CN106086077A - 用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106086077A
CN106086077A CN201610526284.7A CN201610526284A CN106086077A CN 106086077 A CN106086077 A CN 106086077A CN 201610526284 A CN201610526284 A CN 201610526284A CN 106086077 A CN106086077 A CN 106086077A
Authority
CN
China
Prior art keywords
slow virus
mcs
virus
carrier
car
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610526284.7A
Other languages
English (en)
Inventor
何昱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Pregene Biopharma Co ltd
Original Assignee
Preckin (tianjin) Biotechnology Co Ltd
Beijing Pregene Biotechnology Company ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Preckin (tianjin) Biotechnology Co Ltd, Beijing Pregene Biotechnology Company ltd filed Critical Preckin (tianjin) Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610526284.7A priority Critical patent/CN106086077A/zh
Publication of CN106086077A publication Critical patent/CN106086077A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了用于CAR‑T制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法，为临床应用提供了检测标准。本发明提供的慢病毒载体具有长度小，能够高效表达CAR基因，包装出足够滴度的慢病毒、而且不表达GFP等与治疗无关的标志基因等优点，经实验验证，该慢病毒载体适用于CAR‑T研究和临床应用。

Description

用于CAR-T制备的慢病毒载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及慢病毒载体及其制备和应用。
背景技术
免疫细胞治疗技术是近几年出现的最新的治疗肿瘤的技术，和现有的手术、放疗、化疗、靶向治疗相比，具有自身不可替代的优势和发展潜力，因此，被称为肿瘤治疗的第五大技术。免疫细胞治疗主要包括传统的CIK(Cytokine Induced Killer cells，CIK)、DC-CIK(Dendritic Cells，DC)和最新的CAR-T技术。CAR-T技术，全称为嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T cells，CAR-T)，CAR主要结构包括细胞外结合肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigen，TAA)的单链抗体结构域和细胞胞浆内活化T细胞的CD28协同刺激信号和CD3ζ信号，该组合的基因工程设计的序列，克隆入慢病毒载体，包装为慢病毒，感染肿瘤患者的T细胞，就制备成功CAR-T，CAR-T回输肿瘤患者后，T细胞表面的单链抗体识别肿瘤细胞TAA，进而活化T细胞，活化的T细胞杀死识别的肿瘤细胞。CAR-T技术从2011年取得突破性进展以来，在白血病和淋巴瘤的大量临床试验中，对白血病取得了93％的缓解率，对淋巴瘤取得了47％的缓解率，对于肺癌、肝癌、胃癌等实体肿瘤，正在进行不同设计、不同临床实施方法的临床试验，逐渐将会报道振奋人心的结果。
在CAR-T技术的实施中，最为关键的是慢病毒载体的构建，尽管慢病毒载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。例如，重组病毒的滴度还不够高，除Naldini等报道的结果外，其余均在101TU/ml～103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要。造成重组病毒滴度低的主要原因之一是慢病毒载体偏大，较大的载体会直接影响到病毒的滴度和T细胞的感染效率。为此，设计、构建、使用合适大小的高效表达的慢病毒载体是CAR-T应用中的关键环节，已成为制约CAR-T技术研究和应用的主要瓶颈之一。
发明内容
本发明公开了一种用于CAR-T制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。该发明还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法，为临床应用提供了检测标准。
本发明提供了一种用于嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)制备的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-MCS，其核苷酸序列如SEQ ID1所示。
本发明还公开了慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-MCS的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：基因合成EF1-MCS序列，两端设置ClaI和MluI限制性内切酶位点，所述EF1-MCS序列如SEQ ID 2所示；
步骤2：用限制性内切酶Cla I和MluI双酶切pLVX-IRES-Puro载体和所述EF1-MCS序列，分别回收酶切后目的产物；
其中，所述EF1-MCS序列可以是直接基因合成得到，也可以是先将基因合成得到EF1-MCS序列连接到合适的质粒载体中，转入大肠杆菌中体内扩增、双酶切制备得到，还可以是针对所述EF1-MCS序列设计PCR引物体外扩增，然后双酶切扩增产物得到；
步骤3：连接步骤2回收获得的酶切后目的产物获得慢病毒表达载体。
本发明还公开了慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-MCS的使用方法，包括下述步骤：
步骤1：将目的基因克隆入Pre-Lenti-EF1-MCS载体获得重组慢病毒载体；
步骤2：将步骤1获得的重组慢病毒载体和psPAX2和pMD2.0G共同转染宿主细胞；
步骤3：培养宿主细胞，所述宿主细胞优选293或293T细胞；
步骤4：分离获得重组慢病毒。
本发明还公开了一种的重组慢病毒载体，该重组慢病毒载体如下方法制备得到：将针对肿瘤相关抗原(TAA)的CAR基因克隆入如Pre-Lenti-EF1-MCS的多克隆位点处。其中所述CAR基因识别的肿瘤相关抗原(TAA)选自CD19、CD20、CD22、CD33、CD138、BCMA、CD38、NKG2D、ROR1、间皮蛋白、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、GD-2或其任意组合。
本发明公开的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-MCS和前述克隆有CAR基因的重组慢病毒载体适用于制备抗肿瘤药物。
本发明还公开了一种测定重组病毒滴度的方法，包括如下步骤：
步骤1：慢病毒包装，用前述克隆有针对肿瘤相关抗原(TAA)的CAR基因的重组慢病毒载体和提供病毒膜蛋白和结构蛋白的包装质粒psPAX2和pMD2.0G共转染宿主细胞，收获重组病毒；
步骤2：制备梯度浓度的DNA样品：按照5-15倍比例梯度浓度稀释步骤1制备得到的重组病毒，制成3-10组等梯度浓度的重组病毒稀释液，用稀释后的等梯度浓度的重组病毒稀释液分别感染相同浓度的293或293T细胞并培养，收集等体积经感染和培养的293或293T细胞分别提取DNA，制3-10组梯度浓度的DNA样品；
步骤3：设计荧光定量PCR引物：设计靶向CAR基因胞内段CD3ζ基因的引物；
步骤4：荧光定量PCR方法测定重组病毒滴度：分别取等量步骤2提取的梯度浓度的DNA样品和步骤3获得的荧光定量PCR引物构建荧光定量PCR扩增体系，相同条件下进行扩增，分析实验结果，用绝对定量的方法测定重组病毒滴度。
本发明提供的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-MCS中设计有能在T细胞高效表达的EF1启动子，且该载体长度小，经实验验证，由Pre-Lenti-EF1-MCS构建的表达嵌合抗原受体(CAR)的重组慢病毒载体可大大提高重组病毒滴度(检测可达2x106TU/ml)，且不表达GFP等与治疗无关的标志基因，适用于CAR-T研究和临床应用。
附图说明
图1：Clontech公司pLVX-IRES-Puro载体图谱
图2：本发明构建的Pre-Lenti-EF1-MCS慢病毒载体图谱
图3.CD19CAR基因PCR产物电泳图，其中，CD19CAR基因：1743bp，
Marker：1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp
图4.菌液PCR鉴定电泳图，其中，CD19CAR基因：1743bp，
Marker：1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp
图5.荧光定量PCR熔解曲线
图6.荧光定量PCR扩增曲线
图7.CD19CAR-T的杀伤率
具体实施例
实施例1.CAR-T用慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-MCS设计和合成
1.1使用Clontech公司的pLVX-IRES-Puro慢病毒载体作为起始载体，pLVX-IRES-Puro大小是8140bp，载体序列见SEQ ID 3，载体图谱见附图1。
1.2合成EF1-MCS序列(中美泰和生物技术有限公司)
使用pDRAW32软件分析pLVX-IRES-Puro载体的序列，发现单酶切位点ClaI(序列ATCGAT，位置2180)和单酶切位点MluI(序列ACGCGT，位置4049)能够切下起始载体上的CMV+MCS+IRES+Puro元件(共切下1870bp长度的序列)，酶切后载体大小为6270bp。使用EF1启动子的序列，加上pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点序列，得到序列EF1-MCS，见SEQ ID 2。合成的EF1-MCS序列，EF1启动子553bp，MCS 38bp，两端分别加上ClaI或MluI的序列。合成基因全长603bp(中美泰和生物技术有限公司)。
1.3酶切pLVX-IRES-Puro载体和含EF1-MCS基因序列的合成载体，酶切体系如下：
反应条件为37℃水浴，酶切2小时。
1.4回收酶切后产物
使用Biomiga胶回收试剂盒(货号：DC-3511-01)
胶回收步骤(参照说明书)：
(1).琼脂糖凝胶产物纯化：从凝胶上割下带有目的片段的凝胶块到一个1.5mL或者2.0mL离心管中，加入1倍体积的Buffer GC，置于55℃水浴中10分钟左右，期间颠倒混匀几次，直至凝胶块完全溶化。冷却离心管至室温。
(2).转移以上混合液(每次不超过700μl)至一个带有收集管的吸附柱中，室温，13,000×g离心1分种，弃废液，将离心柱放回收集管中。重复步骤“2”，直至剩余的混合液全部通过吸附柱。
(3).加入650μl DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下13,000×g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。重复步骤3。
(4).室温下，13,000×g，将吸附柱开盖离心2分钟，去除残留的乙醇。
(5).转移吸附柱至1.5mL收集管中，加入30μl60℃预热的Elution Buffer(10mMTris-HCl,pH8.5)到吸附柱膜中央，室温放置1分钟。13,000×g离心1分种以洗脱DNA。如果想提高收获量，将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次。
1.5连接反应
使用Takara的快速连接试剂盒(货号：6022)
根据载体(酶切过)nmole数：片段(酶切过的目的基因片段)nmole数＝1：3，即：[载体质量(50ng/100ng)/载体分子质量]×3＝片段质量/片段分子量；其中，载体pLVX-IRES-Puro 8140bp，基因序列EF1-MCS 603bp。
连接体系如下：
按上述内容定量加入各组分至1.5mL离心管中(SolutionⅠ冰上加)，充分混匀。16℃水浴30min。
1.6转化，涂氨苄平板
冰上加感受态50μl，冰上孵20～30min；42℃水浴90s；冰上2～5min；加500μl LB复苏1h；4000rpm离心5min，留适量上清液50-100μl重悬，涂板(氨苄抗性)。
1.7挑克隆，摇菌
第二天，待克隆长出后，随机挑取几个克隆，于3ml LB液体培养基内摇菌过夜。
1.8质粒提取
使用Biomiga的无内毒素质粒提取试剂盒(货号：PD1220-02)
(1).取1.7制备得到的菌液。
(2).室温下10,000×g离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
(3).加入250μl Buffer A1，用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
(4).加入250μl Buffer B1,轻轻地反转5-10次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液由粘稠变澄清。
(5).加入60μl Buffer N3,立即反转5次，用手用力摇晃5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
(6).将离心管转至高速离心机，在室温下13,000rpm离心10分钟(若上清中仍有白色沉淀，可再次离心)。
(7).定量吸取离心后的上清液至新的1.5mL管中，加入1倍体积的Buffer RET,(如500μl裂解液加入到500μl的上清液)及250μl的100％ethonal，用手用力甩3次以混匀。
(8).将溶液700μl转移至带有收集管的DNA柱中，室温下13,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。再重复此步骤至全部溶液转移至DNA柱中。
(9).向DNA柱中加入500μl Buffer KB,室温下13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。
(10).向离心柱中加入650μl DNA Wash Buffer(确保已加入无水乙醇)，室温下，13,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“10”。
(11).将离心柱放回高速离心机中，13,000rpm室温下开盖离心2分钟，以彻底去除残留的乙醇。
(12).将离心柱转至一个新的1.5mL离心管中，向DNA柱的正中间加入100μl Endo-Free Elution Buffer，室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟，洗脱质粒DNA。将离心管中的洗脱液再次加到DNA柱的正中间，室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟，收集洗脱液到同一个离心管中。
1.9测序
测序引物如SEQ ID 4所示，测序结果和EF1-MCS合成序列Blast，测序结果完全正确。至此，构建成功了Pre-Lenti-EF1-MCS载体。Pre-Lenti-EF1-MCS全长序列如SEQ ID 1所示，载体图谱见附图2，长度为：6867bp，比pLVX-IRES-Puro慢病毒载体小1273bp。
实施例2 表达CD19CAR慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19的构建
2.1.CD19CAR基因合成
CD19CAR基因序列如SEQ ID 5所示。
2.2引物设计
使用pDRAW32软件分析CD19CAR基因序列，发现单酶切位点EcoRI(识别序列GAATTC)、BamHI(识别序列GGATCC)适合用于基因克隆，能够和Pre-Lenti-EF1-MCS载体的多克隆位点匹配，设计上、下游引物如下，
EcoRI-正向引物序列如SEQ ID 6所示；
BamHI-反向引物序列如SEQ ID 7所示。
2.3PCR扩增：收到合成的序列和引物后，进行PCR扩增，反应体系见下(使用Toyobo的高保真KOD Fx酶)，
反应程序为
PCR产物电泳见附图3。
2.4酶切
酶切反应体系如下：
反应条件为37℃水浴，酶切2小时。
2.5回收酶切后产物，使用Biomiga胶回收试剂盒(货号：DC-3511-01)，步骤同前Pre-Lenti-EF1-MCS载体构建。
2.6连接反应，操作同前Pre-Lenti-EF1-MCS载体构建。
2.7转化，涂氨苄平板，操作同前Pre-Lenti-EF1-MCS载体构建。
2.8挑克隆，摇菌，PCR鉴定，引物为克隆所用引物，反应条件同前2.3PCR扩增，实验结果见附图4。
2.9质粒提取，使用Biomiga的无内毒素质粒提取试剂盒(货号：PD1220-02)，步骤同前Pre-Lenti-EF1-MCS载体构建。
2.9测序
测序引物为：Pre-up-Seq如SEQ ID 8所示；Pre-down-Seq如SEQ ID 9所示；
测序结果经和CD19CAR基因比对，完全正确。至此，得到CD19CAR慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19。
实施例3.Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19慢病毒包装
3.1慢病毒包装遵循常规方法，大致如下：
3.1.1细胞培养293T细胞培养于37℃，5％CO2孵箱内，培养基为DMEM/HighGlucose/10％FBS。
3.1.2种植细胞包装病毒前一天，胰酶消化293T细胞，5×106细胞/孔种植10cm培养皿，准备包装Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19慢病毒。
3.1.3细胞转染细胞转染时，除了使用Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19质粒外，每种质粒还需要和包装质粒(提供病毒膜蛋白和结构蛋白)psPAX2、pMD2.0G共转染。其中
Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19使用5μg，psPAX2使用3.75μg，pMD2.0G使用1.25μg。转染时，将以上三种质粒的混合物加入500μl MEM培养基内，在另一个微型离心管内将25μl
Lipofectamine 2000转染试剂加入500μl MEM培养基内，然后，将稀释后的转染试剂加入稀释后的质粒上方，混匀，离心，室温静置20分钟；时间到后，将质粒和转染试剂的混合物加入10cm培养皿内，摇晃、混匀，放入孵箱。
3.1.4收获病毒细胞转染3天后，可以收获病毒，将9ml含病毒培养基转入50ml离心管内，4℃，1500rpm，离心5分钟，去除死亡的293T细胞，然后，将含病毒培养基过滤分装，-80℃冻存。
实施例4.荧光定量PCR测定病毒滴度
4.1测定前一天，种植293T细胞至24孔板，2×105个细胞/孔，一种病毒准备4个孔；
4.2第二天，感染病毒；
首先10倍比例系列稀释病毒，具体为首先在1.5ml离心管准备180μl细胞培养基，第一管内加入20μl病毒原液，吹打混匀，移出20μl稀释后的病毒液至第二管，吹打混匀，依次往后稀释，得到的每管内的病毒液为20μl、2μl、0.2μl、0.02μl，吸掉24孔板内培养基，加入稀释过的病毒液；CO2孵箱培养72h；
4.3DNA提取(组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒，博迈德生物技术有限公司)，参照说明书，简要步骤如下，
收集105-106细胞到1.5ml离心管中，13000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来，弃去上清，加200μl1×PBS重悬洗涤，13000rpm离心10秒，弃上清，180μl1×PBS重悬，加入4μlRNaseA(10mg/ml)溶液，振荡15秒，室温静置5min，再加入20μl蛋白酶k(20mg/ml)溶液充分混匀，然后加入200μl结合液CB，立即涡旋振荡混匀，在70℃放置10分钟，冷却后加100μl异丙醇，立即涡旋振荡混匀，将混合物加入吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心60秒，倒掉收集管废液，加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃废液，再加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒,洗2次，再将吸附柱放回空收集管，13000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液，取出吸附柱AC，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加入100μl洗脱缓冲液EB(先70℃水浴中预热),室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟，将所得液体再加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，收DNA。
4.4荧光定量PCR
4.4.1设计荧光定量PCR引物，锚定CD19CAR基因的CD3ζ链，产物164bp，
CD3ζ-正向引物如SEQ ID 10所示，CD3ζ-反向引物序列如SEQ ID 11所示。
4.4.2用THUNDERBIRD SYBRqPCR Mix(Toyobo)进行扩增，实验操作按产品说明书进行，反应体系为：
扩增程序：95℃60sec，(95℃15sec，60℃15sec，72℃45sec)×40个循环，
熔解曲线如附图5所示。
扩增曲线如附图6所示。
4.4.3标准曲线和滴度计算：
标准曲线样品用Pre-Lenti-EF1-MCS质粒换算为拷贝数,根据质粒浓度和分子量将样品稀释成4000拷贝数/μl、400拷贝数/μl、40拷贝数/μl、4拷贝数/μl、0拷贝数/μl，具体如下表：
表1标准曲线样品Ct值和病毒拷贝数对应表
测算测定病毒的滴度方法，具体为：20μl的ct均值为22.46，将该值代入y＝-0.371x+11.98得4.01，4×104.01＝41510.8，就说明20μl病毒感染的该孔中拷贝数为41510.8,10μl就有20755.4个拷贝，所以该病毒滴度就是2.1×106/ml.取平均值为2.25×106/ml，即包装所得Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19病毒的滴度为2.25×106pfu/ml。
表2标准曲线样品Ct值、病毒拷贝数和病毒滴度对应表
实施例5.CD19CAR-T制备和杀伤实验
5.1PBMCS分离
(1)抽血：在无菌的条件下抽取人体的静脉血。
(2)稀释：将获得的血液用相同体积的1640培养基(RPMI Medium Modified)稀释。
(3)在离心管中加入血液稀释完后的体积的二分之一的“人淋巴细胞分离液”(Human Lymphocyte Separation Medium，达科为生物工程有限公司)。
(4)用移液枪将血液贴壁缓慢的加入到离心管中，保证血液在分离液的上层。
(5)将离心管放入低温高速离心机中以700g在22℃下离心25分钟。使得血液在分离液中发生分层。
(6)淋巴细胞在组织匀浆层和分离液之间的白膜层中，
(7)用84滴管尽量将白膜层吸到另一支离心管中。注意不要吸到分离液。
(8)将离心管放入低温高速离心机中以250g在22℃下离心10分钟。
(9)吸掉上层的液体，用加人白介素-2(IL2)的含灭活血清的1640培养基重悬，计数。
5.2T细胞纯化
(1)将分离出来的淋巴细胞计数，取个淋巴细胞于微型离心管中。
(2)将微型离心管放入低温高速离心机中以250g在22℃下离心10分钟。
(3)吸除上层液体，并用80μl磁珠分离缓冲液重悬，并加入20μl的CD3MicroBeads。
(4)在4℃的冰箱中放置1小时，并将磁体放入生物安全柜中灭菌。
(5)1小时之后在微型离心管中加入1mL的缓冲液。再在低温高速离心机以317g，在5℃离心10分钟。此时准备过滤柱子，将过滤柱安放在磁铁上，用500μl的缓冲液洗，缓冲液随着重力向下流。
(6)离心弃上清，细胞用500μl的缓冲液重悬，并加入柱子，下面用离心管接收废液。缓冲液随着重力向下，并用500μl的缓冲液冲洗四次。
(7)冲完之后，将柱子从磁铁上取下来，并用1mL缓冲液将T细胞冲下来。
(8)将冲下来的细胞在低温高速离心机以317g，在5℃离心10分钟。
(9)最后用加了IL2的含灭活血清的1640培养基重悬，计数。
5.3T细胞慢病毒感染
(1)将纯化的T计数，1×106个T细胞/孔(6孔板)种植，培养过夜后，加入MOI为2的对照病毒液(空载体包装，Control)和Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19病毒液，感染过夜。
(2)感染第二天，加入1ml新鲜培养基。
(3)感染后第三天，T细胞已充分活化，增殖旺盛，此时将T细胞转入25cm2小培养瓶。
(4)感染5天后，进行杀伤实验。
5.4杀伤实验
(1)计数表达CD19分子的Raji细胞，1×104个Raji细胞/孔(96孔板)；计数病毒感染的T细胞(Control病毒液感染的Control T细胞和Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19病毒感染的CD19CAR-T细胞)，按照效靶比10:1,5:1,2.5:1的比例加入Raji细胞上层，实验设计如下表：
表3杀伤实验设计表
5.5杀伤测量
使用Promega试剂盒(CytoTox 96非放射性细胞毒性检测，货号：G1780)通过测量死亡细胞的LDH酶得到CAR-T细胞杀死Raji细胞的百分率。操作照试剂盒说明书，
(1)杀伤实验进行4小时后，最大释放孔加入试剂盒提供的10×细胞裂解液。
(2)2小时后，每孔取50μl上清，加入50μlLDH反应底物，反应20分钟后，于酶标仪测量492nm处吸光度OD492。
5.6杀伤率计算
按照公式“％细胞毒性＝[(实验-效应细胞自发-靶细胞自发)/(靶细胞最大-靶细胞自发)]×100”计算杀伤率，其中实验孔为不同效靶比得到的OD492，效应细胞自发为Control T细胞或CD19CAR-T细胞单独的OD492，靶细胞自发为Raji单独(最小释放)，靶细胞最大为Raji单独(最大释放)。计算得到的杀伤率见附图7，表明我们构建的Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19载体能够成功地包装为慢病毒，制备CAR-T，具有杀伤功能，完全能够满足CAR-T研究和应用的需要。

Claims (10)

1.用于CAR-T制备的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为Pre-Lenti-EF1-MCS，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。
2.如权利要求1所述的慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：基因合成EF1-MCS序列，两端设置ClaI和MluI限制性内切酶位点，所述EF1-MCS序列如SEQ ID 2所示；
步骤2：用限制性内切酶Cla I和MluI双酶切pLVX-IRES-Puro载体和所述EF1-MCS序列，分别回收酶切后目的产物；
步骤3：连接步骤2回收获得的酶切后目的产物获得慢病毒表达载体Pre-Lenti-EF1-MCS。
3.如权利要求1所述慢病毒载体的使用方法，包括下述步骤：
步骤1：将目的基因克隆入Pre-Lenti-EF1-MCS载体获得重组慢病毒载体；
步骤2：将步骤1获得的重组慢病毒载体和psPAX2和pMD2.0G共同转染宿主细胞；
步骤3：培养宿主细胞；
步骤4：分离获得重组慢病毒。
4.如权利要求3所述慢病毒载体的使用方法，其特征在于，所述宿主细胞为：293或293T细胞。
5.一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体由如下方法制备得到：将针对肿瘤相关抗原(TAA)的CAR基因克隆入如权利要求1所述Pre-Lenti-EF1-MCS的多克隆位点处。
6.如权利要求5所述的重组慢病毒载体，其特征在于，其中所述CAR基因识别的肿瘤相关抗原(TAA)选自CD19、CD20、CD22、CD33、CD138、BCMA、CD38、NKG2D、ROR1、间皮蛋白、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、GD-2或其任意组合。
7.如权利要求1所述的慢病毒载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求5或6所述的重组慢病毒载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种测定重组病毒滴度的方法，包括如下步骤：
步骤1：慢病毒包装：用如权利要求5所述慢病毒载体和提供病毒膜蛋白和结构蛋白的包装质粒共转染宿主细胞，收获重组病毒；
步骤2：制备梯度浓度的DNA样品：按照5-15倍比例梯度浓度稀释步骤1制备得到的重组病毒，制成3-10组等梯度浓度的重组病毒稀释液，用稀释后的等梯度浓度的重组病毒稀释液分别感染相同浓度的宿主细胞并培养，收集等体积经感染和培养的293或293T细胞分别提取DNA，制3-10组梯度浓度的DNA样品；
步骤3：设计荧光定量PCR引物：设计靶向CAR基因胞内段CD3ζ基因的引物；
步骤4：荧光定量PCR方法测定重组病毒滴度：分别取等量步骤2提取的梯度浓度的DNA样品和步骤3获得的荧光定量PCR引物构建荧光定量PCR扩增体系，相同条件下进行扩增，分析实验结果，用绝对定量的方法测定重组病毒滴度。
10.如权利要求9所述的测定重组病毒滴度的方法，其特征在于所述提供病毒膜蛋白和结构蛋白的包装质粒为psPAX2和pMD2.0G，所述宿主细胞为293或293T细胞。
CN201610526284.7A 2016-07-05 2016-07-05 用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用 Pending CN106086077A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610526284.7A CN106086077A (zh) 2016-07-05 2016-07-05 用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610526284.7A CN106086077A (zh) 2016-07-05 2016-07-05 用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106086077A true CN106086077A (zh) 2016-11-09

Family

ID=57212256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610526284.7A Pending CN106086077A (zh) 2016-07-05 2016-07-05 用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106086077A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636003A (zh) * 2017-01-24 2017-05-10 北京普瑞金科技有限公司 一种全人源化EGFRvIII嵌合抗原受体T细胞及其制备方法
CN106822184A (zh) * 2016-12-15 2017-06-13 梁爱斌 多靶点联合的car‑t细胞制剂与制备方法
CN107034237A (zh) * 2017-03-31 2017-08-11 北京呈诺医学科技有限公司 一种car‑nk细胞及其制备方法与应用
CN107557388A (zh) * 2017-07-26 2018-01-09 生研医药科技（武汉）有限公司 一种用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用
CN107937428A (zh) * 2017-11-28 2018-04-20 马晓冬 一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法
CN109439632A (zh) * 2018-11-16 2019-03-08 中国科学院合肥肿瘤医院 一种提高car-t细胞转染效率的方法
CN109554447A (zh) * 2018-12-19 2019-04-02 武汉波睿达生物科技有限公司 慢病毒载体在car-t细胞中的整合位点分析方法及引物
CN112111606A (zh) * 2020-09-24 2020-12-22 深圳普瑞金生物药业有限公司 检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1606456A (zh) * 2001-10-02 2005-04-13 克雷顿研究院 限制性表达慢病毒载体
WO2014207173A1 (en) * 2013-06-27 2014-12-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin 15 (il-15) antagonists and uses thereof for the treatment of autoimmune diseases and inflammatory diseases
CN104830906A (zh) * 2014-02-12 2015-08-12 北京维通达生物技术有限公司 一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方法
CN105949325A (zh) * 2016-07-08 2016-09-21 重庆精准生物技术有限公司 包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1606456A (zh) * 2001-10-02 2005-04-13 克雷顿研究院 限制性表达慢病毒载体
WO2014207173A1 (en) * 2013-06-27 2014-12-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin 15 (il-15) antagonists and uses thereof for the treatment of autoimmune diseases and inflammatory diseases
CN104830906A (zh) * 2014-02-12 2015-08-12 北京维通达生物技术有限公司 一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方法
CN105949325A (zh) * 2016-07-08 2016-09-21 重庆精准生物技术有限公司 包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姜丽翠 等: "嵌合体抗原受体修饰的T细胞对CD19+套式淋巴瘤细胞的杀伤", 《免疫学杂志》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106822184A (zh) * 2016-12-15 2017-06-13 梁爱斌 多靶点联合的car‑t细胞制剂与制备方法
CN106636003A (zh) * 2017-01-24 2017-05-10 北京普瑞金科技有限公司 一种全人源化EGFRvIII嵌合抗原受体T细胞及其制备方法
CN107034237A (zh) * 2017-03-31 2017-08-11 北京呈诺医学科技有限公司 一种car‑nk细胞及其制备方法与应用
CN107034237B (zh) * 2017-03-31 2018-10-16 北京呈诺医学科技有限公司 一种car-nk细胞及其制备方法与应用
CN107557388A (zh) * 2017-07-26 2018-01-09 生研医药科技（武汉）有限公司 一种用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用
CN107937428A (zh) * 2017-11-28 2018-04-20 马晓冬 一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法
CN107937428B (zh) * 2017-11-28 2021-08-06 马晓冬 一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法
CN109439632A (zh) * 2018-11-16 2019-03-08 中国科学院合肥肿瘤医院 一种提高car-t细胞转染效率的方法
CN109554447A (zh) * 2018-12-19 2019-04-02 武汉波睿达生物科技有限公司 慢病毒载体在car-t细胞中的整合位点分析方法及引物
CN112111606A (zh) * 2020-09-24 2020-12-22 深圳普瑞金生物药业有限公司 检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法
CN112111606B (zh) * 2020-09-24 2023-10-03 深圳普瑞金生物药业有限公司 检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106086077A (zh) 用于car‑t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用
CN105602992B (zh) 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN105924533B (zh) Ror1特异性嵌合抗原受体及其应用
CN108409840B (zh) 抗cd123单链抗体及其组合的嵌合抗原受体和应用
CN107868791A (zh) 一种加强型Slit2 CAR‑T和CAR‑NK细胞制备方法和应用
CN109593786A (zh) 联合EpCAM和MSLN单链抗体的双靶点CAR载体及其构建方法和在乳腺癌应用
CN105949316B (zh) 抗EGFRvIII嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN106279432B (zh) 一种vc-car分子及在清除hiv-1感染细胞中的应用
CN105820255B (zh) 抗cd33嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN105950664B (zh) 一种靶向cd123的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN107384870A (zh) 一种靶向pd‑l1嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN110964697A (zh) 一种抗肿瘤nk细胞及其制备方法和应用
CN105820254B (zh) 抗cd138嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
CN108103105A (zh) 一种car-t细胞的制备方法、制得的car-t细胞及其应用
CN106350533A (zh) Anti‑PD‑L1‑CAR‑T及其制备方法和应用
CN107759699A (zh) 靶向cd30抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用
CN108641000A (zh) 肝癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
WO2018218879A1 (zh) 一种基于octs技术的胰腺癌、恶性间皮瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108203720A (zh) 能靶向Her2并封闭PD-L1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体及其构建方法和应用
CN104829710A (zh) 一种抗埃博拉病毒的免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法
CN108220251A (zh) 一种重组传染性脓疱溶瘤病毒及其制备方法与应用
CN108285486A (zh) 以cd20为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
CN111138548A (zh) 一种egfr靶向性的嵌合抗原受体、car-nk细胞及其制备方法、应用
CN109680003A (zh) 靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白fshr的car载体及其构建方法和应用
CN109628492A (zh) 联合MSLN单链抗体和PD-1mAb杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Zi street Jinhui road Shenzhen city Guangdong province 518122 Pingshan District pit No. 14 Shenzhen Biomedical Innovation Industrial Park, building 1, 402

Applicant after: SHENZHEN PREGENE BIOPHARMA Co.,Ltd.

Applicant after: PREGENE (TIANJIN) BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Address before: 100190 Zhichun Road, Haidian District, Haidian District, No. 5411, room 5, room 5

Applicant before: BEIJING PREGENE TECHNOLOGY CO.,LTD.

Applicant before: PREGENE (TIANJIN) BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180206

Address after: Zi street Jinhui road Shenzhen city Guangdong province 518122 Pingshan District pit No. 14 Shenzhen Biomedical Innovation Industrial Park, building 1, 402

Applicant after: SHENZHEN PREGENE BIOPHARMA Co.,Ltd.

Address before: Zi street Jinhui road Shenzhen city Guangdong province 518122 Pingshan District pit No. 14 Shenzhen Biomedical Innovation Industrial Park, building 1, 402

Applicant before: SHENZHEN PREGENE BIOPHARMA Co.,Ltd.

Applicant before: PREGENE (TIANJIN) BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161109