CN114235805B - 一种用于胰腺实性假乳头状瘤预后评估的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种基于胰腺实性假乳头状瘤的病理形态学特点及增殖指数对预后进行预测的系统。胰腺实性假乳头状瘤的手术切除标本，首先通过充分取材制成苏木素伊红染色(Hematoxylin‑eosin staining,HE)切片，通过光镜判断是否存在淋巴管血管侵犯(Lymphovascular invasion,LVI)，再通过免疫组化染色(IHC)方法评估肿瘤增殖指数(Ki‑67，％)。根据我们的评估系统：存在LVI且Ki‑67≥3％为疾病进展高危组；存在LVI且Ki‑67<3％，或不存在LVI且Ki‑67≥3％为中危组；不存在LVI且Ki‑67<3％为低危组。本系统可以较准确地预测胰腺实性假乳头状瘤的进展情况，比目前国际上应用的美国癌症联合会(AJCC)第八版胰腺癌分期更有效。此外，本发明还提出，胰腺实性假乳头状瘤预后极好，应根据其危险度定性为良性或交界性肿瘤。

Description

一种用于胰腺实性假乳头状瘤预后评估的系统
技术领域
本发明涉及肿瘤预后技术领域，具体涉及一种关于胰腺实性假乳头状瘤的预后评估系统。
背景技术
胰腺实性假乳头状瘤是一种较罕见的胰腺外分泌肿瘤，随着对其认识的深入，目前文献报道的明确诊断的病例呈上升趋势，但其生物学行为仍不明确。自1959年Frantz首次报道以来，该疾病的定性经历了一系列变化：2000年版《WHO消化系统肿瘤病理学和遗传学》将其分为恶性潜能未定的实性假乳头状瘤(ICD-O编码8452/1)及恶性的实性假乳头状癌(ICD-O编码8452/3)，但其中恶性诊断标准并未明确建立，仅指出神经周围浸润、血管浸润或对周围组织浸润较深提示恶性生物学行为；2010年第四版《WHO消化系统肿瘤分类》将其全部归类为恶性(ICD-O编码8452/3)；2019年最新版《WHO消化系统肿瘤分类》沿用了此定义，并提出“实性假乳头状瘤伴高级别癌”这一亚型，其临床侵袭性极强，但此类病例极其罕见。
分期方面，胰腺实性假乳头状瘤一直沿用与胰腺导管腺癌一致的分期方法，缺乏有针对性的预后预测系统。目前主要是基于肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移进行评估，具体分期如下表：
Figure BDA0003416061090000011
Figure BDA0003416061090000021
总而言之，胰腺实性假乳头状瘤的预后缺少有效的评估系统，有针对性的临床分期尚不完善。
由于胰腺实性假乳头状瘤较罕见，上述临床分期是否适用有待探索。根据目前少数的文献研究，临床实际病例中，III期病例极少，AJCC第七版及第八版分期均难以区分I期及II期病例的预后情况。因此，目前缺乏针对胰腺实性假乳头状瘤较特异的预后评估系统。
近年来，已有部分研究着重于实性假乳头状瘤的预后相关因素探究，然而，受限于病例总数及复发/转移性病例数较少、随访时间短、对恶性指标定义不明确等多种因素，各项研究结果差异较大，提出的指标不尽相同，很难从中提取出与预后明确相关的因素。综上，目前亟需纳入较多复发/转移性病例、临床及病理信息完整、各分析指标定义明确、随访时间长的大宗病例分析，从而准确描述胰腺实性假乳头状瘤的生物学行为，并建立可靠的、易于临床实践的、重复性好的预后评估系统。
发明内容
基于此，有必要对胰腺实性假乳头状瘤的生物学行为进行定性，同时提供一种可靠的、基于临床及病理特点的、临床上可行的预后评估系统，以便对患者进行危险度分层，预测疾病进展情况，从而对患者进行有针对性的随访管理及治疗。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
提出了一种判断胰腺实性假乳头状瘤复发/转移风险的危险度评估系统。本系统基于是否存在淋巴管血管侵犯(Lymphovascular invasion,LVI)及肿瘤增殖指数(Ki-67)，可以较准确地预测实性假乳头状瘤的进展风险。由于目前临床上对于此疾病患者首选手术完整切除(包括转移灶)，本评估系统适用于AJCC I-IV期全部患者。步骤如下：
1.组织病理形态学评估
对于手术切除病例，获得福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded,FFPE)切片，进行苏木素伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色，于显微镜下进行病理形态学评估，判断是否存在LVI。LVI定义为血管或淋巴管(被覆内皮细胞)中可见肿瘤细胞。
2.免疫组织化学(IHC)评估
通过IHC方法进行Ki-67染色，计算Ki-67百分比。Ki-67是一种定位于细胞核的蛋白，以核着色为阳性。使用UMAB107抗体，选取标记最强的区域，计数500-2000个细胞的阳性百分比。
3.综合评估系统
危险度分层如下：不存在LVI且Ki-67<3％为低危组；存在LVI且Ki-67<3％，或不存在LVI且Ki-67≥3％为中危组；存在LVI且Ki-67≥3％为肿瘤进展高危组。
4.胰腺实性假乳头状瘤的生物学行为定性
本发明基于438例随访时间≥1月的胰腺实性假乳头状瘤患者随访信息，提出该肿瘤预后好，极少患者因肿瘤而死亡，但少数患者存在进展(复发或转移)风险。因此应根据前述患者危险度分层，定义为良性(低危)或交界性肿瘤(中危或高危)。
首先，本发明提供了一种用于胰腺实性假乳头状瘤预后评估、病情监测的系统，包括组织病理形态学评估模块、免疫组织化学评估模块和综合评估模块，所述组织病理形态学评估模块检测肿瘤切片并判断是否存在淋巴管血管侵犯；所述免疫组织化学评估模块处理并检测肿瘤切片，计算Ki-67百分比；所述综合评估模块根据组织病理形态学评估模块和免疫组织化学评估模块结果评估患者预后、病情。
优选地，所述综合评估模块根据组织病理形态学评估模块和免疫组织化学评估模块结果将患者的疾病进展情况进行危险度分组：
高危组：存在淋巴管血管侵犯且Ki-67≥3％；
中危组：存在淋巴管血管侵犯且Ki-67<3％，或不存在淋巴管血管侵犯且Ki-67≥3％；
低危组：不存在淋巴管血管侵犯且Ki-67<3％。
优选地，判断是否存在所述淋巴管血管侵犯步骤：对于手术切除病例，充分取材获得福尔马林固定石蜡包埋切片，进行苏木素伊红染色，于显微镜下进行病理形态学评估，判断是否存在淋巴管血管侵犯。
优选地，所述淋巴管血管侵犯判读标准：血管或淋巴管(被覆内皮细胞)中可见肿瘤细胞为存在淋巴管血管侵犯，血管或淋巴管(被覆内皮细胞)中不可见肿瘤细胞为不存在淋巴管血管侵犯。
优选地，所述Ki-67判读标准：细胞核着色为阳性，选取热点区域，计数500-2000个细胞中的Ki-67阳性细胞，从而计算出百分比。
优选地，Ki-67抗体使用UMAB107抗体。
优选地，适用于胰腺实性假乳头状瘤AJCC I-IV期全部患者。
进一步地，还提供了所述的系统在制备用于胰腺实性假乳头状瘤患者预后评估、病情监测的产品中的应用。
进一步地，还提供了所述系统在制备用于胰腺实性假乳头状瘤分类的产品中的应用，根据患者疾病进展危险度分组进行分类，将所述胰腺实性假乳头状瘤定义为良性肿瘤或交界性肿瘤。
优选地，所述患者疾病进展危险度分组中的低危组定义为良性肿瘤，所述患者疾病进展危险度分组中的中危组和高危组定义为交界性肿瘤。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明研究发现LVI情况以及Ki-67增殖指数与胰腺实性假乳头状瘤复发/转移风险有显著关系，可以联合使用作为预后评估系统，较准确、特异地预测不同分期患者的预后情况，从而对患者进行有针对性的随访管理及治疗，并且易于临床实践。
附图说明
图1本发明中胰腺实性假乳头状瘤预后评估系统的技术路线。
图2基于本发明的预后模型(A)及AJCC第八版分期(B)的患者生存曲线。
图3本发明中全部胰腺实性假乳头状瘤患者的生存曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1、研究对象
本发明的研究对象为AJCC分期I-IV期的胰腺实性假乳头状瘤患者。纳入标准：经病理确诊为胰腺实性假乳头状瘤的患者；有石蜡病理切片资料；随访时间至少1个月。排除标准：术前行新辅助治疗；石蜡病理切片资料缺失；随访时间<1个月。
2、研究方法
2.1临床信息收集
通过北京协和医院病理科及病案科电子系统查阅确诊为胰腺实性假乳头状瘤的患者，收集性别、年龄、肿瘤标志物、影像学、手术方式、术前是否接受新辅助治疗、病理结果、AJCC分期、术后是否接受化疗或靶向药物治疗等信息。通过患者或家属联系电话和住院及门诊病历记录获得随访信息，记录患者是否存活、是否复发、复发时间、复发部位、死亡时间及原因。共348例获得完整病理切片资料及Ki-67指数的胰腺实性假乳头状瘤病例；438例获得随访信息的胰腺实性假乳头状瘤患者。
2.2病理特点收集
显微镜下复习病例的全部HE切片，判断LVI情况及淋巴结转移情况。并根据病理结果，通过肿瘤大小、淋巴结情况、是否有远处转移确定患者AJCC分期。
2.3免疫组织化学染色(IHC)
(1)在显微镜下挑选含有肿瘤组织的切片，找出其对应石蜡组织标本。
(2)使用病理组织切片机进行切片，厚度为3μm，将展开的切片用防脱粘附载玻片捞起，放于切片架晾干，在烤片机上70℃烘烤45min。
(3)把切片置于染色架上，将染色架依次置入二甲苯(第一次)、二甲苯(第二次)、二甲苯(第三次)、100％酒精、95％酒精、90％酒精、85％酒精、75％酒精、50％酒精、蒸馏水中各5min，进行脱蜡。
(4)取出染色架并沥干。
(5)使用EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION HIGH pH(50×)(Dako)作为免疫组化抗原修复缓冲液，在PT Link抗原修复仪进行抗原修复，具体过程如下：
A.取适量抗原修复液于修复槽中，提前预热至65℃；
B.将放有切片的染色架放入修复槽的修复液中，盖上盖子，继续加热至98℃，修复30min；
C.修复结束后，待抗原修复液冷却至65℃，打开仪器盖子，取出染色架，温热流水冲洗掉浮蜡，放入Wash Buffer中冷却；
D.玻片冷却后，将玻片放入全自动免疫组化染色仪Autostainer Link 48(Dako)的玻片架上。
(6)染色：使用Autostainer Link 48进行染色，选择FLEX程序，设置如下：
Category Reagent Volume Incubation
Rinse Buffer 0
Endogenous Enzyme Block FLEX Peroxidase Block 150 5
Rinse Buffer 0
Primary Antibody Ki-67 150 40
Rinse Buffer 0
Labelled Polymer FLEX/HRP 150 30
Rinse Buffer 0
Rinse Buffer 5
Substrate Chromogen FLEX DAB+Sub-Chromo 300 10
Rinse Buffer 0
Rinse DI Water 0
Ki-67抗体克隆号：UMAB107(中杉金桥，编号：ZM-0166)。
(7)Autostainer Link 48染色结束后，取出玻片放入染色架上，自来水冲洗2～3次，轻甩染色架去掉水分，将其放入苏木素染色液中，染色7min，冲水；
(8)取出切片沥干(约5s)，盐酸酒精分化数秒，冲水；将切片放入氨水中返蓝10s，之后自来水冲洗3次，轻甩染色架去掉水分。
(9)脱水、透明：依次在75％酒精(两次)→95％酒精(两次)→100％酒精(两次)进行脱水(每次30s)；依次在二甲苯(第一次)→二甲苯(第二次)透明。
(10)封片：滴加1-2滴中性树胶于切片组织上，盖上盖玻片，并确保组织完全被中性树胶覆盖住，且没有较大气泡(如有较大气泡，可通过挤压盖玻片排出)。
(11)于通风橱中晾干切片。
(12)显微镜下观察切片。Ki-67判读标准：细胞核着色为阳性。选取热点区域，计数500-2000个细胞中的Ki-67阳性细胞，从而计算出百分比。
2.4判断复发风险
如图1所示，根据LVI情况以及Ki-67百分比将患者的疾病进展情况进行危险度分组：
Figure BDA0003416061090000081
2.5统计学方法
利用GraphPad Prism(Version 8.0.1)软件绘制各危险度分级患者的Kaplan-Meier生存曲线。利用Log-rank检验比较各组间差异。P<0.05被认为有统计学差异。利用R语言中的survcomp包计算本系统的一致性指数(concordance index,C-index)。
2.6结果
(1)本发明基于348例获得完整病理切片资料及Ki-67指数的胰腺实性假乳头状瘤病例，可以有效区分不同复发/转移风险的患者：
联合使用LVI及Ki-67指数进行危险度分层，不同危险组别的患者预后具有显著统计学差异：低危患者193例，其中2例有进展，5年无进展生存率(PFS)为100.0％，10年PFS为92.2％；中危患者135例，其中12例有进展，5年PFS为96.6％，10年PFS为75.9％；高危患者20例，其中6例有进展，5年PFS为77.4％，10年PFS为44.2％。低危组vs中危组，p＝0.0222；中危组vs高危组，p＝0.0161；低危组vs高危组，p<0.0001。本系统及AJCC第八版胰腺癌分期的PFS生存曲线见图2，本发明的技术方案通过联合使用两种临床上易于评估的指标，可以较明显地区分出3类不同预后的患者；而根据AJCC第八版胰腺癌分期，I期及II期患者预后难以区分，且III期患者在实际临床实践中极少，因此本系统区分度更好。
(2)本发明具有较强的预测能力。C-index是所有病人对子中预测结果与实际结果一致的对子所占的比例，用以估计预测的结果与实际观察到的结果相一致的概率。对于患者的无进展生存期(PFS)，本发明计算出C-index为0.87(95％置信区间0.77-0.97)，对于预测此类整体预后较好的肿瘤的生物学行为来讲，具有较好的准确性。
(3)本发明基于438例获得随访信息的胰腺实性假乳头状瘤患者，提出其生物学行为良好，但部分病例有进展(复发或转移)风险：5年总体生存率(OS)为100％，10年OS为99.1％；5年疾病特异性生存率(DSS)为100％，10年DSS为100％；5年PFS为97.4％，10年PFS为89.3％(图3)。本发明提出，应根据上述危险度评估系统，将其定义为良性或交界性肿瘤。对于低危患者，该肿瘤生物学行为类似良性肿瘤；中危或高危患者有进展风险，应将该肿瘤视为交界性病变，密切随访。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种用于胰腺实性假乳头状瘤预后评估、病情监测的系统，其特征在于，包括组织病理形态学评估模块、免疫组织化学评估模块和综合评估模块，所述组织病理形态学评估模块，对每一例病例检测肿瘤切片并判断是否存在淋巴管血管侵犯；所述免疫组织化学评估模块，对每一例病例处理并检测肿瘤切片，计算Ki-67百分比；所述综合评估模块根据组织病理形态学评估模块和免疫组织化学评估模块结果将患者的疾病进展情况进行危险度分组：
高危组：存在淋巴管血管侵犯且Ki-67≥3%；
中危组：存在淋巴管血管侵犯且Ki-67<3%；或不存在淋巴管血管侵犯且Ki-67≥3%；
低危组：不存在淋巴管血管侵犯且Ki-67<3%，
所述淋巴管血管侵犯判读标准：血管或淋巴管中可见肿瘤细胞为存在淋巴管血管侵犯，血管或淋巴管中不可见肿瘤细胞为不存在淋巴管血管侵犯；
淋巴管或血管认定标准为其需要被覆内皮细胞，
所述Ki-67判读标准：细胞核着色为阳性，选取热点区域，计数500-2000个细胞中的Ki-67阳性细胞，从而计算出百分比。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述判断是否存在淋巴管血管侵犯步骤包括：对于手术切除病例，充分取材获得福尔马林固定石蜡包埋切片，进行苏木素伊红染色，于显微镜下进行病理形态学评估，判断是否存在淋巴管血管侵犯。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，Ki-67抗体使用UMAB107抗体。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，适用于胰腺实性假乳头状瘤AJCC I-IV期全部患者。
5.权利要求1-4任一所述的系统在制备用于胰腺实性假乳头状瘤患者预后评估、病情监测的产品中的应用。
6.权利要求1-4任一所述系统在制备用于胰腺实性假乳头状瘤分类的产品中的应用，其特征在于，根据患者疾病进展危险度分组进行分类，将所述胰腺实性假乳头状瘤定义为良性肿瘤或交界性肿瘤。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述患者疾病进展危险度分组中的低危组定义为良性肿瘤，所述患者疾病进展危险度分组中的中危组和高危组定义为交界性肿瘤。
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