CN116930498B - 一种原发性肝细胞癌切除术后复发风险预测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种原发性肝细胞癌切除术后复发风险预测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原发性肝细胞癌切除术后复发风险预测试剂盒及其应用。本发明提供了检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质或结合待测肝癌患者临床指标在制备预测肝癌患者术后复发风险或生存率产品中的应用。本发明适用于临床中低复发风险人群，对现有复发评估体系具有较强的补充能力；基于多中心大人群蛋白质组数据进行标志物发现与验证，保证模型稳定性，有助于前瞻队列预测；以临床复发分级为基础，开发存在互补性的标志物组合，保证模型灵敏度与准确率，符合临床应用场景；免疫组化是目前最为简便通用的标志物检测方法，以更适合大规模推广与市场下沉。

Description

一种原发性肝细胞癌切除术后复发风险预测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于预后评估领域，涉及免疫组化检测技术在临床上的应用，具体涉及一种原发性肝细胞癌切除术后复发风险预测试剂盒及其应用。
背景技术
肝癌是世界发病率第七，死亡率高居第三位的恶性肿瘤，最常见的原发性肝癌是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC），约占总人群的85%。
术后复发是肝细胞癌死亡率居高不下的重要原因。数据表明，HCC术后5年复发率高达72%，其中69%为早期复发（2年内复发）。多数早复发患者在复发后两年内即死亡。基于术后复发的重要影响，CSCO指南指出“降低术后复发率是提高肝癌整体疗效的关键”。
降低复发率，第一步要做的就是精准识别复发人群。现有的肝癌诊疗流程主要包括早诊，手术与病理诊断，和术后监测。病理诊断过程中会进行免疫组化检查，这是能够直接观察肿瘤分子特征的重要窗口。之后临床医生会根据以上信息进行复发风险评估，但目前尚无公认的复发评估准则。常用策略是根据MVI、肿瘤数目与肿瘤体积进行风险评估，多灶或存在MVI的患者被认为存在高复发风险。但是目前临床使用的复发风险分级对于早复发的灵敏度仅为58%，临床判定的中低风险人群中仍有45%的患者5年内复发，30%的病人在2年内复发。针对此类病人，唯有寄希望于开发新的标志物组合进行进一步识别。
面向需求，已发表文献与专利报告了大量的复发预测模型，但都未能推广应用，其原因可能在于：1.已有模型大部分基于小队列人群，假阳性比例大，在前瞻性外部队列中难以复现；2.复发人群的异质性大，单因素甚至单一维度的灵敏度与准确性均不足；3.部分模型没有考虑临床指标，这其实是脱离临床应用场景的。实际应用过程中一定是先判断临床指标，所以重点不只是超越临床标准，而是在临床标准的基础上进行补充。完全丢弃临床指标可能导致灵敏度下降，且不易在临床推广。4.应用于临床的检测技术要求简便、稳定、技术成熟，目前来说：基因组难以应用于复发预测、转录组技术操作要求更高、靶向蛋白质组仍需进一步发展，结合诊疗流程，免疫组化（immunohistochemistry, IHC）是最佳选择，但是基于组学的模型大多难以在免疫组化水平完全复现，阻碍进一步推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种原发性肝细胞癌切除术后复发风险预测试剂盒及其应用，提供一组能对临床指标进行补充的，能够用于肝细胞癌术后复发风险预测的蛋白；提供上述蛋白联合临床指标进行肝细胞癌术后复发风险预测的试剂盒与预测模型。
第一方面，本发明提供了检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质在制备预测肝癌患者术后复发风险或生存率产品中的应用。
第二方面，本发明提供了检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质和检测待测肝癌患者临床指标的物质在制备预测肝癌患者术后复发风险或生存率产品中的应用；
所述检测待测肝癌患者临床指标的物质包括如下2）和3），或1）至3）；
1）检测待测肝癌患者肿瘤数目的试剂和/或仪器；
2）检测待测肝癌患者肿瘤最大直径的试剂和/或仪器；
3）检测待测肝癌患者术前血液中AFP值的试剂和/或仪器。
上文所述应用中，所述检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质为检测待测肝癌患者肿瘤组织中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量。
上文所述应用中，所述检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质分别为免疫组化检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质。
在本发明的实施例中，所述检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质分别为特异结合FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白的抗体。
上文所述应用中，所述预测肝癌患者术后复发风险或生存率为预测肝癌患者术后2年或5年复发风险或生存率。
上文所述应用中，所述肝癌患者为临床定义低风险复发人、临床定义中风险复发人或临床定义高风险复发人。
第三方面，本发明提供了一种预测肝癌患者术后复发风险或生存率的试剂盒，其包括第一方面中的检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质。
上文所述试剂盒包括记载有模型的载体或者负载有模型的装置；
所述模型由输入信息（1）、输入信息（2）和输入信息（3）建立并且用于展示所述输入信息（1）、所述输入信息（2）和所述输入信息（3）之间的关系构建的COX回归模型；所述输入信息（1）为：建模组所有受试者肿瘤组织中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的信息；（2）建模组所有受试者的临床风险等级信息，即为临床高风险人群、临床中风险人群或临床低风险人群；所述输入信息（3）在本发明的实施例中为如下模型公式：
针对临床高风险人群: Score=0.08×FKBP10+0.018×SYNGR2-0.114×CYP3A4 ；
针对临床中风险人群: Score=0.014×FKBP10+0.113×SYNGR2+0.044×CYP3A4；
针对临床低风险人群: Score=0.058×FKBP10+0.026×SYNGR2-0.185×CYP3A4。
上述受试者为临床确诊的肝癌患者。
本发明还提供一种预测肝癌患者术后复发风险或生存率的装置，包括检测装置和结果输出装置；
检测装置用于检测待测者肿瘤组织中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量；
所述结果输出装置用于接收所有受试者肿瘤组织样本中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量信息，并且结合所有受试者的临床风险等级信息，将这些信息输入模型，由模型输出结果，预测待测者肝癌术后复发风险；
所述模型由输入信息（1）、输入信息（2）和输入信息（3）建立并且用于展示所述输入信息（1）和所述输入信息（2）之间的关系；所述输入信息（1）为：建模组所有受试者肿瘤组织样本中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的信息；所述输入信息（2）为：建模组所有受试者的临床风险等级信息，即为临床高风险人群、临床中风险人群或临床低风险人群；所述输入信息（3）为：模型公式：
针对临床高风险人群: Score=0.08×FKBP10+0.018×SYNGR2-0.114×CYP3A4 ；
针对临床中风险人群: Score=0.014×FKBP10+0.113×SYNGR2+0.044×CYP3A4；
针对临床低风险人群: Score=0.058×FKBP10+0.026×SYNGR2-0.185×CYP3A4。
第四方面，本发明提供了一种预测肝癌患者术后复发风险或生存率的试剂盒，其包括第二方面中的所述检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质和所述检测待测肝癌患者临床指标的物质。
第四方面所述试剂盒还包括记载有模型的载体或者负载有模型的装置；
所述模型由输入信息（1）、输入信息（2）和（3）建立并且用于展示所述输入信息（1）、所述输入信息（2）和所述输入信息（3）之间的关系构建的COX回归模型；所述输入信息（1）为：建模组所有受试者肿瘤组织样本中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的信息；所述输入信息（2）为：建模组所有受试者的临床风险等级信息，即为临床高风险人群、临床中风险人群或临床低风险人群；所述输入信息（3）为：建模组所有受试者的肿瘤数目、肿瘤最大直径和术前AFP值，或，建模组所有受试者的肿瘤最大直径和术前AFP值。
在本发明的实施例中构建的模型如图14、图16、图18、图20、图22和图24所示。
本发明还提供一种预测肝癌患者术后复发风险或生存率的装置，包括检测装置和结果输出装置；
检测装置用于检测待测者肿瘤组织中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量和用于检测检测待测患者临床指标（如肿瘤数目、肿瘤最大直径和血液中AFP值）；
所述结果输出装置用于接收所有受试者肿瘤组织样本中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量信息和临床指标，并且结合所有受试者的临床风险等级信息，将这些信息输入模型，由模型输出结果，预测待测者肝癌术后复发风险；
所述模型由输入信息（1）、输入信息（2）和输入信息（3）建立并且用于展示所述输入信息（1）和所述输入信息（2）之间的关系；所述输入信息（1）为：建模组所有受试者肿瘤组织样本中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的信息和临床指标；所述输入信息（2）为：建模组所有受试者的临床风险等级信息，即为临床高风险人群、临床中风险人群或临床低风险人群；所述输入信息（3）为：建模组所有受试者的肿瘤数目、肿瘤最大直径和术前AFP值，或，建模组所有受试者的肿瘤最大直径和术前AFP值。
第五方面，本发明提供了第三或第四方面所述试剂盒在制备预测肝癌患者术后复发风险或生存率产品中的应用。
第六方面，本发明提供了FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白在开发预测肝癌患者术后复发风险或生存率模型制备中的应用。
上文中的肝癌患者为临床已经确诊的肝癌患者，术后为原发性肝细胞癌手术切除治疗后。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、适用于临床中低复发风险人群，对现有复发评估体系具有较强的补充能力。
2、基于多中心大人群蛋白质组数据进行标志物发现与验证，保证模型稳定性，有助于前瞻队列预测；
3、以临床复发分级为基础，开发存在互补性的标志物组合，保证模型灵敏度与准确率，符合临床应用场景；
4、免疫组化是目前最为简便通用的标志物检测方法，以更适合大规模推广与市场下沉。
附图说明
图1为用于肝细胞癌术后复发风险预测的蛋白（FKBP10、CYP3A4、SYNGR2）筛选流程。
图2为FKBP10在多套队列的蛋白质组数据中具有稳定的良中选恶能力；图中组1为临床定义高复发风险组；组2为临床定义为中低复发风险但FKBP10高表；组3为临床定义为中低风险同时FKBP10低表。
图3为 FKBP10在免疫组化数据中具有稳定的良中选恶能力；图中组1为临床定义高复发风险组；组2为临床定义为中低复发风险但FKBP10高表；组3为临床定义为中低风险同时FKBP10低表。
图4为 CYP3A4在多套队列的蛋白质组数据中具有稳定的良中选恶能力；图中组1为临床定义高复发风险组；组2为临床定义为中低复发风险但CYP3A4高表；组3为临床定义为中低风险同时CYP3A4低表。
图5为CYP3A4在免疫组化数据中具有稳定的良中选恶能力；图中组1为临床定义高复发风险组；组2为临床定义为中低复发风险同时CYP3A4高表；组3为临床定义为中低风险同时CYP3A4低表。
图6为FKBP10与CYP3A4联用，建立基于IHC 12分级评分的COX回归模型，能够在临床中低复发风险患者中进一步稳定筛选出高危复发人群；图中组1为临床定义高复发风险组；组2代表临床定义为中低复发风险但分子模型判定为高危；组3代表临床定义为中低复发风险同时分子模型判定为低危组。
图7为SYNGR2在多套队列的蛋白质组数据中具有稳定的良中选恶能力；图中组1为临床定义高复发风险组；组2为临床定义为中低复发风险但SYNGR2高表；组3为临床定义为中低风险同时SYNGR2低表。
图8为SYNGR2在免疫组化数据中具有稳定的良中选恶能力；图中组1为临床定义高复发风险组；组2为临床定义为中低复发风险但SYNGR2高表；组3为临床定义为中低风险同时SYNGR2低表。
图9为基于IHC 12分级评分的3蛋白COX回归模型在免疫组化数据中具有稳定的良中选恶能力；图中组1为临床定义高复发风险组；组2代表临床定义为中低复发风险但分子模型判定为高危；组3代表临床定义为中低复发风险同时分子模型判定为低危组。
图10为临床风险分级各组复发率（高风险组：存在多灶或微血管侵犯；中风险组：不存在多灶或微血管侵犯，但最大肿瘤直径大于5cm；低风险组：不存在多灶或微血管侵犯，最大肿瘤直径小于5cm。
图11为针对临床低复发风险患者的分组与复发率展示(Score=0.058×FKBP10+0.026×SYNGR2-0.185×CYP3A4)。
图12为针对临床中复发风险患者的分组与复发率展示(Score=0.014×FKBP10+0.113×SYNGR2+0.044×CYP3A4)。
图13为针对临床高复发风险患者的分组与复发率展示(Score=0.08×FKBP10+0.018×SYNGR2-0.114×CYP3A4)。
图14为低风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5/0)。
图15为低风险人群分段式2年复发风险预测模型分组预测效果（卡值点为-0.1）。
图16为中风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为4，SYNGR2卡值点为4，CYP3A4卡值点为0) 。
图17为中风险人群分段式2年复发风险预测模型分组预测效果（卡值点为-1.3）。
图18为高风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5) 。
图19为高风险人群分段式2年复发风险预测模型分组预测效果(卡值点为-0.1)。
图20为低风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5/0)。
图21为低风险人群分段式5年复发风险预测模型（卡值点为-0.7）。
图22为中风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为4，SYNGR2卡值点为4，CYP3A4卡值点为0)。
图23为中风险人群分段式5年复发风险预测模型（卡值点为-2）。
图24为高风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5)。
图25为高风险人群分段式5年复发风险预测模型（卡值点为-1.6）。
图26为预测样本示例。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的样本来源于临床已经确诊的肝癌患者，且进行了原发性肝细胞癌手术切除治疗。
下述实施例中临床定义高复发风险组（临床高风险组）：存在多灶或微血管侵犯；临床定义中复发风险组（临床中风险组）：不存在多灶或微血管侵犯，但最大肿瘤直径大于5cm；临床定义低复发风险组（临床低风险组）：不存在多灶或微血管侵犯，最大肿瘤直径小于5cm。
下述实施例中FKBP10 FKBP prolyl isomerase 10 [ Homo sapiens (human) ]
Gene ID: 60681, updated on 1-Aug-2023；SYNGR2 synaptogyrin 2 [ Homosapiens (human) ]Gene ID: 9144, updated on 21-Jun-2023；CYP3A4 cytochrome P450family 3 subfamily A member 4 [ Homo sapiens (human) ]Gene ID: 1576, updatedon 24-Jul-2023。
下述实施例中各个蛋白的抗体为如下表1所示。
下述实施例中免疫组化反应步骤：
1、标准染色流程：
A. 将组织芯片放入烘箱中，温度调至63度，烘蜡一小时。
B. 配制试剂：
10× PBS缓冲液（配方：80g NaCl、2g KCl、15.35g Na2HPO4、2g KH2PO4，用纯水定容至1000毫升）：将10×PBS缓冲液稀释至1×PBS缓冲液，再在1×PBS缓冲液中加入占总体积0.05%的吐温试剂；
抗原修复液：82毫升0.1mol/L的柠檬酸钠溶液+18毫升0.1mol/L的柠檬酸溶液+900毫升的纯水置于高压锅中；
C.片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡；
脱蜡过程：二甲苯两缸，每缸15分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟； 90%酒精1缸，7分钟；80%酒精1缸，7分钟；70%酒精1缸，7分钟；
D. 从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，一次3分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电炉上开始加热；
E. 抗原修复
柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时，5分钟。时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却至室温；
F. 配制内源性过氧化物酶阻断剂。38.4ml无水甲醇+12ml 30%浓度的H2O2+9.6ml纯水；
G. 将片子放入阻断剂中10分钟。
H. 取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；
I. 冰箱中取出抗体，放入离心机里7200转离心30秒；
J. 取出抗体，按照稀释度用DAKO抗体稀释液稀释；
K. 滴加抗体；
L. 将湿盒放入冰箱，4℃过夜。
M. 从冰箱里取出湿盒，静置1小时待其恢复到室温；
N. 将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；
O. 滴加EnVision™+/HRP兔工作液（来自DAKO公司），30分钟；
P. 时间到后用PBS冲洗3次，一次5分钟。
Q. 从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mlDAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；（来自DAKO液体DAB+底物系统）
R. 在片子上滴加稀释后的DAB，显色5分钟，到时后自来水冲洗15分钟。
S. 在片子上滴加苏木素2分钟，时间到后在0.25%的盐酸酒精中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟；
T. 将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片。
脱水过程：75%酒精1缸，3分钟；
85%酒精1缸，3分钟；
95%酒精1缸，3分钟；
无水乙醇两缸，每缸5分钟；
二甲苯两缸，每缸5分钟。
U. 2名病理学专家阅片打分，采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。最终评分为细胞染色强度积分与阳性细胞表达数积分相乘。细胞染色强度积分：(1) 细胞不着色为阴性，记0分;(2)细胞着浅黄色为弱阳性,记1分;(3)细胞着棕黄色或着棕色且无背景着色,或细胞着深棕色但有浅棕色背景为中等阳性,记2分;(4)细胞着深棕色或棕褐色且无背景着色为强阳性,记3分。阳性细胞表达数积分:(1)阳性细胞表达数=0%,记0分;(2) 0%<阳性表达细胞数<25%,记1分;(3) 25%<阳性细胞数<50%,记2分;(4) 50%<阳性表达细胞数<75%,记3分;(5)阳性表达细胞数〉75%,记4分。
下述实施例中FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白表达量为肿瘤组织中FKBP10、CYP3A4、SYNGR2表达量。若用免疫组化检测，免疫组化总评分表示表达量。
实施例1、用于肝细胞癌术后复发风险预测的蛋白（FKBP10、CYP3A4、SYNGR2）筛选及预测肝细胞癌术后复发风险模型的建立
一、用于肝细胞癌术后复发风险预测的蛋白（FKBP10、CYP3A4、SYNGR2）筛选
筛选流程见图1，具体流程如下：
1、筛选蛋白所用数据如下表2-表4：
表2中队列1-3来源于实验室自产数据，队列4-5为已发表文献公开数据。(队列4：Jiang, Y., Sun, A., Zhao, Y. et al. Proteomics identifies new therapeutictargets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature 567, 257–261 (2019).https://doi.org/10.1038/s41586-019-0987-8；队列5：Gao Q,et al. IntegratedProteogenomic Characterization of HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cell.2019 Oct 3;179(2):561-577.e22. doi: 10.1016/j.cell.2019.08.052. Erratum in:Cell. 2019 Nov 14;179(5):1240. PMID: 31585088.) 临床风险分级方式见上文。
表4中HLivH165Su01和HLivH180Su09为上海芯超生物科技有限公司商业芯片，详情见官网(https://www.superchip.com.cn/biology/tissue.html)，临床风险分级方式见表5所示，通过免疫组化检测结果如表5所示。
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上表中，第一列为样本名称，第二列为预后复发时间（月），第3列为预后复发状态（1为复发，2为无复发），第4列为临床划分复发风险等级，第5列为肿瘤数量，第6列为最大肿瘤直径，第7列为术前血液中AFP值，第8-10列分别为肿瘤组织中FKBP10、SYNGR2、CYP3A4蛋白的免疫组化检测最终评分。
2、FKBP10蛋白的筛选
基于表2的蛋白质组数据（蛋白表达量）与预后数据（预后无复发生存时间），使用R语言survminer与survival包进行计算，高风险蛋白定义为在最优卡值条件下，风险比HR大于1，logrankP小于0.05。最优卡值(阈值)为根据蛋白质组数据与预后数据确定的高低表组预后差异最为显著的卡值点。高表组为对应蛋白高表达组，表达量高于最佳阈值，低表组为对应蛋白低表达组，表达量低于最佳阈值。
筛选在5套队列（队列1-队列5）全人群中具有稳定5年复发预测能力的复发高风险蛋白和3套数据集（队列1-队列3）的中低风险人群中具有稳定2年复发预测能力的复发高风险蛋白，取交集后按照中低风险人群-2年复发HR排序，保留前15个蛋白作为模型候选蛋白，其中FKBP10排名第二，中低风险人群、随访截止时间24个月情况下，HR为2.873，FKBP10蛋白高表达组2年复发率为50.3%；全体人群、随访截止时间60个月情况下，HR为2.290，FKBP10蛋白高表达组5年复发率为64.8%。选取前5个候选蛋白的免疫组化抗体，针对表4的两组芯片数据 HLivH165Su01和HLivH180Su09进行验证，结果FKBP10蛋白的效果最好。
队列1-3中的FKBP10蛋白蛋白质组数据和临床预后数据，使用R语言survminer与survival包进行计算复发率，结果如图2，组1为临床定义高复发风险组（高风险组）；组2为临床定义为中低复发风险（中低风险组）但FKBP10蛋白高表；组3为临床定义为中低复发风险（中低风险组）同时FKBP10低表；可以看出，FKBP10在多套队列的蛋白质组数据中具有稳定的良中选恶能力。
免疫组化检测FKBP10蛋白的表达量结合复发率统计结果如图3所示，组1为临床定义高复发风险组（高风险组）；组2为临床定义为中低复发风险（中低风险组）但FKBP10高表；组3为临床定义为中低风险（中低风险组）同时FKBP10低表，可以看出，FKBP10在免疫组化水平预测能力最佳。
3、CYP3A4蛋白的筛选
1）模型补充蛋白初筛标准
表2的蛋白质组的队列1-3的数据，用使用R语言survminer与survival包进行计算，复发高风险蛋白 (HML Risk-5 years: HR>1, logrank P<0.05&ML Risk-2 years: HR>1, logrank P<0.05)，共252个；复发低风险蛋白 (HML Risk-5 years:HR<1, logrank P<0.05&ML Risk-2 years: HR<1, logrank P<0.05) ，共128个。
2）CYP3A4蛋白
队列1-3中的蛋白组数据，使用中低风险人群数据，随访时间截止到2年，3组表达谱(队列1-3)只进行数据集内部Quantile归一化。要求在3套数据中均符合
使用3套数据（队列1-3）分别建立cox回归模型，得到16个候选蛋白。选16个候选蛋白中前5个候选蛋白的免疫组化抗体，针对表4的两组芯片数据 HLivH165Su01和HLivH180Su09进行验证，结果CYP3A4蛋白的效果最好。
其中，队列1-3中的CYP3A4蛋白的表达谱的数据和临床信息，使用R语言survminer与survival包进行计算复发率，结果如图4，组1为临床定义高复发风险组（高风险组）；组2为临床定义为中低复发风险（中低风险组）但CYP3A4蛋白高表；组3为临床定义为中低风险（中低风险组）同时CYP3A4低表；可以看出，CYP3A4在多套队列的蛋白质组数据中具有稳定的良中选恶能力。
免疫组化检测CYP3A4蛋白的表达量结合复发率统计结果如图5所示，组1为临床定义高复发风险组（高风险组）；组2为临床定义为中低复发风险（中低风险组）但CYP3A4高表；组3为临床定义为中低复发风险（中低风险组）同时CYP3A4低表，可以看出，CYP3A4在免疫组化水平预测能力最佳。
3）FKBP10和CYP3A4在免疫组化水平进行建立cox回归模型
使用FKBP10和CYP3A4在表4各组样本的免疫组化表达量数据（免疫组化评分）和预后数据，采用R语言survminer与survival包进行建立cox回归模型，相比于FKBP10，2蛋白组合在3个人群范围内均能够提升C-index和AUC（表6），2蛋白免疫组化预测模型对应KM曲线如图6所示。
4、SYNGR2蛋白的筛选
将步骤1）中的复发高风险高风险蛋白作为候选，使用3套数据（队列1-3）的蛋白组数据分别建立cox回归模型。
使用中低风险人群数据，随访时间截止到2年，3组表达谱(队列1-3)只进行数据集内部Quantile归一化。分别建模评估，要求在3套数据中均符合“C-indexFKBP10+CYP3A4+pro>C-indexFKBP10+CYP3A4 ”，至少在1套数据中存在“AICFKBP10+CYP3A4+pro<AICFKBP10+CYP3A4”。得到13个候选蛋白。
其中，队列1-3中的SYNGR2蛋白蛋白质组数据（蛋白表达量）与预后数据（预后无复发生存时间），使用R语言survminer与survival包进行计算复发率，结果如图7，组1为临床定义高复发风险组（高风险组）；组2为临床定义为中低复发风险（中低风险组）但SYNGR2蛋白高表；组3为临床定义为中低风险（中低风险组）同时SYNGR2低表；可以看出，SYNGR2在多套队列的蛋白质组数据中具有稳定的良中选恶能力。
选13个候选蛋白中前5个候选蛋白的免疫组化抗体，针对表4的两组芯片数据HLivH165Su01和HLivH180Su09进行验证，结果SYNGR2蛋白的效果最好。
免疫组化检测SYNGR2蛋白的表达量结合复发率统计结果如图8所示，组1为临床定义高复发风险组（高风险组）；组2为临床定义为中低复发风险（中低风险组）但SYNGR2高表；组3为临床定义为中低复发风险（中低风险组）同时SYNGR2低表，可以看出，SYNGR2在免疫组化水平预测能力最佳。基于IHC 12分级评分的3蛋白COX回归模型在免疫组化数据中具有稳定的良中选恶能力，对应KM 曲线如图9所示。
5、FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白预测肝细胞癌术后复发风险模型的建立
1）模型的建立
将表5中的FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白的免疫组化表达量数据（免疫组化评分）和预后数据R语言survminer与survival包，建立用于预测肝癌术后复发风险的蛋白模型如下：
高风险人群: Score=0.08×FKBP10+0.018×SYNGR2-0.114×CYP3A4
中风险人群: Score=0.014×FKBP10+0.113×SYNGR2+0.044×CYP3A4
低风险人群: Score=0.058×FKBP10+0.026×SYNGR2-0.185×CYP3A4
其中，高风险人群、中风险人群和低风险人群是按照临床的高风险组、中风险组和低风险组划分。
上述中，Score表示预测复发分值，FKBP10、SYNGR2和CYP3A4均表示免疫组化方法检测蛋白的表达量（免疫组化检测评分）。Score分值越高，则复发风险越大。
上述蛋白模型的灵敏度、阳性预测率均优于临床标准，具体见表7所示。
图10为根据表5所示数据计算的临床风险分级的差异预后展示，其中临床高风险组2年复发率为54.8%,5年复发率为70.9%；临床中风险组2年复发率为48.4%,5年复发率为58.3%；临床低风险组2年复发率31.2%,5年复发率为45%。（临床高风险组：存在多灶或微血管侵犯；临床中风险组：不存在多灶或微血管侵犯，但最大肿瘤直径大于5cm；临床低风险组：不存在多灶或微血管侵犯，最大肿瘤直径小于5cm）。
上述复发率即该人群2/5年内复发的比例，复发率=复发人数/总人数×100%
将表5中临床低风险组的数据采用低风险人群对应模型: Score=0.058×FKBP10+0.026×SYNGR2-0.185×CYP3A4 进行检测，根据Score值可进一步分为有预后差异的两组，结果如图11所示，可以看出，3蛋白模型能够在低风险人群进行进一步复发分级，且3蛋白模型预测的高风险组5年复发率为72.6%,与临床高风险组持平。
将表5中临床划分为中风险组的数据采用中风险人群对应模型: Score=0.014×FKBP10+0.113×SYNGR2+0.044×CYP3A4进行检测，根据Score值可进一步分为有预后差异的两组，分别计算复发率，结果如图12所示，可以看出，3蛋白模型能够对中风险人群进行进一步复发分级。
将表5中临床划分为高风险组的数据采用高风险人群对应模型: Score=0.08×FKBP10+0.018×SYNGR2-0.114×CYP3A4进行检测，根据Score值可进一步分为有预后差异的两组，分别计算复发率，结果如图13所示，可以看出，3蛋白模型能够对高风险人群进行进一步复发分级。
上述结果可以看出，FKBP10、SYNGR2和CYP3A4的免疫组化表达量结果可以用于预测临床定义低、中或高风险复发肝癌患者术后2年或5年的复发率。
实施例2、联合临床信息的FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白预测肝细胞癌术后复发风险模型的建立
一、肝癌患者的样本的临床信息
肝癌患者样本的临床信息包括如下：肿瘤数目（单位个）、肿瘤最大直径（单位cm）、术前血液中AFP值（单位为ng/ml）。
其中临床中风险或低分险的临床信息不含有肿瘤数目。
二、模型的建立
1、确定肝癌患者的FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白免疫组化染色检测的评分
检测肝癌患者的肿瘤组织中FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白进行免疫组化染色（染色与具体评分方式见具体实施方式），采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。最终评分为细胞染色强度积分与阳性细胞表达数积分相乘。
2、计算卡值点
针对于表5所示的芯片数据中人群，根据上述免疫组化染色检测的染色特征（阳性率与可区分度）和预后区分效果确定各人群卡值点。要求卡值点所对应高低表组存在显著预后差异，且高低表组免疫组化差异明显，如8分值对应高表组要求大于75%肿瘤细胞呈中等染色强度，或半数以上肿瘤细胞呈强染色。具体说明如下：
在临床定义低风险组2年复发风险预测模型中，FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5/0（5/0表示根据免疫组化评分分为3组，分别为0、(0,5)、[5,12]）。
在临床定义中风险人群分段式2年复发风险预测模型中，FKBP10卡值点为4，SYNGR2卡值点为4，CYP3A4卡值点为0。
在临床定义高风险人群分段式2年复发风险预测模型中，FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5。
在临床定义低风险人群分段式5年复发风险预测模型中，FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5/0。
在临床定义中风险人群分段式5年复发风险预测模型中，FKBP10卡值点为4，SYNGR2卡值点为4，CYP3A4卡值点为0。
在临床定义高风险人群分段式5年复发风险预测模型中，FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5。
3、建立模型
针对于表5所示的芯片数据中人群的免疫组化表达量数据（免疫组化评分）和预后数据，采用R语言survminer与survival包建立cox回归模型如图14、图16、图18、图20、图22和图24：
1）图14为低风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5/0)；
采用图14所示的模型判断临床判断为低风险人群的2年复发率的方法的建立：
（1）FKBP10、CYP3A4、SYNGR2的单项得分值的获得
临床判断为低风险组的待测患者，进行FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白免疫组化染色，根据FKBP10染色评分与对应蛋白卡值点进行比较，若大于卡值点，则对应该蛋白的“高表达”，找到对应图中第一行的单项得分值；或，若小于卡值点，则对应该蛋白的“低表达”，找到对应图中第一行的单项得分值；记作FKBP10的单项得分值；根据CYP3A4染色评分与对应蛋白卡值点进行比较，若大于卡值点，则对应该蛋白的“高表达”，找到对应图中第一行的单项得分值；或，若小于卡值点，则对应该蛋白的“低表达”，找到对应图中第一行的单项得分值；记作CYP3A4的单项得分值；根据SYNGR2染色评分与对应蛋白卡值点进行比较，若大于卡值点，则对应该蛋白“高表达”，找到对应图中第一行的单项得分值；或，若小于卡值点，则对应该蛋白的“低表达”，找到对应图中第一行的单项得分值；记作SYNGR2的单项得分值；
（2）肿瘤直径的单项得分值的获得
根据临床检测的患者肿瘤直径，从图14中找打对应的肿瘤最大直径值，再对应找到图中第一行的单项得分值；记作肿瘤直径的单项得分值；
（3）甲胎蛋白AFP的单项得分值的获得
根据临床检测的患者的AFP值，从图14中找打对应的AFP行，再对应找到图中第一行的单项得分值；记作AFP的单项得分值；
（4）计算总分值
将上述（1）-（3）获得的FKBP10的单项得分值、CYP3A4的单项得分值、SYNGR2的单项得分值、肿瘤直径的单项得分值和AFP的单项得分值相加，得到总分值；
（5）对应获得线性得分和2年无复发生存率
根据总分值，对应图中的线性得分和2年无复发生存率， 2年无复发生存率的百分比即为预测2年无复发生存率。
2）图16为中风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为4，SYNGR2卡值点为4，CYP3A4卡值点为0)；
采用图16所示的模型判断临床判断为中风险人群的2年复发率的方法的建立：
与图14的方法相同，不同的是待测患者为临床判断为中风险组，各蛋白的卡值点不同。
3）图18为高风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5)；
采用图18所示的模型判断临床判断为高风险人群的2年复发率的方法的建立：
与图14的方法相同，不同的是待测患者为临床判断为中风险组，各蛋白的卡值点不同。
总分值中还包括肿瘤数目对应的单项得分，具体确定如下：检测肿瘤患者中肿瘤数据，大于1个，则记作“多灶”，否则记作“单灶”，对应再对应找到图中第一行的单项得分值；记作肿瘤数目的单项得分值.
4) 图20为低风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5/0)；
采用图20所示的模型判断临床判断为低风险人群的5年复发率的方法的建立：
与图14的方法相同，待测患者为临床判断为低风险组，各蛋白的卡值点不同，预测的是2年或5年复发率。
5)图22为中风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为4，SYNGR2卡值点为4，CYP3A4卡值点为0)；
采用图22所示的模型判断临床判断为中风险人群的5年复发率的方法的建立：
与图14的方法相同，待测患者为临床判断为中风险组，各蛋白的卡值点不同，预测的是2年或5年复发率。
6)图24为高风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5)；
采用图24所示的模型判断临床判断为中风险人群的5年复发率的方法的建立：
与图14的方法相同，待测患者为临床判断为高风险组，各蛋白的卡值点不同，预测的是2年或5年复发率。
总分值中还包括肿瘤数目对应的单项得分，具体确定如下：检测肿瘤患者中肿瘤数据，大于1个，则记作“多灶”，否则记作“单灶”，对应再对应找到图中第一行的单项得分值；记作肿瘤数目的单项得分值。
三、模型的建立
1）图14为低风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5/0)；
采用表5所示的芯片样本的免疫组化检测的总评分，根据图14进行预测复发率，结果如图15所示，可以看出，3蛋白-临床指标复发预测模型能够对临床低复发风险人群进行2年预后区分，相比于3蛋白模型效果存在提升。
2）图16为中风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为4，SYNGR2卡值点为4，CYP3A4卡值点为0)；
采用表5所示的芯片数据样本的免疫组化检测的总评分，根据图16进行预测复发率，结果如图17所示，可以看出，3蛋白-临床指标复发预测模型能够对临床中复发风险人群进行2年预后区分，相比于3蛋白模型效果存在提升。
3）图18为高风险人群分段式2年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5)；
采用表5所示的芯片数据样本的免疫组化检测的总评分，根据图18进行预测复发率，结果如图19所示，可以看出，3蛋白-临床指标复发预测模型能够对临床高复发风险人群进行2年预后区分，相比于3蛋白模型效果存在提升。
4) 图20为低风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5/0)；
采用表5所示的芯片数据样本的免疫组化检测的总评分，根据图20进行预测复发率，结果如图21所示，可以看出，3蛋白-临床指标复发预测模型能够对临床低复发风险人群进行5年预后区分，相比于3蛋白模型效果存在提升。
5)图22为中风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为4，SYNGR2卡值点为4，CYP3A4卡值点为0)；
采用表5所示的芯片数据样本的免疫组化检测的总评分，根据图22进行预测复发率，结果如图23所示，可以看出，3蛋白-临床指标复发预测模型能够对临床中复发风险人群进行5年预后区分，相比于3蛋白模型效果存在提升。
6)图24为高风险人群分段式5年复发风险预测模型(FKBP10卡值点为8，SYNGR2卡值点为8，CYP3A4卡值点为5)；
采用表5所示的芯片数据样本的免疫组化检测的总评分，根据图24进行预测复发率，结果如图25所示，可以看出，3蛋白-临床指标复发预测模型能够对临床高复发风险人群进行5年预后区分，相比于3蛋白模型效果存在提升。
实施例3、预测肝细胞癌术后复发风险模型的试剂盒
1、FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白预测肝细胞癌术后复发风险模型的试剂盒
包括如下组分：检测肿瘤组织中FKBP10表达量的物质、CYP3A4表达量的物质、SYNGR2表达量的物质、临床定义风险等级信息和根据这些表达量建立的cox回归模型；
cox回归模型具体如下：
用于预测临床诊断高风险人群的模型1为：Score=0.08×FKBP10+0.018×SYNGR2-0.114×CYP3A4；
用于预测临床诊断中风险人群的模型2为：Score=0.014×FKBP10+0.113×SYNGR2+0.044×CYP3A4；
用于预测临床诊断低风险人群的模型3为：Score=0.058×FKBP10+0.026×SYNGR2-0.185×CYP3A4；
其中，高风险人群、中风险人群和低风险人群是按照临床标准划分的。
Score表示预测复发分值，FKBP10、SYNGR2和CYP3A4均表示上述免疫组化检测蛋白的表达量（免疫组化检测评分）。
2、联合临床信息的FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白预测肝细胞癌术后复发风险模型的试剂盒
联合临床信息的FKBP10、CYP3A4、SYNGR2蛋白预测肝细胞癌术后复发风险模型的包括如下组分：
检测肿瘤组织中FKBP10表达量的物质、CYP3A4表达量的物质、SYNGR2表达量的物质、检测患者肿瘤数目（单位个）的物质、检测患者肿瘤最大直径（单位cm）的物质、检测术前患者血液中AFP值（单位为ng/ml）的物质、临床定义风险等级信息和根据这些表达量及临床信息建立的cox回归模型（如图14、图16、图18、图20、图22和图24所示）。
实施例4、临床样本病例检测
D19A3446患者AJCC第7版临床分期为I期(T1,N0,M0)，病理分级II级，单发肿瘤，最大肿瘤直径3.5cm，血液中甲胎蛋白(AFP) 642μg/L，临床判定为低复发风险。免疫组化评分FKBP10为10，SYNGR2为10，CYP3A4为1.5（如图26所示）。
采用实施例2的图14和图20所示的复发风险预测模型进行计算，预测2年复发率大于60%，预测5年复发率大于75%。实际术后7 months复发，术后20 months死亡。证明，本发明的模型准确。
D19A4338患者AJCC第7版临床分期为II期(T2,N0,M0)，病理分级Ⅲ级，单发肿瘤，最大肿瘤直径3cm，存在血管侵犯，AFP 7380μg/L，临床判定为高复发风险。免疫组化评分FKBP10为0，SYNGR2为0，CYP3A4为8（如图26所示）。
采用实施例2的图18和图24复发风险预测模型进行计算，预测2年复发率小于10%，预测5年复发率小于20%。实际术后随访54 months时未复发，术后102 months维持生存。

Claims (9)

1.检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质在制备预测肝癌患者术后复发风险产品中的应用；
所述肝癌患者为临床定义低风险复发人、临床定义中风险复发人或临床定义高风险复发人。
2.检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质和检测待测肝癌患者临床指标的物质在制备预测肝癌患者术后复发风险产品中的应用；
所述检测待测肝癌患者临床指标的物质包括如下2）和3），或1）-3）；
1）检测待测肝癌患者肿瘤数目的试剂和/或仪器；
2）检测待测肝癌患者肿瘤最大直径的试剂和/或仪器；
3）检测待测肝癌患者术前血液中AFP值的试剂和/或仪器。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质为检测待测肝癌患者肿瘤组织中FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质分别为免疫组化检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述预测肝癌患者术后复发风险为预测肝癌患者术后2年或5年复发风险。
6.一种预测肝癌患者术后复发风险的试剂盒，其包括权利要求1中的所述检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质。
7.一种预测肝癌患者术后复发风险的试剂盒，其包括权利要求2中的所述检测FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白表达量的物质和所述检测待测肝癌患者临床指标的物质。
8.权利要求6或7所述试剂盒在制备预测肝癌患者术后复发风险产品中的应用。
9.FKBP10、CYP3A4和SYNGR2蛋白在开发预测肝癌患者术后复发风险模型制备中的应用。
CN202311091776.4A 2023-08-29 2023-08-29 一种原发性肝细胞癌切除术后复发风险预测试剂盒及其应用 Active CN116930498B (zh)

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