CN1606456A - 限制性表达慢病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使转基因在人源造血祖细胞以及其他所有血细胞衍生物内安全、高效而且强劲表达以便于进行人体基因治疗的HIV来源的慢病毒载体。该慢病毒载体含有能使转基因在特定细胞或组织内特异性表达的启动子。而且启动子受活化因子、增强子或抑制因子的调控。这些载体具有自身灭活特性因而具有很高的生物安全性。本发明对其他的启动子也作了描述。载体还可以含有附加的转录增强元件如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，但其特异性和控制启动子的能力并没有下降。这些载体可作为基因治疗的工具用于治疗遗传性和获得性淋巴造血系统疾病、肿瘤特别是造血系统的肿瘤，以及用于通过慢病毒载体介导的人HSCs的基因改造来研究造血功能。

Description

限制性表达慢病毒载体
发明背景
本发明的权利要求得益于2001年10月2日提交的美国临时申请60/326,593号，其全文已被纳入本文作为参考。
1.发明领域
本发明涉及改进型慢病毒载体及其在基因转导和使转移的转基因在靶细胞内高水平表达中的应用，特别是慢病毒载体转染的人造血干细胞来源(hHSC)的分化血细胞。
2.关领域的说明
通过人造血干细胞(hHSC)的转导进行基因治疗代表了一种非常有前景的治疗多种遗传性和获得性淋巴造血系统疾病的方法。但是，利用现有的基因转移系统对经长期再生的hHSC进行基因改造不可能获得很高的效率以满足治疗的要求。例如，尽管莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)来源的癌基因逆转录病毒载体因其能整合到靶细胞的染色体内而被广泛应用，但也无法用于转染未经增殖诱导因子处理的hHSC(Kohn等，1991；Mazurier等，1998)。实际上在MLV预整合复合物进行核转移的时候需要有丝分裂时形成的核包膜破裂(Roe等，1993；Lewis和Emerman，1994)。不幸的是，不论是从骨髓、脐带血(UCB)中采集的hHSC还是从外周血中动员的hHSC，在经过持续的诱导刺激和增殖后大多数都失去了分裂或多潜能分化的能力(Bhatia等，1997；Dao等，1997；Dorrell等，2000)。但是最近的文献说明利用特殊的刺激条件可以使一部分多潜能细胞以及能在非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内长期植入的细胞维持生存、转化甚至扩增能力(Dorrell等，2000；Dao等，1998；Piacibello等，1999；Ueda等，2000)。
慢病毒是逆转录病毒的一个亚型，其整合复合前体的亲核特性可以使其感染非分裂的细胞，该复合体使病毒通过核孔进入核内。因此，人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)来源的慢病毒载体能够在体内和体外介导基因向非有丝分裂的细胞内有效转移、并在细胞内整合和长期表达(Naldini等，1996a；Naldini等，1996b；Blomer等，1997)。特别是HIV来源的载体可以在缺乏细胞因子刺激的条件下高效地转导人CD34+造血干细胞(Akkina等，1996；Sutton等，1998；Uchida等，1998；Miyoshi等，1999；Case等，1999)。这些细胞能在NOD/SCID小鼠体内长期植入(Miyoshi等，1999)。这些初级受体来源的骨髓转导细胞可以在次级小鼠体内重建集落，说明慢病毒介导的基因转导的靶细胞是非常原始的造血祖细胞，很有可能是真正的干细胞。由于目前的其他基因转移系统都不具有这种能力，因此慢病毒载体为造血干细胞的研究以及通过hHSC的基因改造进行遗传性和获得性淋巴-造血系统疾病的基因治疗提供了一个前所未有的基础条件。
但是很重要的一点是前几代的慢病毒载体不能用于基因治疗，因为这些基因无法满足生物安全性的需要(Akkina等，1996；Sutton等，1998；Uchida等1998)，或者因为其所转导的基因表达水平非常低(Miyoshi等，1999；Case等，1999；An等，2000)。因此需要改造慢病毒载体以使其能高效地转导造血细胞，特别是造血祖细胞，并且能使转导的转基因高效表达。
理想的干细胞基因治疗方法应该能有效转导HSCs，同时考虑到干细胞的可塑性，还应该使治疗基因在特定的成熟血细胞系中限制性表达。第三代慢病毒载体是目前最理想的人静止HSC基因转导载体。而且，其自身灭活元件(SIN)提供了不受上游LTR干扰的组织特异性启动子。
发明概述
本发明涉及改进型慢病毒载体的开发，该载体既满足生物安全性的要求，又能在需要时被刺激诱导所转导的基因以组织特异性或干细胞系特异的方式高效表达。另外，本发明还提供了一种通过转录活化或转录灭活控制基因在转导细胞内表达的方法，转录活化或转录灭活是通过转录调节因子调节启动子或增强子而实现的。
本发明相应地描述了特别适于转导人造血祖细胞及在特殊分化造血细胞系内或在特异性转录因子调控下进行基因表达的基因转移载体。这些载体进一步促进了慢病毒载体在造血干细胞基因改造中的应用，特别适用于研究及治疗目的。本发明所涉及的细胞类型包括未成熟的血细胞、成熟血细胞、嗜中性白细胞、单核细胞/巨噬细胞和粒细胞。
但是本领域的技术人员应该明白本发明不仅仅局限于造血细胞的转导，也可以利用本发明的慢病毒载体转导其他类型的细胞以使转基因在该细胞内特异性表达。其他类型的细胞包括终末分化细胞如神经元、肺细胞、肌细胞、肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、心肌细胞、皮肤细胞、骨髓基质细胞以及眼细胞。另外，干细胞和前体细胞如胰腺导管细胞、神经元前体细胞及中胚层干细胞也可以考虑。
因此从整体意义上讲，本发明涉及能转染或转导人造血祖细胞或干细胞(hHSC)并能使转基因在这类细胞内高效表达的改进型载体。
另外，本发明还涉及这些转基因的限制性表达，也就是说其表达是可调节的，可以在HSC特异性传代细胞系内表达或在转录激活物的刺激下表达。本发明的载体也可以是自身灭活的慢病毒载体，载体内含有特定的自身灭活元件从而使这些载体在用于人体时是安全的。这些自身灭活元件或SIN元件包括对载体LTRs的改造以重建慢病毒基因组的复制子。在一个特别优选的实施方式中，SIN元件包含了3’LTR U3区内的核苷酸缺失。
本发明的慢病毒载体首先提供了一种使转基因在基因改造hHSCs的分化传代细胞内达到可控的、细胞特异的、高效表达的有效方法。人HSCs是难以被转导的，因为在未被刺激的状态下这些细胞对以前的载体系统介导的转导是排斥的。本发明的慢病毒载体有能力转染非分裂的细胞，因为这种载体的整合复合前体具有亲核特性，能使其通过核孔进入核内。而且本发明优选的慢病毒载体即使在没有细胞因子刺激的情况下也能在体内和体外介导转基因在非有丝分裂的细胞内有效转移、整合及适当地或长期地表达。被本发明的优选慢病毒载体转导的干细胞能在NOD/SCID小鼠体内长期植入。然而，尤其值得注意的是本发明的优选慢病毒载体具有较优越的特点，即可以使转基因在特异的人前体细胞或成熟的分化细胞内受控制的、又是高效的表达，同时又符合人体生物安全性的要求。
因此本发明的病毒载体一般是指重组载体，至少含有慢病毒的gag、pol和rev基因，或者病毒复制所需要的那些基因，利用病毒生产者细胞系这些基因可以使载体以合理的数量复制。为了满足人体生物安全性的要求，本发明的优选载体不含有慢病毒的任何其他活性基因，如vpr、vif、vpu、nej、tat。这些基因可以被去除，也可以被灭活。较好的是载体内存在的活性慢病毒基因只有上述的gag、pol和rev。
用于制备本发明慢病毒载体的慢病毒基因和骨架(即长末端重复序列或LTRs)的最佳组合为人免疫缺陷病毒(HIV)来源的、更好的是HIV-1来源的。
因此，gag、pol和rev基因优选HIV的基因，更好的是HIV-1的基因。
但是，其他慢病毒的gag、pol和rev基因以及LTR区也可以用于本发明的某些特定目的，包括HIV-2、类人猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、马感染性贫血病毒、羊关节炎脑炎病毒等。这些构建子在改造某些非人源的细胞时是有用的。但是，HIV来源的载体骨架(即HIV LTR和HIV的gag、pol和rev基因)在本发明的绝大多数情况下是优选的，因为HIV来源的构建子在转导人造血祖细胞时最有效。
本发明的病毒载体还包含一个表达盒，该表达盒含有一个位于启动子控制之下的转基因，启动子活化后能促使转基因在人细胞内可测转录。在一个优选实施方式中，启动子活化后能促进转基因在人源造血祖细胞内转录。在一个更优选的实施方式中，启动子活化后能促进转基因在特殊类型的细胞或前体细胞的子代细胞内转录。本发明还有一个优选实施方式，其中的启动子通过转录控制因子或活化因子和抑制因子对其进行活化或抑制从而控制基因的转录。
本发明所用的启动子优选gp91-phox、gp47-phox、CD11b、EF1-α、PGK、β球蛋白启动子、MHC II类启动子、凝血因子IX启动子、胰岛素启动子、PDX1启动子、CD11、CD4启动子和CD2的启动子。
其中gp91-phox的启动子是最好的。该启动子能控制基因在所需要的特定类型的细胞内表达，其中主要是促进转基因在单核细胞和粒细胞内表达，同时其活性通过启动子与活化因子特别是干扰素γ的相互作用而受到调节。但是，在任何情况下，本发明的启动子都不限于上面所述的范围，只要启动子在前体细胞、造血细胞或其他细胞等靶细胞内是有活性的，或者能控制转录活动，都包括在本发明的范围之内。
为了确定一个启动子是否有用，将所选择的启动子在体外插入到构建体中，然后导入选定的前体细胞内，如果在一个可检测的信噪比水平上启动子能促进转基因的表达，就说明该启动子能用于本发明中。期望的信噪比约为10到200，较好的约为40到200，最好的约为150到200。一种检测启动子的方法是利用信号产生基因如绿色荧光蛋白基因(GFP)，下面有该方法的详细描述。
本发明还提供了一种增强转导效率的方法，该方法是在载体内插入一个中央多聚嘌呤簇(cPPT)。转导效率可以达到20％、30％、40％、50％、60％、70％或高达80％。在一个优选实施方式中，cPPT位于启动子序列的下游。cPPT序列由序列号为SEQ ID NO：1的核苷酸序列举例说明。
本发明还有一个优点就是包含独特的多克隆位点。该位点是限制性内切酶识别的位点，其序列与载体内的其他序列不同。几个这样的位点一起构成了独特的多克隆位点。
这些位点优选位于cPPT和启动子之间，或者位于cPPT的上游，尽管这些位点位于其他地方可能便于将多聚核苷酸插入载体或从载体中切除。例如，从这些多克隆位点上可以很容易地将外源片断插入到载体序列中，从而易于实现本发明。
上面所提到的启动子还可以含有转录所需要的元件，并且作为转录盒的一部分。转录盒定义为含有一个或多个启动子元件和增强子和/或位点控制区的序列，启动子与增强子和/或位点控制区结合在一起，后者能保证转基因的高效表达或组织特异的表达。一个或多个增强子可以位于载体的任何位置，他们调节转基因表达的活性最强。为了使转基因在分化的靶细胞内达到最高水平的表达，增强子还可以是分化靶细胞特异的增强子。细胞特异的增强子包括HS位点。HS位点是已知的β球蛋白、CD2和gp91的增强子，但是其他的HS或HS型的位点也可以被使用。例如成红细胞的GATA-1增强子。
人类基因组序列的应用大大促进了这类元件的鉴定，这些也可以作为本发明的一部分。
一组特别优选的增强子和绝缘体元件位于位点控制区(LCR)内，被定义为DNA酶超敏位点。这些HS位点的增强子活性被认为具有染色质区的解链活性，因此能促使转录因子接近染色质，刺激增强子与启动子结合因子之间的蛋白-蛋白相互作用，并且是定义结构域之间的界限所需要的。顺式存在于启动子-基因盒上的HS位点提供了一种高水平的不依赖于整合位点的表达。这些元件可以单个也可以多个存在于转基因序列的上游或下游。在本发明的一个最优选实施方式中，HS位点临近CPPT元件的上游和下游之间，并且整体位于启动子的上游。因此这些HS位点可以被插入到上述的多个独特的克隆位点上。所谓的临近意味着在从参考元件即启动子元件的边界开始扫描载体序列时该元件即cPPT元件是所遇到的在功能的重要性上处于第一位的元件。
在某些情况下，如启动子在某些转导的靶细胞内的活性仅仅是温和的，就需要利用一个转录后调节序列来促进转基因的表达。一类转录后调节序列是位于表达盒内的内含子，它可以刺激基因的表达。但是，以这种方式存在的内含子可能会将慢病毒RNA转录物置于正常的细胞剪接和处理过程中。
因此在一个特殊的实施方式中，需要将含内含子的转基因置于与载体基因组转录物相反的位置上。
一个较好的增强转基因表达的方法是通过利用转录后调节元件，该调节元件不依赖剪接事件，如单纯疱疹病毒的转录后处理元件、乙型肝炎病毒(HPRE)或土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的转录后调节元件，WPRE的转录后调节元件中含有一个额外的顺式作用元件，这是HPRE所没有的。调节元件位于载体内，因此可以被包括在转基因的RNA转录物之内，但是却在转基因翻译单位的终止密码子之外。现已发现这样的调节元件特别适合用在具有温和启动子的条件下，但是对于具有非常高效启动子的情况可能是不合适的。
我们特别希望将LTR区插入到本发明的慢病毒载体中，该LTR相对于野生型的LTR来说其启动子活性弱化，因此这种构建子具有自身灭活(SIN)的生物安全性特征。自身灭活载体是一种在转导细胞内全长载体RNA产物被大大简化或剪切掉的载体。这个特点可以大大降低产生有复制能力的重组子(RCRs)的风险。而且还可以降低临近载体整合位点的细胞编码序列异常表达的危险。另外，SIN还可以减少LTR与控制基因表达的启动子之间相互干扰的可能性。因此，它特别适于发现全能性的内部启动子。
优选的自身灭活特性是通过在载体DNA3’LTR的U3区删除一段序列来实现的，载体DNA就是产生载体RNA的DNA序列。因此在反转录过程中，删除转移到前病毒DNA的5’LTR上。我们希望删除足够的U3序列以便最大限度地降低LTR的转录活性，从而大大降低在转导细胞内产生全长载体RNA的可能性。但是，我们通常期望保留LTR中参与病毒RNA多聚腺苷酸化的那些元件，这种功能不仅仅局限于U3、R和U5。因此就需要尽量从LTR上删除具有转录活性的序列而保留参与多聚腺苷酸化的序列。对于HIV来源的慢病毒来说，已经发现这种载体可以耐受U3区的大片段删除，包括删除LTR的TATA框，(即删除-428到-18)，该删除不会导致载体滴度的明显下降。这些删除使LTR区的转录活性基本被灭活，LTR的转录能力下降约90％或更多。在一个优选实施方式中，LTR的转录能力下降约95％到99％。因此，LTR可以提供约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、到99％的转录灭活。
本发明的慢病毒载体被认为可以根据需要用于转移任何转基因。在转导造血祖细胞的例子中，一般选择一个能在此类细胞中发挥所期望功能的基因，包括球蛋白基因、造血生长因子如红细胞生成素(EPO)基因、白细胞介素(如白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-12(IL-12)等)以及集落刺激因子(如粒细胞集落刺激因子，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子或干细胞集落刺激因子)、血小板特异的整合素αIIbβ、多药物抗性基因、慢性肉芽肿患者所缺乏的gp91-phox或gp47基因、使细胞对病原体如人免疫缺陷病毒感染耐受的抗病毒基因、编码血友病患者所缺乏的凝血因子VIII或IX的基因、参与T细胞介导的免疫反应的配基如T细胞抗原受体、B细胞抗原受体(免疫球蛋白)以及T细胞和B细胞抗原受体单独或联合与单链抗体如ScFv的结合物、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-2、IL-12、γ干扰素、CTLA4、B7等、肿瘤细胞表达的基因如Melana、MAGE基因(如MAGE-1，MAGE-3)、P198、P1A、gp100等。
在一个优选实施方式中，用于治疗的转基因是gp91-phox(Dinauer等，1987)。在另一个优选实施方式中，治疗基因是gp91-phox基因连接上gp91-phox的启动子，用于CGD。在一个最优选的实施方式中，gp91-phox启动子能使gp91-phox基因在单核细胞和粒细胞内表达，并且还可以通过活化因子IFN-γ的作用调节gp91-phox的表达。在另一个优选的实施方式中，载体内含有转录后调节元件WPRE以促进gp91-phox基因的表达。在同一个优选实施方式中，用于治疗的转基因是gp91-phox基因。
本发明转基因方法的主要用途在于将转基因转移到造血细胞内，其目的包括而不限于治疗由于化疗或免疫抑制治疗以及感染如AIDS、遗传性疾病、肿瘤等引起的骨髓抑制和嗜中性白细胞减少症。
造血细胞遗传性疾病的例子有镰刀型细胞贫血症、地中海贫血(包括β地中海贫血)、血红蛋白病、Glanzmann血小板无力症、溶酶体病(包括Fabry disease、葡萄糖脑苷脂酶缺乏症、尼曼-皮克病、T细胞功能障碍免疫缺陷病)、重症联合免疫缺陷综合征(SCID)、白细胞粘连缺乏症(LAD)和由于分泌蛋白系统缺乏而导致的疾病，如凝血因子VIII和/或IX。在这种情况下，需要导入的基因包括括球蛋白基因(包括β球蛋白)、α-半乳糖苷酶A、葡萄糖脑苷脂酶、鞘磷脂磷酸二脂酶、细胞因子受体、CD18整合素的亚单位、造血生长因子如红细胞生成素(EPO)、白细胞介素(特别是白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-12(IL-12)等)以及集落刺激因子(如粒细胞集落刺激因子，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子或干细胞集落刺激因子)、血小板特异的整合素αIIbβ、多药物抗性基因、gp91-phox或gp47-phox基因、使细胞对病原体如人免疫缺陷病毒感染耐受的抗病毒基因、编码血友病患者所缺乏的凝血因子VIII或IX的基因、参与T细胞介导的免疫反应的配基如T细胞抗原受体、B细胞抗原受体(免疫球蛋白)以及T细胞和B细胞抗原受体单独或联合与单链抗体如ScFv的结合物、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-2、IL-12、γ干扰素、CTLA4、B7等、肿瘤细胞表达的基因如Melana、MAGE基因(如MAGE-1，MAGE-3)、P198、P1A、gp100等。
造血系统来源的肿瘤的例子包括髓样细胞系、淋巴细胞系或红细胞系以及其前体细胞来源的肿瘤。髓系白血病的例子包括而不限于急性早幼粒细胞性白细胞(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)。可用本发明的慢病毒载体治疗的淋巴系恶性肿瘤包括而不限于急性成淋巴细胞性白细胞(ALL)，其中包括B系的ALL和T系的ALL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病(BOL)和Waldenstrom巨球蛋白血症。可用本发明的慢病毒载体治疗的其他形式的恶性淋巴瘤包括而不限于非何杰金氏淋巴瘤及其变异株、周围T细胞淋巴瘤、成人T细胞性白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)和何杰金氏病。
在其他实施方式中，本发明直接涉及用上述慢病毒载体转导的宿主细胞。据信本发明的慢病毒载体可用于转导多种细胞。这些细胞包括而不限于CD4+细胞、外周血淋巴细胞、外周血单核细胞、造血干细胞、胎儿的脐带血细胞、成纤维细胞、脑细胞、肺细胞、肝细胞、肌细胞、胰腺细胞、内皮细胞、心肌细胞、皮肤细胞、骨髓细胞以及眼细胞、胰腺导管细胞、神经元前体细胞、中胚层干细胞等。转导的细胞还可以是灵长类动物来源的、鼠源的或人源的，也可以是其他物种来源的。
为了制备病毒颗粒，需要使用任何适于慢病毒gag和pol基因表达的细胞，或者经基因改造后适于上述基因表达的任何细胞。例如可以使用病毒生产者细胞如293T细胞和HT1080细胞。
当然，如上面所提到的，本发明的慢病毒载体特别适于转导从骨髓、外周血或脐带血中获得的人定向造血干细胞或造血干细胞，以及转导CD4+T细胞、外周血B或T细胞、外周血单核细胞、树突状细胞以及单核细胞。特别优选的靶细胞是CD34+细胞，包括那些从外周血动员的CD34+细胞。
在其他实施方式中，本发明直接涉及转导人造血干细胞的方法，该方法包括使一群包括造血干细胞在内的人源细胞与上述的慢病毒载体接触，通过载体将基因导入上述细胞群内的造血祖细胞内。根据用途的不同干细胞可以在体内转导也可以在体外转导。即使在人的基因治疗中，如利用人干细胞进行的基因治疗中，可以在体内转导干细胞，也可以在体外转导然后将转导的干细胞注入人体内。本实施方式的另一方面是用本领域熟知的方法将人干细胞从人体内，也就是患者体内取出，再按照上述方法转导。然后将转导的干细胞回输到同一人体内或其他患者体内。
如果是通过将载体直接注射到人体内进行治疗，则一般采用静脉注射的方法注入载体。当细胞如CD34+细胞、树突状细胞、外周血细胞或肿瘤细胞在体外被转导时，与细胞共孵育的载体颗粒量一般应在1到50感染复数(MOI)，相当于每105个细胞有1×105到5×105个病毒载体转染单位。这其中当然包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50 MOI的载体量。一般来说，载体的量用HeLa转染单位(TU)表示。载体的其他注射途径包括动脉内注射(intrarterially)、通过内窥镜注射、病灶内注射、经皮注射、皮下注射、肌肉内注射、膜内注射、眼眶内注射、真皮内注射、腹膜内注射、经气管注射、表皮下注射、通过中柱内(intrastemal)注射、吸入或鼻内喷雾、支气管内途径等。在涉及用本发明的载体治疗肿瘤/癌症时，表达载体可以直接注射到肿瘤内或肿瘤血管内。
体外进行基因治疗的一个优选实施例是患有慢性肉芽肿病的病人，其CD34+细胞可从骨髓或外周血中分离出来，回输前在体外用表达gp91-phox基因的慢病毒载体转染，该基因在gp91-phox启动子的控制之下。同样的方法可用于治疗地中海贫血的病人，如β地中海贫血，患者的细胞可用表达β球蛋白的慢病毒载体转染，β球蛋白在β球蛋白启动子或其他合适启动子的控制之下。同样，本发明的表达适当基因的慢病毒载体和启动子结合可用于治疗白细胞粘连缺乏症(LAD)。
对于患有重症联合免疫缺陷(SCID)的病人来说，本发明也采用同样的方法利用本发明的表达患者所缺乏基因的慢病毒载体，例如编码白细胞介素受体普通γ链的连接上适当的能使基因在特定细胞内表达并且是可控表达的启动子的基因。对于HIV感染者的治疗来说，本发明的发明者考虑采用细胞内免疫的方法，其中，的细胞通过导入抗病毒的基因对HIV病毒耐受。在细胞内免疫治疗HIV的实施方式中，本发明的慢病毒载体的靶细胞包括造血祖细胞、外周血CD4+T细胞和单核细胞。如本领域技术人员所知道的，其他的病毒感染也可以用同样的细胞内免疫方法治疗。
对于肿瘤的免疫治疗来说，可以用本发明的慢病毒载体基因改造肿瘤细胞或抗原提呈细胞如树突状细胞。某些基因可用于肿瘤的基因治疗，这些基因包含在本发明的慢病毒载体内，可以抑制和/或杀死肿瘤细胞、和/或阻止肿瘤细胞的增殖、和/或诱导肿瘤细胞的调亡，或者是一些基因如TNF。
本文所描述的慢病毒载体也可通过直接注入血液或特定的器官用于体内。例如在一个实施方式中，脑内注射表达神经胶质细胞来源神经生长因子(GDNF)的慢病毒载体可用于治疗帕金森氏病。在另外一个实施例中，门脉内注射表达凝血因子VIII的慢病毒载体用于矫正A型血友病是可行的。本发明还有一个实施例是通过静脉或肌肉注射表达营养障碍基因的慢病毒载体用于治疗杜兴肌营养不良。
还有一个优选实施例是注射表达gp91-phox的慢病毒载体治疗慢性肉芽肿病(CGD)。在一个优选的实施方式中，表达受gp91-phox启动子控制的gp91-phox基因的慢病毒载体被注射用于治疗CGD。因此，本领域的普通技术人员可以多方面地使用本发明的慢病毒载体进行基因治疗。
从下面的详细说明中可以很清楚地看到本发明的目的、特征和优势。但是应该明白的是这些详细描述和特定实施例在说明本发明的优选实施方式的同时，仅仅是通过说明的方式列举的，本领域的技术人员根据这些详细描述可以本着本发明的精神在本发明的范围内对本发明作出改变和修改。
附图的简要描述
下面的附图构成了本说明书的一部分，还用于进一步证明本发明的的某些方面。参考这些附图中的一个或多个并结合本文特定实施方式的详细描述可以更好地理解本发明。
图1A.含有gp91-phox启动子的慢病毒载体。含gp91-phox启动子(1540bp)(pHPP91-GFP)和WPRE序列(pWPP91-GFP)的慢病毒载体的示意图。
图1B.gp91-phox启动子的调节模型。转录阻抑蛋白CDP与转录激活物竞争结合4个元件。CDP的DNA结合活性在终末巨噬细胞发育的过程中是逐渐下调的，因此允许转录激活物与gp91-phox启动子相互作用(Luo W，SkalnikDG.JBC，271：18203，1996)。
图2A.干扰素γ可诱导的GFP基因在UCB CD34+细胞来源的单核细胞中的表达情况。GFP基因的表达受gp91-phox启动子驱动，UCB CD34+细胞用pWPT-GFP和pWPP91-GFP慢病毒载体转染(MOI 10)。细胞在体外用GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)诱导3周分化成单核细胞(CD14+细胞)。分化的细胞用IFN-γ(1000U/ml)刺激6天，然后用连接PE单克隆抗体标记。PE阳性细胞群中GFP的表达情况通过FACS检测。数字指的是每个象限中细胞的百分数。
图2B.干扰素γ可诱导的GFP基因在UCB CD34+细胞来源的粒细胞中的表达情况，GFP基因的表达受gp91-phox启动子驱动，UCB CD34+细胞用pWPT-GFP和pWPP91-GFP慢病毒载体转染(MOI 10)。细胞在体外用G-CSF(粒细胞集落刺激因子)诱导3周分化成粒细胞(CD15+细胞)。分化的细胞用IFN-γ(1000U/ml)刺激6天，然后用连接PE单克隆抗体标记。PE阳性细胞群中GFP的表达情况通过FACS检测。数字指的是每个象限中细胞的百分数。
图3A.将慢病毒载体转导的UCB CD34+细胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓内GFP的表达情况。将未转染的UCB CD34+细胞静脉注射到经亚致死剂量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠体内(8-10周龄)。8周后从移植小鼠的股骨中分离骨髓细胞，然后用连接PerCP的抗人CD45抗体标记植入的细胞，人特异的细胞用连接PE的抗下列分子的抗体进行进一步的鉴别：CD34(造血祖细胞)、CD19(B淋巴细胞)、CD33(嗜中性白细胞)、CD14(单核细胞)、CD15(粒细胞)、CD42b(巨核细胞)和血型糖蛋白A(成红细胞)。GFP的表达情况用CD45+和PE阳性细胞来表示。数字指的是每个象限中细胞的百分数。
图3B.将慢病毒载体转导的UCB CD34+细胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓内GFP的表达情况。将pHPT-GFP慢病毒载体(MOI 10)转染的UCB CD34+细胞静脉注射到经亚致死剂量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠体内(8-10周龄)。8周后从移植小鼠的股骨中分离骨髓细胞，然后用连接PerCP的抗人CD45抗体标记植入的细胞，人特异的细胞用连接PE的抗下列分子的抗体进行进一步的鉴别：CD34(造血祖细胞)、CD19(B淋巴细胞)、CD33(嗜中性白细胞)、CD14(单核细胞)、CD15(粒细胞)、CD42b(巨核细胞)和血型糖蛋白A(成红细胞)。GFP的表达情况用CD45+和PE阳性细胞来表示。数字指的是每个象限中细胞的百分数。
图3C.将慢病毒载体转导的UCB CD34+细胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓内GFP的表达情况。将pHPP91-GFP慢病毒载体(MOI 10)的UCB CD34+细胞静脉注射到经亚致死剂量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠体内(8-10周龄)。8周后从移植小鼠的股骨中分离骨髓细胞，然后用连接PerCP的抗人CD45抗体标记植入的细胞，人特异的细胞用连接PE的抗下列分子的抗体进行进一步的鉴别：CD34(造血祖细胞)、CD19(B淋巴细胞)、CD33(嗜中性白细胞)、CD14(单核细胞)、CD15(粒细胞)、CD42b(巨核细胞)和血型糖蛋白A(成红细胞)。GFP的表达情况用CD45+和PE阳性细胞来表示。数字指的是每个象限中细胞的百分数。
图3D.将慢病毒载体转导的UCB CD34+细胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓内GFP的表达情况。将pWPT-GFP慢病毒载体(MOI 10)的UCB CD34+细胞静脉注射到经亚致死剂量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠体内(8-10周龄)。8周后从移植小鼠的股骨中分离骨髓细胞，然后用连接PerCP的抗人CD45抗体标记植入的细胞，人特异的细胞用连接PE的抗下列分子的抗体进行进一步的鉴别：CD34(造血祖细胞)、CD19(B淋巴细胞)、CD33(嗜中性白细胞)、CD14(单核细胞)、CD15(粒细胞)、CD42b(巨核细胞)和血型糖蛋白A(成红细胞)。GFP的表达情况用CD45+和PE阳性细胞来表示。数字指的是每个象限中细胞的百分数。
图3E.将慢病毒载体转导的UCB CD34+细胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓内GFP的表达情况。将pWPP91-GFP慢病毒载体(MOI 10)的UCB CD34+细胞静脉注射到经亚致死剂量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠体内(8-10周龄)。8周后从移植小鼠的股骨中分离骨髓细胞，然后用连接PerCP的抗人CD45抗体标记植入的细胞，人特异的细胞用连接PE的抗下列分子的抗体进行进一步的鉴别：CD34(造血祖细胞)、CD19(B淋巴细胞)、CD33(嗜中性白细胞)、CD14(单核细胞)、CD15(粒细胞)、CD42b(巨核细胞)和血型糖蛋白A(成红细胞)。GFP的表达情况用CD45+和PE阳性细胞来表示。数字指的是每个象限中细胞的百分数。
图4.WPRE对gp91-phox启动子控制的GFP基因在小鼠体内髓样细胞中表达的影响。数据来自图3B、3C和3D；对照组细胞的背景荧光强度已经减去。Neu代表嗜中性白细胞，Mo代表单核细胞，Gr代表粒细胞。
图5A、5B、5C和5D.携带受EF-1α启动子控制的(5A、5B)或受gp91-phox髓样细胞特异性启动子控制的(5C、5D)GFP标记基因的慢病毒载体。载体5B和5D含有WPRE序列。
图6A、6B和6C.从pHPT-GFP开始构建携带gp91-phox启动子片断(500bp)、多克隆位点(MCS)和gp91-phox特异性增强子插入片断的慢病毒载体流程图。第一步，通过PCR方法以1540bp的片段为模板(MCS-I序列包括在5’正向引物中)扩增出人gp91-phox启动子的一个500bp的片段，插入到pHPT-GFP的XhoI-BamHI位点上，位于EF-1α短启动子的位置上，得到一个中间载体pHP500-GFP。下一步，利用pHP500-GFP载体作为模板(MCS-II序列包括在5’正向引物中)扩增出一个含MCS-II、cPPT、MCS-I和gp91-phox 500bp片段的PCR产物，将该产物插入到pHOX-GFP载体的ClaI-BamHI位点中得到载体pHPX-GFP(图6B)。然后将gp91-phox特异的增强子插入到cPPT序列上游或下游的多克隆位点上得到载体pHPHS-GFP(图6C)。最后，将WPRE序列插入到载体pHPHS-GFP中得到载体pWPHS-GFP。PCR扩增的HS元件在人基因组DNA序列中的位置(+1 gp91-phox转录起始点)是：HS-12(-11502，-13244)、HS-14(-13244，-14715)、HS-26(-25345，-26529)、HS-27(-26529，-27656)，HS-28(-27657，-28893)(图6C)。所显示的片段比计算出来的长度稍长，这是因为插入了几个限制性酶切位点以便于克隆操作(HS-12和HS-14；gta恢复了pHPX-GFP上的5’SnaB I位点；HS-26、HS-27、HS-28 Sal I；gcgtcgac和Xho I；ctcgagcggc)。
图7.cPPT元件插入到慢病毒载体中。中央多聚嘌呤簇(cPPT)来自pRRLsinb.hPGK.EGFP载体(见Follenzi，A，Ailles，L.E.，Bakovic，S.，Geuna，M.，Naldini，L.(2000)Gene Transfer by Lentiviral Vecotrs is Limited by NuclearTranslocation and Rescued by HIV-1 pol Sequences.Nat.Genet.25：217-22.)。将一个含有cPPT元件的Not I-EcoR V片段克隆到pHOX-GFP载体的Not I-Cla I位点上得到载体pHPT-GFP。Not I和Cla I位点都被连接片段所填充，因此Not I在pHPT-GFP中不再存在。Cla I位点得以恢复但成了dam甲基化的。因此，质粒必须在dam(-)细菌中生长以便于利用此Cla I位点。
实施方式的说明
慢病毒载体为基因治疗特别是人造血干细胞(hHSC)的转导提供了一种强有力的工具，但是到目前为止，所构建出的载体还不能满足生物安全性的要求，并且其转导的转基因表达效率还不够高。例如，含CMV启动子的HIV来源的载体能使转基因在中枢神经系统内高效表达(Naldini等，1996a；Naldini等，1996b；Blomer等，1997)，并且已经初步证实这个基因转移工具也能有效地转导多潜能造血祖细胞，但在将治疗基因导入大多数淋巴-造血系统细胞时该载体基本是无用的，因为在这些靶细胞内其转录活性被抑制的很低(Miyoshi等，1999；Case等，1999；An等，2000)。现在的慢病毒载体大多将多个HIV的致病基因剔除了，从而消除了通过重组重新生成野生型病毒的能力(Zufferey等，1997；Dull等，1998)。自身灭活的设计剔除了HIV的转录元件从而使载体获得了生物安全性(Zufferey等，1998)。但是这会降低转基因的表达效率，较明显的是通过降低多聚腺苷酸化的效率来实现(DeZazzo等，1991；Valsamakis等，1991；Brown等，1991；Cherrington和Ganem，1992；Valsa.Makis等，1992；Gilmartin等，1992)。
本发明克服了本领域的这些缺点及其他缺陷，描述了构建改进型HIV来源载体的方法，该载体具有良好的生物安全性和较高的基因表达效率。因此在实现本发明时，人源细胞可用HIV来源的慢病毒载体转导，该载体含有抑制具有复制能力的重组子(RCR)形成的元件和诱导转基因在造血祖细胞和体外分化的血细胞以及初级T细胞内高水平表达的内部启动子元件。例如，本发明的载体可用于转导人CD34+细胞以及其他人源的造血细胞。
本文所描述的载体的启动子元件包括gp91-phox启动子、β-地中海贫血启动子、gp47-phox和CD4启动子、EF-1α启动子或CD1b启动子，但正如本领域技术人员所知道的，几乎所有的启动子元件都可以应用。
Gp91-phox启动子在某些特定类型的细胞如分化的粒细胞和单核细胞内是活化的，可以启动转基因的表达。而且Gp91-phox启动子可以通过与活化因子如IFN-γ的相互作用而被活化。可以考虑通过分析注射这些载体的NOD/SCID小鼠体内植入物和集落形成情况来确定这些启动子在体内的表达稳定性。
本发明的慢病毒载体中抑制RCR的元件是经过自身灭活(SIN)设计的。这是通过删除载体3’LTR U3的主要部分而实现的，这种删除能使载体具有自身灭活(SIN)特性(Zufferey等，1998)。
这种删除也可以防止LTR和内部启动子元件之间互相干扰。但是，SIN会使转基因的表达水平下降，特别是当启动子的启动能力不太强时，如PGK启动子。本发明还描述了一种使不具有强启动子的慢病毒载体内的转基因恢复表达水平的方法，该方法是将其他的调节元件如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)或乙型肝炎病毒调节元件(HPRE)插入到缺失的3’LTR上游。WPRE的插入不会影响启动子元件表达的特异性。
载体中插入HS元件还有其他好处，比如将HS系列的增强子元件插入到pHPX-GFP中可以获得高水平的基因表达，并且由于HS的沉默活性使杂基因的表达较少。见May等，(2000)″表达编码人β球蛋白的慢病毒的β地中海贫血小鼠体内治疗性血红蛋白的合成″(″Therapeutic haemaglobin synthesis in beta-thalassaemic miceexpressing lentivirus-encoded human beta-globin，)″Nature 406：82-86，本文已纳入作为参考。May等人(2000)证实慢病毒载体内位于β球蛋白启动子上游的HS元件可以使β球蛋白cDNA高水平表达，并且其他基因的表达水平很低。在MLV来源的载体无效的情况下本发明的慢病毒载体可以有效地转导几种人血细胞，其中，包括CD34+细胞。
而且，人CD34+细胞还被证实能以相对较低的MOI被有效转染，尽管基因转移的效率下降到约60％-70％。用10个MOI就可以达到预期的转导效率，这一数值比以前文献报道的都要低，以前大约需要60-300和1000-3000 MOI(Miyoshi等，1999；Cas等，1999)。这部分是由于增大了载体与靶细胞之间接触的可能性，因为本发明的方法是在一个较小的体积(200μl的体积内105个细胞)内使CD34+细胞与载体颗粒混合约6到24小时。
因此，本发明提供了安全、高效并且能使转基因在人造血祖细胞及其他各种血细胞中表达的HIV来源的载体，该载体还具有自身灭活特性。这些载体还提供了在分化细胞内的细胞类型特异性表达及可控表达特性。因此这些载体可作为基因治疗的工具治疗遗传性和获得性淋巴造血系统疾病、肿瘤特别是造血系统的肿瘤，预防和治疗HIV感染，以及通过慢病毒载体介导的人HSCs的基因改造来研究造血功能。
1.慢病毒载体和基因治疗
慢病毒是复合型的逆转录病毒，除了含有一般逆转录病毒所具有的gag、pol和env基因外，还含有其他调节基因或结构基因。这种高度的复杂性使病毒能在潜在感染期内调整自己的生命周期。慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和类人猿免疫缺陷病毒：SIV。通过将HIV的多个致病基因如env、vif、vpr、vpu和nef删除构建出了高生物安全性的慢病毒载体。
慢病毒载体用于基因治疗具有很大优势。载体可以稳定地整合到靶细胞的基因组内获得长期表达。载体还不会转移病毒的基因因而避免了转导细胞被细胞毒T细胞破坏的问题。载体还具有相对较高的克隆形成能力，足以满足临床应用的需要。另外，慢病毒与其他逆转录病毒相比还能转染非分裂的细胞，这点在进行组织如造血系统、脑、肝脏、肺和肌肉的基因治疗时非常重要。
例如，HIV-1来源的载体能在体内和体外有效地将转基因导入并整合到细胞内并使其在细胞内稳定表达，这些细胞包括神经元、肝细胞和单核细胞(Blomer等，1997；Kafri等，1997；Naldini等，1996；Naldini等，1998)。
慢病毒基因组和前病毒DNA含有三个存在于逆转录病毒中的基因：gag、pol和env，三者之间被两个长末端重复序列(LTR)分开。gag基因编码内部结构蛋白(基质、壳体和核壳体)；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(反转录酶)、蛋白酶和整合酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR负责启动病毒RNA的转录和多聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需要的所有其他顺式作用元件。慢病毒还含有其他基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpv、nef和vpx。
5’LTR附近的序列是基因组(tRNA引物结合位点)反转录和病毒RNA有效包装进入病毒颗粒(Psi位点)所必须的。如果包装(或逆转录病毒RNA包装成有感染能力的病毒颗粒)所需要的序列被从基因组中删除，则这种顺式缺失就会阻止基因组RNA的包装。但是，所产生的突变株依然能指导所有病毒蛋白的合成。
慢病毒载体是本领域所熟知的，见Naldini等，(1996和1998)；Zufferey等，(1997)；Dull等，(1998)，Ramezani等，(2000)，本文都已纳入作为参考。
还可参见美国专利5,994,136；6,013,516；6,165,782；6,207,455；6,218,181；6,218,186；和6,277,633号，本文都已纳入作为参考。一般来说，这些载体都是质粒来源的或病毒来源的，都含有插入外源核酸、筛选及将核酸转移到宿主细胞所需的序列。
构建病毒来源的基因转移系统包括两部分：第一部分是用于包裹结构蛋白的包装元件和产生有感染性的病毒所需要的酶，第二部分是载体本身的一些元件，也就是被转移的基因序列。两部分在设计时都采取了保证生物安全性的措施。
第一代HIV来源的载体的包装单位含有除包膜蛋白之外的所有HIV-1的蛋白质(Naldini等，1998)。后来发现删除另外四个负责毒性的病毒基因vpr、vif、vpu和nef也不会改变载体系统的效率(Zufferey等，1997)。后来还发现HIV的主要反式作用因子Tat对于产生具有全部功能的载体也是可有可无的(Dull等，1998)。因此，第三代HIV来源的慢病毒载体的包装单位只含有野生型病毒的三个基因：gag、pol和rev，这样就消除了通过重组重新产生野生型病毒的可能性。
这一系统还可以通过去除载体上的HIV转录单位加以改进(Zufferey等，1998)。实验证明将产生载体RNA的DNA3’LTR的U3区删除可以构建出具有自身灭活(SIN)特性的载体。在反转录过程中这种删除转移到前病毒DNA的5’LTR上。只要删除足够的序列，包括去除TATA框，就可以消除LTR的转录活性，阻止转导细胞内产生全长的载体RNA。但这并不影响载体的滴度和在体外和体内的特性。
本发明还对现有的慢病毒载体进行了几种改进，如上面所描述的及说明书的其他部分所描述的。将带有外源基因的用于治疗本发明所述的淋巴-造血系统疾病的慢病毒载体导入包装细胞中就可以得到病毒生产者细胞，该细胞可以释放出具有感染性的携带外源转基因的病毒颗粒。
env基因可以是任何病毒的，其中包括逆转录病毒。env优选双噬性的包膜蛋白，这样就可以转染人源细胞和其他物种的细胞。
逆转录病毒来源的env基因包括而不限于下列病毒的：Moloney鼠白细胞病毒(MoMuLV或MMLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。其他env基因如水泡性口炎病毒(VSV)蛋白G(VSV G)、肝炎病毒和流感病毒的env也可以使用。
虽然VSV G蛋白是一种理想的env基因，因为VSV G使重组病毒具有很宽的宿主范围，但是VSV G对宿主细胞有害。因此当使用VSV G时最好用可诱导的启动子系统以便调节VSV G的表达，在不需VSV G表达时能使其对宿主的毒性降到最小。例如，Gossen和Bujard(1992)构建的四环素调节的基因表达系统可用于提供VSV G的可诱导表达，当转染细胞无四环素时VSV G的表达停止。因此，tet/VP16反式作用因子存在于第一个载体中，而另一个载体上的tet操纵区控制克隆到启动子下游的VSV G编码序列。
含有病毒env核酸序列的载体在发挥功能时与调节序列如启动子或增强子有关。调节序列可以是任何真核启动子或增强子，包括EF1α、PKG、Moloney鼠白血病病毒启动子-增强子元件、人巨细胞病毒增强子、牛痘病毒P7.5启动子等(见下面表1和表2中所列的)。在某些情况下，如Moloney鼠白血病病毒启动子-增强子元件，启动子-增强子元件位于LTR序列内或临近LTR元件。较好的调节序列是那些构建载体所用的慢病毒本身所不具有的。例如，如果载体用SIV构建，则SIV LTR中的SIV调节元件应该被非SIV来源的调节元件所替代。
我们还可以通过将特定类型细胞受体的抗体或特定配基连接到病毒的包膜蛋白上从而使重组病毒具有靶向性。将感兴趣的序列(包括调节区)连同编码特定靶细胞受体配基的其他基因插入到病毒载体中，载体就具有了靶向特异性。逆转录病毒载体可以通过插入一个糖脂或糖蛋白而使其具有靶向特异性。靶向性通常是通过利用对逆转录病毒载体有靶向性的抗体的抗原结合区或重组型抗体型分子如单链抗体来实现的。本领域的技术人员不需过多的实验就应该知道或很容易地确定如何利用特殊的方法来使逆转录病毒载体具有靶向性。
异源核酸序列或外源核酸序列如编码治疗遗传性或获得性造血系统疾病的基因所具有的多聚核苷酸序列可与调节核酸序列连接。异源序列优选连接到启动子上，构成嵌合基因。
标记基因用于分析载体是否存在，以及观察载体是否感染和整合。标记基因的存在确保了只有那些表达转基因的宿主细胞才能被选择出来并生长增殖。典型的标记基因编码对抗生素或其他毒性物质如组氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、氨甲蝶呤抗性的蛋白质以及编码细胞表面标记物。
本发明的重组病毒能将核酸序列转移到哺乳动物细胞内。术语″核酸序列″是指本文所详细描述的任何核酸分子，尤其是指DNA。核酸分子可以是各种来源的，包括DNA、cDNA、合成的DNA、RNA或上述物质的组合。这种核酸序列也包括基因组DNA，其中可以包含天然的内含子，也可以不包含。而且，这种基因组DNA可以带有启动子区、多聚腺苷酸区或其他相关序列。基因组DNA可以通过本领域所熟知的方法从适当的细胞内提取和纯化。另外也可以从细胞中分离信使RNA(mRNA)，通过反转录或其他方法制备cDNA。
载体可以通过转染或感染的方式进入包装细胞株。包装细胞产生含有载体基因组的病毒颗粒。转染或感染的方法是本领域技术人员所熟知的。将包装载体和转移载体共转染到包装细胞后，重组病毒从培养液中恢复出现，其滴度可以本领域技术人员所使用的标准方法确定。因此，包装载体一般和显性选择标记物如新霉素、DHFR、谷氨酰胺合成酶一起通过钙-磷酸盐沉淀、脂质体转染或电穿孔导入人源细胞系内，随后用适当的药物筛选，分离出阳性克隆。选择标记基因一般与载体的包装基因相连。
已知有些稳定的细胞系适宜作为具有包装功能的包装细胞，如美国专利5,686,279号和Ory等人(1996)的文献所描述的包装细胞。转染有慢病毒载体的包装细胞就称为病毒生产者细胞。因此所谓的病毒生产者细胞就是能产生或释放包装的具有感染性病毒颗粒的细胞或细胞系，该病毒颗粒中含有治疗转基因。
这些细胞还可以是贴壁依赖性的，就是说这些细胞在黏附到一种表面如玻璃或塑料表面上时可以生长、存活或维持其功能。病毒生产者细胞也可以是恶性转化细胞。可以作为慢病毒载体包装细胞的贴壁依赖性细胞系有HeLa细胞或293细胞和PERC.6细胞，载体在这些包装细胞内具有复制能力。
在某些应用方面，特别是当病毒用于基因治疗时，优选复制能力缺陷的载体以避免病毒在治疗的患者体内无节制地增殖。在某些例子中，可以选择经改造的哺乳动物细胞系，细胞系的改造是通过修饰病毒生产者细胞的基因组以使其具有病毒的基本功能，或者是与辅助病毒共转染病毒生产者细胞，使其表达某些蛋白质，该蛋白质能弥补因从病毒基因组删除序列而缺失的功能。例如，对于HIV-1来源的载体来说，可用如Corbeau等人(1996)描述的HIV-1包装细胞系PSI422。同样，如果所产生的病毒载体是逆转录病毒，则可用Ory等人(1996)所描述的人源293来源的逆转录病毒包装细胞293GPG，该细胞能产生高滴度的逆转录病毒颗粒。如果载体系统很小，则可以通过改造病毒生产者细胞(或者通过改造病毒的基因组，或者通过使用辅助病毒或粘粒)以弥补亲本病毒的功能，使其能在病毒生产者细胞内复制并包装成病毒颗粒。Naldini等人(1996)已经用慢病毒转移载体感染体外贴壁生长的人源细胞，并且通过直接将载体注射到成年大鼠脑内来转导神经元。载体能有效地将标记基因转移到神经元中，并且能长期表达而不会造成明显的病理损伤。单剂量的载体注射后10个月检测动物发现基因表达的平均水平无明显下降，也没有迹象表明出现了病理损伤或免疫反应(Blomer等，1997)。
2.SIN设计
SIN的设计提高了慢病毒载体的生物安全性。HIV LTR主要是由U3序列组成的，该序列含有增强子和启动子元件，二者能调节HIV基因在感染细胞内的基础表达和诱导表达，并且受细胞活化的影响。这些启动子元件中的几个是病毒复制所必须的。某些增强子元件在各种病毒分离株中是高度保守的，已被证明是病毒产生致病性的关键因素。增强子元件可以影响病毒在不同靶细胞内的复制速度(Marthas等，1993)。
由于病毒的转录起始于5’LTR U3区的3’末端，这些序列不包含在病毒mRNA之内，因此3’LTR来源的拷贝作为产生整合的前病毒两个LTR的模板。如果逆转录病毒载体中的U3区的3’拷贝发生改变，则载体RNA还可以从病毒生产者细胞的无活性的5’LTR产生，但是在靶细胞内不能再产生。用这种载体转导结果就会使子代病毒的两个LTR都失去活性。因此，逆转录病毒是自身灭活的(SIN)，这些病毒被称为SIN转移载体。
有关SIN设计的进一步细节见Zufferey等，1998和美国专利5,994,136号的描述，本文已纳入作为参考。但是正如其中所描述的，3’LTR删除的范围也有限制。首先，U3区的5’末端还有另外一项基本功能，就是该末端是整合所必须的(末端的二核苷酸+att序列)。因此，末端的二核苷酸和att序列是U3序列5’端能删除的边界。另外，某些松弛区也会影响R区中下游多聚腺苷酸化位点的活性。过多地从3’LTR删除U3序列会降低载体转录物的多聚腺苷酸化水平，进而对载体在病毒生产者细胞中的滴度和基因在靶细胞中的表达造成负面影响。但是另外一个方面，有限的删除不会取消LTR在转导细胞内的转录活性。
本文所描述的慢病毒载体可以是将3’LTR U3区的-418到-18位核苷酸删除的。这样大范围的删除甚至可以到TATA框，因此LTR在转导细胞内的转录活性被完全灭活。但这些载体在病毒生产者细胞内的滴度及转基因在靶细胞内的表达并不受影响。这一设计大大提高了载体的生物安全性。
象这种大范围删除U区的SIN型载体无法以鼠白血病病毒(MLV)或脾坏死病毒(SNV)来源的逆转录病毒载体为基础构建而其转导效率不降低。
去除-418到-18位的核苷酸序列可以使LTR的转录活性消失，从而使载体在转导细胞内无法生成全长的载体RNA。但是HIV来源的慢病毒载体无论在体内还是体外都无法通过SIN设计来使其活性降低。
3.转录后调节元件(PRE)
在某些实施方式中需要增强转基因的表达，特别是本发明的那些具有温和启动子的慢病毒载体。
一种类型的PRE是位于表达盒内的内含子，该内含子能刺激基因的表达。但是在慢病毒的生命周期循环中内含子会被剪切掉。因此，如果用内含子作为PRE，就需要将其置于载体基因组转录物方向相反的位置上。
不依赖剪接事件的转录后调节元件其优点在于在病毒的生命循环周期中不会被删除。这种调节元件的例子包括单纯疱疹病毒的转录后处理元件、乙型肝炎病毒的转录后调节元件(HPRE)和土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件(WPRE)。其中WPRE是最好的，因为它含有HPER所不具有的顺式作用元件(Donello等，1998)。这个调节元件位于载体内因此可以被包含在转基因的RNA转录物之内，但是位于转基因翻译单位的终止密码子之外。如本发明和Zufferey等人(1999)所证明的，WPRE是在使用慢病毒载体时刺激和增强转基因表达的有效工具。
3.WPRE的特征见美国专利6,136,597号的描述，本文已纳入作为参考。如该专利文献所描述，WPRE是一种RNA输出元件，可以有效介导RNA从核到胞浆的转运。它可以通过插入一个顺式作用核酸序列来增强转基因的表达，因此该元件和转基因位于同一个转录物之内。实验表明顺式存在的WPRE能将转基因的表达增强7到10倍。逆转录病毒载体转移序列是以cDNA的形式而不是以含内含子的完全基因的形式转移出来，其剪接一般是在形成逆转录病毒颗粒的事件中完成的。内含子介导初级转录物与剪接复合物的相互作用。由于剪接复合物对RNA的处理促进了RNA向胞浆的转运，并且剪接结构和转运结构通常是结合在一起的，因此cDNA的表达效率常常不高。而载体中包含WPRE就可以增强转基因的表达。
4.启动子和增强子
″启动子″是一种调控序列，该序列控制转录的起始和速度。它可以含有遗传元件，调节蛋白和分子在此结合，如RNA多聚酶，从而启动核酸序列的特异性转录。术语″位于操纵下的″、″连接于调控下的″、″控制下的″以及″转录控制下的″是指启动子与核酸序列具有正确的功能定位和/或正确的方向以便控制该序列的转录起始和/或表达。启动子一般含有一个能定位RNA合成起始位点的序列。其中最熟悉的是TATA框，但是某些启动子没有TATA框，如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，重叠于起始位点上的不连续元件可以帮助其定位转录起始点。另外，启动子元件还能调节转录起始的频率。一般来说，启动子位于起始位点上游30-110bp区域内，虽然也有许多启动子含有位于起始位点下游的功能元件。为了使一个编码序列置于启动子控制之下，需要将转录阅读框架转录起始位点的5’端置于该启动子的下游，即3’端。″上游″启动子能刺激DNA的转录、促进编码RNA的表达。
各启动子元件之间的距离通常是很灵活的，这样各元件相对移动时启动子的功能也不会发生改变。比如tk启动子的各元件之间距离达到50bp时其活性才开始下降。不同的启动子作用方式不同，各元件之间可以协同活化转录，也可以各自独立活化转录。启动子可以和增强子连接，也可以不连接，增强子是指调节核酸序列转录活化的顺式调节序列。
启动子可以是与核酸序列有关的天然序列，例如可以通过分离编码片段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。这种启动子被称为″内源性″的启动子。同样，增强子也可以是与核酸序列有关的天然序列，位于该序列的下游或上游。另外，将编码核酸片段置于重组的或异源的启动子控制之下也有某些优势，重组的或异源的启动子是指在自然环境中该启动子不会与核酸片段相关。重组的或异源的增强子也是指在自然环境中该启动子不会与核酸片段相关的增强子。这种启动子或增强子包括其他基因的启动子或增强子、从其他任何病毒、原核细胞或真核细胞分离的启动子或增强子和非″天然的″的启动子或增强子，即含有能改变表达的不同转录调节区和/或突变体的不同元件。例如，重组DNA载体中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)的启动子系统。除了通过合成构建启动子和增强子核酸序列外，还可以利用本文所描述的组合物通过重组克隆技术和/或核酸扩增技术构建启动子和增强子序列，包括PCRTM(见美国专利4,683,202和5,928,906号，本文都已纳入作为参考)。
另外，那些调控基因在线粒体、叶绿体等无核细胞器内转录和/或表达的序列也可用于本发明中。含有启动子、增强子以及其他位点或转录控制/调节元件的控制序列也被称为″转录盒″。
利用天然的启动子和/或增强子有效控制DNA片段在细胞器、细胞、组织、器官或有机体内表达是非常重要的。分子生物学领域的技术人员一般都知道如何结合使用启动子、增强子和某种类型的细胞来进行蛋白的表达(见Sambrook等，1989，本文已纳入作为参考)。所用的启动子可以是组成的、组织特异的、可诱导的、和/或在适当的条件下能使导入的DNA片段高水平表达的，比如适于基因治疗的，或者适于某些用途如大规模制备重组蛋白和/或肽的。启动子可以是异源的，也可以是内源性的。
利用T3、T7或SP6胞浆表达系统是另外一种可能的实施方式。真核细胞支持某些细菌启动子控制的胞浆转录，只要提供合适的细菌多聚酶，该启动子可以作为转导复合物的一部分，也可以作为附加的基因表达载体。
表1列出的是本发明可使用的能调节RNA表达的元件/启动子的例子，这些例子是非限定性的。表2列出的是可诱导元件的例子，可诱导元件是能被特异的刺激活化的核酸序列，这些例子也是非限定性的。
                                            表1启动子和/或增强子
启动子/增强子 参考文献
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H2B(TH2B)组蛋白 Hwang等，1990
鼠和/或I型胶原 Ripe等，1989
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大鼠生长激素 Larsen等，1986
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杜兴肌营养不良 Klamut等，1990
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逆转录病毒 Kriegler等，1982，1983；Levinson等，1982；Kriegler等，1983，1984a，b，1988；Bosze等，1986；Miksicek等，1986；Celander等，1987；Thiesen等，1988；Celander等，1988；Chol等，1988；Reisman等，1989
乳头状瘤病毒 Campo等，1983；Lusky等，1983；Spandidos和/或Wilkie，1983；Spalholz等，1985；Lusky等，1986；Cripe等，1987；Gloss等，1987；Hirochika等，1987；Stephens等，1987
乙型肝炎病毒 Bulla等，1986；Jameel等，1986；Shaul等，1987；Spandau等，1988；Vannice等，1988
人免疫缺陷病毒 Muesing等，1987；Hauber等，1988；Jakobovits等，1988；Feng等，1988；Takebe等，1988；Rosen等，1988；Berkhout等，1989；Laspia等，1989；Sharp等，1989；Braddock等，1989
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长臂猿白血病病毒 Holbrook等，1987；Quinn等，1989
                                        表2可诱导元件
元件 诱导物 参考文献
MT II 佛波酯(TFA)重金属 Palmiter等，1982；Haslinge等，1985；Searle等，1985；Stuart等，1985；Imagawa等，1987，Karin等，1987；Angel等，1987b；McNeall等，1989
MMTV(鼠乳腺肿瘤病毒) 糖皮质激素 Huang等，1981；Lee等，1981；Majors等，1983；Chandler等，1983；Lee等，1984；Ponta等，1985；Sakai等，1988
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α-2-巨球蛋白 IL-6 Kunz等，1989
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HSP70 E1A，SV40大T抗原 Taylor等，1989，1990a，1990b
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组织特异性启动子或元件及其活性特征的鉴定是本领域普通技术人员所熟知的。这种序列包括而不限于在下列基因中：人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、生长抑素受体2基因(Kraus等，1998)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、鼠α2(XI)胶原(Tsumaki等，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee等，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu等，1997)以及人血小板内皮细胞黏附分子-1(Almendro等，1996)。
最初本发明的慢病毒载体用于将治疗基因转化细胞时是将基因置于规则的真核细胞启动子之下。尽管优选gp91-phox启动子，但上面表1和表2中所描述的启动子和调节信号元件也可以使用。另外，任何启动子/增强子的组合(如真核启动子数据库EPDB中的每一个)都可用于驱动编码治疗转基因的结构基因的表达，该治疗基因位于本发明的慢病毒载体内。肿瘤基因治疗所用的组织特异性启动子或肿瘤的靶标可与本发明的慢病毒载体一起用于肿瘤的治疗，特别是造血系统肿瘤的治疗。
启动子和增强子元件可以通过与适当的转录激活物或转录抑制因子相互作用被活化或抑制，如图1B所描述的gp91-phox启动子和Luo和Skalnik(1996)J.Biol.Chem.271：18203-201，以及Luo和Skalnik(1996)J.Biol.Chem.271：23445-23451所描述的那些元件，本文已纳入作为参考。对于gp91-phox启动子来说，干扰素-γ对表达盒转录和表达的调控可以作为说明本发明中启动子或增强子元件与调控因子如何相互作用的例子。
增强子最初是被看作位于同一DNA分子远处位置上的能增强启动子转录活性的元件。它的这种能在很远的位置发挥作用的能力在以前的原核细胞转录调节的经典研究中是没有先例的。
后来的研究表明具有增强子活性的DNA区结构类似于启动子。也就是说它们也是由许多单个的元件构成的，每个元件结合一个或多个转录调节蛋白。比如图1B所显示的gp91-phox启动子的调节模式。本发明中比较典型的增强子是DNA酶超敏元件，其同源类似物见文献Lien LL，Lee Y，Orkin SH，(1997)″通过酵母人工染色体转导胚胎干细胞研究髓样细胞表达的人gp91-phox的调节：抑制多变的细胞表达模式需要远端顺式作用元件的完全互补″(″Regulation of the myeloid-cell-expressed human gp91-phox gene as studied by transfer of yeast artificialchromosome clones into embryonic stem cells：suppression of a variegatedcellular pattern of expression requires a full complement of distant ciselements，)″Mol Cell Biol.17(4)：2279-90。其全部内容已清楚地纳入本文中作为参考。在这些增强子元件的影响下，基因表达可能增强(由于HS的增强子活性)而且稳定(由于HS的沉默活性)。
gp91-phox启动子HS元件的模拟物在其他的启动子-增强子系统中是有活性的。例如文献May C，Rivelia S，Callegari J，Heller G，Gaensler KM，Luzzatto L，Sadelain M，(2000)″表达慢病毒编码的人β球蛋白的β地中海贫血小鼠体内治疗性血红蛋白的合成″(Therapeutic haemoglobin synthesis in beta-thalassaemicmice expressing lentivirus-encoded human beta-globin.)Nature 406(6791)：82-6，本文已纳入作为参考，其中类似的β球蛋白HS元件位于慢病毒内控制β球蛋白cDNA表达的β球蛋白启动子的上游。
启动子和增强子都具有在细胞内活化转录的基本功能。他们通常重叠并相邻，常常具有同样的结构模式。总之，这些都说明增强子和启动子是同源的，结合到这些序列上的转录活化蛋白以基本相同的方式与细胞的转录复合物相互作用。二者之间的基本区别是其调控模式。增强子作为整体来讲必须位于远端刺激转录，这和启动子区及其组成元件是不同的。另外，启动子必须含有一个或多个在特定位点并在特定方向上直接启动RNA合成的元件，而增强子不具备这些特征。除了操作距离的区别之外，增强子和启动子是非常相似的。因此，控制转录和表达的调控序列可以含有各种排列组合的元件，以便控制其调控的方式和力度。
一个被证明有用的信号是多聚腺苷酸信号(hGH、BGH、SV40)。内部核糖体结合位点(IRES)序列的使用使信使RNA具有了多基因性或多顺反子化。IRES元件绕过了5’甲基化帽子依赖翻译的核糖体扫描模式，可以在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。
细小核糖核酸病毒家族两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒)(Pelletier和Sonenberg，1988)和一个哺乳动物信使RNA(Macejak和Sarnow，1991)的IRES元件已被报道。IRES可与异源开放阅读框架连接。多个开放阅读框架可以一起转录，但每个都由一个IRES分开，形成多顺反子信使RNA。由于有IRES元件，每个开放阅读框架都和核糖体结合而翻译。多个基因可以由一个启动子/增强子驱动转录出一条信使RNA而得以有效表达。
在任何情况下都应该明白启动子是DNA元件，只有当其位于基因的上游时才能导致该基因的表达。用本发明的慢病毒载体转移的大多数转基因都位于启动子元件的下游才能发挥功能。
一个特异的起始信号也是编码序列有效翻译所需要的。这些信号包括ATG起始密码子或其临近的序列。外源的翻译控制信号包括ATG起始密码子也需要提供。本领域的普通技术人员应该能够很容易地确定这一点并提供必须的信号。大家都知道，起始密码子必须位于目的编码序列的开放阅读框架内才能确保整个编码序列的完整翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的，也可以是合成的。表达的效率会因包含适当的转录增强子元件而得到提高。
5.表中序列的简要描述
SEQ ID NO：1代表的是HIV中央多聚嘌呤簇元件的核苷酸序列，如文献Follenzi，A，Ailles，L.E.，Bakovic，S.，Geuna，M.，Naldini，L.(2000)″慢病毒载体介导的基因转移被核转位所限制而被HIV-1 pol序列所恢复″，(″Gene Transfer byLentiviral Vecotrs is Limited by Nuclear Translocation and Rescued by HIV-1pol Sequences，)″Nat.Genet.25：217-22所报道的，该序列来自HIV。SEQ ID NO：2-6代表的是含DNA酶超敏位点的核苷酸序列，这些序列在本发明的某些实施方式中用作增强子。见下述文献的报道Lien LL，Lee Y，和Orkin SH，″通过酵母人工染色体转导胚胎干细胞研究髓样细胞表达的人gp91-phox的调节：抑制多变的细胞表达模式需要远端顺式作用元件的完全互补″(″Regulation of the myeloid-cell-expressed human gp91-phox gene as studied by transfer of yeast artificialchromosome clones into embryonic stem cells：suppression of a variegatedcellular pattern of expression requires a full complement of distant ciselements，)″Mol.Cell.Biol.17(4)：2279-90(1997)。
SEQ ID NOS：7-16代表的是用于制备SEQ ID NO：2-6的HS元件的PCR引物序列。PCR引物序列和HS元件的序列是基于人类基因组工程所报道的人基因组序列(编号NT011844；http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)。PCR扩增的HS元件(+1 gp91-phox转录起始点)在人基因组DNA序列中的位置为：HS-12(-11503，-13244)，HS-14(-13244，-14715)，HS-26(-25345，-26529)，HS-27(-26529，-27656)，HS-28(-27657，-28893)。所显示的片段比计算出来的长度稍长，这是因为在末端插入了几个限制性酶切位点以便于克隆操作(HS-12和HS-14；gta恢复了pHPX-GFP上的5’SnaB I位点；HS-26、HS-27、HS-28 Sal I；gcgtcgac和Xho I；ctcgagcggc)。
本发明特定实施方式中所涉及的其他序列包括那些编码gp91-phox及其同源物的序列，其中包括Genbank检索号为NM000397的编码gp91-phox的核苷酸序列(Dinauer，等，1987)，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19多肽序列。特定实施方式中涉及的序列还有Genbank检索号为M66390的核苷酸序列所编码的gp91-phox启动子，编号为SEQ ID NO：17，以及Genbank检索号为M82856的核苷酸序列所编码的CD11b启动子，编号为SEQ ID NO：20。
6.核酸
本发明的一个实施方式涉及转移编码治疗基因的核酸，特别是用于治疗造血系统和淋巴造血系统疾病，如上述遗传性和获得性疾病的基因。在一个实施方式中，核酸编码全长的基因、基本为全长的基因或与这种基因功能相当的基因。
因此，在本发明的某些实施方式中，造血系统和淋巴造血系统疾病的治疗包括向造血系统来源的细胞内转导含有治疗性核酸表达构建体的慢病毒载体。还涉及向造血细胞内转导该构建体并使其表达编码治疗性多肽的核酸，从而恢复细胞的正常表型。
核酸可以通过本领域普通技术人员所熟知的任何技术制备。合成的核酸，特别是合成的寡核苷酸的非限定性的例子包括通过磷酸三酯、亚磷酸或phosphoramidite化学技术以及EP 266,032描述的固相合成技术经体外合成而制备的核酸，本文已纳入作为参考。或者通过如Froehler等(1986)和美国专利5,705,629号所描述的脱氧核苷H磷酸中间体合成的核酸，本文都已纳入作为参考。通过酶催化反应制备核酸的非限定性例子包括通过酶扩增反应如PCR(见美国专利4,683,202号和4,682,195号，本文已纳入作为参考)，或者如美国专利5,645,897号所描述的寡核苷酸的合成，本文已纳入作为参考。通过生物方法制备核酸的非限定性的例子包括在活细胞内制备的重组核酸(如Sambrook等，1989，本文已纳入作为参考)。
核酸可以用聚丙稀酰胺凝胶电泳、氯化铯密度梯度离心或本领域普通技术人员所熟知的其他任何技术纯化(如Sambrook等1989，本文已纳入作为参考)。
术语″核酸″一般是指至少一个分子，一条DNA、RNA链或其衍生物或模仿物，其中至少含有一个碱基，如DNA中天然的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T和胞嘧啶C)、RNA中嘌呤或嘧啶碱基(A、G、鸟嘧啶U和C)。术语″核酸″包含″寡核苷酸″和″多聚核苷酸″。术语″寡核苷酸″是指长度约为3到100碱基之间的至少一个分子。术语″多聚核苷酸″是指长度约大于100个碱基的至少一个分子。这些定义一般指至少一个单链分子，但在某些特定实施方式中，还可以至少包含另外一条链，该链至少与其他一条单链部分、基本或完全互补。因此，一个核酸可以至少含有一条或多条双链分子，或者至少含有一个三链分子，三链分子中含有一条或多条互补链或含有与特定序列互补的一条链。
在某些实施方式中，″基因″是指可以转录的核酸。本文所用″基因片段″是指基因的核酸片段。在某些情况下，基因包含位于转录物中的调节序列、信使RNA产物或组合物。
在某些特定实施方式中，基因含有编码蛋白、多肽或肽的转录序列。在另外一些特殊情况下，基因含有核酸、和/或含有编码多肽或肽的序列，这些序列在造血系统和淋巴造血系统疾病中是缺失的或突变的。与本文所描述的术语相一致的是，″分离基因″可以含有可转录的从其他序列如其他的天然基因、调节序列、多肽或肽编码序列等分离出来的核酸序列、调节序列、编码序列等。因此，简单地说，术语″基因″就是指含有能被转录的核苷酸序列及其互补序列的核酸。在某些特定情况下，能被转录的核酸至少含有一个功能蛋白、多肽和/或肽编码单位。正如本领域技术人员所理解的，功能术语″基因″包括基因组序列、RNA或cDNA序列，或者一些小的人工合成核酸片段，包括基因非转录部分的核酸片段，其中包括而不限于基因的非转录启动子或增强子区。
小的人工合成基因核酸片段通过核酸操作技术可以表达或者适于表达蛋白质、多肽、蛋白质结构域、肽、融合蛋白、突变体等。因此，″截短的基因″是指一些临近核苷酸残基缺失的核酸序列。
可以根据特定的核酸序列来设计各种长度的核酸片段。通过给序列赋值，如第一个残基为1，第二个残基为2等，就可以确定所有核酸片段残基的位置：
                            n→n+y
其中n为从1开始到序列最后一个残基数字的整数，y为核酸片段的长度减1，n+y不会超过序列的最后一个数字。因此，对于一个10-mer的核酸片段来说，其相应的碱基为1到10、2到11、3到12...等等，依此类推。对于一个15-mer的核酸片段来说，其相应的碱基为1到15、2到16、3到17...等等，依此类推。对于一个20-mer的核酸片段来说，其相应的碱基为1到20、2到21、3到22...等等，依此类推。
本发明的核酸，不论其长度如何，都可以和其他的核酸序列连接，其中包括而不限于启动子、增强子、多聚腺苷酸信号、限制性内切酶酶切位点、多克隆位点、编码片段等，从而形成一个或多个核酸构建体。各种核酸构建体之间的长度差别很大。因此几乎所有长度的核酸片段都可以使用，但是总长度最好不要太大以便于基因操作或在合适的重组核酸载体内使用。
术语″载体″是指携带核酸分子的载体，核酸序列可以插入其中以便于导入细胞内并被复制。如上面及本说明书其他部分所描述的，本发明的载体是慢病毒来源的。由本发明载体所携带的核酸分子编码治疗性基因，可用于基因治疗。本领域的技术人员可以通过标准的重组技术(见Maniatis等，1988和Ausubel等，1994，本文都已纳入作为参考)构建这样的载体。
术语″表达载体″是指任何类型的、含有能编码可翻译RNA的核酸的基因构建体。在某些情况下，RNA分子进而被翻译成蛋白质、多肽或肽。在另外一些情况下，这些序列不翻译，例如只生成反义分子或核酶。表达载体可以含有各种″调控序列″，调控序列是与编码序列相连的、基因在特定宿主细胞内转录和翻译所必须的核酸序列。除了控制转录和翻译的调控序列以外，载体和表达载体还可以包含具有其他功能的核酸序列，描述如下：
A.多克隆位点
本发明的载体可以含有多克隆位点(MCS)，多克隆位点是指含有多个限制性酶切位点的核酸区，通过标准重组技术在每个位点都可以消化载体(见Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，和Cocea，1997，本文已纳入作为参考)。″限制性内切酶消化″是指只在核酸分子的特定位置上用酶催化裂解核酸分子。这些限制性内切酶大多是商品化的。其应用是本领域技术人员所熟知的。常常用限制性内切酶在MCS上切开以线性化或片段化载体，从而使外源片段连接到载体上。″连接″是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，两个片段可以彼此临近，也可以不临近。与限制性内切酶和连接反应相关的技术是重组技术领域的技术人员所熟知的。
B.剪接位点
大多数可翻译的真核RNA分子都要经过剪接过程以去除初级转录物中的内含子。含有真核基因组序列的载体需要供体和/或受体的剪接位点以确保转录物被正确加工从而翻译出蛋白质(见Chandler等，1997，本文已纳入作为参考)。
C.终止信号
本发明的载体或构建体一般至少含有一个终止信号。″终止信号″或″终止子″是由能终止RNA聚合酶合成RNA转录物的DNA序列组成的。因此，在某些实施方式中，终止信号可以终止RNA转录物的产生。终止子是在体内达到理想的信使RNA水平所必须的。
在真核系统中，终止子区还可以含有特异的DNA序列，该序列可以使新的转录物通过位点特异的裂解暴露出多聚腺苷酸位点。这一序列发出信号使特异性内源多聚酶将一段约200个腺苷酸残基的序列(多聚A)加到转录物的3’末端。具有这种多聚A尾巴的RNA分子更加稳定，并且翻译的效率更高。因此，在涉及真核基因的其他实施方式中，优选能促进信使RNA多聚腺苷酸化的终止信号。终止子和/或多聚腺苷酸位点元件可以增加信使RNA的水平，并且可以降低核糖体越过表达盒进入其他序列的可能性。
可用于本发明的终止子包括本说明书中所描述的以及本领域普通技术人员所熟知的任何已知的终止子，包括而不限于基因的终止序列，如牛生长激素终止子，或病毒的终止序列如SV40终止子。在某些实施方式中，终止信号缺少可转录或可翻译的序列，例如由于序列截短。
D.多聚腺苷酸信号
在真核基因的表达中，一般都包括一个多聚腺苷酸信号以使转录物正确腺苷酸化。多聚腺苷酸信号的性质被认为不是成功实现本发明的关键，任何序列的腺苷酸信号都可以使用。例如SV40的多聚腺苷酸信号和牛生长激素的多聚腺苷酸信号，只要该信号便于并且适于用在各种靶细胞中。多聚腺苷酸尾巴可以增加转录物的稳定性，并能促进转录物向胞浆转运。
E.复制起点
为了使本发明的载体在宿主细胞内增殖，载体需要有一个或多个复制起始位点(常被称作″ori″)，它是一个特异的核酸序列，复制在此起始。另外，如果宿主细胞是酵母，可以用自主复制序列(ARS)。
F.可筛选和可扫描标记物
在本发明的某些实施方式中，转导本发明慢病毒载体的细胞需要在体外被鉴定，或者需要观察转导的细胞是否出现可鉴别的变化以确定细胞是否含有表达载体。一般来说，筛选标记物是指能使细胞被筛选的标记物。阳性筛选标记物是指当标记物存在时细胞被筛选出来，阴性筛选标记物是指当标记物存在时细胞不被筛选出来。阳性筛选标记物的例子有药物抗性标记物。
一般来说，使用药物筛选标记物的目的在于转化子的克隆和鉴定，例如，对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素、组胺醇耐受的基因可以作为筛选标记。除了提供表型筛选以区别转化子的标记物之外，其他类型的标记物还有可扫描的标记物如GFP，其筛选基础在于比色分析。另外，可扫描的酶标记物如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)也可以使用。本领域的技术人员还应该知道如何使用FACS分析免疫标记物。用什么样的标记物并不重要，只要该标记物能和编码基因产物的核酸同时表达。其他可筛选和可扫描标记物的例子都是本领域技术人员所熟知的。
7.宿主细胞
本文所用的术语″细胞″、″细胞系″和″细胞培养物″可以混用。这些术语都包含其子代细胞，即任何的或所有的子代细胞。可以理解的是并非所有的子代细胞都是一样的，这是因为会发生定向的或偶然的突变。在表达异源核酸序列时，″宿主细胞″是指原核细胞或真核细胞，或者任何可转导的有机体，载体能在其中复制并且本发明载体所编码的异源核酸能在其中表达。宿主细胞能作为并且已经作为载体的受体。宿主细胞能被″转染″或″转化″是指外源核酸能被转染或导入宿主细胞中。转化的细胞包括初级转化细胞及其子代细胞。本文所用的术语″基因工程的″和″重组的″细胞或宿主细胞一般是指外源核酸序列如本发明的携带治疗基因的慢病毒载体能被导入其中的细胞。因此，重组细胞与天然的细胞是有区别的，后者不含有被导入的重组核酸。
在某些实施方式中，RNA或蛋白序列可以与其他RNA或蛋白序列在同一个宿主细胞内表达。共表达可以通过两个或多个不同的重组载体共转染宿主细胞来实现。另外，一个重组载体也可以构建成含有编码多个不同RNA的载体，这些RNA都可以在转染有这种载体的宿主细胞内表达。
宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，这要根据是希望复制载体还是希望载体编码的核酸序列被部分或全部表达而定。许多细胞系和细胞培养物都可以作为宿主细胞，还可以从美国典型培养物收集中心(ATCC)得到，该机构是负责储存活的培养物和基因材料的组织(www.atcc.org)。
本发明所涉及的宿主细胞的例子包括而不限于病毒包装细胞、病毒生产者细胞、293细胞、人造血祖细胞、人造血干细胞、CD34+细胞、CD4+细胞等。
A.组织和细胞
组织可以含有宿主细胞或能被转化的或与核酸转移组合物和/附加试剂接触的细胞。组织可以是有机体的一部分或是从有机体中分离出来的。在某些实施方式中，组织及其组成细胞包括但不限于血(如造血细胞(如人造血祖细胞、人造血干细胞、CD34+细胞、CD4+细胞)、淋巴细胞以及其他血细胞)、骨髓、脑、干细胞、血管、肝脏、肺脏、骨、乳腺、软骨、宫颈、结肠、角膜、胚胎、子宫内膜、内皮细胞、上皮细胞、食管、筋膜、成纤维细胞、滤泡、神经节细胞、神经胶质细胞、杯状细胞、肾、淋巴结、肌肉、神经元、卵巢、胰腺、外周血、前列腺、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸。
B.有机体
在某些实施方式中，宿主细胞或组织至少包含在一种有机体中。在某些实施方式中，有机体可以是人、灵长类动物或鼠。在另外一些实施方式中，有机体可以是任何真核的甚至是原核的(如真细菌，一种太古生物)生物，这些都是本领域普通技术人员很容易理解的(例如参见网页http：∥phylogeny.arizona.edu/tree/phylogeny.html)。
C.可注射组合物和药用制剂
为了利用本发明的慢病毒载体组合物进行基因治疗，一般将需要的细胞与含有治疗基因的慢病毒载体混合。细胞还可以包含在有机体如需要基因治疗的人体内。注射的途径有多种，根据注射的部位及疾病的性质而定，包括静脉注射、动脉注射、真皮内注射、皮内注射、肌肉注射、鼻内注射、皮下注射、经皮注射、气管内注射、腹膜内注射、瘤内注射、灌注以及灌洗。有时也可以将细胞从有机体中分离出来，在体外用慢病毒转染后再移植到有机体内。
本发明的慢病毒载体可以用注射器或任何用于注射液体的方法注射，只要表达载体能通过用于注射的针头孔径。最近出现了一种新型的无针注射系统(美国专利5,846,233)，该系统含有一个能储存液体的玻璃腔的喷嘴和一个用于将液体从喷嘴喷到注射部位的动力装置。注射器系统也可以是用于基因治疗的将多种剂量的液体精确注射到任何深度的装置(美国专利5,846,225号)。
用于制备核酸溶液的自由碱或药用盐可以用水适量混合表面活性剂如羟丙纤维素配制。分散溶液也可以用甘油、液体聚乙烯甘油及其混合物或油配制。
在普通的储藏和使用条件下，这些含有保存液的制剂会防止微生物的生长。适于注射的药用制剂包括无菌水溶液或分散液，以及可以在使用时制备成无菌水溶液或分散液的无菌粉末(见美国专利5,466,468号，本文特地将其纳入作为参考)。但是不管在什么情况下，制剂都必须是无菌的，并且还要有一定的流动性以便于注射。制剂在制造和储存条件下必须是稳定的，并且在储存时不能出现微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是含有水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇以及液体聚乙烯甘油等)、上述物质的适宜混合物、和/或植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以通过使用包被如卵磷脂、通过在分散液中保持所需要的颗粒直径以及通过使用表面活性剂来维持。防止微生物污染可以通过加入各种抗细菌和抗真菌药物来达到，如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选等渗的试剂如糖或氯化钠。要延长注射组合物的吸收时间可以通过在组合物中加入延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和凝胶来实现。
对于经胃肠道外途径注射的水溶液来说，如果需要溶液应该是适于缓冲的，液体稀释时应首先用足量的盐或葡萄糖将其调整为等渗。这种水溶液特别适于静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、瘤内注射以及腹膜内注射。因此，本领域的技术人员根据本说明书可以很容易地知道哪些是可用的无菌注射溶剂。例如，一个剂量的药物可用1ml等渗的氯化钠溶液溶解，然后或者加到1000ml皮下灌注液中，或者直接注射到适当部位，(见《Remington制药学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第15版，1035-1038页和1570-1580页)。根据病人的不同状况也可以改变注射的剂量。在任何情况下都要根据病人的实际状况来确定注射的剂量。而且，用于人体注射的制剂必须符合FDA生物标准所要求的无菌、无热源、一般安全性及纯度的标准。
无菌注射液可以通过将需要量的溶于适当溶剂中的活性化合物与上述各种所需的其他组分混合，经过滤除菌后制备。一般来说分散液是通过将各种无菌的活性组分掺入到含碱性分散介质和上述其他各种组分的无菌载体中而制备的。如果用无菌粉末制备无菌注射液，优选的制备方法是将真空干燥或冷冻干燥的活性组分粉末与上述无菌过滤液中的所需组分混合。
本文所涉及的组合物还可以制备成中性溶液或盐溶液。药用盐，包括加酸的盐，一般是用无机酸如盐酸或硫酸、有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等配制。与游离羰基形成的盐也可以来自无机碱如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁，也可以来自有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。一旦成为制剂，溶液就以与剂型相适的方式来注射，所用的剂量是治疗有效量的。制剂可以很容易地以各种剂型如注射液、药物释放胶囊等给药。
本文所用的术语″载体″包括任何的及所有的溶剂、分散介质、载体、包被物稀释液、抗细菌及抗真菌试剂、等渗液、吸收延迟液、缓冲液、载体溶液、悬液、胶体等。这些介质和试剂如何用于药用活性物质是本领域所熟知的。除了与活性组分不相容的常规介质或试剂以外，上述物质都可用于治疗组合物中。其他的活性组分也可以添加到组合物中。
术语″药用的″是指那些注射到人体内后不会产生变态反应或其他毒副作用的分子实体或组合物。含有蛋白活性组分的水溶性组合物的制备是本领域所熟知的。这种组合物一般都制备成注射液或注射悬液，也可以制备成适于制成液体或悬液的固体。
术语″接触″或″暴露于″用于细胞时是指将治疗性慢病毒载体导入靶细胞。
对于分散的、固体的、能接触到的肿瘤来说，基因治疗特别适于采取瘤内注射或肿瘤血管内注射的方式。也可以考虑局部、区域或全身给药。对于＞4cm的肿瘤，注射量约为4-10ml(优选10ml)，对于＜4cm的肿瘤，注射量约为1-3ml(优选3ml)。多点注射时单个剂量一般约为0.1-0.5ml。病毒颗粒最好通过多点注射到肿瘤内来导入，注射点之间相隔约1cm。某些疾病入造血系统肿瘤优选全身给药。
如果需要时也可以连续给药。优选通过注射器或导管给药。连续注射可以持续一段时间，如从初次注射开始持续约1-2小时、约2-6小时、约6-12小时、约12-24小时、约1-2天、约1-2周或更长。一般来说，通过持续灌注给予治疗组合物的量与单次或多次注射所给予的量相等，在灌注期内可以适当调整剂量。
治疗方案可以是各种各样的，这要根据疾病的类型、发病组织的部位以及病人的健康状况及年龄等因素而定。临床医生可以根据自己对本发明慢病毒载体治疗制剂效率和毒性(如果有)的了解作出决定。
治疗时有各种″单位剂量″。一个单位剂量定义为一个含本发明慢病毒载体的预定量的治疗组合物。给药剂量及给药途径和剂型都是临床医生所熟悉的。一个单位剂量并不一定通过一次注射来完成，可以在一定期间内连续给予。本发明的单位剂量为了方便以转导单位(T.U.)表示，通过测定细胞系如HeLa或293细胞内病毒的滴度来确定。单位剂量为103，104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013 T.U.或更高。
8.实施例
下面的实施例用于说明本发明的优选实施方式。本领域的技术人员优先选用实施例中所描述的技术，这些技术是发明者所发现的，很适于实现本发明，因此可以作为实现本发明的优选实施模式。但是，本领域的技术人员根据本说明书的精神，可以对本文所描述的特殊实施方式作出改变，在不背离本发明的精神及范围的情况下同样也能得到一样或相似的结果。
A.实施例1-3所用的材料和方法
1.载体的制备
具有水泡性口炎病毒(VSV)G包膜蛋白假模型的HIV来源载体的制备是通过与三个质粒共转染293上皮细胞而获得的，见Naldini等，1996a的描述。HIV来源的包装构建体是pCMvΔR8.91，该载体编码HIV-1的Gag和Pol前体和调节蛋白Tat及Rev(Zufferey等，1997)。VSV G是pMD.G.表达的。
HIV载体质粒起源于pHR’，是将其骨架经改造而成的(Naldini等，1996a)。自身灭活载体来自上述的SIN-18载体，该载体的3’LTR的U3区从-418到-18缺失，去除了所有的转录活性序列(Zufferey等，1998)。简言之，pHR’SIN的构建过程如下：将一个含多聚嘌呤簇序列的KpnI-XbaI片段和3’LTR从pHR’上切下，然后克隆到pUC-18的相应位点中。再将获得的质粒用EcoRV完全酶切，用PvuII部分酶切，然后自身连接起来。得到一个U3区缺失400个核苷酸的质粒。将一个XhoI连接物插入到缺损质粒的EcoRI位点，并将XhoI-XbaI片段插入到经相应酶消化的质粒pHR’CMVlacZ中。其他所有的SIN-18质粒是通过用报告基因(编码荧光素酶、GFP和Neo)替代lacZ而获得的。本发明所用的pHR’载体与原来最初所报告的不同(Naldini等，1996)，本发明的载体是通过XhoI-KpnI酶切从多聚嘌呤簇上游的Nef编码区删除一个11bp的片段和从3’LTR下游的人源序列中删除一个1456bp的片段。这个人源序列在HXB2前病毒基因组的原始克隆中还存在。这两个删除不会影响病毒在分裂的293T细胞中的滴度和基因的表达。
EF1α片段的插入是通过将一个含有EF1-GFP序列的ClaI-BamHI盒插入到pHR’-W-SIN的ClaI-BamHI位点而实现的，得到的载体为pHR-EF1-GFP-W-SIN。这个载体衍生物具有几个不同的功能特点，其不同在于EF-1α-短启动子、3’LTR的loxP位点以及cPPT。3’LTR的loxP位点在转导细胞内是复制到5’LTR上的，并且如果存在附加的Cre重组酶，整合的前病毒将被去除。但是，loxP位点和Cre介导的删除并不是gp91-phox启动子发挥活性所必须的，并且也不是载体用于造血干细胞临床治疗所需要的。存在于pHR-EF1-GFP-(+/-)W-SIN中的EF-1α和存在于pHPT-GFP及pWPT-GFP中的EF-1α短启动子之间的区别就在于短的版本不含内含子，这使载体更小。
图5A到5D中的示意图描述的是质粒构建体pHPT-GFP，pWPT-GFP，pHPP91-GFP和pWPP91-GFP。
用磷酸钙沉淀法将质粒瞬时转染293T细胞后，收获上清，蔗糖密度梯度离心浓缩病毒颗粒，然后重悬到无血清的CellgroSCGM培养基(Cellgenix，德国)中，用0.45μm的SpinX滤膜过滤。病毒原种保存于-70℃，如上面所描述的(Zufferey等，1997)通过转导HeLa细胞并用流式细胞仪测定GFP的表达来确定病毒的滴度。滴度在每毫升5×107到108HeLa转导单位(TU)之间。
2.CD34+细胞的纯化和转导
按照研究指导手册收集脐带血(CB)样品，纯化CD34+细胞(见Arrighi等，1999)。简要步骤如下：用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)密度梯度离心获得的CB单个核细胞置于冰上与抗CD34 M450Dynabeads(Dynal，挪威)按照厂商提供的说明书共孵育。经几次洗涤洗去未结合的细胞后，通过与试剂盒内的″Detach-a-bead″在37℃孵育15分钟从磁珠上分离CD34+细胞。立即洗涤细胞并用流式细胞仪分析。纯化的细胞中CD34+细胞占89±7.0％。将105细胞接种到含100μl Cellgro SCGM培养基的96孔板中用于转导，培养基中加入了抗生素(Gibco BRL，Life TechnologiesLTD，Paisley，Scotland，U.K.)、10-4M二硫苏糖醇(Fluka Biochemika，Buchs，瑞士)和TPO(10ng/ml)、SCF(50ng/ml)、Flt3L(50ng/ml)。孵育过夜后，每孔中加入106(一般来说)或105-5×105(用于剂量-效应分析)HeLa转导单位(TU)的载体，将液体体积用含TPO的Cellgro SCGM培养基调整到200μl。24小时后，洗涤细胞并用添加抗生素、10-4M二硫苏糖醇和TPO(10ng/ml)、SCF(50ng/ml)、Flt3L(50ng/ml)的Cellgro SCGM培养基稀释到400μl，继续培养3天。细胞直接用于分析GFP和CD34的表达，或用3种生长因子继续培养。
3.细胞因子
所有细胞因子都是人源重组的，得自Peprotech(英国，伦敦)。
4.抗体和免疫反应试剂
所有抗体都来自Becton Dickinson Pharmingen(USA)。抗-CD34 mIgG包被的M450 Dynabeads来自Dynal A/S(奥斯陆，挪威)。
5.体外分化和IFN-γ刺激
体外分化是用GM-CSF和SCF刺激向单核细胞分化，以及用G-CSF或G-CSF刺激三周和SCF刺激向粒细胞分化。分化的细胞用IFN-γ(1000U/ml)刺激6天，用PE连接的单克隆抗体标记，然后用FACS分析PE阳性细胞群中的GFP表达情况。数字表示的是每个象限中的细胞百分数。
6.流式细胞术
细胞按Arrighi等描述的方法稍加改动在FACScalibur(Becton-Dickinson)上分析。FL-1用于分析GFP，FL-2用于分析PE标记的单克隆抗体，FL-3用于分析PercP标记的单克隆抗体。细胞在分析前用0.5％的多聚甲醛固定。数据用Scripps研究所(La Jolla，CA)的J.Trotter编写的WINMDI软件和CellQuest软件(Becton-Dickinson)分析。
B.实施例1-4
实施例1：用含gp91-phox启动子控制下的表达盒的HIV来源的慢病毒载体转染人造血祖细胞可以在单核细胞及粒细胞内获得基因的限制性表达
pWPP91-GFP(含WPRE)和pHPP91-GFP(不含WPRE)慢病毒载体是通过用pWPT-GFP和pHPT-GFP慢病毒载体上巨噬细胞NADPH氧化酶启动子(1)的gp91-phox亚单位的1540bp片段替换EF-1α而构建的。pWPT-GFP和pHPT-GFP都是SIN(自身灭活)慢病毒载体，含有中央多聚嘌呤簇(cPPT)以增强靶细胞的转导效率(图1和图5)。重组慢病毒载体用上述标准方法制备并浓缩100倍，用于造血干祖细胞(HSCs)CD34+细胞的转导。见Salmon P，Kindler V，Ducrey O，Chapuis B，Zubler RH，Trono D.，″用改进型慢病毒载体转导人造血祖细胞和分化血细胞后基因在细胞内的高水平表达″(″High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors anddifferentiated blood lineages after transduction with improved lentiviralvectors，″)Blood 96(10)：3392-8(2000)，本文已纳入作为参考。
利用慢病毒载体可以使UCB HSC达到很高的转导百分率，例如可以达到80％，该载体的EF1-α-GFP表达盒下游插入一个中央多聚嘌呤簇。转化的HSCs经体外分化(细胞因子混合物刺激)或体内分化(移植到NOD/SCID小鼠体内)后还能保持较高的GFP阳性率。
用携带gp91-phox-GFP表达盒的慢病毒载体转导HSCs，然后经体外分化(细胞因子混合物刺激)或体内分化(移植到经亚致死剂量射线照射的NOD/SCID小鼠体内)后，能表达GFP的细胞只限于成熟的单核细胞和粒细胞。成熟嗜中性白细胞内gp91启动子控制的GFP表达可以通过插入WPRE而增强，并且其特异性不会下降。
由慢病毒载体转导到HP/SCs内的gp91-phox启动子，不论是否含有WPRE，在成熟的嗜中性白细胞内都对IFN-γ的刺激产生生理性反应(图2)。
实施例2：HS增强子元件产生高效稳定的表达
对于各种淋巴造血系统疾病的基因治疗来说，一个重要的问题是如何使治疗基因在相应的分化细胞内达到高水平的表达。为了达到高效稳定的表达水平，可以在位于慢病毒载体4个DNA酶超敏位点(HS)内的gp91-phox基因上游30kb处插入gp91特异的增强子。
首先，为了缩短病毒基因组，用一个与gp91启动子功能相当的0.5kb片段替代gp91启动子(Skalnik等，1991)，得到pHP500-GFP载体(图6A)。为了便于克隆，引入一个独特的多克隆位点以便于在两个cPPT位点上都能插入增强子(插入增强子后其中央位置和功能依然保持)，得到载体pHPX-GFP(图6B)。
覆盖4个HS位点的片段是以基因组DNA为模板通过PCR方法制备的。PCR引物序列是基于人类基因组工程所报道的人基因组序列(编号NT011844；http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)。见SEQ ID NOS：2-16。gp91-phox HS位点的位置参考了文献，见Lien LL，Lee Y，和Orkin SH(1997)。
扩增出特异性位点两侧约1-1.5kb的片段，然后克隆到慢病毒载体中得到最终的pHPHS-GFP。见SEQ ID NOS：2-16。含有WPRE序列的载体也构建出来(pWPHS-GFP，图6C)。包含HS元件的载体一旦转染到HSCs并经分化后，转基因就会高水平和/或稳定地表达。
实施例3：慢性肉芽肿性疾病的治疗进展
慢性肉芽肿性疾病(CGD)的发生与gp91-phox基因的缺失高度相关，该基因编码NADPH的一个亚单位(Dinauer等，1987)。与X染色体连锁的gp91-phox基因在约60％的CGD患者中出现缺损。其综述资料见Malech HL，″慢性肉芽肿性疾病的基因治疗进展″(″Progress in gene therapy for chronic granulomatous disease)，Infect.Dis.179(Suppl.2)：S 318-25，1999。一种治疗该疾病的方法是转导适当的细胞以便至少将gp91-phox的一个功能拷贝导入病人体内。如上面所讨论的，这种治疗方法包括将细胞从患者体内分离出来，经体外转导后再移植回患者体内。
从CGD病人体内分离出CD34细胞，用本发明的慢病毒载体转导，该载体携带gp91-phox基因的一个功能拷贝，如含SEQ ID NO：18所示核酸序列的gp91-phox基因，或者任何编码具有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的多肽的核酸序列。通过载体内gp91-phox启动子的控制，gp91-phox多肽可适当表达。如上所述，加上WPRE元件和HS增强子可使基因的表达效率提高。
将细胞移植到检测系统内，如SCID-NOD小鼠或相应的患者体内。可以通过将转导细胞移植到适当的基因敲除小鼠体内进一步评价这种治疗方法的效果。
实施例4：白血病粘连缺乏病(LAD)的治疗方法
一种治疗该疾病的方法是转导适当的细胞以便至少将髓样单核细胞白细胞整合素的一个功能拷贝导入病人体内。如上面所讨论的，这种治疗方法包括将细胞从患者体内分离出来，经体外转导后再移植回患者体内。
从LAD病人体内分离出CD34细胞，用本发明的慢病毒载体转导，该载体携带整合素基因的一个功能拷贝。通过载体内CD11b启动子的控制，整合素多肽可适当表达。CD11b启动子可以选自SEQ ID NO：20所示的多聚核苷酸序列编码的启动子。见Hickstein等，1992。如上所述，加上WPRE元件和HS增强子可使基因的表达效率提高。
根据本说明书的精神，本说明书和权利要求书所描述的所有组合物和/或方法不需要特别的实验就可以制备和实现。虽然本发明的组合物和方法是以优选实施方式来描述的，但是只要不超越本发明的概念、精神和范围，本领域的技术人员很容易对本发明的组合物和/或方法作出修改，例如在步骤上，以及步骤的顺序上作出调整。特别需要指出的是，只要能达到同样的或相似的效果，本文所描述的试剂都可以用化学及生理相关的试剂来代替。本领域的技术人员应该很清楚所有这些代替或修改都应该在本发明权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
                               参考文献
下面的参考文献对本说明书作了一定程度的补充和细节说明，特地将其纳入作为参考。
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                            序列表
<110>D.特罗诺(TRONO，DIDIER)
M.维兹那罗维茨(MACIEJ WIZNEROWICZ)
<120>限制性表达慢病毒载体
<130>CLFR：014WO
<140>未知
<141>2002-09-30
<140>60/326,593
<141>2001-10-02
<160>20
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>118
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>1
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat    60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttt      118
<210>2
<211>1744
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
gtataaggta acatatccac aggttctaga gattagtacc tagacatctt tggttggggg    60
taatatttat ccaactacaa atggatatga taattttaca tacctcataa ggtggttgtg    120
aaaaataaat gagacaaagc acataagaca tgtggtgtgt ataaaatgct ttgtaaatgt    180
cagctgttgt taataagacc aagttgtttg taaaaaaaga tttttcaagg aaataagcca    240
atataataca ggatgcatac tgaaaagttt tagttcaaat caataactag agatttcctc    300
atttttcctt tattctgatg aattaatgta tacaagtcat atttaacata aaggggtaaa    360
atgtaaatct tcatcgccag acattttcat tttctattaa gtgaaatgcc agtaaaagcc    420
acattcttaa tgcctttaat tgcctagatc agtacactaa cccttcttcc ccgaatacct    480
cttcttctac tttgttattt tctctcccaa acaagagata gaacatttgg atcccattcc    540
agcaaacttc ttcaactttt attaactctt gagattctgg tgatgaaata aaagtgagtt    600
tctttatacc atgatttact gagaaccctt cttgatataa gcagtagaaa tacaactgga    660
actgttttcc ttaagcagaa agtggcagtg gtgggaattt atggcttctg tagccaggtt    720
aaatacagtg atgtggcaac caggtccaag atcttgccca agatcactca aggtcatccc    780
agcttcagat ctcctcgtgg gattgctgag gccttattgt gaccacatga taactcaact    840
gctccttctg cccacttctg ctttcttatt tttcattgcc ttttacagct atttacctct    900
aagaacactc cctaatgaaa ctcctgcaca ctaaactcca tctcagaatc tgcttcccag    960
gaaacccaat ctaaaagaat aattgagagg tccaagtatc tcaggcagat cagactcaat    1020
aattcaaaca ctgtaatcac atctgtctcc agacttctct atccttccct aaatactgat    1080
tatgattttg tttgtgttga cataattttt atgtagctat ttagcacaag gtggtccaaa    1140
tggcctatgg cagcatcagg catacatcat tcacaaagag agaaaagctt gactttctct    1200
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taaatgccca cccctgggac aaacactgag tccagaggaa tgaagtcatt gcagtagcca    1320
tccttaggca aggaatgtgg ggctacacaa atcatagaag gatatagagt gggagcatga    1380
tggttctgga aagaatagga tacatggcag agataaaggg aacagaaatc catttttcat    1440
tagcacaagg aataaaactc attaagaacc ttggcatagt aacacatctc tctttcatca    1500
gcaatttcat acatgcacct tgacgtaatt aggaacataa ttttgtggtt gaaatttatt    1560
tttattattg tgacagtcta caactactgt attattccat ttcagaaatt ttttgactat    1620
gagttttaac ctactatgga aagcataata ttgaggttta taataaaaaa ttatatttga    1680
tttgaagtaa aaaggtccag agcacattct ctcactaact ggctataatc tcaagaaagc    1740
aacc                                                                 1744
<210>3
<211>1475
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gtattcagag tgtgcagatg tctttgcaca tccatgagaa agtaaaatct tgtgattcat    60
ttgcagtctt gctgattgac tttcttagga ttctttaatt actgagatac tcagtctcag    120
aaagcaattc tgtaaatctc ccaaatggcc acaaatgaat aatctcatat taaagtataa    180
taaatattca ttatctgctt tactttttta tgtccactat aaaacaggct gatgaataac    240
ccctggttta ccaataggaa gttgacagca acctcagtaa ggtcttactg gagagaaatg    300
aggggaagca gatgttgtgg gttgaggtga gggagtgaga tgcctcaaaa tggctgaggc    360
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tggtttcatt ttgtttttaa atagaagcct gtaaatgttg ttgataggaa gctaatctac    480
ttcaatttag gactagcttc tgccttatcc cacaagatga ccattaattc aaggttgatg    540
ttgtgttgtg cttgttaatt agctttatga agatataaac aacagaaagg gactataaaa    600
caggaaaagg aaaaccagca ataattatcg tgtatccctt ttttccatga tcatcatcat    660
gaacaggaaa gccccttatc ggccatatca tttcttggga cagatattct gttttattcc    720
gtgacctatt cctaatctct gtgagaacca cttctatcca ccatgacatt ctcttccaca    780
aactccagag caagcctcac atcaggtaac actgtaagtt tctccaccca agaacatcac    840
cctttcattt tactgtactg agcagtttaa ctcttctctg actcaacctc taacccctag    900
accaggcagt gcctttcaat tcccaaaaag tccatcaaag tgtctgccct actagaagag    960
cagcctctcc tcaaaactaa ttccccaatt cccagagaaa tgtgcacaca ctgaagatag    1020
cttctgaggt gttagatttt acaaaccatt ttcttttaaa ataatttcat gcagaagata    1080
aaggtattac aaagaaatcc aaggtactcc tgatccagat tcatcaacta ttaacatttt    1140
gtcacattta cgttgtcatt ctctctctct ccatatgatt atttttttct attttctttt    1200
ttctttttct ttctttcttt ttttttttct tttttttttt ttcgagacag agttttgatc    1260
ttgccaccca ggatggagtg caatggcgcg atctcggctc actgaaactg ctgcctcctg    1320
ggttcaagca attctcttgc ctcagcctcc caagtagctg ggattacagg ataaggatcc    1380
tgtaattaca ttgggcccac ccagataatc catgaaaaac tttctttctc aatagcctta    1440
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<210>4
<211>1201
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
gcgtcgacat agtgtggtct ccataacata ggaagtcaag atcccccttc actcttgacc    60
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gaggagactg gggctaaatg aggtcaaata ggttgctcaa ggtcttatag cttgttagtg    300
cagtggtcag gatttgaaca aattctatgt aagtttatca tgaaaccact ttgcaagaaa    360
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ggtcatcccc atcccctaca aaaccttccc accggacatc tgtacttctc ctcccatggt    660
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tactctacat gccatgctat gagagtggac taggctatga gagttgtttt tttcctagct    840
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c                                                                    1201
<210>5
<211>1143
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
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<211>1256
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
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<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>7
gtataaggta acatatccac agg                                             23
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>8
ggctataatc tcaagaaagc aacc                                            24
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>9
gtattcagag tgtgcagatg tctttgc                                    27
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>10
cctgcaaagt ccctttaacc gtat                                       24
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>11
gcgtcgacat agtgtggtct ccataacata gg                              32
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>12
gcttctgaaa tctgcatctc gagcggc                                    27
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>13
gcgtcgactt tccagggctt cttccatagc                                     30
<210>14
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>14
ggttacacca tagatatggt taactcgagc ggc                                 33
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>15
gcgtcgacca tccatgttgt ttcaatgaca gg                                  32
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>16
gcagcaacag actagccatt ctcgagcggc                                     30
<210>17
<211>1557
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
tctagaagct ttattctgtt tttaaatttt ttatttttat attttacctt taaaacattt    60
ttgttaaaag ctaagacaca aacatacaca ttagcctagg cccacacaaa gtcaggatca    120
ttaatatcac tgtcttccac ctccacattt tgccccactg gacagtcttc aagggcacta    180
acatgcatga agctgtcatc tatgacagca atgcattctt ctggaatacc ttctgaagga    240
cctgcctgag attcttttac agttaacttt tttataagta ggagtatact ctaaaataat    300
gattaaaagt atagtctagt aaataaatga accagtaaca tagtcatcta tttttactat    360
caagtactat gtaatgtaca taattgtatg tgctatactt ttacaactgg cagctcagta    420
ggtttgttta caccagcatt gccacaaaca catgagtaat gtgttatgct acaatgtcac    480
tagatggtag gaatttttca gcacacacac acaagtatat atattatata ttatattata    540
tattatatat atatatgtat atatatatat atatatagag agagagagag agagagagag    600
agagagatgg agtcttgctc tgtcgcccag gctggggtgc aatgacacaa tctcggctca    660
ctgcaacctg actcccaggt tcaagtgatt ctcctgcctc agcctcctga gtagctggga    720
ctacaggtgc ccaccaccat gcccagctaa tttttgtatt tttagtagag acggggtttc    780
accatgttgg ccagattggt cccaaactcc tgacctcaag tgatccaccc cactcagcct    840
ctcaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc accgtgcctg gccaacacca ttataatctt    900
atgggaccac tgtcatacat gtggttcatc attggccaaa gcatctgtat ttatatatgt    960
atgtttcaaa ttatatatat atatatatat atatatatat atgatagcta tacatgaaca    1020
tacacacaca catatataga catatatagc acataaaatt ggcacatatt aagcattttg    1080
taaatatcaa ccattacaat tgttactact tttctcagca aggctatgaa tgctgttcca    1140
gcctgtcaaa atcacacctg tttaatgtgt tttacccagc acgaagtcat gtctagttga    1200
gtggcttaaa aattgtgatc aaatagctgg ttagttaaaa agttatttca ctgtgtaaaa    1260
tacatccctt aaaatgcact gttatttatc tcttagttgt agaaattggt ttcattttcc    1320
actatgttta attgtgactg gatcattata gacccttttt ttgtagttgt tgaggtttaa    1380
agatttaagt ttgttatgga tgcaagcttt tcagttgacc aatgattatt agccaatttc    1440
tgataaaaag aaaaggaaac cgattgcccc agggctgctg ttttcatttc ctcattggaa    1500
gaagaagcat agtatagaag aaaggcaaac acaacacatt caacctctgc caccatg       1557
<210>18
<211>4266
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(15)..(1727)
<400>18
cttcctctgc cacc atg ggg aac tgg gct gtg aat gag ggg ctc tcc att     50
                Met Gly Asn Trp Ala Val Asn Glu Gly Leu Ser Ile
                  1               5                  10
ttt gtc att ctg gtt tgg ctg ggg ttg aac gtc ttc ctc ttt gtc tgg     98
Phe Val Ile Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn Val Phe Leu Phe Val Trp
         15                  20                  25
tat tac cgg gtt tat gat att cca cct aag ttc ttt tac aca aga aaa     146
Tyr Tyr Arg Val Tyr Asp Ile Pro Pro Lys Phe Phe Tyr Thr Arg Lys
     30                  35                  40
ctt ctt ggg tca gca ctg gca ctg gcc agg gcc cct gca gcc tgc ctg     194
Leu Leu Gly Ser Ala Leu Ala Leu Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Leu
 45                  50                  55                  60
aat ttc aac tgc atg ctg att ctc ttg cca gtc tgt cga aat ctg ctg     242
Asn Phe Asn Cys Met Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Leu Leu
                 65                  70                  75
tcc ttc ctc agg ggt tcc agt gcg tgc tgc tca aca aga gtt cga aga    290
Ser Phe Leu Arg Gly Ser Ser Ala Cys Cys Ser Thr Arg Val Arg Arg
             80                  85                  90
caa ctg gac agg aat ctc acc ttt cat aaa atg gtg gca tgg atg att    338
Gln Leu Asp Arg Asn Leu Thr Phe His Lys Met Val Ala Trp Met Ile
         95                 100                 105
gca ctt cac tct gcg att cac acc att gca cat cta ttt aat gtg gaa    386
Ala Leu His Ser Ala Ile His Thr Ile Ala His Leu Phe Asn Val Glu
    110                 115                 120
tgg tgt gtg aat gcc cga gtc aat aat tct gat cct tat tca gta gca    434
Trp Cys Val Asn Ala Arg Val Asn Asn Ser Asp Pro Tyr Ser Val Ala
125                 130                 135                 140
ctc tct gaa ctt gga gac agg caa aat gaa agt tat ctc aat ttt gct    482
Leu Ser Glu Leu Gly Asp Arg Gln Asn Glu Ser Tyr Leu Asn Phe Ala
                145                 150                 155
cga aag aga ata aag aac cct gaa gga ggc ctg tac ctg gct gtg acc    530
Arg Lys Arg Ile Lys Asn Pro Glu Gly Gly Leu Tyr Leu Ala Val Thr
            160                 165                 170
ctg ttg gca ggc atc act gga gtt gtc atc acg ctg tgc ctc ata tta    578
Leu Leu Ala Gly Ile Thr Gly Val Val Ile Thr Leu Cys Leu Ile Leu
        175                 180                 185
att atc act tcc tcc acc aaa acc atc cgg agg tct tac ttt gaa gtc    626
Ile Ile Thr Ser Ser Thr Lys Thr Ile Arg Arg Ser Tyr Phe Glu Val
    190                 195                 200
ttt tgg tac aca cat cat ctc ttt gtg atc ttc ttc att ggc ctt gcc    674
Phe Trp Tyr Thr His His Leu Phe Val Ile Phe Phe Ile Gly Leu Ala
205                 210                 215                 220
atc cat gga gct gaa cga att gta cgt ggg cag acc gca gag agt ttg    722
Ile His Gly Ala Glu Arg Ile Val Arg Gly Gln Thr Ala Glu Ser Leu
                225                 230                 235
gct gtg cat aat ata aca gtt tgt gaa caa aaa atc tca gaa tgg gga    770
Ala Val His Asn Ile Thr Val Cys Glu Gln Lys Ile Ser Glu Trp Gly
            240                 245                 250
aaa ata aag gaa tgc cca atc cct cag ttt gct gga aac cct cct atg    818
Lys Ile Lys Glu Cys Pro Ile Pro Gln Phe Ala Gly Asn Pro Pro Met
        255                 260                 265
act tgg aaa tgg ata gtg ggt ccc atg ttt ctg tat ctc tgt gag agg    866
Thr Trp Lys Trp Ile Val Gly Pro Met Phe Leu Tyr Leu Cys Glu Arg
    270                 275                 280
ttg gtg cgg ttt tgg cga tct caa cag aag gtg gtc atc acc aag gtg    914
Leu Val Arg Phe Trp Arg Ser Gln Gln Lys Val Val Ile Thr Lys Val
285                 290                 295                 300
gtc act cac cct ttc aaa acc atc gag cta cag atg aag aag aag ggg    962
Val Thr His Pro Phe Lys Thr Ile Glu Leu Gln Met Lys Lys Lys Gly
                305                 310                 315
ttc aaa atg gaa gtg gga caa tac att ttt gtc aag tgc cca aag gtg    1010
Phe Lys Met Glu Val Gly Gln Tyr Ile Phe Val Lys Cys Pro Lys Val
            320                 325                 330
tcc aag ctg gag tgg cac cct ttt aca ctg aca tcc gcc cct gag gaa    1058
Ser Lys Leu Glu Trp His Pro Phe Thr Leu Thr Ser Ala Pro Glu Glu
        335                 340                 345
gac ttc ttt agt atc cat atc cgc atc gtt ggg gac tgg aca gag ggg    1106
Asp Phe Phe Ser Ile His Ile Arg Ile Val Gly Asp Trp Thr Glu Gly
    350                 355                 360
ctg ttc aat gct tgt ggc tgt gat aag cag gag ttt caa gat gcg tgg    1154
Leu Phe Asn Ala Cys Gly Cys Asp Lys Gln Glu Phe Gln Asp Ala Trp
365                 370                 375                 380
aaa cta cct aag ata gcg gtt gat ggg ccc ttt ggc act gcc agt gaa    1202
Lys Leu Pro Lys Ile Ala Val Asp Gly Pro Phe Gly Thr Ala Ser Glu
                385                 390                 395
gat gtg ttc agc tat gag gtg gtg atg tta gtg gga gca ggg att ggg    1250
Asp Val Phe Ser Tyr Glu Val Val Met Leu Val Gly Ala Gly Ile Gly
            400                 405                 410
gtc aca ccc ttc gca tcc att ctc aag tca gtc tgg tac aaa tat tgc    1298
Val Thr Pro Phe Ala Ser Ile Leu Lys Ser Val Trp Tyr Lys Tyr Cys
        415                 420                 425
aat aac gcc acc aat ctg aag ctc aaa aag atc tac ttc tac tgg ctg    1346
Asn Asn Ala Thr Asn Leu Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Phe Tyr Trp Leu
    430                 435                 440
tgc cgg gac aca cat gcc ttt gag tgg ttt gca gat ctg ctg caa ctg    1394
Cys Arg Asp Thr His Ala Phe Glu Trp Phe Ala Asp Leu Leu Gln Leu
445                 450                 455                 460
ctg gag agc cag atg cag gaa agg aac aat gcc ggc ttc ctc agc tac    1442
Leu Glu Ser Gln Met Gln Glu Arg Asn Asn Ala Gly Phe Leu Ser Tyr
                465                 470                 475
aac atc tac ctc act ggc tgg gat gag tct cag gcc aat cac ttt gct    1490
Asn Ile Tyr Leu Thr Gly Trp Asp Glu Ser Gln Ala Asn His Phe Ala
            480                 485                 490
gtg cac cat gat gag gag aaa gat gtg atc aca ggc ctg aaa caa aag      1538
Val His His Asp Glu Glu Lys Asp Val Ile Thr Gly Leu Lys Gln Lys
        495                 500                 505
act ttg tat gga cgg ccc aac tgg gat aat gaa ttc aag aca att gca      1586
Thr Leu Tyr Gly Arg Pro Asn Trp Asp Asn Glu Phe Lys Thr Ile Ala
    510                 515                 520
agt caa cac cct aat acc aga ata gga gtt ttc ctc tgt gga cct gaa      1634
Ser Gln His Pro Asn Thr Arg Ile Gly Val Phe Leu Cys Gly Pro Glu
525                 530                 535                 540
gcc ttg gct gaa acc ctg agt aaa caa agc atc tcc aac tct gag tct      1682
Ala Leu Ala Glu Thr Leu Ser Lys Gln Ser Ile Ser Asn Ser Glu Ser
                545                 550                 555
ggc cct cgg gga gtg cat ttc att ttc aac aag gaa aac ttc taa          1727
Gly Pro Arg Gly Val His Phe Ile Phe Asn Lys Glu Asn Phe
            560                 565                 570
cttgtctctt ccatgaggaa ataaatgtgg gttgtgctgc caaatgctca aataatgcta    1787
attgataata taaatacccc ctgcttaaaa atggacaaaa agaaactata atgtaatggt    1847
tttcccttaa aggaatgtca aagattgttt gatagtgata agttacattt atgtggagct    1907
ctatggtttt gagagcactt ttacaaacat tatttcattt ttttcctctc agtaatgtca    1967
gtggaagtta gggaaaagat tcttggactc aattttagaa tcaaaaggga aaggatcaaa    2027
aggttcagta acttccctaa gattatgaaa ctgtgaccag atctagccca tcttactcca    2087
ggtttgatac tctttccaca atactgagct gcctcagaat cctcaaaatc agtttttata    2147
ttccccaaaa gaagaaggaa accaaggagt agctatatat ttctactttg tgtcattttt    2207
gccatcatta ttatcatact gaaggaaatt ttccagatca ttaggacata atacatgttg    2267
agagtgtctc aacacttatt agtgacagta ttgacatctg agcatactcc agtttactaa    2327
tacagcaggg taactgggcc agatgttctt tctacagaag aatattggat tgattggagt    2387
taatgtaata ctcatcattt accactgtgc ttggcagaga gcggatactc aagtaagttt    2447
tgttaaatga atgaatgaat ttagaaccac acaatgccaa gatagaatta atttaaagcc    2507
ttaaacaaaa tttatctaaa gaaataactt ctattactgt catagaccaa aggaatctga    2567
ttctccctag ggtcaagaac aggctaagga tactaaccaa taggattgcc tgaagggttc    2627
tgcacattct tatttgaagc atgaaaaaag agggttggag gtggagaatt aacctcctgc    2687
catgactctg gctcatctag tcctgctcct tgtgctataa aataaatgca gactaatttc    2747
ctgcccaaag tggtcttctc cagctagccc ttatgaatat tgaacttagg aattgtgaca    2807
aatatgtatc tgatatggtc atttgtttta aataacaccc accccttatt ttccgtaaat    2867
acacacacaa aatggatcgc atctgtgtga ctaatggttt atttgtatta tatcatcatc    2927
atcatcctaa aattaacaac ccagaaacaa aaatctctat acagagatca aattcacact    2987
caatagtatg ttctgaatat atgttcaaga gagagtctct aaatcactgt tagtgtggcc    3047
aagagcaggg ttttcttttt gttcttagaa ctgctcccat ttctgggaac taaaaccagt    3107
tttatttgcc ccaccccttg gagccacaaa tgtttagaac tcttcaactt cggtaatgag    3167
gaagaaggag aaagagctgg gggaagggca gaagactggt ttaggaggaa aaggaaataa    3227
ggagaaaaga gaatgggaga gtgagagaaa ataaaaaagg caaaagggag agagagggga    3287
agggggtctc atattggtca ttccctgccc cagatttctt aaagtttgat atgtatagaa    3347
tataattgaa ggaggtatac acatactgat gttgttttga ttatctatgg tattgaatct    3407
tttaaaatct ggtcacaaat tttgatgctg agggggatta ttcaagggac taggatgaac    3467
taaataagaa ctcagttgtt ctttgtcata ctactattcc tttcgtctcc cagaatcctc    3527
agggcactga gggtaggtct gacaaataag gcctgctgtg cgaatatagc ctttctgaaa    3587
tgtaccagga tggtttctgc ttagagacac ttaggtccag cctgttcaca ctgcacctca    3647
ggtatcaatt catctattca acagatattt attgtgttat tactatgagt caggctctgt    3707
ttattgtttc aattctttac accaaagtat gaactggaga gggtacctca gttataagga    3767
gtctgagaat attggccctt tctaacctat gtgcataatt aaaaccagct tcatttgttg    3827
ctccgagagt gtttctccaa ggttttctat cttcaaaacc aactaagtta tgaaagtaga    3887
gagatctgcc ctgtgttatc cagttatgag ataaaaaatg aatataagag tgcttgtcat    3947
tataaaagtt tcctttttat ctctcaagcc accagctgcc agccaccacg agccagctgc    4007
cagcctagct tttttttttt tttttttttt agcacttagt atttagcatt tattaacagg    4067
tactctaaga atgatgaagc attgttttta atcttaagac tatgaaggtt tttcttagtt    4127
cttctgcttt tgcaattgtg tttgtgaaat ttgaatactt gcaggctttg tatgtgaata    4187
attctagcgg gggacctggg agataattct acggggaatt cttaaaactg tgctcaacta    4247
ttaaaatgaa tgagctttc                                                 4266
<210>19
<211>570
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
Met Gly Asn Trp Ala Val Asn Glu Gly Leu Ser Ile Phe Val Ile Leu
  1               5                  10                  15
Val Trp Leu Gly Leu Asn Val Phe Leu Phe Val Trp Tyr Tyr Arg Val
             20                  25                  30
Tyr Asp Ile Pro Pro Lys Phe Phe Tyr Thr Arg Lys Leu Leu Gly Ser
         35                  40                  45
Ala Leu Ala Leu Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Leu Asn Phe Asn Cys
     50                  55                  60
Met Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Leu Leu Ser Phe Leu Arg
 65                  70                  75                  80
Gly Ser Ser Ala Cys Cys Ser Thr Arg Val Arg Arg Gln Leu Asp Arg
                 85                  90                  95
Asn Leu Thr Phe His Lys Met Val Ala Trp Met Ile Ala Leu His Ser
            100                 105                 110
Ala Ile His Thr Ile Ala His Leu Phe Asn Val Glu Trp Cys Val Asn
        115                 120                 125
Ala Arg Val Asn Asn Ser Asp Pro Tyr Ser Val Ala Leu Ser Glu Leu
    130                 135                 140
Gly Asp Arg Gln Asn Glu Ser Tyr Leu Ash Phe Ala Arg Lys Arg Ile
145                 150                 155                 160
Lys Asn Pro Glu Gly Gly Leu Tyr Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Gly
                165                 170                 175
Ile Thr Gly Val Val Ile Thr Leu Cys Leu Ile Leu Ile Ile Thr Ser
            180                 185                 190
Ser Thr Lys Thr Ile Arg Arg Ser Tyr Phe Glu Val Phe Trp Tyr Thr
        195                 200                 205
His His Leu Phe Val Ile Phe Phe Ile Gly Leu Ala Ile His Gly Ala
    210                 215                 220
Glu Arg Ile Val Arg Gly Gln Thr Ala Glu Ser Leu Ala Val His Asn
225                 230                 235                 240
Ile Thr Val Cys Glu Gln Lys Ile Ser Glu Trp Gly Lys Ile Lys Glu
                245                 250                 255
Cys Pro Ile Pro Gln Phe Ala GIy Asn Pro Pro Met Thr Trp Lys Trp
            260                 265                 270
Ile Val Gly Pro Met Phe Leu Tyr Leu Cys Glu Arg Leu Val Arg Phe
        275                 280                 285
Trp Arg Ser Gln Gln Lys Val Val Ile Thr Lys Val Val Thr His Pro
    290                 295                 300
Phe Lys Thr Ile Glu Leu Gln Met Lys Lys Lys Gly Phe Lys Met Glu
305                 310                 315                 320
Val Gly Gln Tyr Ile Phe Val Lys Cys Pro Lys Val Ser Lys Leu Glu
                325                 330                 335
Trp His Pro Phe Thr Leu Thr Ser Ala Pro Glu Glu Asp Phe Phe Ser
            340                 345                 350
Ile His Ile Arg Ile Val Gly Asp Trp Thr Glu Gly Leu Phe Asn Ala
        355                 360                 365
Cys Gly Cys Asp Lys Gln Glu Phe Gln Asp Ala Trp Lys Leu Pro Lys
    370                 375                 380
Ile Ala Val Asp Gly Pro Phe Gly Thr Ala Ser Glu Asp Val Phe Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Glu Val Val Met Leu Val Gly Ala Gly Ile Gly Val Thr Pro Phe
                405                 410                  415
Ala Ser Ile Leu Lys Ser Val Trp Tyr Lys Tyr Cys Asn Asn Ala Thr
            420                 425                  430
Asn Leu Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Phe Tyr Trp Leu Cys Arg Asp Thr
        435                 440                 445
His Ala Phe Glu Trp Phe Ala Asp Leu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gin
    450                 455                 460
Met Gln Glu Arg Asn Asn Ala Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Ile Tyr Leu
465                 470                 475                 480
Thr Gly Trp Asp Glu Ser Gln Ala Asn His Phe Ala Val His His Asp
                485                 490                 495
Glu Glu Lys Asp Val Ile Thr Gly Leu Lys Gln Lys Thr Leu Tyr Gly
            500                 505                 510
Arg Pro Asn Trp Asp Asn Glu Phe Lys Thr Ile Ala Ser Gln His Pro
        515                 520                 525
Asn Thr Arg Ile Gly Val Phe Leu Cys Gly Pro Glu Ala Leu Ala Glu
    530                 535                 540
Thr Leu Ser Lys Gln Ser Ile Ser Asn Ser Glu Ser Gly Pro Arg Gly
545                 550                 555                 560
Val His Phe Ile Phe Asn Lys Glu Asn Phe
                565                 570
<210>20
<211>1774
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>20
ggttcaagtg attctgctgc ctcagcctcc caggcgggat tacaggtgcc tgccaccacg    60
cctggctaat ttttttgtct ttttagtaaa gatgaggttt caccatgttg ggcaggctgg    120
tttcaattgc tgacctcaag tgagccaccc cgcctcagcc tccaaaatgc taggattaca    180
ggcatgagcc accgcaccca gccaagtttg tacatatatt tttgactaca cttcttaact    240
attcttagga taaattacta gaagtgaaaa ttcttgggtg aagagcttga ggcctttaca    300
cacacacaca cacacacaca cacacacaca caaataggct ggatcgagtg gctcacacct    360
gtaatctcag cagtttggga ggctgaggaa ggaggatcac ttgagtccag gaggttgaga    420
atagcctgaa caacatagca agatcttgtc tctacaaaaa agtttaaaaa aaattagctg    480
gccatggcag catgtgcctg tagtaccagc tactcggaag gctgaggtag gaggatcgct    540
tgagcccagg aggtgattga agctgcagtg agctgtgatt acaccactgc actccagcct    600
gggcaacaga gctagactct gtctctaaaa aaaggcacaa aataatattt aaaaagcacc    660
aggtatgcct gtacttgagt tgtctttgtt gatggctaca aatgagacag ctctggctga    720
agggcggctt ccatttccat gggctggagg aggacatttt gcaaagtgtg ttttcaggaa    780
gacacagagt tttacctcct acacttgttt gatctgtatt aatgtttgct tatttattta    840
tttaattttt tttttgagac agagtctcac tctgtcacct gggctggagt gcagtggcat    900
tattgaggct cattgcagtc tcagactcct gagctcaaac aatcctcctg cctcagcctc    960
tggagtagct aggactacag gcatgtgcca ccatgcctgg ctaatttttt aaatgtattt    1020
ttttgtagag tcggggtctc cctatgttgc ccaggctgga gtgcagtggt gtgatcctag    1080
ctcactgcag cctggacctc gggctcaaga aattctcaca cctcagcctg tccagtagca    1140
ggggctacag gcgcgcacca ccatcccagc taattaaaaa tatttttttg tagagacagg    1200
gtctctctat gttgcccagg ctggtttcaa actcccaggc tcaagcaatc ctcctgcctt    1260
gcctcccaaa tgacatcgga ttacaggcgt gagccactga gcctggcccg tattaatgtt    1320
tagaacacga attccaggag gcaggctaag tctattcagc ttgttcatat gcttgggcca    1380
acccaagaaa caagtgggtg acaaatggca ccttttggat agtggtattg actttgaaag    1440
tttgggtcag gagctgggga ggaagggtgg gcaggctgtg ggcagtcctg ggcggaagac    1500
caggcagggc tatgtgctca ctgagcctcc gccctcttcc tttgaatctc tgatagactt    1560
ctgcctccta cttctccttt tctgcccttc tttgctttgg tggcttcctt gtggttcctc    1620
agtggtgcct gcaaccctgg ttcactcttc caggttctgg ctccttccag ccatggctct    1680
cagagtcctt ctgttaacag gtgcatgggg gtggggtggg ggactctggg tggggaggag    1740
ggtaactttt gggtctgtca taaatagagg gccc                                1774

Claims (68)

1.一种重组慢病毒载体，所述载体包含：
(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；
(b)含有转基因的表达盒，该转基因位于启动子的控制之下，启动子能促使转基因在人细胞内可测转录；以及
(c)位于表达盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)。
2.如权利要求1所述的载体，其中，cPPT包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的载体，其中，所述载体能转导约20％到约80％的细胞。
4.如权利要求1所述的载体，其中，所述载体能转导约40％到约80％的细胞。
5.如权利要求1所述的载体，其中，所述载体能转导约60％到约80％的细胞。
6.如权利要求1所述的载体，所述载体还包含位于cPPT附近的多个独特的克隆位点。
7.如权利要求2所述的载体，其中，所述多个独特的克隆位点位于cPPT上游。
8.如权利要求2所述的载体，其中，所述多个独特的克隆位点位于cPPT下游。
9.如权利要求2所述的载体，其中，所述多个独特的克隆位点位于cPPT上游和下游。
10.如权利要求2所述的载体，其中，gag、pol和rev基因是HIV的gag、pol和rev基因。
11.如权利要求10所述的载体，其中，gag、pol和rev基因是HIV-1的gag、pol和rev基因。
12.如权利要求1所述的载体，该载体还被定义为自身灭活载体(SIN)。
13.如权利要求1所述的载体，其中，LTR区是通过3’LTR U3区的删除而被修饰成几乎无转录活性的。
14.如权利要求13所述的载体，其中，删除的是相对于U3-R区边界的-418到-18位的核苷酸。
15.如权利要求1所述的载体，该载体还被定义为不能通过重组重建野生型慢病毒的载体。
16.如权利要求15所述的载体，其中，所述载体不表达gag、pol和rev之外的慢病毒的功能基因。
17.如权利要求1所述的载体，其中，所述启动子是gp91-phox启动子、gp47-phox启动子、CD11b启动子、EF1-α启动子、PGK启动子、β球蛋白启动子、MHC II类启动子、凝血因子IX启动子、胰岛素启动子、PDX1启动子、CD4启动子和CD2的启动子。
18.如权利要求17所述的启动子，其中，所述启动子是gp91-phox启动子。
19.如权利要求17所述的启动子，其中，所述启动子是gp47-phox启动子。
20.如权利要求17所述的启动子，其中，所述启动子是CD11b启动子。
21.如权利要求17所述的启动子，其中，所述启动子是EF1-α启动子。
22.如权利要求17所述的载体，该载体还包含至少一个增强子序列。
23.如权利要求22所述的载体，其中，至少一个增强子序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的序列。
24.如权利要求22所述的载体，其中，至少一个增强子序列位于cPPT附近。
25.如权利要求19.5所述的载体，其中，至少一个增强子序列位于cPPT上游。
26.如权利要求24所述的载体，其中，至少一个增强子序列位于cPPT下游。
27.如权利要求24所述的载体，其中，增强子序列位于cPPT上游和下游。
28.如权利要求27所述的载体，其中，所述增强子序列选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的序列。
29.如权利要求1所述的载体，其中，所述启动子能促使转基因以约10-约200的信-噪比为表达。
30.如权利要求29所述的载体，其中，所述启动子能促使转基因以约40-约200的信-噪比为表达。
31.如权利要求30所述的载体，其中，所述启动子能促使转基因以约150-约200的信-噪比为表达。
32.如权利要求1所述的载体，其中，所述启动子能使转基因在转录激活物的刺激下表达。
33.如权利要求32所述的载体，其中，所述转录激活物是IFN-γ。
34.如权利要求32所述的载体，其中，所述启动子能促使转基因在特定类型的细胞内表达。
35.如权利要求1所述的载体，其中，所述启动子能促使转基因在特定类型的细胞内表达。
36.如权利要求35所述的载体，其中，所述特定细胞类型选自成熟血细胞、嗜中性白细胞、单核细胞、粒细胞、神经元、肺细胞、肌细胞、肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、心肌细胞、皮肤细胞、骨髓基质细胞和眼细胞。
37.如权利要求35所述的载体，其中，所述细胞类型是成熟血细胞。
38.如权利要求35所述的载体，其中，所述细胞类型是嗜中性白细胞。
39.如权利要求35所述的载体，其中，所述细胞类型是单核细胞或粒细胞。
40.如权利要求35所述的载体，其中，所述细胞类型是神经元。
41.如权利要求1所述的载体，其中，所述转基因是gp91-phox、gp47-phox、红细胞生成素、白细胞介素、集落刺激因子、整合素αIIbβ、多药物抗性基因、抗病毒基因、编码凝血因子VIII的基因、编码凝血因子IX的基因、T细胞抗原受体、B细胞抗原受体、单链抗体(ScFv)、TNF、γ干扰素、CTLA4、B7、Melana、MAGE、标记基因、荧光素酶或GFP。
42.如权利要求41所述的载体，其中，所述转基因是gp91-phox。
43.如权利要求41所述的载体，其中，所述转基因是gp47-phox。
44.如权利要求41所述的载体，其中，所述转基因是编码标记基因的基因。
45.如权利要求41所述的载体，其中，所述转基因是编码GFP的基因。
46.如权利要求1所述的载体，该载体还包含促进所述转基因表达的转录后调节序列。
47.如权利要求46所述的载体，其中，所述转录后调节序列是位于表达盒内的内含子。
48.如权利要求47所述的载体，其中，所述内含子位于与载体基因组转录物相反的方向上。
49.如权利要求46所述的载体，其中，所述转录后调节序列是转录后调节元件。
50.如权利要求49所述的载体，其中，所述转录后调节序列是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
51.如权利要求50所述的载体，其中，所述转录后调节序列是乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
52.一种被权利要求1所述的载体转导的宿主细胞。
53.如权利要求52所述的转导的宿主细胞，其中，所述细胞是病毒生产者细胞。
54.如权利要求53所述的转导的宿主细胞，其中，所述生产者细胞是293T细胞。
55.如权利要求54所述的宿主细胞，其中，所述细胞是人造血祖细胞。
56.如权利要求55所述的转导的宿主细胞，其中，所述人造血祖细胞是CD34+细胞。
57.一种自身灭活的重组慢病毒载体，所述载体包含：
(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；
(b)含有转基因的表达盒，该转基因位于启动子的控制之下，启动子与转录激活物相互作用时能促使转基因在人细胞内可测转录；
(c)位于表达盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)；以及
(d)能促进转基因表达的转录后调节元件。
58.一种自身灭活的重组慢病毒载体，所述载体包含：
(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；
(b)含有转基因的表达盒，该转基因位于启动子的控制之下，启动子能促使转基因在特定类型的人细胞内可测转录；
(c)位于表达盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)；以及
(d)能促进转基因表达的转录后调节元件。
59.一种自身灭活的重组慢病毒载体，所述载体包含：
(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；
(b)含有转基因的表达盒，该转基因位于启动子的控制之下，其中，
(i)所述启动子能促使转基因在特定类型的人细胞内可测转录，以及
(ii)所述启动子与转录激活物相互作用时能促使转基因在特定类型的人细胞内可测转录；
(c)位于表达盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)；以及
(d)能促进转基因表达的转录后调节元件。
60.一种自身灭活的重组慢病毒载体，所述载体包含：
(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；
(b)含有转基因的表达盒，该转基因位于启动子的控制之下，其中
(i)启动子能促使转基因在特定类型的人细胞内可测转录，以及
(ii)启动子与转录激活物相互作用时能促使转基因在特定类型的人细胞内可测转录；
(c)位于表达盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)；
(d)能促进转基因表达的转录后调节元件；以及
(e)至少一个增强子元件。
61.一种转导人造血干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使一群含造血干细胞的人细胞与权利要求1所述的载体接触，条件是用所述载体能有效转导所述细胞群中的造血祖细胞。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述人造血干细胞群包含CD34+细胞。
63.如权利要求61所述的方法，其中，所述细胞群经处理后能刺激细胞的增殖，但不会明显丢失干细胞的多潜能性。
64.如权利要求61所述的方法，其中，所述干细胞在体内转导。
65.如权利要求61所述的方法，其中，所述干细胞在体外转导。
66.如权利要求65所述的方法，其中，所述转导的干细胞被输注到人类受试者。
67.一种在限定类型的细胞内表达转基因的方法，其特征在于，所述方法包括按照权利要求61所述的方法转导人细胞并使所需的细胞类型成熟。
68.如权利要求67所述的方法，所述方法还包括使启动子与转录激活物相互作用以刺激转基因表达的步骤。
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