CN104830906A

CN104830906A - 一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方法

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Publication number: CN104830906A
Application number: CN201410048337.XA
Authority: CN
Inventors: 邓宏魁; 杜媛媛; 时艳; 贾均; 王金琳; 向晨罡; 宋南; 徐君; 尹明
Original assignee: BEIJING WEITONGDA BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Peking University
Current assignee: BEIJING WEITONGDA BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Peking University
Priority date: 2014-02-12
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2034-02-12
Also published as: KR101897001B1; US20170218333A1; AU2015218082A8; CA2939525C; CA2939525A1; AU2015218082B2; AU2015218082A1; EP3105315A1; JP6535028B2; EP3105315B1; CN104830906B; JP2017511150A; KR20160143651A; WO2015120776A1; EP3105315A4; US11613735B2

Abstract

本发明公开了一种重编程获得人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的人肝脏实质细胞的方法，本发明提供了一种将哺乳动物成纤维细胞转分化为肝细胞的方法，包括如下步骤：1）将转录调控因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PROX1、CEBPA、MYC和p53基因共同导入哺乳动物成纤维细胞中，在体细胞培养基中培养，得到转基因细胞系；2）将所述转基因细胞系在肝细胞培养基中增殖培养，得到哺乳动物肝细胞；本发明的实验证明，本发明将提供了一种重编程方法，能够通过在人成体细胞中过表达肝脏特定蛋白使其转分化为能够人工体外来源的，具有肝脏代谢功能并能体外扩增的人肝细胞。这将极大地推动人肝脏实质细胞在再生医学和药物研发中的应用。

Description

一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方法。

背景技术

肝脏是人体新陈代谢的重要器官，也是最重要的解毒器官。肝脏中执行肝脏功能的最主要细胞类型是肝脏实质细胞。肝脏实质细胞的主要关键功能包括：药物代谢、清洁和解毒血液中的毒素和废物、合成和存储机体所需的糖类、蛋白、脂肪和其他物质等。由于肝脏实质细胞执行了大多数肝脏的关键功能，因此获得具有功能的人肝脏实质细胞具有非常重要的应用价值，尤其是在药物研发和再生医学领域。

肝脏实质细胞可以在药物研发中发挥关键的作用。目前导致候选药物失败的主要原因是其ADME（吸收、分布、代谢、排泄）方面不理想。由于肝脏在药物的代谢活动中发挥核心作用，因此在所有新药研发过程中，一个必须的研究环节是检测药物在肝细胞的代谢情况和毒理效应，人肝脏实质细胞具有完整的参与药物代谢的三相代谢酶，以及完备的调控药物代谢的辅因子，因此使用人肝脏实质细胞在体外进行药物代谢的研究结果可以很好地反应药物在体内的代谢情况。目前在体外药物研发上主要使用的是人成体原代肝细胞，由于来源及其有限，并且原代肝细胞的功能很难在体外维持，因此其在药物研发上的应用相当受限。

在治疗肝功能衰竭和丧失的疾病上，肝脏实质细胞也有重要的应用前景，特别是在生物人工肝支持系统方面。肝功能的衰竭和丧失是最为严重的肝脏疾病之一，以急性肝功能衰竭为例，其起病急、病程发展快，原位肝移植是目前治疗此类疾病的主要手段，但是由于供体的严重缺乏，许多病人在等待肝移植的过程中死亡。基于肝脏实质细胞构建的生物人工肝支持系统可暂时替代衰竭肝脏的主要功能，清除有害物质，补充肝脏合成的生物活性物质，稳定和改善病人的内环境，直到有合适的供体来源用于移植。此外，由于肝脏具有强大的再生能力，在生物人工肝支持系统的帮助下有可能使肝细胞再生，直至自身的肝脏功能恢复。目前研发中的生物人工肝支持系统多采用猪肝脏实质细胞以及人肝脏实质细胞系，这些细胞来源存在一些关键问题制约了其应用，如物种差异可能导致的免疫排斥反应、肝脏实质细胞体外功能水平低下、肝脏实质细胞缺乏增殖能力等。

此外，人肝脏实质细胞还可用于构建人源化肝脏小鼠模型，该模型可以解决乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV）和疟疾（Malaria）等人类传染病缺乏动物感染模型的难题，为这些疾病的病理研究、疫苗和新药研发以及人肝细胞代谢功能的体内研究提供可靠的研究平台。

人肝脏实质细胞虽然具有广阔的应用前景，但是如何在体外获得大量的功能性人肝脏实质细胞是制约其应用的瓶颈因素。如前所述，现有的人肝脏实质细胞来源，如人成体原代肝脏实质细胞、人肝脏实质细胞系等，来源困难，数量及其有限，因此很难同时解决维持肝脏实质细胞的功能水平和获得较强的体外扩增能力两大问题。通过干细胞分化等方法获得的肝脏细胞，其代谢功能不完善。因此，需要开发新的策略和方法来解决这一难题。

细胞重编程技术能够通过特定方法在体细胞内过表达转录因子蛋白来调控细胞命运，使其转变为特定类型的功能细胞。目前已经有报道在鼠成纤维细胞中过表达肝脏特定的转录因子能够使成纤维细胞转分化为鼠肝细胞。但是，这些重编程来源的鼠肝细胞功能并不成熟，例如表达AFP，并且其药物代谢最关键的P450酶活性较低。

发明内容

本发明的一个目的是提供诱导因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PROX1、CEBPA、MYC和p53基因抑制剂的至少一种的应用。

本发明提供的诱导因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PROX1、CEBPA、MYC和p53基因抑制剂的至少一种在用于诱导产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实质细胞中的应用。

上述应用中，所述诱导因子为DNA形式，mRNA形式或蛋白质形式；

所述哺乳动物具体为人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；所述哺乳动物尤其具体为人。

本发明的另一个目的是提供一种用重编程体外制备人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝实质细胞的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

（1）使离体哺乳动物体细胞中过表达或表达诱导因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PROX1、CEBPA、MYC中的至少一种，且抑制所述离体哺乳动物体细胞中p53基因、p53mRNA或p53蛋白的表达，得到转基因细胞，

（2）在肝细胞培养基中继续培养所述转基因细胞，即得到人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的肝脏实质细胞。

上述方法中，

所述步骤（1）的方法如下：将诱导因子导入离体哺乳动物体细胞中，培养，得到转基因细胞，

所述诱导因子为HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROX1基因、CEPBA基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子中的至少一种。

上述方法中，所述诱导因子为如下1）或2）：

1）所述诱导因子为HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROX1基因、CEPBA基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子；

2）所述诱导因子为HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROX1基因、CEPBA基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子中任意三个。

上述方法中，所述体细胞为成纤维细胞、肝癌细胞、胃细胞、角质细胞或血液细胞；

上述方法中，各种所述诱导因子均通过表达其的慢病毒共同导入所述哺乳动物体细胞中；

各种所述诱导因子及其对应的慢病毒如下：

所述HNF1A基因，其对应的慢病毒为表达HNF1A的慢病毒；

所述HNF6基因，其对应的慢病毒为表达HNF6的慢病毒；

所述HNF4A基因，其对应的慢病毒为表达HNF4A的慢病毒；

所述ATF5基因，其对应的慢病毒为表达ATF5的慢病毒；

所述PROX1基因，其对应的慢病毒为表达PROX1的慢病毒；

所述CEBPA基因，其对应的慢病毒为表达CEBPA的慢病毒；

所述MYC基因，其对应的慢病毒为表达MYC的慢病毒；

所述抑制p53基因表达的DNA分子，其对应的慢病毒为抑制p53基因表达的慢病毒。

上述方法中，所述HNF1A基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；

所述HNF6基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；

所述HNF4A基因的核苷酸序列为序列表中的序列3；

所述ATF5基因的核苷酸序列为序列表中的序列4；

所述PROX1基因的核苷酸序列为序列表中的序列5；

所述CEBPA基因的核苷酸序列为序列表中的序列6；

所述MYC基因的核苷酸序列为序列表中的序列7；

所述抑制p53基因表达的DNA分子由序列表中序列8所示的单链DNA分子和序列表中序列9所示的单链DNA分子退火得到；

步骤1）中，所述培养采用的培养基为哺乳动物体细胞培养基；

所述培养的时间为以慢病毒感染哺乳动物体细胞起5-14天；

步骤2）中，所述继续培养的时间为以慢病毒感染哺乳动物体细胞起15-35天。

所述表达各种诱导因子的慢病毒等量共同导入所述哺乳动物体细胞中；

所述表达HNF1A基因的慢病毒为由表达HNF1A基因的重组载体导入靶细胞中，包装得到；

所述表达HNF6基因的慢病毒为由表达HNF6基因的重组载体导入靶细胞中，包装得到；

所述表达HNF4A的慢病毒为由表达HNF4A基因的重组载体导入靶细胞中，包装得到；

所述表达ATF5的慢病毒为由表达ATF5基因的重组载体导入靶细胞中，包装得到；

所述表达PROX1的慢病毒为由表达PROX1基因的重组载体导入靶细胞中，包装得到；

所述表达CEBPA的慢病毒为由表达CEBPA基因的重组载体导入靶细胞中，包装得到；

所述表达MYC的慢病毒为由表达MYC基因的重组载体导入靶细胞中，包装得到；

所述抑制p53基因表达的慢病毒为由抑制p53基因表达的重组载体导入靶细胞中，包装得到。

所述表达HNF1A基因的重组载体A为将HNF1A基因插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体得到的重组载体；

所述表达HNF6基基因的重组载体B为将HNF6基因插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体得到的重组载体；

所述表达HNF4A基因的重组载体C为将HNF4A基因插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体得到的重组载体；

所述表达ATF5基因的重组载体D为将ATF5基因插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体得到的重组载体；

所述表达PROX1基因的重组载体E为将PROX1基因插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体得到的重组载体；

所述表达CEBPA基因的重组载体F为将CEPBA基因插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体得到的重组载体；

所述表达MYC基因的重组载体G为将MYC基因插入pll3.7表达载体得到的重组载体；

所述抑制p53基因表达的重组载体H为将抑制p53基因的DNA分子插入pll3.7表达载体得到的重组载体。

由上述方法得到的哺乳动物肝实质细胞也是本发明保护的范围；

或通过转基因或添加诱导因子的方法诱导哺乳动物细胞肝脏特异基因的表达而产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的肝实质细胞也是本发明保护的范围；

本发明的第三个目的是提供一种用于诱导产生具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实质细胞的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，为如下1）-3）中任一种：

1）诱导因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PROX1、CEPBA、MYC和p53基因抑制剂的至少一种；

2）HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROX1基因、CEBPA基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子中的至少一种；

3）表达HNF1A基因的慢病毒、表达HNF6基因的慢病毒、表达HNF4A的慢病毒、表达ATF5的慢病毒、表达PROX1的慢病毒、表达CEBPA的慢病毒、表达MYC的慢病毒、抑制p53基因表达的慢病毒中的至少一种；

所述至少一种具体为全部。

上述的试剂盒在诱导产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实质细胞中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂盒在用重编程制备人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝实质细胞中的应用也是本发明保护的范围。

或上述哺乳动物肝实质细胞在体外筛药、人工肝、体内移植、肝病如HBV/HCV、疟原虫感染相关研究或人源化肝脏动物模型中的应用也是本发明保护的范围。

上述具有肝脏代谢功能体现在如下1）-6）中至少一种：

1）哺乳动物肝实质细胞在体外或导入体内后分泌白蛋白；

2）哺乳动物肝实质细胞在体外合成糖原；

3）哺乳动物肝实质细胞在体外具有低密度脂蛋白内吞能力；

4）哺乳动物肝实质细胞在体外具有ICG的内吞和外排能力；

5）哺乳动物肝实质细胞在体外或导入体内后表达与药物代谢相关的酶；

6）哺乳动物肝实质细胞在体外具有解毒能力。

本实施例中的人成纤维细胞也是可以自商业途径获得。

本发明的实验证明，本发明通过在人成纤维细胞中过表达肝脏特异基因组合以及促进细胞扩增基因组合，能够将人成纤维细胞转分化为具有功能的肝脏实质细胞，并且转分化的肝脏实质细胞能够大量增殖，并且能够冻存。复苏后的肝脏实质细胞也能够维持其肝细胞的特性和功能。肝脏实质细胞能够分泌白蛋白；表达肝脏关键的蛋白；此外能够具备糖原合成、脂肪合成，LDL吸收以及ICG的吸收和排放等肝细胞的基本特性。此外，在药物代谢能力方面，转分化肝细胞能够具备同成体肝细胞类似的P450酶活性，能够发挥药物解毒功能。

为了验证转分化来源的人肝细胞对小鼠成体肝脏的重建能力,将转分化来源的人肝细胞从脾静脉注射到Tet-uPA/Rag2-/-/γc-/-肝损伤免疫缺陷型小鼠体内。小鼠血清内的人血清白蛋白含量不断增高,在注射iHep的第七周时已经高达313微克每毫升。比同批移植的人类胚胎干细胞来源的分化细胞的白蛋白分泌量要高1000倍以上,且与同批移植的成体肝细胞的白蛋白分泌量相当。此外，通过免疫组化检测，转分化来源的人肝细胞在体内依然能够充分表达最重要的几个CYP酶包括：CYP3A4,CYP2C9,CYP1A2等。

总之本发明用重编程方法体外获得具有成熟功能的人肝脏实质细胞。这些细胞可以在经过大量扩增后仍然维持关键的人肝脏实质细胞功能，从而可以被用于体外药物研发、生物人工肝支持系统和人源化肝脏小鼠的构建等应用中。这将极大地推动人肝脏实质细胞在再生医学和药物研发中的应用。

附图说明

图1为诱导人肝脏实质细胞流程图

图2为诱导人肝脏实质细胞的形态

图3为诱导人肝脏实质细胞的白蛋白的分泌量

图4为诱导人肝实质细胞糖原合成能力分析

图5为诱导人肝实质细胞的低密度脂蛋白内吞能力分析

图6为诱导人肝脏实质细胞吲哚青绿内吞和外排能力分析。

图7为诱导人肝实质细胞药物代谢能力分析。

图8为诱导人肝实质细胞药物毒性分析

图9为诱导人肝实质细胞移植入肝脏损伤模型小鼠后人白蛋白血清分泌量分析

图10为诱导人肝实质细胞移植入肝脏损伤模型小鼠后，人源细胞的嵌合比例分析

图11为诱导人肝实质细胞移植入肝脏损伤模型小鼠后，人源细胞的药物代谢酶表达分析

图12为提高HepG2细胞药物代谢相关的关键基因如CYP3A4、CYP2B6

图13为HNF1A、HNF6、HNF4、ATF5、PROX1、CEBPA、MYC以及抑制P53的siRNA在人成纤维细胞中表达

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用哺乳动物体细胞培养基配方如下：

DMEM(Invitrogen)

10%（体积百分含量）胎牛血清（Excell）

1%（体积百分含量）青霉素/链霉素（Invitrogen，15070-063）

实施例1、用重编程由人成纤维细胞转分化为人功能性肝脏实质细胞

1、慢病毒的制备

1、慢病毒混合物的制备

1）构建重组载体

重组载体A为将转录调控因子HNF1A编码基因（序列1）插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体(System Biosciences,CD520A-1)的XbaI和EcroI酶切位点间得到的重组载体；

重组载体B为将转录调控因子HNF6编码基因（序列2）插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体的XbaI和EcroI酶切位点间得到的重组载体；

重组载体C为将转录调控因子HNF4A编码基因（序列3）插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体的NheI和NotI酶切位点间得到的重组载体；

重组载体D为将转录调控因子ATF5编码基因（序列4）插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体的XbaI和EcroI酶切位点间得到的重组载体；

重组载体E为将转录调控因子PROX1编码基因（序列5）插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体的XbaI和EcroI酶切位点间得到的重组载体；

重组载体F为将转录调控因子CEBPA编码基因（序列6）插入pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro表达载体的XbaI和EcroI酶切位点间得到的重组载体；

重组载体G为将转录调控因子MYC编码基因（序列7）插入pLL-IRES-puro表达载体（Zhao Y et al.Cell Stem Cell.2008Nov6;3(5):475-9.公众可从北京维通达生物技术有限公司；北京大学获得）的Xho I和EcoR I酶切位点间得到的重组载体；

重组载体H为将干扰转录调控因子p53表达的DNA分子插入pll3.7(Rubinson and Dillon et al,Nature Genetics,2003；公众可从北京维通达生物技术有限公司；北京大学获得，具体信息和全序列可参考http://www.sciencegateway.org/protocols/lentivirus/pllmap.html)表达载体的Hpa I和Xho I酶切位点间得到的重组载体。

上述干扰转录调控因子p53表达的DNA分子通过正义链5'-TGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTTC-3'（序列8）以及反义链5'-TC GAGAAAAAAGACTCCAGTGGTAATCTACTCTCTTGAAGTAGATTACCACTGGAGT CA-3'（序列9）退火获得到。

2）慢病毒的获得

将重组载体A-H分别转染HEK293T细胞（ATCC,产品目录号CRLv-11268），分别包装得到表达HNF1A的慢病毒、表达HNF6的慢病毒、表达HNF4A的慢病毒、表达ATF5的慢病毒、表达PROX1的慢病毒、表达CEPBA的慢病毒、表达MYC的慢病毒和抑制p53表达的慢病毒。

检测滴度，结果如下：

表达HNF1A的慢病毒的滴度为250ul/1万细胞、表达HNF6的慢病毒的滴度为500ul/1万细胞、表达HNF4A的慢病毒的滴度为100ul/1万细胞、表达ATF5的慢病毒的滴度为500ul/1万细胞、表达PROX1的慢病毒的滴度为100ul/1万细胞、表达CEBPA的慢病毒的滴度为250ul/1万细胞、表达MYC的慢病毒的滴度为10ul/1万细胞和抑制p53表达的慢病毒的滴度为10ul/1万细胞。

抑制p53表达的慢病毒中p53表达降低，详细参照文献J.Biol.Chem.2007,vol282,p5842-5852。

2、人成纤维细胞的制备

将离体的新鲜人胚胎皮肤组织（HEF）和离体的人成体包皮组织（HFF）分别用75％乙醇水溶液消毒并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤；用眼科剪小心分离出皮下组织并剪碎；再用PBS洗几遍，取小组织块接种于培养皿中，放置于在37℃，5%二氧化碳培养箱中；两个小时后加入DMEM高葡萄糖培养基(购自Hyclone公司，产品目录号为SH30022.01B，其中添加15％的胎牛血清(FBS),0.1mMβ-巯基乙醇，1%非必需氨基酸,1mM谷氨酸盐,8单位/ml庆大霉素)；培养3天，移去不能贴壁的组织块；继续培养9天，移去残余的组织块；0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA室温消化细胞5分钟，用上述DMEM高葡萄糖培养基中和，1：3接种于新培养皿中；以后每2天换液，每4天1：3传代，得到人成纤维细胞（源于胚胎皮肤）和人成纤维细胞（源于成体包皮）。

3、人肝脏实质细胞的制备

1）慢病毒感染

将人成纤维细胞（源于胚胎皮肤）培养于哺乳动物体细胞培养基中，每两天更换一次培养基。

病毒感染前一天，将人成纤维细胞按2万细胞/孔的密度接种到含哺乳动物体细胞培养基的12孔细胞培养皿中，在37摄氏度和5%二氧化碳培养条件下培养12小时；再向其中加入10ul上述1得到的表达HNF1A的慢病毒、10ul表达HNF6的慢病毒、6ul表达HNF4的慢病毒、10ul表达ATF5的慢病毒、3ul表达PROX1的慢病毒、3ul表达CEBPA的慢病毒、10ul表达MYC的慢病毒和10ul抑制p53表达的慢病毒进行感染，20小时后更换培养基，之后每天换液；培养7天得到转基因细胞。

通过定量PCR检测，HNF1A、HNF6、HNF4、ATF5、PROX1、CEBPA、MYC以及抑制P53的siRNA在人成纤维细胞中分别有明显表达，证明其能够成功转入人成纤维细胞（图13）。

在病毒感染一周之内观察，看到细胞形态逐渐从成纤维形态转变为上皮形态。

2）、增殖

将转基因细胞传代，并将哺乳动物体细胞培养基更换为肝细胞培养基（HCM购自LONZA公司，货号CC-3198）进行传代培养，每天换液。每4天传代一次；感染后30天，得到人肝脏实质细胞。

在传代培养中细胞快速增殖，细胞形态进一步向上皮转变；在病毒感染后两周，细胞初步转变为典型的人成体肝细胞形态；继续培养直至病毒感染后30天，细胞增殖速度逐渐放缓并逐步获得成熟的功能，得到人肝脏实质细胞。

图1为诱导人肝脏实质细胞流程图。

观察人肝脏实质细胞，结果如图2所示，可以看出，人肝脏实质细胞形态与人原代成体肝脏细胞相似，明显区别于人成纤维细胞。比例尺为100μm。

采用同样的方法由人成纤维细胞（源于成体包皮）获得人肝脏实质细胞。

二、肝脏实质细胞功能检测

下述实验中的人成纤维细胞(HEF)源于胚胎皮肤；人肝脏实质细胞(iHep)为由人成纤维细胞转分化得到的人肝脏实质细胞；新鲜人原代肝实质细胞F-HEP为由北京佑安医院获得。

A）白蛋白（ALB，为肝脏实质细胞的标志蛋白）的ELISA检测

1、试剂制备

包被缓冲液：称取2.12g Na₂CO₃和2.92g NaHCO₃，溶于1L双蒸水中，调节PH值到9.6；

漂洗液：称取6.06g Tris和8.19g NaCl，溶于1L双蒸水中，并加入0.5mlTween20，调节pH值到8.0；

封闭液：称取6.06g Tris、8.19g NaCl和10g BSA，溶于1L双蒸水中，调节pH值到8.0；

样品/酶联抗体稀释液：称取6.06g Tris、8.19g NaCl和10g BSA溶于1L双蒸水中，并加入0.5ml Tween20,调节pH值到8.0；

酶底物：将TMB的两个小瓶里的溶液按照等体积混合；

终止液：量取164ml双蒸水倒入在容积为500ml的玻璃烧杯中，量取20ml浓H2SO4，小心地将浓H2SO4沿烧杯内壁慢慢倒入水中，边倒边搅拌。

2、操作步骤

在上述一得到的人肝脏实质细胞在细胞换液后的24小时，从每个孔（或者培养皿）中取出200μl培养基。并确定需要包被的96孔板的数目。每个样品需要2个孔进行测量，另外每个96孔板需要设立两组相同的标准样（每组8个，共16个）。

1）包被。取出所需数目的96孔板，将捕获抗体（Capture Antibody，Bethyl公司，货号E80-129）按照1：100稀释于包被缓冲液中，然后向每个96孔板的一个孔中加入100μl稀释后的工作液，室温（25℃）放置60分钟；

2）漂洗。吸去包被液，向每个孔中加入200μl漂洗液，然后吸出扔掉。如是重复三遍。包被好的96孔板可以在4度存放过夜；

3）封闭。向每个孔中加入200μl封闭液；室温放置30分钟。按步骤2）漂洗三遍；

4）加入底物。将标准样稀释到400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、0ng/ml八种浓度，将待测样品的浓度稀释到Elisa反应的线性范围。向每个孔中加入100μl稀释好的待测样品和标准样，室温放置1小时。按步骤2）漂洗五遍；

5）加入酶联抗体（Capture Antibody，Bethyl公司，货号E80-129）。将酶联抗体按照1：50,000—1：150,000稀释。然后向每个孔中加入100μl稀释液，室温放置1小时。按步骤2）漂洗五遍；

6）加入底物。向每个孔中加入100μl酶的底物（TMB溶液）。室温放置5分钟，具体根据反应产物的颜色而定。当最高浓度（400ng/ml）的标准样颜色变为深蓝时，即需要终止反应；

7）终止反应。向每个孔中加入100μl的终止液；

8）读出。将96孔板置于酶标仪中，设定读出波长（若使用TMB底物，则读出波长为450nm），读出反应产物的OD值。最高浓度样品的OD值最好在2左右，不能大于3。如果超出此范围，则应调整酶联抗体的浓度和反应时间；

9）计算，将每个样品的两个孔的读出值除以2，取其平均值，然后利用Elisa分析软件（深圳晶美生物工程有限公司提供），计算出每个样品的浓度。

结果如图3所示，其中HEF为人成纤维细胞，iHep为人肝脏实质细胞；F-HEP为新鲜人原代肝实质细胞；可见，人肝脏实质细胞的白蛋白分泌量大约是2微克/天/百万细胞，与成体肝脏细胞白蛋白分泌量相近，远高于人成纤维细胞分泌量（人成纤维细胞是基本检测不到白蛋白的分泌）。

B）糖原染色

操作步骤

1)将上述一得到人肝脏实质细胞用PBS洗一遍，加入4%多聚甲醛室温固定20分钟；

2)PBS洗三遍，加入含0.1%Triton的PBS，室温放置10分钟；

3)PBS洗三遍，加入1%periodic acid溶液，室温放置5分钟；

4)用双蒸水洗三遍，加入Schiff试剂，室温放置15分钟；

5)用双蒸水冲洗10分钟；加入苏木精（Hematoxylin），室温放置1分钟；

6)用双蒸水冲洗5分钟，然后在光镜下进行观察。

结果如图4所示，比例尺100μm，可以看出，人肝脏实质细胞具有糖原合成能力。

C）LDL吸收实验

操作步骤

1)将Dil-Ac-LDL（Invitrogen公司，货号L-3484）用肝细胞培养基HCM稀释到10μg/ml；

2)将上述一制备得到的人肝脏实质细胞弃去培养基，然后加入含Dil-Ac-LDL的新鲜培养基；

3)将细胞放回培养箱，继续培养4小时；

4)将细胞取出，弃去含Dil-Ac-LDL的培养基。用PBS洗三遍；

5)加入4%的多聚甲醛，室温固定20分钟。然后按照免疫荧光的操作步骤进行染色。

结果如图5所示，比例尺100μm，显示人肝脏实质细胞具有低密度脂蛋白内吞能力。

D）吲哚青绿（ICG）吸收和排除实验

1、试剂准备

5mg/ml ICG溶液：将25mg ICG溶解到5ml组织培养级别的水中，过滤除菌，分装。长期保存冻于-20度。短期保存放于4度冰箱；

2、操作步骤

1)将5mg/ml的ICG溶液用培养基稀释到含10%FBS的DMEM中；

2)将上述一制备得到的人肝脏实质细胞弃去培养基，然后加入含ICG的培养基；

3)将细胞放回培养箱，孵育15分钟；

4)将细胞取出，弃去含ICG的培养基，用PBS洗三遍，加入含10%FBS的DMEM；

5)光镜下观察并拍照，然后将细胞放回培养箱中继续培养6小时；

6)6小时后，将细胞取出，给细胞更换新鲜的培养基，光镜下观察并拍照。

结果如图6所示，比例尺100μm，显示人肝脏实质细胞具有ICG的内吞和外排能力。

E)酶活性检测

1、试剂准备

甲醇，各CYP底物，各CYP底物对应的同位素内标，各CYP底物对应的产物即标准品，Rifampicin，β-Naphthoflavone，phenobarbital，William’sMedium E，10mM Heps,PH7.4，GlutaMAX。

2、操作步骤

采用了细胞悬浮测酶活的标准方法，具体操作步骤如下：

1)将上述一制备得到的人肝脏实质细胞iHep、人成纤维细胞（HEF）、HepG2（购自ATCC，货号HB8095）、人原代肝实质细胞F-HEP培养在50μM Rifampicin，50μMβ-Naphthoflavone和1mM phenobarbital的诱导培养基中，培养72小时；

2)再用Accutase或胰酶消化下来，用台盼蓝检测细胞存活率，并用血清计数板计数,新鲜分离的成体肝细胞，直接用台盼蓝检测细胞存活率并计活细胞数；

3)制备细胞悬浮液，用孵育液将各细胞密度调整为每毫升培养液中含1×10⁶个细胞，孵育液的主要成分为：William’s Medium E,10mM Heps,PH7.4,GlutaMAX；

4)制备底物浓储液，底物浓储液使用孵育液配制，各CYP酶的底物及其配制浓度如下：Testosterone,3A4,400μM;Midazolam,3A4,10μM;Phenacetin,1A2,200μM;Bupropion,2B6,1mM;(S)-Mephenytoin,2C19,500μM;Diclofenac,2C9,50μM；

5)将等体积（250μl）细胞悬浮液和底物浓缩液混合于流式管（5ml）中，轻摇混匀，将流式管放置到37度摇床里，孵育15到240分钟；

6)将流式管取出离心1500rpm,5min收集上清400μl于EP管中，EP管预先添加含有同位素内标的3倍体积的甲醇（1200μl），各CYP酶相应底物对应的内标如下：Testosterone,3A4,6β-Hydroxytestosterone-d7;Midazolam,3A4,Hydroxymidazolam-[13C3];Phenacetin,1A2,Acetomidophenol-[13C2,15N];Bupropion,2B6,Hydroxybupropion-[D6];(S)-Mephenytoin,2C19,4′-Hydroxymephenytoin-[D3];Diclofenac,2C9,4′-Hydroxydiclofenac-[13C6]，各内标的终浓度是相应底物浓度的百分之一;

7)将终止后的样品颠倒混匀，储存在-80度冰箱或送至康龙化成通过传统的LC/MS方法检测产物的浓度，结果表示为pmol/min/million cells。

结果如图7所示，1为成纤维细胞，2为HepG2，3为人肝脏实质细胞iHep，4为人原代肝实质细胞样品1，5为人原代肝实质细胞样品2；结果显示人肝脏实质细胞表达与药物代谢相关的酶（CYP3A4（Testosterone,Midazolam），CYP1A2（Phenacetin），CYP2C9（Diclofenac），CYP2B6（Bupropion），CYP2C19（(S)-Mephenytoin）），具有与人原代肝实质细胞接近的代谢能力，显著地区别于人成纤维细胞和肝癌细胞系HepG2。

F)肝毒性检测

将Cadmium,Tamoxifen,Chlorpromazine,Rifampin,Omeprazole,Methapyriliene,Aspirin及Acetaminophen配制成不同浓度梯度的培养液；将上述一制备的人肝脏实质细胞iHep、人原代肝实质细胞培养在上述溶液中24h，细胞存活率通过MTT方法检测。

结果如图8所示，结果显示体外获得的人肝脏实质细胞在多种具有代表性的肝毒性药物处理下，呈现出与人原代肝实质细胞相似的半致死浓度；因此，可被用于体外筛选排除那些有肝毒性的药物前体，为药物筛选提供细胞来源。

G)体内移植

BALB/c背景的Tet-uPA/Rag2-/-/γc-/-小鼠购买自北京维通达生物科技有限公司。

将上述一制备的2X10⁶人肝实质细胞（iHep）、人原代肝实质细胞（F-HEP）和人成纤维细胞（HEF）重悬于100ulPBS中，从脾脏注射到小鼠体内。不同时间收集的血液样本用人白蛋白免疫酶联定量试剂盒(Bethyl Laboratory)来检测白蛋白的分泌水平。

受体鼠的肝脏切片用OCT化合物固定（樱花牌）后保存在液氮中。用于染色的冰冻切片厚度均为10um。

结果如图9所示，人肝脏实质细胞在移植后，可以分泌人血清白蛋白，且其分泌量随着移植时间的延长，逐渐提高（左图）。在移植后第七周分析，发现移植人肝脏实质细胞的小鼠血清中，人白蛋白的分泌量与移植人原代肝实质细胞的小鼠接近（右图）。

移植诱导人肝脏实质细胞的小鼠肝脏中，将受体小鼠的肝脏取出来之后，通过灌流分离出肝细胞，将肝细胞做流式细胞分析，结果显示诱导人肝脏实质细胞的嵌合比例可以到30%（图10）。将移植体分离出来做冰冻切片并免疫组化染色发现，移植体表达药物代谢相关的多种酶（图11）。

实施例2、重编程获得功能性的人肝脏实质细胞

一、将肝癌细胞系恢复为功能成熟的肝细胞

1、慢病毒混合物的制备：与实施例1的一的1一致，得到慢病毒混合物。

2、转分化：与实施例1的一的2基本一致，不同的是将人成纤维细胞替换为肝癌细胞系HepG2（购自ATCC，货号HB8095），得到功能成熟的肝细胞。

二、肝细胞功能检测

将上述二得到的肝细胞进行如下检测：

定量PCR检测引物：

ALB GCACAGAATCCTTGGTGAACAG ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA

CYP2C19 GAAGAGGAGCATTGAGGACCG GCCCAGGATGAAAGTGGGAT

CYP2C9 GCCACATGCCCTACACAGATG TAATGTCACAGGTCACTGCATGG

CYP3A4 AGCCTGGTGCTCCTCTATCT CCCTTATGGTAGGACAAAAT

CYP2B6 CCGGGGATATGGTGTGATCTT CCGAAGTCCCTCATAGTGGTC

结果证明，相同基因组合转入肝癌细胞系HepG2中，得到的功能成熟的肝细胞，能够明显提高HepG2细胞药物代谢相关的关键基因如CYP3A4、CYP2B6等的表达（图12）。

因此，转分化来源的肝细胞和HepG2细胞能够为研究药物代谢提供理想的体外细胞模型，同时也为生物人工肝提供一种理想的新型肝细胞来源。

Claims

1.诱导因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PROX1、CEBPA、MYC和p53基因抑制剂的至少一种在用于诱导产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实质细胞中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述诱导因子为DNA形式，mRNA形式或蛋白质形式；

3.一种用重编程体外制备人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实质细胞的方法，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）的方法如下：将诱导因子导入离体哺乳动物体细胞中，培养，得到转基因细胞，

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述诱导因子为如下1）或2）：

2）所述诱导因子为HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROX1基因、CEPBA基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子中任意三个；

所述体细胞为成纤维细胞、肝癌细胞、胃细胞、角质细胞或血液细胞；

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：

各种所述诱导因子均通过表达其的慢病毒共同导入所述哺乳动物体细胞中；

各种所述诱导因子及其对应的慢病毒如下：

所述HNF1A基因，其对应的慢病毒为表达HNF1A的慢病毒；

所述HNF6基因，其对应的慢病毒为表达HNF6的慢病毒；

所述HNF4A基因，其对应的慢病毒为表达HNF4A的慢病毒；

所述ATF5基因，其对应的慢病毒为表达ATF5的慢病毒；

所述PROX1基因，其对应的慢病毒为表达PROX1的慢病毒；

所述CEBPA基因，其对应的慢病毒为表达CEBPA的慢病毒；

所述MYC基因，其对应的慢病毒为表达MYC的慢病毒；

7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述HNF1A基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；

所述HNF6基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；

所述HNF4A基因的核苷酸序列为序列表中的序列3；

所述ATF5基因的核苷酸序列为序列表中的序列4；

所述PROX1基因的核苷酸序列为序列表中的序列5；

所述CEBPA基因的核苷酸序列为序列表中的序列6；

所述MYC基因的核苷酸序列为序列表中的序列7；

所述培养的时间为以慢病毒感染哺乳动物体细胞起5-14天；

8.由权利要求3-7中任一所述方法得到的哺乳动物肝实质细胞；

或通过转基因或添加诱导因子的方法诱导离体哺乳动物细胞肝脏特异基因的表达而产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的肝实质细胞；

9.一种用于诱导产生具有肝脏代谢功能哺乳动物肝脏实质细胞的试剂盒，为如下1）-3）中任一种：

所述至少一种具体为全部。

10.权利要求9所述的试剂盒在诱导产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实质细胞中的应用；

或权利要求9所述的试剂盒在用重编程制备人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝实质细胞中的应用。

或权利要求8所述哺乳动物肝实质细胞在体外筛药、人工肝、体内移植、肝病如HBV/HCV、疟原虫感染相关研究或人源化肝脏动物模型中的应用。