用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体包括用于检测以下两个蛋白分子标记物的抗体：CD68(细胞分化抗原68)，PD-L1(程序性死亡配体1)；还包括TSA(酪胺信号放大试剂)。
根据本发明所述的双抗体联合荧光检测试剂盒的进一步特征，所述第二抗体是辣根过氧化物酶标记的第二抗体。
通过本发明所述的用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒，能综合分析上述两种第一抗体所特异性标记的抗原在肝癌标本中的表达水平，达到评估组织中PD-L1的表达模式和水平的目的。
本发明所述的用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒的检测原理是：
首先，利用基于免疫组织化学技术的酪胺信号放大技术检测PD-L1和CD68两种分子标记物在肝癌切除术患者石蜡切片肿瘤区域中的表达情况。
然后，利用专业图像分析软件分析PD-L1在肝癌癌巢组织中的表达模式：分别采用PD-L1与CD68分子双阳性信号占CD68分子的单阳性信号的比例大于等于5％为巨噬细胞PD-L1阳性的阈值；PD-L1阳性与CD68阴性占总体PD-L1表达的比例大于等于5％为肿瘤细胞PD-L1阳性的阈值。并以此阈值对样本进行“阳性”与“阴性”的分组。
最后，在453例接受原发性肝癌切除术患者中，通过生存分析，可获得肿瘤细胞或者巨噬细胞表达与不表达PD-L1两组患者的总体生存率都具有显著差异(P<0.05)。
本发明所述的用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒具有以下优点：
(1)试验方法非常成熟，检测过程简便，直观，易于重复，由普通技术员即可完成。
(2)采用免疫多标技术便于客观准确地区分表达PD-L1的细胞类型，优于传统免疫组织化学技术的检测手段。
附图说明
图1显示采用本发明所述的双抗体联合荧光检测试剂盒检测肝癌组织中PD-L1的表达。红色荧光显示PD-L1分子，绿色荧光显示CD68分子，合并图像显示CD68与PD-L1的定位情况。
图2显示生存曲线分析肝癌患者肿瘤组织中PD-L1的表达模式与患者总体生存情况的关系。
具体实施方式
本发明所述的用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体包括用于检测以下两个蛋白分子标记物的抗体：CD68(细胞分化抗原68)，PD-L1(程序性死亡配体1)；还包括TSA(酪胺信号放大试剂)。第二抗体是辣根过氧化物酶标记的第二抗体。
对于本发明所述的双抗体联合荧光检测试剂盒，通过以下步骤检测其有效性。
(一)标本检测
1.选取包含肿瘤区域的肝癌石蜡切片，并确保无大片坏死；
2.获取4μm的石蜡切片8片，在60℃烤片2小时，取出，略冷；
3.室温下用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；
4.在100％乙醇中洗去二甲苯，再依次经过95％酒精、80％酒精、70％酒精，每次5分钟；
5.双蒸水中洗5分钟；
6.用0.3％H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温10分钟；
7.双蒸水中洗4次，每次5分钟；
8.抗原修复：10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)，高压热修复10分钟；
9.室温自然冷却30分钟；
10.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液洗4次，每次3分钟；
11.用含5％BSA，0.1％Triton-100的PBS溶液室温封闭30分钟；
12.将第一抗体PD-L1(购自Cell Signaling Technology，货号为13684S)滴加在组织切片上，室温孵育1小时；
13.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液冼4次，每次5分钟；
14.滴加辣根过氧化物酶标记的第二抗体(购自Dako公司，货号为K5007)，室温孵育20分钟；
15.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液冼4次，每次5分钟；
16.滴加酪胺信号放大试剂(购自PerkinElmer，货号为NEL741001KT)，室温避光孵育10分钟；
17.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液冼4次，每次5分钟；
18.将切片置抗原修复液中，置微波炉中高火5分钟，低火15分钟；
19.室温自然冷却30分钟；
20.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液洗4次，每次3分钟；
21.用含5％BSA，0.1％Triton-100的PBS溶液室温封闭30分钟；
22.将第二个第一抗体CD68(购自中杉金桥，货号为ZM-0464)滴加在组织切片上，室温孵育1小时；
23.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液冼4次，每次5分钟；
24.滴加辣根过氧化物酶标记的第二抗体(购自Dako公司，货号为K5007)，室温孵育20分钟；
25.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液冼4次，每次5分钟；
26.滴加酪胺信号放大试剂(购自PerkinElmer，货号为NEL741001KT)，室温避光孵育10分钟；
27.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液冼4次，每次5分钟；
28.滴加细胞核染料；
29.含0.1％Tween-20的TBS缓冲液冼2次，每次5分钟；
30.防淬灭剂封片。
(二)图像采集
1.在荧光显微镜的高倍视野(200倍)下获取癌巢区域的图片5张；
2.采用分析软件分别识别CD68(绿色荧光)和PD-L1(红色荧光)的单阳性信号图像以及两者双阳性信号图像(如图1)；
3.分析PD-L1和CD68双阳性信号数量，以及CD68单阳性信号，计算PD-L1和CD68双阳性信号占CD68单阳性信号的比例(即巨噬细胞表达PD-L1的比例)；
4.分析PD-L1阳性和CD68阴性信号数量，以及PD-L1单阳性信号，计算PD-L1阳性和CD68阴性信号占PD-L1单阳性信号的比例(即肿瘤细胞表达PD-L1的比例)；
5.最终结果为5张照片的平均值。
(三)结果分析
1.将上述分析结果按5％的阈值将样本分为巨噬细胞表达与不表达PD-L1两组或者肿瘤细胞表达与不表达PD-L1两组；
2.巨噬细胞表达PD-L1的比例大于等于5％，则记这例样本为阳性，反之则为阴性；肿瘤细胞表达与不表达PD-L1以同样的方式评定。
3.生存分析表明，不同分组的患者总体生存有显著差异(巨噬细胞：P＝0.017，肿瘤细胞：P＝0.001，如图2)。

Claims (2)

1.一种用于肝癌切除术后预后的双抗体联合荧光检测试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，其特征在于：所述第一抗体包括用于检测以下两个蛋白分子标记物的抗体：CD68(细胞分化抗原68)，PD-L1(程序性死亡配体1)；还包括TSA(酪胺信号放大试剂)。
2.根据权利要求1所述的双抗体联合荧光检测试剂盒，其特征在于：所述第二抗体是辣根过氧化物酶标记的第二抗体。
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