KR20040054699A - 제한된 발현의 렌티바이러스 벡터 및 이의 적용과 관련된방법 및 조성물 - Google Patents

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엥스띠뛰 끌레이톤 드 라 러쉐르쉬
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Abstract

본 발명은 특히 사람 조혈 전구세포 뿐만 아니라 모든 기타 혈구 유도체에서 사람 유전자 요법을 위한 전이유전자를 발현시키는데 있어 안전하고 매우 효과적이며 매우 강력한 HIV-유래된 렌티벡터를 제공한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 세포형 또는 조직에 특이적인 발현을 촉진할 정도로 활성인 프로모터를 포함한다. 추가로, 프로모터는 활성화인자, 인핸서 또는 억제인자에 의해 조절될 수 있다. 이러한 벡터는 생체안정성을 위한 자가-불활성화 형태로 존재한다. 추가의 프로모터가 또한 기술된다. 상기 벡터는 특이성이나 상기 프로모터에 의해 발휘되는 조절에서의 어떠한 감소없이 추가의 전사 증강 요소, 예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소를 또한 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 벡터는 유전적 및 후천적 림프-조혈 질환과 같은 유전자 치료, 암, 특히 혈액암에 대한 유전자 요법 뿐만 아니라, 사람 HSC의 렌티벡터-매개된 변형을 통한 조혈 연구에 유용한 도구를 제공한다.

Description

제한된 발현의 렌티바이러스 벡터 및 이의 적용과 관련된 방법 및 조성물{Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications}
발명의 배경
본 출원은 전문이 본원에서 참조로 인용되는 2001년 10월 2일 제출된 미국 분할 출원 제60/326,593호의 우선권을 주장한다.
1. 발명의 분야
본 발명은 개선된 렌티바이러스 벡터 및 표적 세포, 특히 렌티바이러스 벡터-변형된 사람 조혈 줄기세포(hHSC)로부터 유래된 분화된 혈구 계통에 대한 목적하는 전이유전자의 유전자 전달 및 고수준 발현에서 이의 용도에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 설명
사람 조혈 줄기세포(hHSC)의 형질도입을 통한 유전자 요법은 다수의 유전적 및 후천적 림프-혈액 질환의 치료에 매우 유망한 방식이다. 그러나, 기존의 유전자 전달 시스템으로 hHSC를 장기적으로 재증식시키는 안정적인 유전자 조작은 치료 현실에 적합한 효율을 달성하지 못한다. 예를 들어, 몰로니 쥐 백혈병바이러스(MLV)로부터 유래된 종양레트로바이러스 벡터는 표적 세포의 염색체내로 이의 일부를 삽입시킨다는 점에서 매력적이지만, 증식의 유도인자로 먼저 처리되지 않은 hHSC를 형질도입할 수 없다(Kohn et al., 1991; Mazurier et al., 1998). 실제로, MLV 전결합 복합체(preintegration complex)의 핵 전달에는 유사분열동안 나타나는 핵막의 파괴가 요구된다(Roe et al, 1993; Lewis and Emerman, 1994). 불행하게도, 골수(BM) 또는 제대혈(UCB)로부터 수거되었거나 말초 순환계에 결집되었는지에 상관없이 hHSC는 대부분 분열되지 않고 연속적인 자극과 증식이후에 다능성(pluripotentiality)을 상실한다(Bhatia et al., 1997; Dao et al., 1997; Dorrell et al., 2000). 그러나, 최근에 SCID-재증식 세포(SRC)로도 지칭되는 비-비만형 당뇨/중증 복합 면역결핍(NOD/SCVID)에서 장기적인 생착이 가능한 세포뿐만 아니라 다능 세포의 상당 부분을 특정한 자극 조건을 이용하여 유지시키고 형질도입하며 심지어 확대시킬 수도 있는 것으로 보고되었다(Dorrell et al., 2000; Dao et al., 1998; Piacibello et al., 1999; Ueda et al., 2000).
렌티바이러스는 핵공(nucleopore)을 통하여 활성 유입을 가능하게 하는 전결합 복합체의 핵질친화성(karyophilic) 특성으로 인하여 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 세부그룹이다. 따라서, I형 사람 면역결핍 바이러스(HIV-1)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터는 시험관내와 생체내에서 비-유사분열 세포로 전이유전자의 효과적인 전달, 삽입 및 장기적인 발현을 매개할 수 있다(Naldini et al., 1996a; Naldini et al., 1996b; Blomer et al., 1997). 특히, HIV계 벡터는 사이토킨 자극의 부재하에 사람 CD34+조혈 세포를 효과적으로 형질도입할 수 있다(Akkina et al., 1996; Sutton et al., 1998; Uchida et al., 1998; Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999). 이들 세포는 NOD/SCID 마우스에서 장기적으로 생착할 수 있다(Miyoshi et al., 1999). 이들 1차 수용자로부터 얻은 골수는 두 번째 마우스를 형질도입된 세포로 재증식시킬 수 있는데, 이는 매우 원시적인 조혈 전구세포, 대부분은 선의의(bona fide)줄기세포의 렌티벡터-매개된 유전자 변형을 입증한다. 현재 이용가용한 다른 유전자 전달 시스템은 이런 능력을 갖고 있지 않기 때문에, 렌티바이러스 벡터는 HSC의 유전자 조작을 통하여, 조혈 연구 및 유전과 후천 림프-혈액 질환의 유전자 요법에 대한 전인미답의 기초를 제공한다.
그러나, 생체안전성 요구를 충족시키지 못하거나(Akkina et al., 1996; Sutton et al., 1998; Uchida et al., 1998) 전이유전자의 발현을 미미한 수준으로 유도하기 때문에(Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999; An et al., 2000), 치료 용도에 부적합한 초기 세대의 렌티바이러스 벡터에 의해 이러한 중요한 점이 입증되었다. 따라서, 조혈 세포, 특히 조혈 전구세포를 효과적으로 형질도입할 수 있고 목적하는 전이유전자를 높은 수준으로 발현할 수 있는 형질도입 벡터로서 개선된 렌티바이러스의 개발이 필요하다.
최적의 줄기세포 유전자 요법은 HSC의 효과적인 형질도입을 초래하고, 줄기세포의 적응성에 비추어 특정한 성숙한 혈구 계통으로 치료 유전자의 제한된 발현을 초래한다. 3세대 렌티바이러스 벡터는 비-순환성 사람 HSC로 유전자를 전달하는데 가정 적합한 도구이다. 게다가, 자가-불활성화 설계(SIN)는 상부 LTR로부터 간섭없이 조직 특이적 프로모터의 사용을 가능하게 한다.
본 발명의 요약
본 발명은 생체안전성 요구를 충족시키고, 원하는 경우에 조직이나 줄기세포 계통 특이적 방식으로 높은 수준의 전이유전자 발현이 유도되도록 자극할 수 있는 개선된 렌티바이러스 벡터의 개발에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 프로모터 또는 인핸서와 전사 조절인자의 접촉에 기인하는 전사 활성화 또는 억제를 통하여 형질도입된 세포에서 전이유전자 발현을 조절한다.
따라서, 본 발명은 사람 조혈 전구세포(HPC)의 형질도입 및 특정한 분화된 혈액 계통에서 또는 특정 전사 인자의 조절하에 전이유전자의 발현에 매우 적합한 유전자 전달 운반체를 제시한다. 이들 벡터는 조혈 줄기세포의 유전자 조작에 렌티바이러스 벡터의 추가적인 사용을 용이하게 하고 연구와 치료학적 적용에 특히 유용하다. 고려되는 세포형의 몇가지 예는 미성숙한 혈구, 성숙한 혈구, 호중구, 단핵구/대식세포 및 과립구이다.
그러나, 당해 분야의 숙련가라면 본 발명이 조혈 세포의 형질도입에 국한되지 않으며, 다른 세포형에서 전이유전자의 세포-특이적 발현을 위해서도 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 고려되는 다른 세포형의 몇가지 예는 최종적으로 분화된 세포, 예를 들면 뉴런, 폐 세포, 근육 세포, 간 세포, 췌장 세포, 내피 세포, 심장 세포, 피부 세포, 골수 간질 세포 및 안구 세포이다. 이에 더하여, 줄기세포와 전구세포, 예를 들면 췌장 췌관 세포, 신경 전구세포 및 중배엽 줄기세포도 또한 고려된다.
따라서, 본 발명은 사람 조혈 전구세포 또는 줄기세포(hHSC)의 형질감염과 형질도입이 가능하고 이런 세포에서 목적하는 전이유전자를 높은 수준으로 발현하도록 설계된 개선된 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HSC의 특정한 세습적 계통에서 전사 활성화인자에 반응하여 발현이 달성되도록 이들 목적하는 전이유전자의 제한된 발현을 제공한다. 또한, 본 발명의 벡터는 사람에게 사용하기에 안전하도록 특정한 "자가-불활성화" 설계 특징을 보유한다는 점에서 자가-불활성화 렌티바이러스이다. 이들 자가-불활성화 또는 SIN 설계 특징에는 복제 적격한(competent) 렌티바이러스 게놈의 재구성이 방지되게 하는 벡터 LTR의 변형이 포함된다. 이런 SIN 설계의 특히 바람직한 구체예는 3' LTR의 U3 영역에서 뉴클레오티드의 결실이다.
본 발명의 렌티바이러스는 유전자 조작된 hHSC의 분화된 후손에서 목적하는 전이유전자의 조절되고 세포형 특이적이며 높은 수준의 발현을 달성하는 효과적인 수단을 처음으로 제공한다. 사람 HSC는 자극되지 않은 상태에서 기존의 벡터 시스템에 의한 형질도입에 대해 비교적 내성이기 때문에, 형질도입이 곤란하였다. 본 발명의 렌티바이러스는 이의 전결합 복합체 핵공(nucleopore)을 통하여 활성 유입을 가능하게 하는 전결합 복합체의 핵질친화성(karyophilic) 특성으로 인하여 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 능력을 보유한다. 게다가, 본 발명의 바람직한 렌티바이러스 벡터는 사이토킨 자극의 부재하에서도 시험관내 및 생체내 둘다에서비-유사분열 세포로 전이유전자의 효과적인 전달, 삽입 및 적절하거나 장기적인 발현을 매개할 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 렌티벡터로 형질도입된 줄기세포는 예를 들어, NOD/SCID 마우스에서 장기적으로 생착할 수 있다. 그러나, 본 발명의 보다 바람직한 렌티벡터는 사람 생체안전성 요구를 충족하면서, 사람 전구세포와 성숙한 분화된 세포형의 특정 계통에서 조절되지만 여전히 높은 수준의 발현을 가능하게 하는 매우 바람직한 특징을 갖는다.
따라서, 본 발명의 바이러스 벡터는 적어도 렌티바이러스gag,pol,rev유전자, 또는 입수가능한 생산 세포주를 이용하여 합리적인 양으로 벡터를 제조할 수 있게 하는 바이러스 생산에 요구되는 다른 유전자를 포함하는 재조합 벡터이다. 중요한 사람 안정성 요구를 충족시키기 위해 본 발명에 따른 보다 바람직한 벡터는 임의의 다른 활성 렌티바이러스 유전자, 예를 들면vpr,vif,vpu,nef,tat를 포함하지 않는다. 이들 유전자는 제거되거나 불활성화된다. 벡터에 존재하는 유일한 활성 렌티바이러스 유전자는gag,pol및rev유전자이다.
본 발명에 따른 렌티벡터를 제조하는데 사용되는 렌티바이러스 유전자와 골격(즉, 긴 말단 반복부위 또는 LTR)의 가장 바람직한 조합은 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 좀더 구체적으로 HIV-1로부터 유래되는 조합이다. 따라서,gag,pol,rev유전자는 바람직하게는 HIV 유전자, 보다 바람직하게는 HIV-1 유전자이다. 그러나,gag,pol및rev유전자 및 다른 렌티바이러스의 LTR 영역을 상기 유전자와 HIV-2, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스, 소 면역결핍 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스 및 염소 관절염 뇌염 바이러스 등의 LTR 영역을 포함하여 본 발명에 따른 특정 적용을 위해 사용될 수 있다. 이런 작제물은 예를 들어, 비-사람 기원의 특정 세포를 변형시키려는 경우에 유용할 수 있다. 그러나, HIV계 작제물이 사람 조혈 전구세포의 형질도입에 가장 효과적이라는 점에서, HIV계 벡터 골격(즉, HIV LTR 및 HIVgag,pol,rev유전자)이 본 발명에서 가장 바람직하다.
본 발명의 바이러스 벡터는 사람 세포에서 전이유전자의 검출가능한 전사를 촉진할 정도로 활성인 프로모터의 조절하에 위치하는 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 또한 포함한다. 바람직한 구체예에서, 프로모터는 사람 조혈 전구세포에서 전이유전자의 전사를 촉진할 정도로 활성이다. 보다 바람직한 구체예는 전구세포의 특정 세포형이나 후손 계통에서 전사를 촉진할 정도로 활성인 프로모터이다. 이보다 보다 바람직한 구체예는 전사 조절인자 또는 활성화인자 및 억제인자에 의한 활성화 또는 억제를 통하여 조절되는 프로모터이다.
본 발명과 관련하여 바람직하게 사용될 수 있는 프로모터의 예는 gp91-phox 프로모터, gp47-phox 프로모터, CD11b 프로모터, EF1-α프로모터, PGK 프로모터, 베타-글로빈 프로모터, MHC II형 프로모터, 응혈 인자 IX 프로모터, 인슐린 프로모터, PDX1 프로모터, CD11 프로모터, CD4 프로모터 및 CD2 프로모터이다. 이중에서, gp91-phox 프로모터가 특히 바람직하다. gp91-phox 프로모터는 주로 단핵구와 과립구에서 전이유전자의 발현을 촉진하고 이의 활성이 활성화인자, 특히 인터페론-감마(IFN-감마)와의 접촉으로 조절된다는 점에서 특정한 당해 세포형에 국한되는 조절가능 발현을 제공하는 프로모터의 전형이다. 그러나, 프로모터가 전구세포, 조혈 세포, 또는 전사 조절을 표적하거나 이런 전사 조절에 반응하는 다른 세포에서 활성을 보인다면, 본 발명의 실시는 전술한 프로모터에 국한되지 않는다.
특정 프로모터가 유용한지를 결정하기 위하여, 선택된 프로모터는 선택된 전구세포에서 시험관내 작제물에서 검사하는데, 이런 프로모터가 검출가능한 시그날 대 노이즈 비로 전이유전자의 발현을 촉진할 수 있다면, 일반적으로 본 발명에 따라 유용할 것이다. 바람직한 시그날 대 노이즈 비는 10 내지 200이고, 보다 바람직한 시그날 대 노이즈 비는 40 내지 200이고, 이보다 보다 바람직한 시그날 대 노이즈 비는 150 내지 200이다. 이런 프로모터를 검사하는 한가지 수단은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 시그날 발생 전이유전자를 사용하는 것으로, 아래에 좀더 상세하게 기술한다.
본 발명은 벡터에서 중심 폴리푸린 지역(cPPT)의 포함을 통하여 증가된 형질도입 효율을 추가적으로 제공한다. 이런 형질도입 효율은 20%, 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 또는 최대 80%의 형질도입이다. 바람직한 구체예에서, cPPT는 서열의 프로모터 상부에 위치한다. cPPT는 서열 1의 뉴클레오티드 서열로 예시된다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예는 다수의 고유한 클로닝 부위(unique cloning site)를 포함한다. 유일 클로닝 부위는 벡터 서열내에서 고유힌 제한 효소 인식 서열 부위이다. 집단적으로 모여 있는 이들 몇몇 부위는 다수의 고유한 클로닝 부위를 제공한다. 이들 부위는 벡터의 내외부로 폴리뉴클레오티드를 조작하기에 편리할 수 있는 모든 곳에 위치될 수 있지만, 바람직하게는 cPPT와 프로모터 사이에, 또는 cPPT의 상부에 위치한다. 예를 들어, 이들 다수의 고유한 클로닝부위는 본 발명을 실시하는데 유용한 벡터 서열 요소의 용이한 도입을 가능하게 한다.
앞서 언급된 프로모터는 전사에 필요한 추가 요소를 포함할 수 있고, 따라서 전사 카세트의 일부가 될 수 있다. 전사 카세트는 전이유전자의 강한 발현 또는 조직-제한된 발현을 보장하기 위하여 인핸서 및/또는 유전자좌 조절 영역에 결합된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 것으로 정의된다. 하나 이상의 인핸서는 전이유전자의 발현을 조절하는데 있어 가장 활성인 곳이라면 벡터상의 어디에나 위치될 수 있다. 표적 분화된 세포 계통에서 높은 수준의 전이유전자 발현을 달성하기 위하여, 인핸서는 표적 분화된 계통에 특이적일 수도 있다. 계통-특이적 인핸서는 HS 부위를 포함한다. HS 부위는 베타-글로빈, CD2, gp91에서 확인되었지만, 추가의 HS 또는 HS-형 부위가 확인될 수 있다. 예를 들어, 적모세포(erythroblast)에 대한 GATA-1 인핸서. 사람 게놈 서열의 입수가능성은 본 발명의 일부로 고려되는 이런 요소의 동정을 매우 용이하게 한다.
인핸서와 격리 요소(insulator element)의 특히 바람직한 그룹은 유전자좌 조절 영역(LCR)내에 위치하는 것들이며, DNAase 과민성 부위로서 동정될 수 있다. 이들 HS 부위의 공조된 인핸서 활성은 염색질 도메인 개방 활성을 주도하고, 따라서 염색질에서 전사인자 접근을 용이하게 하고 인핸서-결합된 인자와 프로모터-결합된 인자 사이의 단백질-단백질 상호작용을 촉진하는 것으로 생각되는데, 이런 활성은 도메인 경계를 한정하는데 필요하다. 프로모터-유전자 카세트에 대하여 시스(cis)로 존재하는 HS 부위는 높은 수준의 통합-부위-독립적 발현을 제공한다.이들 요소는 전이유전자 카세트의 상부 또는 하부에 단독으로 또는 다수개로 위치할 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, HS 요소는 cPPT 요소의 상부와 하부 둘다에 인접하여 위치하고 프로모터의 상부에 위치한다. 따라서, 이들 HS 부위는 앞서 기술된 다수의 고유한 클로닝 부위에 도입될 수 있다. 인접이란, 본 발명의 요소, 예를 들면 cPPT 요소가 참고 요소, 즉 프로모터 요소의 경계로부터 벡터 서열을 조사할 때 마주치게 되는 기능적으로 중요한 첫 번째 요소라는 것을 의미한다.
예를 들어, 형질도입을 위해 표적화된 세포에서 단지 중간정도로 활성인 프로모터의 경우에 특수한 적용을 위해 전이유전자의 발현을 촉진하도록 위치하는 전사후 조절 서열을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 전사후 조절 요소의 한가지 유형은 발현 카세트내에 위치하는 인트론인데, 이는 유전자 발현을 촉진하는 역할을 할 수 있다. 그러나, 이런 방식으로 위치하는 인트론은 렌티바이러스 RNA 전사체를 정상적인 세포 스플라이싱 및 가공 기전에 노출시킬 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서 인트론-보유 전이유전자는 벡터 게놈 전사체와 반대 배향으로 위치시키는 것이 바람직하다.
전이유전자 발현을 강화시키는 보다 바람직한 방법은 스플라이싱 현상에 의존하지 않는 전사후 조절 요소, 예를 들면 단순 포진 바이러스의 전사후 가공 요소, B형 간염 바이러스의 전사후 조절 요소(HPRE), 또는 HPRE에서 발견되지 않는 추가의 시스-작용 요소를 보유하는 우드척(woodchuck) 간염 바이러스의 전사후 조절 요소(WPRE)를 사용하는 것이다. 벡터에서 이런 조절 요소는 전이유전자의 전사체에는 포함되지만 전이유전자 해독 단위의 종결 코돈의 외부에 존재하도록 배치된다. 이런 조절 요소는 중간정도의 프로모터에는 매우 바람직하지만, 매우 효율적인 프로모터의 경우에는 금기시될 수 있다.
본 발명의 렌티벡터에 야생형 LTR에 비하여 감소된 프로모터 활성을 보유하는 LTR 영역을 사용하는 것이 특히 바람직한데, 그 이유는 이런 작제물이 "자가-불활성화"(SIN) 생체안전성을 제공하기 때문이다. 자가-불활성화 벡터는 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산이 현저하게 감소되거나 완전히 소멸된 벡터이다. 이런 특성은 복제 적격한 재조합체(RCR)가 출현할 수 있는 위험을 현저하게 감소시킨다. 게다가, 이는 벡터 결합 부위에 인접하여 위치하는 세포 암호 서열이 비정상적으로 발현되는 위험을 감소시킨다. 이에 더하여, SIN 설계는 LTR과 전이유전자의 발현을 유도하는 프로모터 사이의 간섭 가능성을 감소시킨다. 따라서, 내부 프로모터의 완전한 잠재력이 나타나도록 하는 것이 특히 바람직하다.
바람직하게는, 자가-불활성화는 벡터 DNA, 즉 벡터 RNA를 생산하는데 사용되는 DNA의 3' LTR의 U3 영역에 결실을 도입시킴으로써 달성된다. 따라서, 역전사 동안 이런 결실은 프로바이러스 DNA의 5' LTR로 전이된다. LTR우ㅏ 전사 활성을 현저하게 감소시키거나 완전히 소멸시키킴으로써 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 현저하게 감소시키거나 완전히 소멸시키기 위하여 U3 서열을 충분히 제거하는 것이 바람직하다. 그러나, U3, R, U5에 걸쳐있는 기능인 바이러스 RAN의 폴리아데닐화(polyadenylation)에 관여하는 LTR 영역은 유지하는 것이 바람직하다. 따라서, 폴리아데닐화 결정요소를 유지하면서 LTR로부터 전사에 중요한 모티프를가능한 많이 제거하는 것이 바람직하다. HIV계 렌티벡터의 경우에, 이러한 벡터가 벡터 역가에서 현저한 감소없이 LTR TATA 박스의 제거를 포함한 비롯한 상당한 U3 결실(예, -418에서 -18까지 결실)에 대해 내성이 있는 것으로 밝혀졌다. 이런 결실로 인하여 LTR 영역은 상기 LTR 영역의 전사능력이 90% 이상 감소된다는 점에서 사실상 전사적으로 불활서이다. 바람직한 구체예에서, LTR 전사는 약 95% 내지 99% 감소한다. 따라서, LTR은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 전사적으로 불활성이다.
본 발명의 렌티벡터는 적용에 따라서 목적하는 전이유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 조혈 전구세포로의 전달의 경우에, 이런 세포에 바람직한 기능을 부여하는 전이유전자, 예를 들면 글로빈 유전자; 에리트로포이에틴(EPO), 인터류킨(예, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-12(IL-12) 등), 콜로니 자극 인자(예, 과립구 콜로니-자극 인자, 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자, 줄기-세포 콜로니-자극 인자)를 비롯한 조혈 성장 인자; 혈소판-특이적 인테그린 αIIbβ; 다중약물 내성 유전자; 만성 육아종 질환(CGD) 환자에서 결함된 gp91-phox 또는 gp47 유전자; 세포가 사람 면역결핍 바이러스와 같은 병원균 감염에 내성이도록 하는 항바이러스 유전자; 혈우병에서 돌연변이되는 혈액 응고 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ를 암호화하는 유전자; 단독으로 또는 단쇄 항체(ScFv), 종양 괴사 인자(TNF), IL-2, IL-12, 감마 인터페론, CTLA4 및 B7 등과 병용되는 T와 B 항원 수용체의 조합 뿐만 아니라 T 세포 항원 수용체, B 세포 항원 수용체(면역글로불린)와 같은 T 세포-매개된 면역 반응에 관여하는 리간드;멜라나(Melana), MAGE 유전자(예, MAGE-1, MAGE-3), P198, P1A, gp100 등과 같은 종양 세포에서 발현되는 유전자가 선별된다.
바람직한 구체예에서, 요법에 도입되는 전이유전자는 gp91-phox 유전자이다(Dinauer, et al. 1987). 다른 바람직한 구체예에서, 전이유전자는 CGD 요법에 도입되는 gp91-phox 프로모터에 작동가능하게 연결된 gp91-phox 유전자이다. 가장 바람직한 구체예에서, gp91-phox 프로모터는 gp91-phox 유전자의 단핵구와 과립구를 발현시키고, 추가로 활성화인자 INF-감마의 작용을 통하여 gp91-phox 발현을 조절한다. 다른 바람직한 구체예에서, gp91-phox 유전자의 발현을 강화시키기 위하여 전사후 조절 요소 WPRE를 벡터에 위치시킨다. 다른 바람직한 구체예에서, 치료에 도입되는 전이유전자는 gp47-phox 유전자이다.
본 발명의 주요 적용은 여러 가능한 이유로 목적하는 전이유전자를 조혈 세포에 전달하는 것이다. 여기에는 화학요법이나 면역억제요법의 결과로 유발될 수 있는 골수억제와 호중구 감소증 또는 AIDS와 같은 감염, 유전 질환, 암 등의 치료가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
고려되는 조혈 세포의 예시적 유전 질환에는 겸상 적혈구 빈혈증, 탈라세미아(베타-탈라세미아 포함), 혈색소병증, 혈소판 무력증, 리소솜 축적 질환(예, 페브리병, 고셔병, 니만-피크병 및 위스콧-알드리히(Wiskott-Aldrich) 증후군), 중증 복합 면역결핍 증후군(SCID), 백혈구 흡착 결핍(LAD) 및 분비된 단백질, 예를 들면 응혈 인자 Ⅷ 및/또는 Ⅸ의 전반적 생산의 부족으로 인한 질환 등이 포함된다. 이런 경우에, 전이유전자, 예를 들면 글로빈 유전자(베타-글로빈 포함); 알파-갈락토시다제 A; 글루코세레브로시다제; 스핑고미엘린 포스포디에스테라제-1; 사이토킨 수용체; CD18 인테그린 아단위; 에리트로포이에틴(EPO), 인터류킨(예, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-6, 인터류킨-12 등), 콜로니 자극 인자(예, 과립구 콜로니-자극 인자, 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 또는 줄기-세포 콜로니-자극 인자)를 비롯한 조혈 성장 인자; 혈소판-특이적 인테그린 αIIbβ; 다중약물 내성 유전자; gp91-phox 또는 gp47 유전자; 세포가 사람 면역결핍 바이러스와 같은 병원균 감염에 내성이도록 하는 항바이러스 유전자; 혈우병에서 돌연변이되는 혈액 응고 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ를 암호화하는 유전자; 단독으로 또는 단쇄 항체(ScFv), TNF, IL-2, IL-12, 감마 인터페론, CTLA4, B7 등과 병용되는 T와 B 항원 수용체의 조합 뿐만 아니라 T 세포 항원 수용체, B 세포 항원 수용체(면역글로불린)와 같은 T 세포-매개된 면역 반응에 관여하는 리간드; 멜라나(Melana), MAGE 유전자(예, MAGE-1, MAGE-3), P198, P1A, gp100 등과 같은 종양 세포에서 발현되는 유전자를 도입하는 것이 바람직하다.
전형적인 암은 예를 들어, 골수계, 림프계 또는 적혈구계, 또는 이들의 전구세포로부터 발생하는 조혈 기원의 암이다. 전형적인 골수성 질환에는 급성 전골수성 백혈병(APML), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 만성 골수성 백혈병(CML)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 렌티벡터를 사용하여 치료할 수 있는 림프구성 종양에는 B-계통 ALL과 T-계통 ALL을 포함하는 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병(PLL), 모상 세포 백혈병(HLL) 및 왈덴스트롬 거대글로불린혈증(WM) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본발명의 렌티바이러스 벡터를 이용하여 치료할 수 있는 후보로서 고려되는 다른 형태의 악성 림프종에는 비-호지킨 림프종과 이의 변종, 말초 T-세포 림프종, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATL), 피부 T-세포 림프종(CTCL), 대형 과립 림프구성 백혈병 및 호지킨병 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 앞서 기술된 렌티벡터로 형질도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 렌티벡터는 대부분의 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 전형적인 세포에는 CD4+T 세포, 말초혈 림프구 세포, 말초혈 단핵구 세포, 조혈 줄기세포, 태아 제대혈 세포, 섬유아세포, 뇌 세포, 폐 세포, 간 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 내피 세포, 심장 세포, 피부 세포, 골수 간질 세포, 안구 세포, 췌장 췌관 세포, 신경 전구세포, 중배엽 줄기세포 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 더 나아가, 형질도입된 세포는 영장류, 쥐, 돼지 또는 사람으로부터 기원하거나 다른 동물 종으로부터 기원할 수 있다.
바이러스 입자의 생산을 위해 렌티바이러스gag와pol유전자의 발현에 적합한 임의의 세포주, 또는 이런 발현을 뒷받침하도록 조작될 수 있는 임의의 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 293T 세포와 HT1080 세포와 같은 생산 세포가 사용될 수 있다.
물론, 본 발명의 렌티벡터는 전술한 바와 같이, CD4+T 세포, 말초혈 B 또는 T 림프구 세포, 말초혈 단핵 세포, 수상돌기 세포 및 단핵구 세포의 형질도입에서 뿐만 아니라 골수, 말초혈 또는 제대혈로부터 수득된 조혈 전구세포 또는 조혈 줄기세포의 형질도입에 특히 유용하다. 특히 바람직한 표적은 결집된 말초혈로부터 분리되는 CD34+세포이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 조혈 줄기세포를 포함하는 사람 세포 집단을, 이러한 집단내의 사람 조혈 전구세포가 벡터에 의해 형질도입되도록 하는 조건하에 상기 벡터와 접촉시킴을 포함하는, 사람 조혈 줄기세포의 형질도입 방법에 관한 것이다. 줄기세포는 궁극적 용도에 따라 시험관내 또는 생체내 형질도입된다. 사람 유전자 요법, 예를 들면 사람 줄기세포의 유전자 요법의 범주에서 줄기세포를 생체내 형질도입하거나 시험관내에서 형질도입하고, 이후 형질도입된 줄기세포를 사람 개체에 주입할 수 있다. 이런 구체예의 한 측면에서, 사람 줄기세포는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 사람, 예를 들면 사람 환자에서 분리하고 앞서 밝힌 바와 같이 형질도입할 수 있다. 이후, 형질도입 줄기세포는 동일하거나 상이한 사람 개체에 재도입된다.
사람 개체를 이 개체에 벡터를 도입함으로써 직접 치료되는 경우에, 치료는 벡터의 정맥내 투여로 실시된다. 세포, 예를 들면 CD34+세포, 수상돌기 세포, 말초혈 세포 또는 종양 세포가 생체외에서 형질도입되는 경우에, 벡터 입자는 105세포당 1x105내지 50x105형질도입 단위의 바이러스 벡터에 상응하는 1 내지 50 감염 다중도(MOI)의 순차 용량을 사용하여 세포와 함께 배양한다. 여기에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 MOI가 당연히 포함된다.전형적으로, 벡터의 양은 HeLa 형질도입 단위(TU)로 표시된다. 다른 벡터 투여 경로에는 동맥내, 내시경, 병소내, 경피, 피하, 근육내, 경막내, 안와내, 피내, 복강내, 경기관, 피하 투여; 척수강주사; 흡입이나 비강 스프레이; 기관내 경로 등이 포함된다. 본 발명의 벡터를 이용한 종양/암 요법과 관련된 구체예에서, 발현 벡터는 종양 또는 종양 맥관구조(vasculature)로의 직접 주사로 전달될 수 있다.
생체외 유전자 요법의 바람직한 실례는 만성 육아종 질환(CGD) 환자인데, 이들의 CD34+세포를 골수 또는 말초혈로부터 분리하고, 재이식에 앞서 gp91-phox 프로모터의 조절하에 gp91-phox 유전자를 발현하는 렌티벡터로 생체외에서 형질도입할 수 있다. 이와 유사한 방식으로 탈라세미아, 예를 들면 베타-탈라세미아 환자를 치료할 수 있는데, 여기서는 세포를 베타-글로빈 또는 다른 적합한 프로모터의 조절하에 베타-글로빈을 발현하는 렌티벡터로 형질도입할 수 있다. 유사하게, 백혈구 흡착 결핍증(LAD)의 치료에서 적절한 유전자와 프로모터 조합을 발현하는 본 발명의 렌티벡터가 기대된다.
중증 복합 면역결핍증(SCID) 환자의 경우에, 본 발명자들은 이들 환자에서 결함된 유전자, 예를 들면 적합한 조직 또는 세포 특이성과 작동가능 조절을 제공하는 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결된 인터류킨 수용체의 공통 감마 쇄를 암호화하는 유전자를 발현하는 본 발명의 렌티벡터를 이용한 유사한 방식을 고려한다. HIV 감염의 유전자 치료를 위하여, 본 발명자들은 세포내 면역화를 고려하는데, 여기서 세포는 항바이러스 유전자의 도입을 통하여 HIV 바이러스에 내성을 갖게된다. HIV에 대한 세포내 면역화의 구체예에서, 본 발명에 따른 렌티벡터의 표적에는 조혈 전구세포, 말초혈 CD4+세포 및 단핵구가 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 다른 바이러스 감염에도 유사한 세포내 면역화 방법이 이용될 수 있다. 암의 면역요법에서, 종양 세포 또는 수상돌기 세포와 같은 항원 제시 세포는 본 발명의 렌티벡터로 유전자 조작한다. 암 요법에서 본 발명의 렌티벡터 작제물에서 사용될 수 있는 일부 전이유전자는 암, 종양 세포 및/또는 유전자의 증식을 저해, 소멸 및/또는 예방하거나 TNF와 같이 암, 종양 세포 및/또는 유전자의 아폽토시스를 매개할 수 있는 것들이다.
본원에 기술된 렌티벡터는 혈액 또는 특정 장기로의 직접 주사로 생체내에서도 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서 아교 세포 유래된 신경 성장 인자(GDNF)를 발현하는 렌티벡터의 뇌내 주사는 파킨슨병 치료에 이용될 수 있다. 다른 예에서, A형 혈우병의 치료를 위하여 혈액 응고 인자 Ⅷ를 발현하는 렌티벡터의 문맥내 주사를 고려한다. 또 다른 예에서, 뒤시엔느 근이영양증 치료를 위하여 디스트로핀(dystrophin) 유전자를 발현하는 본 발명에 따른 렌티벡터의 정맥내 또는 근육내 주사를 고려한다. 또 다른 바람직한 예에서, gp91-phox를 발현하는 렌티벡터가 만성 육아종 질환(CGD)의 치료에 주사된다. 특히 바람직한 구체예에서, gp91-phox 프로모터의 조절하에 gp91-phox를 발현하는 렌티벡터가 CGD의 치료시에 주사된다. 따라서, 당업자는 유전자 요법의 측면에서 본 발명에 따른 렌티벡터 작제물의 광범위한 용도를 인지할 것이다.
본원의 명세서 또는 특허청구범위에서 "포함하는"이란 용어와 관련하여 사용되는 경우 단수 표현은 하나 또는 하나 이상을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "또 다른"은 적어도 두번째 이상의 것을 의미한다.
본 발명의 다른 목적, 특성 및 잇점은 아래의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않는 다양한 변화 및 변형이 이런 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하기 때문에, 본 발명의 바람직한 구체예를 진술하는 상세한 설명과 특정 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.
도면의 설명
아래의 도면은 명세서의 일부이며, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본원에서 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 함께, 이들 도면을 참고하면 더욱 명확하게 이해할 수 있다.
도 1A: gp91-phox 프로모터를 함유하는 렌티벡터. gp91-phox 프로모터 (1540bp)(pHPP91-GFP)와 WPRE 서열(pWPP91-GFP)을 보유하는 렌티바이러스 벡터의 개요 지도.
도 1B: gp91-phox 프로모터의 조절을 위한 모델. 전사 억제인자 CDP는 4가지 요소에서 전사 활성 인자의 결합과 경쟁한다. CDP의 DNA 결합 활성은 최종적 식세포 발달 동안 하향-조절되고, 따라서 전사 활성화인자와 gp91-phox 프로모터의 상호작용을 가능하게 한다(Luo W, Skalsik DG. JBC, 271: 18203,1996).
도 2A: pWPT-GFP와 pWPP91-GFP 렌티벡터(MOI 10)로 형질도입된 gp91-phox 프로모터 UCB CD34+에 의해 유도되는 UCB CD34+ 유래된 단핵구에서 인터페론-γ 유도성 GFP 발현. 세포는 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니 자극 인자)의 존재하에 3주동안 단핵구(CD14+ 세포)로 시험관내 분화시켰다. 분화된 세포는 6일동안 INF-γ(1000 U/㎖)로 자극하고 PE-공액된 모노클로날 항체로 표지하였다. PE 파지티브 집단에서 GFP 발현은 FACS를 이용하여 분석하였다. 숫자는 사분면에서 세포의 비율을 나타낸다.
도 2B: pWPT-GFP와 pWPP91-GFP 렌티벡터(MOI 10)로 형질도입된 gp91-phox 프로모터 UCB CD34+에 의해 유도되는 UCB CD34+ 유래된 과립구에서 인터페론-γ 유도성 GFP 발현. 세포는 시험관내에서 G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자)의 존재하에 3주동안 과립구(CD15+ 세포)로 분화시켰다. 분화된 세포는 6일 동안 INF-γ(1000 U/㎖)로 자극하고 PE-공액된 모노클로날 항체로 표지하였다. PE 양성 집단에서 GFP 발현은 FACS를 이용하여 분석하였다. 숫자는 사분면에서 세포의 비율을 나타낸다.
도 3A: 렌티벡터 형질도입된 UCB CD34+로 이식된 NOD/SCID 마우스의 골수에서 GFP 발현. 형질도입되지 않은 UCB CD34+는 거의 치사량에 가까운 방사선이 조사된 (375 cGy) NOD/SCID 마우스(8-10주령)에 정맥내 주사하였다. 8주후, 이식된 마우스의 대퇴골에서 수득된 골수 세포는 PerCP-공액된 항-사람 CD45로 표지하여 생착된 세포를 표지하고, 특정 사람 계통은 CD34(조혈 전구세포), CD19(B 림프구), CD33(호중구), CD14 (단핵구), CD15(과립구), CD42b(거핵구) 및 글리코포린 A(적모세포)에 대한 PE-공액된 항체를 사용하여 추가 동정하였다. GFP 발현은 CD45+ 개폐되는 PE-양성 세포에서 분석하였다. 숫자는 사분면에서 세포의 비율을 나타낸다.
도 3B: 렌티벡터 형질도입된 UCB CD34+로 이식된 NOD/SCID 마우스의 골수에서 GFP 발현. pHPT-GFP 렌티벡터(MOI 10)로 형질도입된 UCB CD34+는 거의 치사량에 가까운 방사선이 조사된 (375 cGy) NOD/SCID 마우스(8-10주령)에 정맥내 주사하였다. 8주후, 이식된 마우스의 대퇴골에서 수득된 골수 세포는 PerCP-공액된 항-사람 CD45로 표지하여 생착된 세포를 표지하고, 특정 사람 계통은 CD34(조혈 전구세포), CD19(B 림프구), CD33(호중구), CD14 (단핵구), CD15(과립구), CD42b(거핵구), 글리코포린 A(적모세포)에 대한 PE-공액된 항체를 사용하여 추가 동정하였다. GFP 발현은 CD45+ 개폐되는 PE-양성 세포에서 분석하였다. 숫자는 사분면에서 세포의 비율을 나타낸다.
도 3C: 렌티벡터 형질도입된 UCB CD34+로 이식된 NOD/SCID 마우스의 골수에서 GFP 발현. pHPP91-GFP 렌티벡터(MOI 10)로 형질도입된 UCB CD34+는 거의 치사량에 가까운 방사선이 조사된 (375 cGy) NOD/SCID 마우스(8-10주령)에 정맥내 주사하였다. 8주후, 이식된 마우스의 대퇴골에서 수득된 골수 세포는 PerCP-공액된 항-사람 CD45로 표지하여 생착된 세포를 표지하고, 특정 사람 계통은 CD34(조혈 전구세포), CD19(B 림프구), CD33(호중구), CD14 (단핵구), CD15(과립구), CD42b(거핵구), 글리코포린 A(적모세포)에 대한 PE-공액된 항체를 사용하여 추가 동정하였다. GFP 발현은 CD45+ 개폐되는(적색) PE-파지티브 세포에서 분석하였다. 숫자는 사분면에서 세포의 비율을 나타낸다.
도 3D: 렌티벡터 형질도입된 UCB CD34+로 이식된 NOD/SCID 마우스의 골수에서 GFP 발현. pWPT-GFP 렌티벡터(MOI 10)로 형질도입된 UCB CD34+는 거의 치사량에 가까운 방사선이 조사된 (375 cGy) NOD/SCID 마우스(8-10주령)에 정맥내 주사하였다. 8주후, 이식된 마우스의 대퇴골에서 수득된 골수 세포는 PerCP-공액된 항-사람 CD45로 표지하여 생착된 세포를 표지하고, 특정 사람 계통은 CD34(조혈 전구세포), CD19(B 림프구), CD33(호중구), CD14 (단핵구), CD15(과립구), CD42b(거핵구), 글리코포린 A(적모세포)에 대한 PE-공액된 항체를 사용하여 추가 동정하였다. GFP 발현은 CD45+ 개폐되는 PE-파지티브 세포에서 분석하였다. 숫자는 사분면에서 세포의 비율을 나타낸다.
도 3E: 렌티벡터 형질도입된 UCB CD34+로 이식된 NOD/SCID 마우스의 골수에서 GFP 발현. pWPP91-GFP 렌티벡터(MOI 10)로 형질도입된 UCB CD34+는 거의 치사량에 가까운 방사선이 조사된 (375 cGy) NOD/SCID 마우스(8-10주령)에 정맥내 주사하였다. 8주후, 이식된 마우스의 대퇴골에서 수득된 골수 세포는 PerCP-공액된 항-사람 CD45로 표지하여 생착된 세포를 표지하고, 특정 사람 계통은 CD34(조혈 전구세포), CD19(B 림프구), CD33(호중구), CD14 (단핵구), CD15(과립구), CD42b(거핵구), 글리코포린 A(적모세포)에 대한 PE-공액된 항체를 사용하여 추가 동정하였다. GFP 발현은 CD45+ 개폐되는 PE-파지티브 세포에서 분석하였다. 숫자는 사분면에서 세포의 비율을 나타낸다.
도 4: WPRE은 골수 세포에서 GFP 발현 유도된 gp91-phox 프로모터를 생체내에서 보호한다. 도 3B, 3C, 3D 데이터; 대조 세포의 배경 형광은 제외하였다.Neu-호중구, Mo-단핵구, Gr-과립구.
도 5A, 5B, 5C 및 5D: 구성적 EF-1 알파 프로모터(5A, 5B) 또는 gp91-phox 골수-특이적 프로모터(5C, 5D)의 조절하에 GFP 마커 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터. 벡터 5B와 5D는 WPRE 서열을 포함한다.
도 6A, 6B 및 6C: pHPT-GFP로 시작한, gp91-phox 프로모터 단편(500bp), 다중클로닝 부위(MCS)를 보유하는 렌티바이러스 벡터의 작제 및 gp91-phox-특이적 인핸서의 삽입. 첫 번째 단계에서, 사람 gp91-phox 프로모터의 500bp 단편은 1540bp 단편을 주형(MCS-1 서열은 5' 전방향 프라이머로 포함된다)으로 사용하는 PCR로 제조하고 EF-1α-짧은 프로모터 대신에 pHPT-GFP의 XhoI-BamHI로 삽입하여 pHP500-GFP 중간체 벡터를 만들었다. 이후 pHP500-GFP 벡터를 주형(MCS-Ⅱ 서열은 5'선행 프라이머로 추가되었다)으로 사용하여 생성시킨 MCSII, cPPT, MCS-1, gp91-phox 500bp 단편을 포함하는 PCR 단편을 pHOX-GFP 벡터의 ClapI- BamHI 부위에 삽입하여 pHPX-GFP 벡터(도 6B)를 만들었다. gp91-phox-특이적 인핸서는 cPPT 서열의 상부 또는 하부에 있는 두 MCS 모두에 순차적으로 삽입하여 pHPHS-GFP 벡터(도 6C)를 만들었다. 최종적으로, pWPHS-GFP 벡터는 WPRE 서열을 pHPHS-GFP 벡터에 삽입하여 만들었다. 사람 게놈 DNA 서열에서 PCR 증폭된 HS 요소의 위치(+1 gp91-phox 전사 시작)는 아래와 같다: HS-12(-11503,-13244), HS-14(-13244, -14715), HS-26(-25345, -26529), HS-27 (-26529, -27656), HS-28(-27657,-28893)(도 6C). 도시된 단편은 클로닝을 용이하게 하기 위해 말단에 제한 부위의 혼입(HS-12와 HS14; pHPX-GFP에서 상기 부위로 클로닝한 후 5' SnaBI을 복구시키는 gta; HS-26, HS27,HS-28 SalI; gcgtcgac, XhoI; ctcgagcggc)시키기 때문에 계산된 단편보다 약간 더 크다.
도 7: 렌티벡터내로 cPPT 요소의 삽입. 중심 폴리푸린 지역(cPPT)은 pRRLsinb.hPGK.EGFP 벡터(Follenzi, A, Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. (2000) Gene Transfer by Lentiviral Vecotrs is Limited by Nuclear Translocation and Rescued by HIV-1 pol Sequences. Nat. Genet. 25: 217-22)로부터 획득하였다. cPPT요소를 포함하는 NotIEcorRV 단편은 pHOX-GFP 벡터의 NotI-ClaI 부위로 클론닝하여 pHPT-GFP를 만들었다. NotI과 Clal 부위를 연결 단편내에 충전시켜 HPT-GFP에서 NotI 부위가 복구되지 않도록 한다. ClaI 부위는 복구되긴 하지만 Dam 메틸화된다. 따라서, 상기 플라스미드 벡터는 ClaI 부위를 이용하기 위하여 Dam(-) 박테리아에서 성장시켜야 한다.
예시적 양태의 설명
렌티바이러스 벡터가 유전자 요법 및 사람 조혈 줄기세포(hHSC)에 높은 잠재력을 제공하지만, 지금까지 개발된 벡터는 생체안전성 기준을 충족시키지 못하고 전이유전자의 발현에서 여전히 비효율적이다. 예를 들어, CMV 프로모터-포함 HIV-유래된 벡터는 중추 신경계에서 높은 수준의 전이유전자 발현을 유도할 수 있고(Naldini et al., 1996a; Naldini et al., 1996b; Blomer et al., 1997), 다능 조혈 전구세포가 이런 유전자 전달 도구에 의해 효과적으로 형질도입되는 것으로 초기에 입증되었지만, 치료 유전자를 대부분의 림프-조혈 세포로 전달하는 데에는거의 무용한데, 그 이유는 표적 세포에서 이들의 전사 활성이 매우 낮기 때문이다(Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999; An et al., 2000). 현재 렌티바이러스 벡터는 재조합으로 야생형 바이러스의 재구성 능력을 제거한 다중 약독화된 HIV 병원성 유전자를 포함한다(Zufferey et al.,: 1997; Dull et al., 1998). 자가-불활성화 설계는 HIV의 전사 요소를 제거함으로써 벡터를 생물학적으로 좀더 안전하게 하였다(Zufferey et al., 1998). 그러나, 이는 명백히 폴리아데닐화 효율을 감소시킴으로써 전이유전자 발현에 부정적인 영향을 줄 수 있다(DeZazzo et al., 1991; Valsamakis et al., 1991; Brown et al., 1991; Cherrington and Ganem, 1992; Valsa. makis et al., 1992; Gilmartin et al., 1992).
본 발명은 당해 분야의 이러한 문제점과 다른 문제점을 해결하고 생체안전성과 증가된 유전자 발현의 측면에서 최적화된 개선된 HIV-유래된 벡터의 개발을 제시한다. 따라서, 본 발명의 실행에서 사람 세포는 복제 적격한 재조합체(RCR)의 형성을 예방하는 요소를 포함하고 일차 T 세포에서뿐만 아니라 조혈 전구세포와 시험관내 분화된 혈액 계통에서 높은 수준의 전이유전자 발현을 유도하는 내부 프로모터 요소를 추가로 포함하는 HIV-유래된 렌티벡터로 형질도입될 수 있다. 예를 들어, 사람 CD34+세포 및 다른 사람 조혈 계통은 본 발명의 벡터를 이용하여 형질도입할 수 있다.
본 발명에 따른 벡터의 프로모터 요소에는 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이 거의 모든 프로모터 요소가 사용될 수 있다 해도 바람직하게는 gp91-phox 프로모터, 베타-탈라세미아 프로모터, gp47-phox 프로모터, CD4 프로모터, EF1-α프로모터 또는 CD11b 프로모터이다.
gp91-phox 프로모터는 특정 세포형, 즉 분화된 과립구와 단핵구를 발현시킬 정도로 활성이다. 게다가, gp91-phox 프로모터는 활성화인자, 예를 들면 IFN-감마와 접촉됨으로써 활성화될 수 있다. 이에 더하여, 생체내에서 이들 프로모터로부터 발현의 안정성을 확인하기 위해 이들 벡터로 NOD/SCID 마우스에서 생착과 재증식 분석을 실시하는 것이 고려된다.
본 발명의 렌티벡터에서 PCR을 예방하는 요소는 자가-불활성화(SIN) 설계이다. 이는 벡터 플라스미드의 3' LTR에서 U3의 주요 부분을 결실시켜 자가-불활성화(SIN) 형태를 유도함으로써 달성된다(Zufferey et al., 1998). 이런 결실은 LTR과 내부 프로모터 요소 사이의 잠재적 간섭도 예방한다. 그러나, SIN은 특히 PKG 프로모터와 같은 매우 강하지 않은 프로모터에서 전이유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 결실된 3' LTR의 바로 상부에서 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(SPRE) 또는 B형 간염 바이러스 요소(HPRE)와 같은 다른 조절 요소를 벡터에 삽입함으로써 강한 프로모터를 보유하지 않은 렌티벡터 작제물에서 전이유전자 수준을 보호하는 방법을 제시한다. WPRE 요소의 삽입은 프로모터 요소의 발현 특이성에 영향을 주지 않는다.
다른 이점은 HS 요소를 벡터내로 작동가능하게 통합시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, HS 계열의 인핸서 요소를 pHPX-GFP에 통합하면, HS의 침묵 활성으로 인하여 유전자가 높은 수준으로 발현되고 발현의 다양성이 감소한다((May, etal. (2000) "Therapeutic haemaglobin synthesis in beta-thalassaemic mice expressing lentivirus-encoded human beta-globin," Nature 406:82-86). 문헌[참조: May et al.(2000)]에는 베타-글로빈 프로모터의 상부에서 렌티벡터에 포함된 HS 요소가 베타-글로빈 cDNA의 수준이 높고 다양성이 덜한 발현을 유도한다고 개시하였다.
본 발명의 렌티벡터는 MLV계 벡터가 비효과적인 조건을 사용하여 CD34+세포를 비롯한 여러 사람 혈구 계통을 효과적으로 형질도입할 수 있다. 게다가, 사람 CD34+세포는 유전자 전달의 효력이 형질도입된 세포의 대략 60 내지 70%에서 포화되었지만, 상대적으로 낮은 MOI에서 효과적으로 형질도입될 수 있다. 예를 들어, 기존 연구에서 60-300 내지 1000-3000 범위보다 현저하게 낮은 10 MOI로 최적 형질도입을 달성할 수 있었다((Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999). 이는 벡터-표적 만남의 증가된 가능성에 부분적으로 기인하는데, 그 이유는 본 발명의 방법이 대략 6 내지 24시간 동안 작은 용적(200㎕ 중 105개 세포)으로 CD34+세포의 벡터 입자에 대한 노출을 수반하기 때문이다.
따라서, 본 발명은 안전하고 매우 효과적이며 사람 조혈 전구세포 및 모든 다른 혈구 유도체, 심지어 자가-불활성화 형태에서도 전이유전자를 강하게 발현하는 HIV-유래된 벡터를 제시한다. 게다가, 이들 벡터는 분화된 세포에서 세포형 특이적 발현 및 조절가능 발현을 제공한다. 따라서, 이들 벡터는 유전적 및 후천적 림프-혈액 질환과 같은 유전자 치료; 암(특히, 혈액암)에 대한 유전자 요법; HIV감염의 치료와 예방 및 사람 HSC의 렌티벡터-매개된 변형을 통한 조혈 연구에 유용한 도구를 제공한다.
1. 렌티바이러스 벡터와 유전자 요법
렌티바이러스는 공통 레트로바이러스 유전자gag,pol및env이외에 조절 또는 구조 기능을 갖는 다른 유전자를 포함하는 복합 레트로바이러스이다. 고도의 복합성의 바이러스가 잠복 감염 과정중에서와 같이 생활 주기를 조절할 수 있도록 한다. 렌티바이러스의 일부 예는 사람 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 유인원 면역결핍 바이러스: SIV이다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 병원성 유전자를 다중으로 약독화시켜, 예를 들면 유전자env,vif,vpr,vpu및nef를 결실시켜 벡터를 생물학적으로 안전하게 만듦으로써 제조하였다.
렌티바이러스 벡터는 유전자 요법에 많은 이점을 제공한다. 이들은 장기간 발현에 요구되는 표적 세포의 염색체에 안정적으로 통합된다. 게다가, 이들은 바이러스 유전자를 전달하지 않고, 따라서 세포독성 T-세포에 의해 파괴될 수 있는 형질도입된 세포가 발생된다는 문제를 피할 수 있다. 더 나아가, 이들은 대부분의 임상적 적용에 충분할 만큼 상대적으로 큰 클로닝 능력을 보유한다. 이에 더하여, 렌티바이러스는 다른 레트로바이러스와 대조적으로, 비-분열 세포를 형질도입할 수 있다. 이는 조혈계, 뇌, 간, 폐 및 근육과 같은 조직용 유전자-요법에서 매우 중요하다. 예를 들어, HIV-1로부터 유래된 벡터는 효과적인 생체내 및 생체외 전달 및 뉴런, 간세포 및 근세포와 같은 세포로 전이유전자의 통합과 안정적인 발현이 가능하다(Blomer et al., 1997; Kafri et al., 1997; Naldini et al., 1996;Naldini et al., 1998).
렌티바이러스 게놈과 프로바이러스 DNA는 레트로바이러스에서 발견되는 3가지 유전자: 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열에 의해 플랭킹되어 있는gag,pol, env를 보유한다.gag유전자는 내부 구조(매트릭스, 캡시드, 뉴클레오캡시드) 단백질을 암호화한다;pol유전자는 RNA-유도된 DNA 폴리머라제(역전사효소), 프로테아제, 인테그라제를 암호화한다;env유전자는 바이러스 외피 당단백질을 암호화한다. 5'와 3' LTR은 비리온 RNA의 전사와 폴리아데닐화를 촉진하는 역할을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 모든 다른 ㅅ-작용 서열을 포함한다. 렌티바이러스는vif,vpr,tat,rev,vpu,nef및vpx를 포함하는 추가의 유전자를 보유한다.
게놈의 역전사에 필요한 서열(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 바이러스 RNA의 입자로의 효율적인 입자형성(encapsidation)에 필요한 서열(Psi부위)은 5' LTR에 인접하여 위치한다. 입자형성(또는 레트로바이러스 RNA의 감염성 비리온으로의 포장(packing))에 필요한 서열이 바이러스 게놈으로부터 상실되는 경우 시스 결함은 게놈 RNA의 입자형성을 예방한다. 그러나, 생성된 돌연변이체는 모든 비리온 단백질의 합성을 여전히 지시할 수 있다.
렌티바이러스는 당분야에 공지되어 있다(Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., (1998), Ramezani et al., (2000), 미국 특허 제5,994,136호; 제6,013,516호; 제6,165,782호; 제6,207,455호; 제6,218,181호; 제6,218,186호; 제6,277,633호). 일반적으로, 이들 벡터는 플라스미드계 또는 바이러스계이고, 외래 핵산의 숙주 세포로의 선택과 전달을 위하여 이런 핵산을 통합하는데 필수적인 서열을 보유하도록 구성된다.
2가지 구성요소가 바이러스계 유전자 전달 시스템을 만드는데 수반된다; 첫 번째, 구조 단백질 및 감염성 입자를 발생시키는데 필요한 효소를 포함하는 포장 요소; 두 번째, 벡터 자체, 즉 전달되는 유전 물질. 이들 두 구성요소의 설계에 생체안전성 보호수단을 도입할 수 있다. 따라서, 1세대 HIV계 벡터의 포장 단위는 외피 단백질을 제외한 모든 HIV-1 단백질을 포함하였다(Naldini et al., 1998). 이후, 병원성과 관련되는 주도하는 4가지 추가의 바이러스 유전자,vpr,vif,vpu및nef가 결실되어도 벡터 시스템의 유용성은 변화지 않는 것으로 밝혀졌다(Zufferey et al., 1997). 또한, HIV의 주요 전이활성화인자(transactivator)인 Tat 역시 완전히 효율적인 벡터의 발생에 중요하지 않은 것으로 밝혀졌다(Dull et al., 1998). 따라서, HIV계 렌티바이러스 벡터의 3 세대 포장 단위는 모 바이러스의 3가지 유전자:gag,pol및rev을 포함하는데, 이는 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 제거한다.
이런 시스템은 벡터로부터 HIV 전사 단위를 제거함으로써 더욱 개선되었다(Zufferey et al., 1998). 벡터 RNA를 생상하는데 사용되는 DNA의 3' LTR의 U3 영역에 결실을 도입하면 자가-불활성화(SIN) 벡터가 발생하는 것으로 입증되었다. 역전사 동안 이런 결실은 프로바이러스 DNA의 5' LTR로 전달된다. TATA 박스의 제거를 포함하여, 충분한 서열이 제거되었는데, 이는 LTR의 전사 활성을 소멸시키고 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 예방한다. 그러나, 이는 벡터 역가, 또는 벡터의 시험관내 또는 생체내 특성에 영향을 주지 않았다.
본 발명은 상기 및 본 명세서의 다른 부분에 기술된 바와 같이, 여러 가지 측면에서 기존의 렌티벡터에 대한 몇가지 개선점을 제공한다. 이종 유전자, 예를 들면 조혈 질환과 림프-조혈 질환을 치료하는 유전자를 포장 세포로 도입하면, 관심있는 외래 유전자를 보유하는 감염성 바이러스 입자를 방출하는 생산 세포가 산출된다.
env유전자는 레트로바이러스를 비롯한 임의의 바이러스로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는,env는 사람과 다른 종의 세포에 형질도입을 가능하게 하는 공동주성(amphotropic) 외피 단백질이다. 레트로바이러스 유래된env유전자의 예에는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMuLV 또는 MMLV), Harvey 쥐 육종 바이러스(HaMuSV 또는 HSV), 쥐 유방 종양 바이러스(MuMTV 또는 MMTV), 기본 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV orGALV), 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 간염 바이러스와 독감 바이러스의 수포성 구내염 바이러스(VSV) 단백질 G(VSV G)와 같은 다른env유전자 역시 이용될 수 있다.
VSV G가 재조합 바이러스에 광범위한 숙주 범위를 제공한다는 점에서 VSV G 단백질이 바람직한env유전자이지만, VSV G는 숙주 세포에 유해할 수 있다. 따라서, VSV G와 같은 유전자를 사용하는 경우에, VSV G 발현이 필요하지 않을 때 VSV G 발현을 조절하여 숙주 독성을 최소화시킬 수 있는 유도성 프로모터 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 문헌[참조: Gossen & Bujard(1992)]의 테트라사이클린-조절가능 유전자 발현계를 사용하여, 테트라사이클린이 전이된 세포로부터 회수될 때 VSV G의 유도성 발현을 제공할 수 있다. 따라서, tet/VP16 전이활성화인자(transactivator)는 첫 번째 벡터에 존재하고, VSV G 암호 서열은 다른 벡터에서 tet 오퍼레이터 서열에 의해 조절되는 프로모터로부터 하부에 클론된다.
바이러스env핵산을 제공하는 벡터는 조절 서열, 예를 들면 프로모터 또는 인핸서와 작동가능하게 연결된다. 조절 서열은 예를 들어, EF1α, PGK, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 요소, 사람 시토메갈로바이러스 인핸서, 우두 P7.5 프로모터 등을 비롯한 임의의 진핵 프로모터 또는 인핸서일 수 있다(하기 표 1과 2에 기재된 예 참조). 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 요소와 같은 일부 경우에, 프로모터-인핸서 요소는 LTR 서열내에 또는 이런 서열에 인접하여 위치한다. 바람직하게는, 이런 조절 서열은 벡터가 작제되는 렌티바이러스에 외인성이다. 따라서, 벡터가 SIV로부터 만들어지면, SIV LTR에서 발견되는 SIV 조절 서열은 SIV로부터 기원하지 않는 조절 서열로 대체될 것이다.
특정 세포형의 수용체로 표적화하기 위해 항체 또는 특정 리간드와 외피 단백질을 연결시킴으로써 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 특정 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 다른 유전자와 함께, 관심있는 서열(조절 서열 포함)을 바이러스 벡터에 삽입하면, 벡터는 표적-특이적으로 된다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어, 당지질 또는 단백질을 삽입함으로써 표적-특이적으로 만들어질 수 있다. 종종, 표적화는 레트로바이러스 벡터를 표적화하는 항체 또는 재조합 항체형 분자, 예를 들면 일본쇄 항체의 항원-결합 부분을 사용함으로써 달성된다. 당해 분야의 숙련가는 레트로바이러스 벡터의 특정 표적으로의 전달을 달성하기 위한 특수한 방법을 알고 있으며 과도한 실험없이 이를 용이하게 확인할 수 있다.
이종 또는 외래 핵산 서열, 예를 들면 유전이나 후천 조혈 질환에 대한 치료 유전자와 같은 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 조절 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 키메라 유전자를 결과하는 프로모터에 연결된다.
마커 유전자를 이용하여 벡터의 존재를 분석하고 감염과 삽입을 확인할 수 있다. 마커 유전자의 존재는 삽입체를 발현하는 숙주 세포만의 선별과 성장을 보장한다. 전형적인 선별 유전자는 항생제와 다른 독성 물질, 예를 들면 히스티디놀, 푸로마이신, 히그로마이신, 네오마이신, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 단백질 및 세포 표면 마커를 암호화한다.
본 발명의 재조합 바이러스는 핵산 서열을 포유동물 세포로 전달할 수 있다. 용어 "핵산 서열"은 본원에서 상세히 거론되는 바와 같이 임의의 핵산 서열, 바람직하게는 DNA를 의미한다. 이들 핵산 분자는 DNA, cDNA, 합성 DNA, RNA 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이런 핵산 서열은 자연 발생 인트론을 보유하거나 보유하지 않는 게놈 DNA를 포함한다. 게다가, 이런 게놈 DNA는 프로모터 영역, 폴리 A 서열 또는 다른 연관된 서열과 결합된 상태로 수득될 수 있다. 게놈 DNA는 당분야에 공지된 수단으로 적당한 세포로부터 추출되고 정제될 수 있다. 대안으로, 세포로부터 메신저 RNA(mRNA)를 분리하고 이를 이용하여 역전사 또는 다른 수단으로 cDNA를 제조할 수 있다.
벡터는 형질감염 또는 감염을 통하여 포장 세포주로 도입된다. 포장 세포주는 벡터 게놈을 보유하는 바이러스 입자를 생산한다. 형질감염 또는 감염의 방법은 당분야에 공지되어 있다. 포장 벡터와 전달 벡터의 포장 세포주로의 공형질감염 후, 재조합 바이러스를 배양 배지로부터 수거하고 당업자에게 공지된 표준 방법으로 역가측정한다. 따라서, 포장 작제물은 일반적으로 우성 선별가능한 마커, 예를 들면 네오마이신, DHFR, 글루타민 합성효소 또는 ADA와 함께, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션(lipofection) 또는 전기천공으로 사람 세포주에 도입되고, 이후 적절한 약물의 존재하에 선별하고 클론을 분리한다. 선별가능한 마커 유전자는 작제물에서 포장 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
포장 기능이 적절한 포장 세포에 의해 발현되도록 구성되는 안정한 세포주는 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,686, 279호; Ory et al., (1996)]. 렌티바이러스 벡터가 병합된 포장 세포는 생산 세포를 형성한다. 따라서, 생산 세포는 관심있는 치료 유전자를 보유하는 포장된 감염성 바이러스 입자를 생산하거나 방출할 수 있는 세포 또는 세포주이다. 이들 세포는 부착 의존성(anchorage dependent)일 수 있는데, 이는 이들 세포가 유리 또는 플라스틱과 같은 표면에 부착되는 경우에 최적으로 성장하거나, 생존하거나 또는 기능한다는 것을 의미한다. 벡터가 복제 적격한 경우에 렌티바이러스 벡터 포장 세포주로 사용되는 부착 의존성 세포주의 일부 예는 HeLa 또는 293 세포 및 PERC.6 세포이다.
특히 바이러스가 유전자 요법에 사용되는 일부 경우에, 벡터는 치료 개체에서 바이러스의 조절되지 않은 증식을 피하기 위하여 복제 결함성(결손)이다. 이런 경우에, 필수 바이러스 기능을 암호화하는 생산 세포의 게놈을 변형시키거나 생산세포와 보조 바이러스를 공감염시킴으로써, 바이러스 게놈으로부터 검출되는 서열의 효과를 보완하는 단백질을 발현하도록 조작된 포유동물 세포주가 선별된다. 예를 들어, HIV-1 유래된 벡터의 경우에, 문헌[참조: Corbeau et al. (1996)]에서 밝힌 바와 같이 HIV-1 포장 세포주, PSI422가 사용될 수 있다. 유사하게, 제조하고자 하는 바이러스 벡터가 레트로바이러스인 경우에, Ory, et al. (1996)에서 밝힌 바와 같이 높은 역가의 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 사람 293-유래된 레트로바이러스 포장 세포주(293GPG)가 사용될 수 있다. 최소 벡터 시스템의 생산에서, 생산 세포는 (바이러스 게놈을 변형시키거나 보조 바이러스 또는 코스미드를 사용함으로써) 생산 세포주에서 비리온으로의 복제와 포장이 가능하게 모 바이러스의 기능을 보완하도록 조작된다.
렌티바이러스 전달 벡터[참조: Naldini 등(1996)]를 사용하여 성장이 중단된 사람 세포를 시험관내에서 감염시키고, 성체 쥐의 뇌로 직접 주사한 후 뉴런을 형질도입하였다. 상기 벡터는 생체내에서 마커 유전자를 뉴런으로 전달하는데 효과적이었고, 검출가능한 병리의 부재하에 장기간의 발현이 달성되었다. 상기 벡터를 단일 주사하고 10개월 후 분석된 동물은 전이유전자 발현의 평균 수준에서 감소를 보이지 않았고 조직 병리나 면역 반응의 징후도 보이지 않았다(Blomer et al., 1997).
2. SIN 설계
SIN 설계는 렌티바이러스 벡터의 생체안전성을 증가시킨다. 대부분의 HIV LTR은 U3 서열을 포함한다. U3 영역은 감염된 세포에서 세포 활성화에 반응하여HIV 게놈의 기본적 및 유도된 발현을 조절하는 인핸서와 프로모터 요소를 포함한다. 이들 프로모터 요소중 여러 요소가 바이러스 복제에 필수적이다. 인핸서 요소중 일부는 바이러스 분리체간에 고도로 보존되고 바이러스 병리에서 중요한 병원성 인자에 관련된다. 인핸서 요소는 바이러스의 서로 다른 세포 표적에서 복제율에 영향을 줄 수 있다(Marthas et al., 1993).
바이러스 전사가 5' LTR의 U3 영역의 3' 말단에서 개시되기 때문에, 이들 서열은 바이러스 mRNA의 일부가 아니고 3'LTR로부터 이들의 복사체가 통합된 프로바이러스에서 두 LTR 모두의 발생을 위한 주형으로 기능한다. U3 영역의 3' 복사체가 레트로바이러스 벡터 작제물에서 변형되면, 벡터 RNA는 생산 세포에서 완전한 5' LTR에서 여전히 생산되긴 하지만 표적 세포에서 재생될 수는 없다. 이런 벡터의 형질도입은 후손 바이러스에서 양 LTR의 불활성화를 결과한다. 따라서, 레트로바이러스는 자가-불활성화(SIN)되는데, 이들 벡터는 SIN 전달 벡터로 알려져 있다.
SIN 설계는 문헌[참조: Zufferey et al., 1998]과 미국 특허 제5,994,136호에서 더욱 상세하게 기술되어 있다. 그러나, 본원에서 밝힌 바와 같이 3' LTR에서의 결실 범위를 제한한다. 먼저, U3 영역의 5' 말단은 벡터 전달에서 다른 필수적인 기능을 수행하고 통합에 요구된다(말단 디뉴클레오티드 + att 서열). 따라서, 말단 디뉴클레오티드와 att 서열은 결실될 수 있는 U3 서열의 5' 경계를 나타낼 수 있다. 이에 더하여, 일부 막연히 한정된 영역이 R 영역에서 하부 폴리아데닐화 부위의 활성에 영향을 줄 수 있다. 3' LTR로부터 U3 서열의 과도한 결실은 벡터 전사체의 폴리아데닐화를 감소시켜 생산 세포에서 벡터의 역가 및 표적 세포에서 전이유전자 발현 모두에 부정적인 결과를 초래할 수 있다. 다른 한편, 제한된 결실은 형질도입된 세포에서 LTR의 전사 활성을 제거하지 못할 수 있다.
본원에 기술된 렌티바이러스 벡터는 뉴클레오티드 -418 내지 -18에 해당되는 3' LTR의 U3 영역의 결실을 보유한다. 이는 TATA 박스까지 이르는 가장 확대된 결실로서, 형질도입된 세포에서 LTR의 전사 활성을 소멸시킨다. 생산 세포에서 벡터의 역가 및 표적 세포에서 전이유전자 발현은 이들 벡터에서 영향을 받지 않았다. 따라서, 이런 설계는 벡터 안전성에서 현저한 향상을 제공한다.
U3 영역이 이렇게 광범위하게 결실된 SIN-형 벡터는 형질도입의 효능을 감소시키지 않으면서 쥐 백혈병 바이러스(MLV)계 또는 비장 괴사 바이러스(SNV)계 레트로바이러스 벡터에서 만들어질 수 없다.
-418 내지 -18 뉴클레오티드 서열의 제거는 LTR의 전사 활성을 제거하고, 따라서 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 소멸시킨다. 그러나, HIV-유래된 렌티벡터에서 시험관내 또는 생체내 특성은 SIN 설계에 의해 전혀 손상되지 않았다.
3. 전사후 조절 요소(PRE)
특정 구체예, 특히 중간정도의 프로모터를 보유하는 본 발명의 렌티바이러스 작제물와 관련된 구체예에서 전이유전자 발현의 강화가 요구될 수 있다.
PRE의 한가지 유형은 발현 카세트내에 위치하는 인트론인데, 이는 유전자 발현을 촉진할 수 있다. 그러나, 인트론은 렌티바이러스의 생활 주기 동안 스플라이싱될 수 있다. 따라서, 인트론이 PRE로 사용되는 경우에, 이들은 벡터 게놈 전사체와 배향으로 위치시켜야 한다.
스플라이싱 현상에 의존하지 않는 전사후 조절 요소는 바이러스 생명 주기동안 제거되지 않는다는 이점을 제공한다. 일부 예는 단순 포진 바이러스의 전사후 가공 요소, B형 간염 바이러스의 전사후 조절 요소(HPRE) 및 우드척 간염 바이러스(WPRE)이다. 이들 중에서 HPRE에서 발견되지 않는 추가의 시스-작용 요소를 보유하는 WPRE가 가장 바람직하다(Donello et al., 1998). 이런 조절 요소는 전이유전자의 RNA 전사체에는 포함되지만 전이유전자 해독 단위의 종결 코돈의 외부에 존재하도록 벡터에 위치한다. 본 발명 및 문헌[참조: Zufferey et al., 1999]에서 입증된 바와 같이, WPRE 요소는 렌티바이러스 벡터의 범주에서 목적하는 전이유전자의 유전자 발현을 자극하고 강화하기 위한 유용한 도구이다.
WPRE은 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제6,136,597호에서 특성화되고 기술되었다. 상기 특허에 기술되어 있는 바와 같이, WPRE은 핵으로부터 세포질로 RNA의 효과적인 전달을 매개하는 RNA 유출 요소이다. 이는 시스-작용 핵산 서열을 삽입시켜 상기 요소와 전이유전자가 단일 작제물내에 포함되게 함으로써 전이유전자의 발현을 강화시킨다. 센스 배향으로 WPRE의 존재는 전이유전자 발현을 최대 7 내지 10배까지 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 인트론이 레트로바이러스 입자의 형성으로 귀결되는 일련의 현상 동안 스플라이싱되기 때문에, 레트로바이러스 벡터는 완전 인트론-포함 유전자 대신에 cDNA 형태로 서열을 전달한다. 인트론은 일차 전사체와 스플라이싱 조직의 상호작용을 매개한다. 스플라이싱 과정에 의한 RNA의 가공이 스플라이싱과 수송 조직 사이의 커플링으로 인하여 이들의세포질 유출을 촉진하기 때문에, cDNA는 종종 비효율적으로 발현된다. 따라서, 벡터내에 WPRE의 포함은 전이유전자의 강화된 발현을 초래한다.
4. 프로모터와 인핸서
"프로모터"는 전사의 개시와 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 이는 조절 단백질과 분자가 결합하여 특정 핵산 서열에서 전사를 개시하는 유전자 요소, 예를 들면 RNA 폴리머라제 및 다른 전사인자를 포함할 수 있다. "작동하게 위치하는", "작동가능하게 연결된", "조절하에", "전사 조절하에"는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재하여 상기 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하는 것을 의미한다.
일반적으로, 프로모터는 RNA 합성의 시작 부위를 지정하는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이지만, TATA 박스가 결여된 일부 프로모터, 예를 들면 포유동물 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터와 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터에서는 시작 부위와 중복되는 별도의 요소가 개시 위치를 정하는데 조력한다. 추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 30-110 bp 상부에 위치하지만, 다수의 프로모터가 시작 부위의 하부에서도 기능적 요소를 포함한다. 암호 서열을 프로모터의 "조절하에" 존재하도록 하기 위하여, 선택된 프로모터의 "하부"(즉 3')에 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "상부" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 및 암호화된 RNA의 발현을 촉진한다.
프로모터 요소간의 간격은 흔히 가요성이어서, 요소가 반전되거나 서로 상대적으로 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소간 간격은 활성이 감소하기 전에 50bp까지 증가시킬 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절 서열을 의미하는 "인핸서"와 병용되거나 병용되지 않을 수 있다.
프로모터는 암호 분절 및/또는 엑손의 상부에 위치하는 5' 비-암호 서열을 분리함으로써 수득되는 핵산 서열과 통상적으로 연결된 프로모터일 수 있다. 이런 프로모터는 "내인성"이라고 말할 수 있다. 유사하게, 인핸서는 핵산 서열의 하부 또는 상부에 위치하고 상기 핵산 서열과 통상적으로 연결된 인핸서일 수 있다. 대안으로, 암호 핵산 분절을 재조합 또는 이종 프로모터의 조절하에 위치시킴으로써 여러 이점을 얻을 수 있는데, 상기 프로모터는 자연 환경에서 핵산 서열과 통상적으로 연결되지 않는 프로모터를 말한다. 이런 프로모터 또는 인핸서에는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 바이러스 또는 원핵 또는 진핵 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서; 자연적으로 발생하지 않는, 즉 서로 다른 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변화시키는 돌연변이를 보유하는 프로모터 또는 인핸서 등이 포함된다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제에 가장 일반적으로 사용되는 프로모터에는 β-락타마제(페니실리나제), 락토오스, 트립토판(trp) 프로모터 시스템이 포함된다. 프로모터와 인핸서의 핵산 서열의 합성에 의한 생산 이외에, 서열은 본원에 개시된 조성물과 연관하여 PCRTM을 비롯한 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술로 생산할 수 있다[참조: 미국 특허 제4,683,202호 및 제 5,928,906호]. 더 나아가, 비-핵 세포소기관, 예를 들면 미토콘드리아, 엽록체 등에서 서열의 전사 및/또는 발현을 조절하는 조절 서열을 사용할 수도 있다. 프로모터, 인핸서 및 다른 유전자좌 또는 전사 조절 요소를 포함하는 조절 요소는 "전사 카세트"라고 한다.
자연적으로, 발현용으로 선택된 세포소기관, 세포형, 조직, 장기 또는 유기체에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요하다. 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포형 조합의 사용은 분자 생물학 분야의 당업자에게 공지되어 있다(Sambrook et al, 1989). 사용된 프로모터는 유전자 요법, 또는 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대규모 생산과 같은 용도로 도입된 DNA 분절의 고수준 발현을 지시하는 적합한 조건하에서 구성적이거나, 조직-특이적이거나, 유도성이거나 또는 유용하다. 프로모터는 이종이거나 내인성이다.
T3, T7 또는 SP6 세포질 발현계의 사용은 또 다른 가능한 구체예이다. 적합한 박테리아 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 부가된 유전자 발현 작제물로서 제공되는 경우에, 진핵 세포는 특정 박테리아 프로모터로부터 세포질 전사를 뒷받침할 수 있다.
표 1에서는 본 발명에서 RNA의 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 요소/프로모터의 비제한적 예를 제시한다. 표 2에서는 핵산 서열에서 특정 자극에 반응하여 활성화될 수 있는 유도성 요소의 비제한적 예를 제시한다.
프로모터 및/또는 인핸서
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본 발명의 렌티바이러스 벡터는 조절된 진핵 프로모터의 조절하에 치료 유전자로 세포를 형질전환하도록 일차적으로 설계된다. gp91-phox 프로모터가 바람직하지만, 상기 표 1과 2에 제시된 다른 프로모터와 조절 시그날 요소 역시 사용될 수 있다. 이에 더하여, 임의의 프로모터/인핸서 조합(진핵 프로모터 Data Base EPDB) 역시 본 발명의 렌티바이러스 벡터에 사용되는 당해 치료 유전자를 암호화는 구조 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 대안으로, 암 유전자 요법 또는 종양 표적화를 위한 조직-특이적 프로모터는 암, 특히 혈액암의 치료를 위하여 본 발명의 렌티바이러스 벡터와 병용될 수 있다.
전형적으로, 진핵 세포에서 단백질을 암호화하는 유전자의 전사를 조절하는 프로모터와 인핸서는 다수의 유전 요소를 포함한다. 세포 조직(cellular machinery)은 각 요소에 의해 전달되는 조절 정보를 모으고 통합할 수 있으며, 서로 다른 유전자가 별도의 복잡한 전사 조절 패턴을 전개시킬 수 있도록 한다. 프로모터와 인핸서 요소의 활성화 또는 억제는 gp91-phox 프로모터에 대하여 도 1B에 기술되어 있고, 문헌[참조: Luo and Skalnik (1996) J.Biol. Chem. 271:18203-210]과 문헌[참조: Luo and Skalnik (1996) J. Biol. Chem. 271: 23445-23451]에 기재된 바와 같이, 이들 요소를 적절한 전사 활성화인자 또는 억제인자와 접촉시켜 달성될 수 있다. gp91-phox 프로모터와 관련하여, 발현 카세트의 전사와 발현을 조절하는 인터페론-감마의 활성은 이런 프로모터 또는 인핸서 요소 및 이들과 상호작용하는 인자가 본 발명의 실시에 어떻게 이용되는 지의 실례이다.
인핸서는 동일 DNA 분자에서 원거리 위치에 위치하는 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전 요소로 초기에 탐지되었다. 원거리 위치에서 작용하는 이의 능력은 원핵 전사 조절의 고전적 연구에서는 전례가 없었다. 후속 연구에서 인핸서 활성을 갖는 DNA 영역은 프로모터와 유사하게 조직화되어 있는 것으로 밝혀졌다. 즉, 이들은 많은 개별 요소로 구성되며, 이들 요소 각각은 하나 이상의 전사 단백질에 결합한다(참조: 도 1B에 제시된 gp91-phox 프로모터의 조절 모델). 본 발명에서 전형적인 인핸서는 DNAase 과민성 요소 및 이들의 상동체이다(Lien LL, Lee Y, Orkin SH, (1997) "Regulation of the myeloid-cell-expressed human gp91-phox gene as studied by transfer of yeast artificial chromosome clones into embryonic stem cells: suppression of a variegated cellular pattern of expression requires a full complement of distant cis elements," Mol Cell Biol. 17 (4): 2279-90). 이들 인핸서 요소의 영향하에서 유전자 발현 수준은 보다 증가되고(HS의 인핸서 활성에 기인) 다양성은 감소된다(HS의 침묵 활성에 기인).
gp91-phox의 HS 요소 유사체는 다른 프로모터-인핸서 시스템에서 활성을 나타내는데[참조: May C, Rivella S, Callegari J, Heller G, Gaensler KM, Luzzatto L, Sadelain M, (2000) Therapeutic haemoglobin synthesis in beta-thalassaemic mice expressing lentivirus encoded human beta-globin. Nature 406 (6791): 82-6; 이는 본원에서 참조로 인용된다], 여기서 유사한 베타-글로빈 HS 요소는 베타-글로빈 cDNA의 발현을 유도하기 위하여 베타-글로빈 프로모터의 상부에서 렌티벡터에 포함되었다.
프로모터와 인핸서는 세포에서 전사를 활성화시키는 동일한 일반적 기능을 갖는다. 이들은 종종 중복되고 인접하는데, 매우 유사한 기준 조직화를 갖는 것으로 보인다. 종합하면, 인핸서와 프로모터는 상동한 존재이고 이들 서열에 결합된 전사 활성화 단백질이 근본적으로 동일한 방식으로 전사 조직(transcriptional machinery)과 상호작용하는 것으로 생각된다. 인핸서와 프로모터의 근본적인 차이점은 작동상의 차이점이다. 전체적으로 인핸서 영역은 원거리 위치에서 전사를 자극할 수 있다; 이는 프로모터 영역이나 이의 구성요소에는 해당되지 않는다. 반면에, 프로모터는 특정 부위에서 특정 방향으로 RNA 합성의 개시를 지시하는 하나 이상의 요소를 필요로 하지만, 인핸서는 이러한 특이성이 결여되어 있다. 이런 유효 범위의 차이를 제외하고, 인핸서와 프로모터는 매우 유사한 존재이다. 따라서, 전사와 발현을 조절하는 요소의 작제물은 강화된 유용성과 작동의 조절 수단을 제공하기 위하여 정렬된 다양한 요소로 구성될 수 있다.
유용성이 입증된 시그날은 폴리아데닐화 시그날(hGH, BGH, SV40)이다. 내부 리보솜 결합 부위(IRES) 요소는 다중유전자, 또는 폴리시스트론 메시지를 만드는데 이용된다. IRES 요소는 5'-메틸화된 캡-의존성 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 해독을 시작할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 포유동물 메시지로부터 유래된 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)를 비롯하여, 피코르나바이러스 계통의 2가지 구성원(폴리오와 뇌심근염)으로부터 유래된 IRES 요소가 보고되었다(Pelletier and Sonenberg, 1988). IRES 요소는 이종 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. IRES에 의해 각각으로 분리되는 다수의 개방 판독 프레임(open reading frame)과 함께 전사되어, 폴리시스트론 메시지를 만들 수 있다. IRES 요소로 인하여, 각각의 개방 판독 프레임은 효과적인 해독을 위하여 리보솜에 접근할 수 있다. 다수의 유전자는 단일 메시지를 전사하는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효과적으로 발현될 수 있다.
어떤 경우든, 프로모터는 유전자의 상부에 기능적으로 위치할 때 상기 유전자의 발현을 유도하는 DNA 요소이다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터로 형질전환되는 대부분의 전이유전자는 프로모터 요소의 하부에 기능적으로 위치한다.
특정 개시 시그날 역시 암호 서열의 효과적인 해독에 필요할 수 있다. 이들 시그날에는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 비롯한 외인성 해독 조절 시그날이 필요할 수 있다. 당업자는 이를 용이하게 결정하고 필요한 시그날을 제공할 수 있다. 개시 코돈은 전체 삽입체의 해독을 보장하기 위하여 목적하는 암호 서열의 판독 프레임과 함께 "프레임내(in-frame)"에 위치해야 한다. 외인성 해독 조절 시그날와 개시 코돈은 천연적이거나 합성적일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 포함으로 강화될 수 있다.
5. 서열 목록의 간단한 설명
서열 1은 문헌[참조: Follenzi, A, Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M. ,Naldini, L. (2000) "Gene Transfer by Lentiviral Vectors is Limited by Nuclear Translocation and Rescued by HIV-1 pol Sequences, "Nat. Genet. 25: 217-22]에 보고되어 있는 바와 같은 HIV로부터 얻은 HIV 중심 폴리푸린지역(central polypurine tract) 요소의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 서열 2 내지 6은 DNAase 과민성 부위를 포함하고 본 발명의 특정 구체예에서 인핸서로 사용되는 뉴클레오티드 서열을 제시한다(Lien LL, Lee Y, and Orkin SH, "Regulation of the myeloid cell-expressed human gp91-phox gene as studied by transfer of yeast artificial chromosome clones into embryonic stem cells: suppression of a variegated cellular pattern of expression requires a full complement of distant cis elements," Mol. Cell. Biol. 17 (4): 2279-90 (1997)).
서열 7 내지 16은 서열 2-6의 HS 요소를 만드는데 사용되는 PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 제시한다. PCR 프라이머 서열과 HS 요소 서열은 Human Genome Project에 의해 공개된 사람 게놈 서열(contig NT_011844; http://www. ncbi. nlm. nih.gov/genome/guide/human/)에 기초한다. 사람 게놈 DNA 서열에서 PCR-증폭된 HS 요소의 위치(+1 gp91-phox 전사 시작)는 아래와 같다: HS-12(-11503, -13244), HS-14(-13244, -14715), HS-26(-25345, -26529), HS-27 (-26529, -27656), HS-28(-27657, -28893). 사용된 단편은 클로닝을 용이하게 하기 위한 말단에 제한 부위의 혼입(HS-12와 HS14; pHPX-GFP에서 상기 부위로 클로닝이후 5' SnaBI을 복구시키는 gta; HS-26, HS27, HS-28 SalI; gcgtcgac, XhoI; ctcgagcggc)으로 인하여 계산된 단편보다 약간 더 크다.
본 발명의 특정 구체예에 혼입되는 다른 서열에는 gp91-phox에 대하여 Genbank 수탁 번호 NM000397에 개시된 뉴클레오티드 서열(Dinauer, et al., 1987), 서열 18 및 서열 19의 폴리펩티드 서열을 비롯하여 gp91-phox를 암호화하는 서열및 이의 상동체가 포함된다. 또한, 특정 구체예에서 Genbank 수탁번호 M66390의 뉴클레오티드 서열, 서열 17에 의해 암호화되는 gp91-phox 프로모터 및 Genbank 수탁 번호 M82856의 뉴클레오티드 서열, 서열 20에 의해 암호화되는 CD11b 프로모터 역시 혼입된다.
6. 핵산
본 발명의 한 구체예는 치료 유전자, 특히 조혈 및 림프-조혈 질환, 예를 들면 앞서 기술된 유전적 및 후천적 질환을 위한 치료를 제공하는 유전자를 암호화하는 핵산을 전달하는 것이다. 한 구체예에서, 핵산은 전장 유전자, 실질적으로 전장 유전자, 또는 이런 유전자의 기능적 등가물을 암호화한다.
따라서, 본 발명의 일부 구체예에서 조혈과 림프-혈액 질환의 치료는 치료 핵산 발현 작제물을 포함하는 본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터를 조혈 기원의 세포에 투여하는 단계를 수반한다. 조혈 세포는 작제물을 흡수하고 핵산에 의해 암호화되는 치료 폴리펩티드를 발현하여 정상적인 표현형을 회복하게 된다.
핵산은 당업자에게 공지된 임의의 기술로 만들 수 있다. 합성 핵산, 특히 합성 올리고뉴클레오티드의 비제한적 예는 포스포트리에스테르, 포스피트 또는 포스포아미디트 화학을 이용한 시험관내 화학적 합성으로, EP 266,032에 기술된 고형상 기술로, 또는 문헌[참조; Froehler et al, 1986]과 미국 특허 제5,705,629호에 기술된 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간물질을 통하여 만들어지는 핵산이다. 효소에 의해 생산되는 핵산의 비제한적 예는 PCRTM과 같은 증폭 반응(미국 특허 제4,683,202호; 미국 특허 제4,682,195호), 또는 미국 특허 제5,645,897호에 기술된 올리고뉴클레오티드 합성 동안 효소에 의해 생산되는 핵산이다. 생물학적으로 생산되는 핵산의 비제한적 예는 살아있는 세포에서 재조합 핵산 생산이다(Sambrook et cul. 1989).
핵산은 폴리아크릴아마이드 겔, 염화세슘 원심분리 구배, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 수단으로 정제할 수 있다.
일반적으로, "핵산"은 적어도 1개의 핵염기, 예를 들면 DNA(예, 아데닌 "A"; 구아닌 "G"; 티민 "T"; 시토신 "C") 또는 RNA (예, A, G, 우라실 "U", C)에서 발견되는 자연 발생 퓨린이나 피리미딘 염기를 포함하는 DNA, RNA 또는 이들의 모방체를 의미한다. "핵산"은 "올리고뉴클레오티드"와 "폴리뉴클레오티드"를 포괄한다. "올리고뉴클레오티드"는 대략 3개 내지 100개 핵염기로 이루어진 하나 이상의 분자를 의미한다. "폴리뉴클레오티드"는 대략 100개 핵염기를 초과하는 하나 이상의 분자를 의미한다. 일반적으로, 이들 정의는 하나 이상의 단일-가닥 분자를 의미하지만, 특정 구체예에서는 하나 이상의 단일-가닥 분자에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 하나 이상의 다른 가닥을 포괄한다. 따라서, 핵산은 한가지이상의 상보성 가닥을 포함하는 하나 이상의 이중-가닥 분자 또는 삼중-가닥 분자, 또는 이런 분자의 가닥을 포함하는 특정 서열의 "보체"를 포괄한다.
특정 구체예에서, "유전자"는 전사되는 핵산을 의미한다. 본원에서 "유전자 분절"은 유전자의 핵산 분절을 의미한다. 특정 측면에서, 유전자는 전사, 또는 메시지 생산이나 구성에 관여하는 조절 서열을 보유한다. 특정 구체예에서, 유전자는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 전사된 서열로 구성된다. 다른 특정 측면에서, 유전자는 조혈과 림프-혈액 질환에서 결함되거나 돌연변이되는 유전자의 핵산 및/또는 폴리펩티드나 펩티드-인암호 서열로 구성된다. 본원에서, "분리된 유전자"는 자연 발생 유전자, 조절 서열, 폴리펩티드나 펩티드-암호화 서열 등과 같은 서열로부터 실질적으로 분리되는 전사된 핵산, 조절 서열, 암호 서열 등으로 구성된다. 이와 관련하여, "유전자"는 전사되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 및 이의 보체를 의미한다. 특정 측면에서, 전사된 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 기능 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드 암호화 단위로 구성된다. 이런 기능적 용어 "유전자"에는 게놈 서열, RNA 또는 DNA 서열, 또는 유전자의 전사되지 않은 프로모터 또는 인핸서 영역이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 유전자의 비-전사 영역의 핵산 분절을 비롯한 좀더 작고 가공된 핵산 분절이 포함된다. 좀더 작고 가공된 유전자 핵산 분절은 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드, 융합 단백질, 변이체 등을 발현하거나, 또는 핵산 조작 기술을 이용하여 이들을 발현하도록 개조될 수 있다. 따라서, "절두된 유전자"는 연속된 핵산 잔기의 신장부가 상실된 핵산 서열을 의미한다.
다양한 핵산 분절은 특정 핵산 서열에 기초하여 임의의 길이로 설계될 수 있다. 서열에 수치를 지정함으로써, 예를 들면 첫 번째 잔기에 1을, 두 번째 잔기에 2를 지정함으로써, 모든 핵산 분절을 정의하는 알고리즘을 만들 수 있다:
n 내지 n + y
여기서, n은 1에서 서열의 마지막 번호까지의 정수이고 y는 핵산 분절의 길이 - 1인데, n + y는 서열의 마지막 번호를 초과하지 않는다. 따라서, 10량체의 경우에, 핵산 분절은 염기 1 내지 10, 2 내지 11, 3 내지 12 등에 상응한다. 15량체의 경우에, 핵산 분절은 염기 1 내지 15, 2 내지 16, 3 내지 17 등에 상응한다. 20량체의 경우에, 핵산 분절은 염기 1 내지 20, 2 내지 21, 3 내지 22 등에 상응한다.
본 발명의 핵산은 서열 길이에 상관없이, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그날, 제한 효소 부위, 다중클로닝 부위, 암호 분절 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 핵산 서열과 결합시켜 하나 이상의 핵산 작제물을 만들 수 있다. 전체 길이는 핵산 작제물간에 현저하게 변할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 분절이 사용될 수 있지만, 의도한 재조합 핵산 프로토콜에서 제조 또는 사용의 용이함에 의해 전체 길이가 제한된다.
"벡터"는 세포로의 도입을 위하여 핵산 서열에 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 의미한다. 본 발명의 벡터는 렌티바이러스계이다. 본 발명의 벡터에 의해 전달되는 핵산 분자는 치료 유전자를 암호화하고 유전자 요법을 실시하는데 사용된다. 당업자는 표준 재조합 기술을 이용하여 이런 치료 벡터를 작제할 수 있다(Maniatis et al., 1988; Ausubel et al., 1994).
"발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 암호화하는 핵산으로 구성되는 임의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 일부 경우에, RNA 분자는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 해독된다. 다른 경우, 예를 들면 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서, 이들 서열은 해독되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 보유할수 있는데, 여기서 조절 서열은 특정 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 암호 서열의 전사와 해독에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 벡터와 발현 벡터는 전사와 해독을 결정하는 조절 서열 이외에, 다른 기능을 수행하는 핵산 서열을 보유할 수 있다.
A. 다중클로닝 부위
본 발명의 벡터는 다수의 제한 효소 부위를 포함하는 핵산 영역인 다중클로닝 부위(MCS)를 보유할 수 있는데, 상기 제한 효소 부위는 표준 재조합 기술과 함께 벡터를 절단하는데 이용될 수 있다(Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, Cocea, 1997). "제한 효소 절단"은 핵산 분자에서 특정 위치에서만 기능하는 효소로 핵산의 촉매 절단을 의미한다. 이들 제한 효소중 대부분은 상업적으로 입수가능하다. 이런 효소의 사용은 당분야에 공지되어 있다. 종종, 벡터는 외인성 서열이 벡터에 결찰될 수 있도록 MCS 내부를 절단하는 제한 효소에 의해 선형화 또는 단편화된다. "결찰"은 서로 연속하거나 연속하지 않는 2개의 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 의미한다. 제한 효소와 결찰 반응과 관련된 기술은 재조합 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
B. 스플라이싱 부위
대부분의 전사된 진핵 RNA 분자는 일차 전사체로부터 인트론을 제거하는 RNA 스플라이싱을 겪게 된다. 게놈 진핵 서열을 보유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사체의 적절한 가공을 담보하기 위하여 공여자 및/또는 수용자 스플라이싱 부위를 필요로 한다(Chandler et al, 1997).
C. 종결 시그날
본 발명의 벡터 또는 작제물은 하나 이상의 종결 시그날을 일반적으로 포함한다. "종결 시그날" 또는 "종결인자"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이적인 종결에 관여하는 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 구체예에서 RNA 전사체의 생산을 중단시키는 종결 시그날을 고려한다. 종결인자는 원하는 메시지 수준을 달성하기 위하여 생체내에서 필요할 수 있다.
진핵 시스템에서, 종결인자 영역은 폴리아데닐화 부위를 노출시키기 위하여 새로운 전사체의 부위-특이적 절단을 가능하게 하는 특이적 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 이는 전사체의 3' 말단에 대략 200 A 잔기의 신장부를 부가하도록 전문화된 내인성 폴리머라제에 시그날을 보낸다. 이런 폴리A 꼬리로 변형된 RNA 분자는 좀더 안정되고 좀더 효과적으로 해독된다. 따라서, 진핵 세포와 관련된 다른 구체예에서 종결인자는 RNA의 절단 시그날을 포함하고, 보다 바람직하게는 종결인자 시그날은 메시지의 폴리아데닐화를 촉진한다. 종결인자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 강화시키고 카세트로부터 다른 서열로의 해독을 최소화시키는 역할을 할 수 있다.
본 발명에 사용되는 종결인자는 소 성장 호르몬 종결인자와 같은 유전자의 종결 서열, SV40 종결인자와 같은 바이러스 종결 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 전사 종결인자이다. 특정 구체예에서, 종결 시그날은 예를 들어, 서열 절두로 인하여 전사가능하거나 해독가능한 서열이 결여되어 있다.
D. 폴리아데닐화 시그날
진핵 유전자 발현에는 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 달성하기 위한 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 폴리아데닐화 시그날의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요하지 않으며, 임의의 서열이 사용될 수 있다. 이런 서열의 예는 다양한 표적 세포에서 효과적으로 기능하고 간편한 SV40 폴리아데닐화 시그날 또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날이다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다.
E. 복제 기점
본 발명의 벡터를 숙주 세포에서 증식시키기 위하여, 벡터는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 하나 이상의 복제 기점("ori")을 보유한다. 대안으로, 숙주 세포가 효모이면 자율적 복제 서열(ARS)이 사용될 수 있다.
F. 선별가능한 및 스크리닝가능한 마커
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 렌티벡터로 형질도입된 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시켜 시험관내 또는 생체내에서 동정할 수 있다. 이러한 마커는 형질도입된 세포에 동정가능한 변화를 부여하여, 발현 벡터를 함유하는 세포를 용이하게 동정할 수 있게 한다. 일반적으로, 선별가능한 마커는 선별을 가능하게 하는 특성을 부여하는 마커이다. 파지티브 선별가능한 마커는 마커의 존재가 선별을 가능하게 마커이고, 반면 네거티브 선별가능한 마커는 마커의 존재가 선별을 차단하는 마커이다. 파지티브 선별가능한 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로, 약물 선별 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝과 동정을 촉진하며, 가령 네오마이신, 푸로마이신, 히그로마이신, DHFR, GPT, 제오신, 히스티디놀에 내성을 부여하는 유전자 작제물이 유용한 선별가능한 마커이다. 조건의 수행에 기초하여 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, 비색계 분석에 기초하는 GFP와 같은 마커를 비롯한 다른 유형의 마커 역시 고려된다. 대안으로, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 선별가능한 효소가 사용될 수 있다. FACS 분석과 함께, 면역학적 마커를 사용하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 사용된 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있기만 하면 되기 때문에 중요하지 않다. 선별가능한 마커의 다른 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.
7. 숙주 세포
본원에서 "세포", "세포주", "세포 배양물"은 서로 호환가능하다. 이들 용어에는 모든 후속 세대가 포함된다. 계획적이거나 우연한 돌연변이로 인하여 모든 후손이 동일하지는 않다. 이종 핵산 서열을 발현하는 "숙주 세포"는 원핵이나 진핵 세포를 의미하는데, 여기에는 벡터를 복제하거나 본 발명의 벡터에 의해 암호화되는 이종 핵산을 발현할 수 있는 임의의 형질전환 유기체가 포함된다. 숙주 세포는 벡터의 수용자로 사용된다. "형질감염된" 또는 "형질전환된"숙주 세포는 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다. 형질전환된 세포에는 일차 세포 및 이의 후손이 포함된다. 본원에서 "조작된" "재조합"세포 또는 숙주 세포는 외인성 핵산 서열, 예를 들면 치료 유전자 작제물을 보유하는 본 발명의 렌티벡터가 도입된 세포를 의미한다. 따라서, 재조합 세포는 재조합으로 도입된핵산을 보유하지 않는 자연 발생 세포와 구별된다.
특정 구체예에서, RNA 또는 단백질성 서열은 동일한 숙주 세포에서 다른 선별된 RNA 또는 단백질성 서열과 공발현될 수 있다. 공발현은 숙주 세포를 2개 이상의 서로 다른 재조합 벡터로 공형질감염시켜 달성할 수 있다. 대안으로, 다수의 서로 다른 RNA 암호화 영역을 보유하도록 단일 재조합 벡터를 작제할 수 있는데, 상기 RNA 암호화 영역은 단일 벡터로 형질감염된 숙주 세포에서 발현된다.
숙주 세포는 원하는 결과가 벡터의 복제, 또는 벡터-암호화된 핵산 서열의 전부 또는 일부의 발현인지에 따라, 진핵이나 원핵으로부터 유래된다. 다양한 세포주와 배양액이 숙주 세포로서 사용될 수 있는데, 이들은 살아있는 배양액과 유전 물질의 수집 기관인 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 구할 수 있다(www.atcc.org). 본 발명에 사용되는 숙주 세포의 일부 예에는 바이러스 포장 세포, 293T 세포, 사람 조혈 전구세포, 사람 조혈 줄기세포, CD34+세포, CD4+세포 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
A. 조직과 세포
조직은 핵산 전달 조성물 및/또는 추가의 제제로 형질전환되거나 이들과 접촉하는 숙주 세포 또는 세포로 구성된다. 조직은 유기체의 일부이거나 이로부터 분리된다. 특정 구체예에서, 조직과 이의 구성 세포에는 혈액(예, 조혈 세포(사람 조혈 전구세포, 사람 조혈 줄기세포, CD34+세포, CD4+세포), 림프구, 다른 혈액 계통 세포), 골수, 뇌, 즐기 세포, 혈관, 간, 례, 골, 유방, 연골, 경부, 결장, 각막, 배아, 자궁내막, 내피, 상피, 식도, 근막, 섬유아세포, 난포, 신경절 세포, 신경교 세포, 술잔 세포, 신장, 림프절, 근육, 뉴런, 난소, 췌장, 말초혈, 전립선, 피부, 소장, 비장, 위, 고환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
B. 유기체
특정 구체예에서, 숙주 세포 또는 조직은 하나 이상의 유기체에서 유래된다. 특정 구체예에서, 유기체는 사람, 영장류 또는 쥐이다. 다른 구체예에서, 유기체는 진핵생물 또는 원핵생물(예, 진정세균, 고세균)이다(참조: 웹페이지 http://phylogeny.arizona.edu/tree/phylogeny.html). 본 발명의 일부 렌티벡터는 원핵과 진핵 세포 모두에서 이들 벡터가 복제되거나 발현될 수 있도록 하는 조절 서열을 보유한다. 앞서 기술된 숙주 세포가 벡터를 유지하고 이들 벡터의 복제를 허용하는 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 렌티벡터의 대규모 생산 및 이들 렌티벡터에 의해 암호화되는 핵산과 유전자 요법에 사용되는 이들의 동계 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드의 생산을 가능하게 하는 기술과 조건 역시 공지되어 있다.
C. 주사가능 조성물과 제약학적 제형
본 발명의 렌티바이러스 벡터 조성물을 이용한 유전자 요법을 달성하기 위하여, 치료 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 세포와 접촉시킨다. 세포는 유전자 요법을 필요로 하는 사람과 같은 유기체에서 유래될 수 있다. 투여 루트는 질환의 위치와 특성에 좌우되는데, 여기에는 정맥내, 동맥내, 피내, 경피(transdermal), 근육내, 비강내, 피하, 경피(percutaneous), 복강내, 종양내,관류, 세척(lavage) 등이 포함된다. 세포는 유기체로부터 분리하고 탈체에서 렌티벡터에 노출시킨 이후 재이식할 수 있다.
발현 작제물이 주사에 요구되는 바늘의 특정 게이지를 통과할 수 있으면, 본 발명의 렌티바이러스 핵산 작제물의 주사는 주사기 또는 용액의 주사에 이용되는 다른 방법으로 전달될 수 있다. 용액을 유지하는 앰플 챔버를 한정하는 노즐 및 용액을 노즐로부터 전달 부위로 밀어내는 에너지 장치를 보유하는 신규한 바늘없는 주사 시스템이 기술되었다(미국 특허 제5,846,233호). 사전결정된 함량의 용액을 임의의 깊이로 정확하게 여러 부위에 주사할 수 있는 유전자 요법용 주사기 시스템 역시 기술되었다(미국 특허 제5,846, 225호).
유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 핵산 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 만들 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 이들의 혼합물 또는 기름에서 만들 수 있다. 정상적인 저장과 사용 조건하에, 이들 제형은 미생물의 성장을 예방하는 방부제를 함유한다. 주사에 적합한 제약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이다(미국 특허 제5,466,468호). 모든 경우에, 이런 형태는 멸균되어야 하고 주사가 용이할 만큼 유동적이어야 한다. 이는 제조와 저장의 조건하에 안정해야 하고, 박테리아와 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한유동성(fluidity)은 예를 들어, 레시틴과 같은 피복제를 사용하여, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지로, 또는 계면활성제의 사용으로 유지할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항생제와 항균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 치메로잘 등으로 달성할 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면 당이나 염화나트륨을 함유하는 것이 바람직하다. 주사가능 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴을 사용하여 달성할 수 있다.
수용액으로 장관외 투여하는 경우에, 용액은 필요한 경우 적절하게 완충하고, 액체 희석액은 충분한 염수 또는 글루코오스로 먼저 등장(isotonic)이 되도록 한다. 이들 수용액은 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 종양내, 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여 사용할 수 있는 멸균 수성 매질은 본원의 개시에 비추어 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 1회 분량은 1 ㎖ 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ㎖ 수분공급 유체(hypodermoclysis fluid)에 첨가하거나 예정된 주입 부위에 주사한다("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). 용량에서 일부 변화는 치료 개체의 상태에 따라 필요하다. 어떤 경우든, 투여를 담당하는 사람이 개별 개체에 적합한 용량을 결정하게 된다. 이에 더하여, 사람 투여용 조성물은 FDA Office of Biologics standards에 의해 요구되는 멸균성, 발열성, 전반적인 안전성, 순도 기준을 충족시켜야 한다.
멸균 주사액은 앞서 기술된 다양한 다른 성분을 함유하는 적절한 용매에 필요 함량의 활성 화합물을 혼합하고, 이후 여과 멸균하여 제조한다. 일반적으로,분산액은 염기성 분산 매질 및 앞서 기술된 다른 필요 성분을 함유하는 멸균 비히클과 함께 다양한 멸균된 활성 성분을 혼합하여 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에 바람직한 제조 방법은 진공-건조와 동결-건조 기술인데, 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 원하는 다른 성분의 분말이 산출된다.
본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 무기산, 예를 들면 염산, 인산, 또는 유기산, 예를 들면 아세트산, 옥살산, 주석산, 만델산 등으로 형성되는 산 첨가염이 포함된다. 또한, 유리 카르복실기로 형성된 염은 무기 염기, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 또는 유기 염기, 예를 들면 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로케인 등으로부터 유래될 수 있다. 제형화시에, 용액은 투여형에 적합한 방식으로 치료학적 유효량으로 투여된다. 제형은 다양한 투여 형태, 예를 들면 주사가능 용액 및 약물 방출 캡슐 등으로 투여된다.
본원에서 "담체"에는 모든 용매, 분산 매질, 부형약, 피복제, 희석제, 항생제와 항균제, 등장제, 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 약제학적 활성 성분에 이런 매질과 제제의 사용은 당분야에 잘 알려져 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분에 부적합한 경우를 제외하고, 치료 조성물에 이들의 사용을 고려한다. 보충적 활성 성분 역시 조성물에 혼합될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는"또는 "약리학적으로 허용되는"은 사람에 투여될 때알레르기 반응이나 유사한 원치않는 반응을 유발하지 않는 분자 존재물 또는 조성물을 의미한다. 단백질을 활성 성분으로 함유하는 수성 조성물의 제조는 당분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이런 조성물은 액체 용액이나 현탁액과 같은 주사가능물질로 제조된다; 주사에 앞서 용액, 현탁액 또는 유체에 용해하기 적합한 고체 형태 역시 제조할 수 있다.
본원에서"접촉된"과 "노출된"은 본 발명의 치료 렌티바이러스 벡터가 표적 세포에 전달되는 과정을 기술하는데 이용된다.
별개의 접근가능한 고형 종양에 대한 유전자 요법에서, 종양내 주사 또는 종양 맥관구조로의 주사가 특히 적합하다. 국소, 국부 또는 전신 투여 역시 가능하다. >4㎝ 종양의 경우에 투여량은 대략 4-10 ㎖(바람직하게는 10 ㎖)이고, <4㎝ 종양의 경우에 투여량은 대략 1-3 ㎖(바람직하게는 3 ㎖)이다. 단일 용량으로 전달되는 다회 주사는 대략 0.1 내지 0.5 ㎖ 분량으로 구성된다. 바이러스 입자는 1 ㎝ 간격으로 종양에 다회 주사하여 접촉시키는 것이 바람직하다. 전신 투여는 조혈 종양과 같은 질환에 선호된다.
연속 투여 역시 이용될 수 있다. 주사기를 통한 전달 또는 도관법(catheterization)이 선호된다. 이런 연속 관류는 초기 치료이후 대략 1-2시간, 대략 2-6시간, 대략 6-12시간, 대략 12-24시간, 대략 1-2일, 대략 1-2주 또는 그 이상동안 진행된다. 일반적으로, 연속 관류를 통한 치료 조성물의 용량은 단일 또는 다회 주사에 의해 제공되는 용량에 상당하며, 관류가 진행되는 기간에 맞게 조정된다.
치료 섭생은 질병의 유형, 병든 조직의 위치, 환자의 건강 상태와 연령에 좌우된다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터에 기초한 치료 조성물의 공지된 효능과 독성을 고려하여, 임상의는 이를 최적으로 결정할 수 있다.
치료제는 다양한 "단위 용량"을 함유할 수 있다. 단위 용량은 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 함유하는 예정된 함량의 치료 조성물로 정의된다. 투여 함량 및 투여 루트와 제형은 임상 분야의 당업자에게 상식이다. 단위 용량은 단일 주사로 투여될 필요는 없으며, 정해진 기간동안 연속 관류될 수 있다. 본 발명의 단위 용량은 HeLa 또는 293 세포주에서 벡터를 적정(titering)하여 정의된 렌티벡터의 형질도입 단위(T.U.)로 표시한다. 단위 용량은 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013T.U. 또는 그 이상이다.
다음의 실시예에서는 본 발명의 바람직한 구체예를 예시한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 아래의 실시예에 개시된 기술은 본 발명자들에 의해 본 발명의 실시에 적합한 것으로 확인된 기술이며, 따라서 본 발명의 실시에 바람직한 양식으로 간주될 수 있다. 그러나, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 본원에 개시된 특정 구체예의 다양한 개변이 가능함은 당업자에게 자명하다.
A. 실시예 1 내지 3에 이용되는 재료와 방법
1. 벡터 제조
수포성 구내염(VSV)G 외피 단백질로 의사(擬似)된 HIV-유래된 벡터의 생산은 3가지 플라스미드의 293T 상피 세포주로의 일시적인 공형질감염으로 달성하였다(Naldini et al 1996a). HIV-유래된 포장 작제물은 pCMVAR8.91을 사용하였는데, 이는 HIV-1 Gag와 Pol 전구체 및 조절 단백질 Tat와 Rev를 암호화한다(Zufferey et al., 1997). VSV G는 pMD.G로부터 발현시켰다.
HIV 벡터 플라스미드는 아래와 같이 변형된 pHR 골격의 유도체이었다(Naldini et al., 1996a). 자가-불활성화 벡터는 nt.-418에서 nt.-18까지 3' LTR의 U3 영역에서 결실을 보유하고 모든 전사 활성 서열이 제거된 앞서 기술된 SIN-18 벡터로부터 만들었다(Zufferey et al. , 1998). 간단히 말하면, pHR'SIN 플라스미드는 아래와 같이 만들었다: 폴리푸린 지역과 3' LTR을 보유하는 KpnI-XbaI 단편은 pHR' 플라스미드로부터 잘라내고 pUC18의 상응하는 부위로 서브클로닝하였다. 상기 플라스미드는EcoRV로 완전히 절단하고PvuII로 부분적으로 절단하며 자가-결찰시켰다. U3의 400개 뉴클레오티드가 결실되는 플라스미드가 회수되었다.XhoI링커는 결실 플라스미드의EcoRI부위에 삽입하고,Xhol-XbaI단편은 상응하는 효소로 절단된 pHR' CMVlacZ 플라스미드로 역 클로닝하였다. 모든 다른 SIN-18 플라스미드는 lacZ를 리포터 유전자(루시페라제, GFP, Neo를 암호화)로 대체하여 수득하였다. 사용된 pHR' 벡터 플라스미드는 폴리푸린 지역의 상부에서Nef암호 서열로부터 118개 뉴클레오티드가 제거되는XhoI-KpnI결실 및 3' LTR의 하부에서 사람 서열의 1,456개 뉴클레오티드 결실에 의하여 처음에 보고된 플라스미드(Naldini et al., 1996)와 구별되었다. 상기 사람 서열은 HXB2 프로바이러스 게놈의 최초 클로닝으로부터 남아있었다. 이들 2가지 결실은 분화하는 293T 세포에서 벡터 역가 또는 전이유전자 발현에 영향을 주지 않았다.
EF1α의 삽입은 EF1-GFP 삽입체를 보유하는ClaI-BamHI카세트를 pHR'-GFP-W-SIN(Zufferey et al., 1999)의ClaI-BamHI부위에 삽입함으로써 실시하고 pHR-EF1-GFP-W-SIN 벡터를 만들었다. 상기 벡터의 유도체는 여러 기능적 차이를 보유하였다. 기능적 차이는 EF-1α-짧은 프로모터, 3' LTR에서 loxP 부위, cPPT이다. 3' LTR에서 loxP 부위는 형질도입된 세포에서 5' LTR에 중복되고, 추가된 발현된 Cre 리콤비나제(recombinase)의 존재하에 삽입된 프로바이러스의 제거를 가능하게 한다. 그러나, loxP 부위와 Cre-매개된 엑시톤(excition)은 gp91-phox 프로모터 활성에 요구되지 않고, 조혈 줄기세포-기초한 임상 시험에서 벡터의 잠재적 실용에도 필요하지 않다. pHR-EF1-GFP-(+/-)W-SIN에 존재하는 EF-1α 및 pHPT-GFP와 pWPT-GFP에 존재하는 EF1α-짧은 프로모터 사이의 차이는 좀더 짧은 형이 인트론을 보유하지 않아 벡터가 좀더 작아진다는 점이다.
도 5A-5D에 도시된 지도는 플라스미드 작제물 pHPT-GFP, pWPT-GFP, pHPP91-GFP, pWPP91-GFP를 도시한다.
293T 세포에서 인산칼슘에 의한 일시적인 형질감염이후, 상층액은 수거하고 자당 구배를 이용한 한외원심분리로 농축하며 혈청-없음 CellgroRSCGM 배지(Cellgenix, Germany)에 재현탁시키고 0.45 마이크론 SpinX 필터를 통하여 여과하였다. 바이러스 원액은 -70℃에서 보관하고 역가(titer)는 HeLa 세포에서 형질도입 및 GFP 발현의 유세포 분석으로 측정하였다(Zufferey et al., 1997). 역가는 ㎖당 5x107내지 108HeLa 형질도입 단위(TU)이었다.
2. CD34 + 세포의 정제와 형질도입
제대혈(CB) 시료는 기관 가이드라인에 따라 수득하고, CD34+세포는 기존 문헌에서 밝힌 바와 같이 정제하였다(Arrighi et al., 1999). 간단히 말하면, Ficoll-Paque(Pharmacia,Uppsala, Sweden) 구배 원심분리 후에 회수된 CB 단핵 세포는 제조업자가 밝힌 바와 같이, 얼음에서 항-CD34 M450 Dynabead(Dynal, Norway)와 함께 배양하였다. 결합하지 않은 세포를 제거하기 위한 수회 세척이후, CD34+세포는 37℃에서 15분동안, 키트에 포함된 "Detach-a-bead"와 함께 배양으로 비드로부터 회수하였다. 세포는 즉시 세척하고 유세포 분석하였다. 정제된 CD34+세포의 비율은 89±7.0이었다. 형질도입을 위하여, 105세포는 항생제(Gibco BRL, Life Technologies LTD, Paisley, Scotland, U.K.), 10-4M 디티오트레이톨(Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland), TPO(1O ng/㎖), SCF(50 ng/㎖), Flt3L(50 ng/㎖)로 보충된 100 ㎕의 CellgroRSCGM 배지에서 96-웰 평판에 분주하였다. 하룻밤동안 배양한 이후, ㎖당 106(전형적으로) 또는 105내지 5X106(용량-반응 분석을 위하여) HeLa-형질도입 단위(TU)의 벡터를 첨가하고, TPO를 함유하는 CellgroRSCGM 배지로 부피를 200 ㎕로 조정하였다. 24시간후, 세포는 세척하고 항생제, 10-4M 디티오트레이톨, TPO(1O ng/㎖), SCF(50 ng/㎖), Flt3L(50 ng/㎖)로 보충된 100 ㎕의 CellgroRSCGM 배지에서 3일동안 400㎕로 희석하였다. 세포는 GFP와 CD34 발현으로 직접 분석하거나, 또는 3가지 성장 인자와 함께 추가로 배양하였다.
3. 사이토킨
모든 사이토킨은 사람 유래의 재조합 물질이며 Peprotech(London, U.K.)로 구입하였다.
4. 항체와 면역반응인자
모든 항체는 Becton Dickinson Pharmingen(USA)으로부터 구입하였다. 항-CD34 mIgG가 피복된 M450 Dynabead는 Dynal A/S(Oslo, Norway)로부터 구입하였다.
5. 시험관내 분화와 IFN-감마 자극
분화는 단구성 분화의 경우에 GM-CSF와 SCF의 존재하에, 골수성 분화의 경우에 G-CSF와 SCF의 존재하에 3주동안 시험관내에서 실시하였다. 분화된 세포는 INF-γ(lOOO U/㎖)로 6일동안 자극하고 PE-공액된 모노클로날 항체로 표지하며, PE 파지티브 집단에서 GFP 발현은 FACS를 이용하여 분석하였다. 숫자는 사분면에서 세포의 비율을 나타낸다.
6. 유세포 분석법
세포는 약간 변형된 FACScalibur(BectonDickinson)에서 기존 문헌에서 밝힌 바와 같이 분석하였다(Arrighi et al., 1999). FL-1은 GFP에, FL-2는 PE-표지된MAb에, FL-3은 PercP-표지된 Mab에 사용되었다. 세포 현탁액은 분석에 앞서 0.5% 파라포름알데하이드로 조정하였다. 데이터는 Scripps Institute(La Jolla, CA)의 J. Trotter에 의해 작성된 WINMDI 소프트웨어 및 CellQuest 소프트웨어(Becton-Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
B. 실시예 1-4
실시예 1: gp91-phox 프로모터의 조절하에 발현 카세트를 보유하는 HIV계 렌티벡터로 사람 조혈 전구세포의 형질도입은 단핵구와 과립구에서 제한된 발현을 초래한다.
pWPP91-GFP(WPRE 보유)와 pHPP91-GFP(WPRE 없음) 렌티바이러스 벡터는 각각 pWPT-GFP와 pHPT-GFP 렌티바이러스 벡터에서 식세포 NADPH 옥시다제 프로모터(1)의 gp91-phox 아단위의 1540bp 단편으로 EF-1α 프로모터를 대체하여 만들었다. pWPT-GFP와 pHPT-GFP는 둘 모두 SIN(자가-불활성화) 렌티바이러스 벡터이며, 표적 세포의 형질도입 효율을 강화시키기 위하여 중심 폴리푸린 지역 서열(cPPT)을 보유한다(도 1과 5). 재조합 렌티벡터는 앞서 기술된 표준 방법으로 생산하고 100x 농축하며 사람 조혈 CD34+전구세포/줄기세포(HSC)의 형질도입에 사용하였다(Salmon P, Kindler V, Ducrey O, Chapuis B, Zubler RH, Trono D., "High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors," Blood 96 (10): 3392-8 (2000))
최대 80%까지 높은 비율의 UCB HSC 형질도입이 렌티벡터에 의해 달성되었는데, 여기서 중심 폴리푸린 지역은 EF1-α-GFP 발현 카세트의 상부에 삽입되었다. 형질도입된 HSC의 시험관내(사이토킨 칵테일) 또는 생체내(NOD/SCID 마우스 이식) 분화이후 많은 숫자의 GFP 파지티브 세포가 존속하였다.
gp91-phox-GFP 카세트를 보유하는 렌티벡터로 HSC의 형질도입, 이후 이들의 시험관내(사이토킨 칵테일) 또는 생체내(거의 치사량에 가까운 방사선이 조사된 NOD/SCID 마우스 이식) 분화는 성숙 단핵구와 과립구에 배타적으로 국한되는 GFP 발현을 결과하였다. 성숙 호중구에서 gp91-phox 프로모터로부터 GFP 발현은 WPRE의 삽입으로 특이성(specificity)의 상실없이 강화되었다.
WPRE를 보유하거나 보유하지 않은 렌티벡터에 의하여 HP/SC로 전달되는 gp91-phox 프로모터는 시험관내에서 성숙 호중구에서 INF-γ에 생리 반응을 보였다(도 2).
실시예 2: HS 인핸서 요소는 좀더 높고 변화가 덜한 발현을 유도한다.
다양한 림프-혈액 질환의 유전자 치료에서 중요한 요점은 분화된 세포의 적절한 아집합에서 치료 전이유전자의 발현 수준이다. 좀더 높고 변화없는 유전자 발현을 달성하기 위하여, 4개의 DNAase 과민성 부위(HS)내에서 gp91-phox 유전자의 30kb 상부에 위치하는 gp91-특이적 인핸서 서열을 렌티바이러스 벡터에 클로닝하였다.
먼저, 바이러스 게놈의 크기를 줄이기 위하여, 1540bp gp91-프로모터 단편은 기능적으로 동등한 5kb 단편(Skalnik, et al. 1991)으로 대체하여, pHP500-GFP 벡터(도 6A)를 만들었다. 클로닝을 용이하게 하기 위하여 cPPT(인핸서의 클로닝이후에도 중심 위치와 기능성을 유지한다)의 양 부위에 인핸서의 도입을 가능하게 하는 다수의 유일 제한 부위를 도입하여 pHPX-GFP 벡터(도 6B)를 만들었다.
4개의 개별 HS 부위를 커버하는 단편은 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR로 만들었다. PCR 프라이머의 서열은 Human Genome Project에 의해 공개된 사람 게놈 서열(contig NT_011844; http://www. ncbi. nlm. nih.gov/genome/guide/human/)에 기초한다(참조: 서열 2-16). gp91-phox HS 부위의 위치는 공개된 데이터에 기초하였다(Lien LL, Lee Y, and Orkin SH(1997)). 특정된 부위를 측면에서 접하는 대략 1-1.5 kb 서열을 증폭하고 렌티벡터로 클로닝하여, 최종적으로 pHPHS-GFP를 만들었다(참조: 서열 2-16). WPRE 서열을 보유하는 이형(異形)을 또한 만들었다(pWPHS-GFP, 도 6C). HSC의 형질도입과 분화 직후에, 이들 형태에 HS 요소의 포함은 전이유전자의 좀더 높은 전체적인 발현 및/또는 변화가 덜한 발현을 초래한다.
실시예 3: 만성 육아종 질환(CGD)에 대한 요법 개발
만성 육아종 질환은 NADPH의 아단위를 암호화하는 gp91-phox 유전자의 결핍과 밀접하게 상관한 것이다(Dinauer et al, 1987). X-연결된 gp91-phox 유전자는 CGD 환자의 대략 60%에서 결함된다(MalechHL,"Progress in gene therapy for chronic granulomatous disease Infect. Dis. 179(Suppl. 2): S 318-25,1999). 한가지 치료 방식은 적합한 세포를 형질도입하여 gp91-phox의 하나 이상 사본이 환자에 도입되도록 하는 것이다. 전술한 바와 같이, 이런 유형의 요법은 환자로부터 세포의 분리, 탈체 형질도입, 이후 환자에서 이들 세포의 재이식을 수반한다.
CD34 세포는 CGD 환자로부터 분리하고 gp91-phox 유전자, 예를 들면 서열 18의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 gp91-phox 유전자, 또는 서열 19의 아미노산 서열의 기능성 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열의 기능적 사본을 보유하는 본 발명의 벡터로 형질도입한다. gp91-phox 폴리펩티드의 적절한 발현은 벡터에 포함된 gp91-phox 프로모터에 의해 발휘되는 조절을 통하여 달성된다. 강화된 발현은 앞서 밝힌 바와 같이 WPRE 요소와 HS 인핸서를 포함시켜 달성할 수 있다.
세포는 검사 시스템, 예를 들면 SCID-NOD 마우스 또는 지시된 환자에 이식된다. 이런 방식의 효능은 형질도입된 세포를 마우스의 적중 변종에 이식하여 추가로 평가한다.
실시예 4: 백혈구 흡착 결핍(LAD)에 대한 치료 방식
한가지 치료 방식은 적합한 세포를 형질도입하여 골수단구성 백혈구 인테그린의 하나 이상 기능적 사본이 환자에 도입되도록 하는 것이다. 전술한 바와 같이, 이런 유형의 요법은 환자로부터 세포의 분리, 탈체 형질도입, 이후 환자에서 이들 세포의 재이식을 수반한다.
CD34 세포는 LAD 환자로부터 분리하고 인테그린 유전자의 기능적 사본을 보유하는 본 발명의 벡터로 형질도입한다. 인테그린 폴리펩티드의 적절한 발현은 벡터에 포함된 CD11b 프로모터에 의해 발휘되는 조절을 통하여 달성된다. CD11b 프로모터는 서열 20의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 프로모터에서 선택된다(Hickstein, et al. 1992). 강화된 발현은 앞서 밝힌 바와 같이 WPRE 요소와HS 인핸서를 포함시켜 달성할 수 있다.
본 발명에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본원의 개시에 비추어 과도한 실험없이 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법이 바람직한 구체예로써 기술되었지만, 본 발명의 개념, 기술적 사상, 범위를 벗어나지 않는 이들 구체예에 대한 다양한 개변이 가능함은 당업자에게 자명하다. 좀더 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 제제는 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 본원에서 밝힌 제제로 대체될 수 있다. 당업자에게 자명한 이들 모든 개변은 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 개념, 취지 및 범위에 속한다.
참조 문헌
하기 참조 문헌은 예시적 과정 또는 본원에서 제시하는 내용에 보충적인 기타 세부사항을 제공하는 정도로 본원에서 참조로 명확히 인용된다.
미국 특허 제4,682,195호
미국 특허 제4,683,202호
미국 특허 제5,466,468호
미국 특허 제5,645,897호
미국 특허 제5,686,279호
미국 특허 제5,705,629호
미국 특허 제5,846,225호
미국 특허 제5,846,233호
미국 특허 제5,925,565호
미국 특허 제5,928,906호
미국 특허 제5,935,819호
미국 특허 제5,994,136호
미국 특허 제6,013,516호
미국 특허 제6,136,597호
미국 특허 제6,165, 782
미국 특허 제6,207,455호
미국 특허 제6,218,181호
미국 특허 제6,218,186호
유럽 특허 제266,032호
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<110> INSTITUT CLAYTON DE LA RECHERCHE <120> Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications <130> 5-2004-010891-4 <140> 60/326,593 <141> 2001-10-02 <160> 20 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 1 ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60 agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttt 118 <210> 2 <211> 1744 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtataaggta acatatccac aggttctaga gattagtacc tagacatctt tggttggggg 60 taatatttat ccaactacaa atggatatga taattttaca tacctcataa ggtggttgtg 120 aaaaataaat gagacaaagc acataagaca tgtggtgtgt ataaaatgct ttgtaaatgt 180 cagctgttgt taataagacc aagttgtttg taaaaaaaga tttttcaagg aaataagcca 240 atataataca ggatgcatac tgaaaagttt tagttcaaat caataactag agatttcctc 300 atttttcctt tattctgatg aattaatgta tacaagtcat atttaacata aaggggtaaa 360 atgtaaatct tcatcgccag 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accaagaaac tctttaaatg tatttgaggg 480 actcttgtct cgaaccaaga aactcttgaa atatatttga gggaacagga tcaagcaagg 540 acagctcttc caattctccc atctcttcta cattctctta attcatctgg gcaacaacct 600 ggtcatcccc atcccctaca aaaccttccc accggacatc tgtacttctc ctcccatggt 660 taatagcctc ccctacaccc tcaactattc tctgaacatc tccacaactt catggccttc 720 tttcctccag aagaccccat ggcctacaga cagctaagct acagcagttg gctctccaac 780 tactctacat gccatgctat gagagtggac taggctatga gagttgtttt tttcctagct 840 cctcattgac atttctatac tttcaatcct tccactgcat gcagatccct gtgccccact 900 gaggtgtggg cctctcggct ctaattccct ctgcccctcc tttgtaatgg gggtggtcca 960 tgtactgctg tgtcctcaca tgagttgctt tattaagaac tcgggcactg cattgcagcc 1020 tgcctctcct cgctaacatt tgccatcttt ctgggtgact tcagtggatc caataccctg 1080 cctcagtcat ccttgacttc ctcattcaga gatcttcacc tccatggact cccatagcca 1140 cactctgaac cctgtcatct ctcagaagtg cactgcttct gaaatctgca tctcgagcgg 1200 c 1201 <210> 5 <211> 1143 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcgtcgactt tccagggctt cttccatagc taaaactcaa agaaacattt 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tggaagccct gtcaaactaa tgcaacaaca tttcctccca ttagatttct taattcgtgt 960 atagctggcc tgataatgtc ttatcagcta ccccaactca attgctgcaa atacattttt 1020 aaaagttctg gtggttgtag ttgattgcac acttctgtat gagccaataa tgtgaggcaa 1080 gtctttaaaa gggtagcaca atcagtctga ggttacacca tagatatggt taactcgagc 1140 ggc 1143 <210> 6 <211> 1256 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gcgtcgacca tccatgttgt ttcaatgaca ggatttcatt ctttttatgg ctgaatagta 60 ttccattgtg tatatatacc acattttcgt tttctattca tccattgatg gaacttaagt 120 taattcttat cttggctatt ggctattgtg aatagtgcta cagtaaacat ggtagtgcag 180 ctatctcttc aatactgact tgctttattt tggatatata cccagtgatg ggattcctgg 240 atcatatggt acttctattt tttgtttttt tgaggaatct ccatactgtt ctctatagtg 300 gttgtactac tttacattcc caccaacagt gtacaatcat tcccctttct ctacatcctt 360 accattatct actatttttt gtctttttga ttaaagccat tttatctggg gtgaggtgat 420 agctcattgt ggttttgatt tgcatttttc taatgattag tgatggtgag catttttcat 480 atacctgttt accacttgta tgtcttcttt tgagaaatgt ctattcagaa ctgtattagt 540 ccattccagc attgctataa 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caccagcatt gccacaaaca catgagtaat gtgttatgct acaatgtcac 480 tagatggtag gaatttttca gcacacacac acaagtatat atattatata ttatattata 540 tattatatat atatatgtat atatatatat atatatagag agagagagag agagagagag 600 agagagatgg agtcttgctc tgtcgcccag gctggggtgc aatgacacaa tctcggctca 660 ctgcaacctg actcccaggt tcaagtgatt ctcctgcctc agcctcctga gtagctggga 720 ctacaggtgc ccaccaccat gcccagctaa tttttgtatt tttagtagag acggggtttc 780 accatgttgg ccagattggt cccaaactcc tgacctcaag tgatccaccc cactcagcct 840 ctcaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc accgtgcctg gccaacacca ttataatctt 900 atgggaccac tgtcatacat gtggttcatc attggccaaa gcatctgtat ttatatatgt 960 atgtttcaaa ttatatatat atatatatat atatatatat atgatagcta tacatgaaca 1020 tacacacaca catatataga catatatagc acataaaatt ggcacatatt aagcattttg 1080 taaatatcaa ccattacaat tgttactact tttctcagca aggctatgaa tgctgttcca 1140 gcctgtcaaa atcacacctg tttaatgtgt tttacccagc acgaagtcat gtctagttga 1200 gtggcttaaa aattgtgatc aaatagctgg ttagttaaaa agttatttca ctgtgtaaaa 1260 tacatccctt aaaatgcact gttatttatc tcttagttgt agaaattggt ttcattttcc 1320 actatgttta attgtgactg gatcattata gacccttttt ttgtagttgt tgaggtttaa 1380 agatttaagt ttgttatgga tgcaagcttt tcagttgacc aatgattatt agccaatttc 1440 tgataaaaag aaaaggaaac cgattgcccc agggctgctg ttttcatttc ctcattggaa 1500 gaagaagcat agtatagaag aaaggcaaac acaacacatt caacctctgc caccatg 1557 <210> 18 <211> 4266 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (15)..(1727) <400> 18 cttcctctgc cacc atg ggg aac tgg gct gtg aat gag ggg ctc tcc att 50 Met Gly Asn Trp Ala Val Asn Glu Gly Leu Ser Ile 1 5 10 ttt gtc att ctg gtt tgg ctg ggg ttg aac gtc ttc ctc ttt gtc tgg 98 Phe Val Ile Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn Val Phe Leu Phe Val Trp 15 20 25 tat tac cgg gtt tat gat att cca cct aag ttc ttt tac aca aga aaa 146 Tyr Tyr Arg Val Tyr Asp Ile Pro Pro Lys Phe Phe Tyr Thr Arg Lys 30 35 40 ctt ctt ggg tca gca ctg gca ctg gcc agg gcc cct gca gcc tgc ctg 194 Leu Leu Gly Ser Ala Leu Ala Leu Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Leu 45 50 55 60 aat ttc aac tgc atg ctg att ctc ttg cca gtc tgt cga aat ctg ctg 242 Asn Phe Asn Cys Met Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Leu Leu 65 70 75 tcc ttc ctc agg ggt tcc agt gcg tgc tgc tca aca aga gtt cga aga 290 Ser Phe Leu Arg Gly Ser Ser Ala Cys Cys Ser Thr Arg Val Arg Arg 80 85 90 caa ctg gac agg aat ctc acc ttt cat aaa atg gtg gca tgg atg att 338 Gln Leu Asp Arg Asn Leu Thr Phe His Lys Met Val Ala Trp Met Ile 95 100 105 gca ctt cac tct gcg att cac acc att gca cat cta ttt aat gtg gaa 386 Ala Leu His Ser Ala Ile His Thr Ile Ala His Leu Phe Asn Val Glu 110 115 120 tgg tgt gtg aat gcc cga gtc aat aat tct gat cct tat tca gta gca 434 Trp Cys Val Asn Ala Arg Val Asn Asn Ser Asp Pro Tyr Ser Val Ala 125 130 135 140 ctc tct gaa ctt gga gac agg caa aat gaa agt tat ctc aat ttt gct 482 Leu Ser Glu Leu Gly Asp Arg Gln Asn Glu Ser Tyr Leu Asn Phe Ala 145 150 155 cga aag aga ata aag aac cct gaa gga ggc ctg tac ctg gct gtg acc 530 Arg Lys Arg Ile Lys Asn Pro Glu Gly Gly Leu Tyr Leu Ala Val Thr 160 165 170 ctg ttg gca ggc atc act gga gtt gtc atc acg ctg tgc ctc ata tta 578 Leu Leu Ala Gly Ile Thr Gly Val Val Ile Thr Leu Cys Leu Ile Leu 175 180 185 att atc act tcc tcc acc aaa acc atc cgg agg tct tac ttt gaa gtc 626 Ile Ile Thr Ser Ser Thr Lys Thr Ile Arg Arg Ser Tyr Phe Glu Val 190 195 200 ttt tgg tac aca cat cat ctc ttt gtg atc ttc ttc att ggc ctt gcc 674 Phe Trp Tyr Thr His His Leu Phe Val Ile Phe Phe Ile Gly Leu Ala 205 210 215 220 atc cat gga gct gaa cga att gta cgt ggg cag acc gca gag agt ttg 722 Ile His Gly Ala Glu Arg Ile Val Arg Gly Gln Thr Ala Glu Ser Leu 225 230 235 gct gtg cat aat ata aca gtt tgt gaa caa aaa atc tca gaa tgg gga 770 Ala Val His Asn Ile Thr Val Cys Glu Gln Lys Ile Ser Glu Trp Gly 240 245 250 aaa ata aag gaa tgc cca atc cct cag ttt gct gga aac cct cct atg 818 Lys Ile Lys Glu Cys Pro Ile Pro Gln Phe Ala Gly Asn Pro Pro Met 255 260 265 act tgg aaa tgg ata gtg ggt ccc atg ttt ctg tat ctc tgt gag agg 866 Thr Trp Lys Trp Ile Val Gly Pro Met Phe Leu Tyr Leu Cys Glu Arg 270 275 280 ttg gtg cgg ttt tgg cga tct caa cag aag gtg gtc atc acc aag gtg 914 Leu Val Arg Phe Trp Arg Ser Gln Gln Lys Val Val Ile Thr Lys Val 285 290 295 300 gtc act cac cct ttc aaa acc atc gag cta cag atg aag aag aag ggg 962 Val Thr His Pro Phe Lys Thr Ile Glu Leu Gln Met Lys Lys Lys Gly 305 310 315 ttc aaa atg gaa gtg gga caa tac att ttt gtc aag tgc cca aag gtg 1010 Phe Lys Met Glu Val Gly Gln Tyr Ile Phe Val Lys Cys Pro Lys Val 320 325 330 tcc aag ctg gag tgg cac cct ttt aca ctg aca tcc gcc cct gag gaa 1058 Ser Lys Leu Glu Trp His Pro Phe Thr Leu Thr Ser Ala Pro Glu Glu 335 340 345 gac ttc ttt agt atc cat atc cgc atc gtt ggg gac tgg aca gag ggg 1106 Asp Phe Phe Ser Ile His Ile Arg Ile Val Gly Asp Trp Thr Glu Gly 350 355 360 ctg ttc aat gct tgt ggc tgt gat aag cag gag ttt caa gat gcg tgg 1154 Leu Phe Asn Ala Cys Gly Cys Asp Lys Gln Glu Phe Gln Asp Ala Trp 365 370 375 380 aaa cta cct aag ata gcg gtt gat ggg ccc ttt ggc act gcc agt gaa 1202 Lys Leu Pro Lys Ile Ala Val Asp Gly Pro Phe Gly Thr Ala Ser Glu 385 390 395 gat gtg ttc agc tat gag gtg gtg atg tta gtg gga gca ggg att ggg 1250 Asp Val Phe Ser Tyr Glu Val Val Met Leu Val Gly Ala Gly Ile Gly 400 405 410 gtc aca ccc ttc gca tcc att ctc aag tca gtc tgg tac aaa tat tgc 1298 Val Thr Pro Phe Ala Ser Ile Leu Lys Ser Val Trp Tyr Lys Tyr Cys 415 420 425 aat aac gcc acc aat ctg aag ctc aaa aag atc tac ttc tac tgg ctg 1346 Asn Asn Ala Thr Asn Leu Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Phe Tyr Trp Leu 430 435 440 tgc cgg gac aca cat gcc ttt gag tgg ttt gca gat ctg ctg caa ctg 1394 Cys Arg Asp Thr His Ala Phe Glu Trp Phe Ala Asp Leu Leu Gln Leu 445 450 455 460 ctg gag agc cag atg cag gaa agg aac aat gcc ggc ttc ctc agc tac 1442 Leu Glu Ser Gln Met Gln Glu Arg Asn Asn Ala Gly Phe Leu Ser Tyr 465 470 475 aac atc tac ctc act ggc tgg gat gag tct cag gcc aat cac ttt gct 1490 Asn Ile Tyr Leu Thr Gly Trp Asp Glu Ser Gln Ala Asn His Phe Ala 480 485 490 gtg cac cat gat gag gag aaa gat gtg atc aca ggc ctg aaa caa aag 1538 Val His His Asp Glu Glu Lys Asp Val Ile Thr Gly Leu Lys Gln Lys 495 500 505 act ttg tat gga cgg ccc aac tgg gat aat gaa ttc aag aca att gca 1586 Thr Leu Tyr Gly Arg Pro Asn Trp Asp Asn Glu Phe Lys Thr Ile Ala 510 515 520 agt caa cac cct aat acc aga ata gga gtt ttc ctc tgt gga cct gaa 1634 Ser Gln His Pro Asn Thr Arg Ile Gly Val Phe Leu Cys Gly Pro Glu 525 530 535 540 gcc ttg gct gaa acc ctg agt aaa caa agc atc tcc aac tct gag tct 1682 Ala Leu Ala Glu Thr Leu Ser Lys Gln Ser Ile Ser Asn Ser Glu Ser 545 550 555 ggc cct cgg gga gtg cat ttc att ttc aac aag gaa aac ttc taa 1727 Gly Pro Arg Gly Val His Phe Ile Phe Asn Lys Glu Asn Phe 560 565 570 cttgtctctt ccatgaggaa ataaatgtgg gttgtgctgc caaatgctca aataatgcta 1787 attgataata taaatacccc ctgcttaaaa atggacaaaa agaaactata atgtaatggt 1847 tttcccttaa aggaatgtca aagattgttt gatagtgata agttacattt atgtggagct 1907 ctatggtttt gagagcactt ttacaaacat tatttcattt ttttcctctc agtaatgtca 1967 gtggaagtta gggaaaagat tcttggactc aattttagaa tcaaaaggga aaggatcaaa 2027 aggttcagta acttccctaa gattatgaaa ctgtgaccag atctagccca tcttactcca 2087 ggtttgatac tctttccaca atactgagct gcctcagaat cctcaaaatc agtttttata 2147 ttccccaaaa gaagaaggaa accaaggagt agctatatat ttctactttg tgtcattttt 2207 gccatcatta ttatcatact gaaggaaatt ttccagatca ttaggacata atacatgttg 2267 agagtgtctc aacacttatt agtgacagta ttgacatctg agcatactcc agtttactaa 2327 tacagcaggg taactgggcc agatgttctt tctacagaag aatattggat tgattggagt 2387 taatgtaata ctcatcattt accactgtgc ttggcagaga gcggatactc aagtaagttt 2447 tgttaaatga atgaatgaat ttagaaccac acaatgccaa gatagaatta atttaaagcc 2507 ttaaacaaaa tttatctaaa gaaataactt ctattactgt catagaccaa aggaatctga 2567 ttctccctag ggtcaagaac aggctaagga tactaaccaa taggattgcc tgaagggttc 2627 tgcacattct tatttgaagc atgaaaaaag agggttggag gtggagaatt aacctcctgc 2687 catgactctg gctcatctag tcctgctcct tgtgctataa aataaatgca gactaatttc 2747 ctgcccaaag tggtcttctc cagctagccc ttatgaatat tgaacttagg aattgtgaca 2807 aatatgtatc tgatatggtc atttgtttta aataacaccc accccttatt ttccgtaaat 2867 acacacacaa aatggatcgc atctgtgtga ctaatggttt atttgtatta tatcatcatc 2927 atcatcctaa aattaacaac ccagaaacaa aaatctctat acagagatca aattcacact 2987 caatagtatg ttctgaatat atgttcaaga gagagtctct aaatcactgt tagtgtggcc 3047 aagagcaggg ttttcttttt gttcttagaa ctgctcccat ttctgggaac taaaaccagt 3107 tttatttgcc ccaccccttg gagccacaaa tgtttagaac tcttcaactt cggtaatgag 3167 gaagaaggag aaagagctgg gggaagggca gaagactggt ttaggaggaa aaggaaataa 3227 ggagaaaaga gaatgggaga gtgagagaaa ataaaaaagg caaaagggag agagagggga 3287 agggggtctc atattggtca ttccctgccc cagatttctt aaagtttgat atgtatagaa 3347 tataattgaa ggaggtatac acatactgat gttgttttga ttatctatgg tattgaatct 3407 tttaaaatct ggtcacaaat tttgatgctg agggggatta ttcaagggac taggatgaac 3467 taaataagaa ctcagttgtt ctttgtcata ctactattcc tttcgtctcc cagaatcctc 3527 agggcactga gggtaggtct gacaaataag gcctgctgtg cgaatatagc ctttctgaaa 3587 tgtaccagga tggtttctgc ttagagacac ttaggtccag cctgttcaca ctgcacctca 3647 ggtatcaatt catctattca acagatattt attgtgttat tactatgagt caggctctgt 3707 ttattgtttc aattctttac accaaagtat gaactggaga gggtacctca gttataagga 3767 gtctgagaat attggccctt tctaacctat gtgcataatt aaaaccagct tcatttgttg 3827 ctccgagagt gtttctccaa ggttttctat cttcaaaacc aactaagtta tgaaagtaga 3887 gagatctgcc ctgtgttatc cagttatgag ataaaaaatg aatataagag tgcttgtcat 3947 tataaaagtt tcctttttat ctctcaagcc accagctgcc agccaccacg agccagctgc 4007 cagcctagct tttttttttt tttttttttt agcacttagt atttagcatt tattaacagg 4067 tactctaaga atgatgaagc attgttttta atcttaagac tatgaaggtt tttcttagtt 4127 cttctgcttt tgcaattgtg tttgtgaaat ttgaatactt gcaggctttg tatgtgaata 4187 attctagcgg gggacctggg agataattct acggggaatt cttaaaactg tgctcaacta 4247 ttaaaatgaa tgagctttc 4266 <210> 19 <211> 570 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Gly Asn Trp Ala Val Asn Glu Gly Leu Ser Ile Phe Val Ile Leu 1 5 10 15 Val Trp Leu Gly Leu Asn Val Phe Leu Phe Val Trp Tyr Tyr Arg Val 20 25 30 Tyr Asp Ile Pro Pro Lys Phe Phe Tyr Thr Arg Lys Leu Leu Gly Ser 35 40 45 Ala Leu Ala Leu Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Leu Asn Phe Asn Cys 50 55 60 Met Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Leu Leu Ser Phe Leu Arg 65 70 75 80 Gly Ser Ser Ala Cys Cys Ser Thr Arg Val Arg Arg Gln Leu Asp Arg 85 90 95 Asn Leu Thr Phe His Lys Met Val Ala Trp Met Ile Ala Leu His Ser 100 105 110 Ala Ile His Thr Ile Ala His Leu Phe Asn Val Glu Trp Cys Val Asn 115 120 125 Ala Arg Val Asn Asn Ser Asp Pro Tyr Ser Val Ala Leu Ser Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Gln Asn Glu Ser Tyr Leu Asn Phe Ala Arg Lys Arg Ile 145 150 155 160 Lys Asn Pro Glu Gly Gly Leu Tyr Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Gly 165 170 175 Ile Thr Gly Val Val Ile Thr Leu Cys Leu Ile Leu Ile Ile Thr Ser 180 185 190 Ser Thr Lys Thr Ile Arg Arg Ser Tyr Phe Glu Val Phe Trp Tyr Thr 195 200 205 His His Leu Phe Val Ile Phe Phe Ile Gly Leu Ala Ile His Gly Ala 210 215 220 Glu Arg Ile Val Arg Gly Gln Thr Ala Glu Ser Leu Ala Val His Asn 225 230 235 240 Ile Thr Val Cys Glu Gln Lys Ile Ser Glu Trp Gly Lys Ile Lys Glu 245 250 255 Cys Pro Ile Pro Gln Phe Ala Gly Asn Pro Pro Met Thr Trp Lys Trp 260 265 270 Ile Val Gly Pro Met Phe Leu Tyr Leu Cys Glu Arg Leu Val Arg Phe 275 280 285 Trp Arg Ser Gln Gln Lys Val Val Ile Thr Lys Val Val Thr His Pro 290 295 300 Phe Lys Thr Ile Glu Leu Gln Met Lys Lys Lys Gly Phe Lys Met Glu 305 310 315 320 Val Gly Gln Tyr Ile Phe Val Lys Cys Pro Lys Val Ser Lys Leu Glu 325 330 335 Trp His Pro Phe Thr Leu Thr Ser Ala Pro Glu Glu Asp Phe Phe Ser 340 345 350 Ile His Ile Arg Ile Val Gly Asp Trp Thr Glu Gly Leu Phe Asn Ala 355 360 365 Cys Gly Cys Asp Lys Gln Glu Phe Gln Asp Ala Trp Lys Leu Pro Lys 370 375 380 Ile Ala Val Asp Gly Pro Phe Gly Thr Ala Ser Glu Asp Val Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Glu Val Val Met Leu Val Gly Ala Gly Ile Gly Val Thr Pro Phe 405 410 415 Ala Ser Ile Leu Lys Ser Val Trp Tyr Lys Tyr Cys Asn Asn Ala Thr 420 425 430 Asn Leu Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Phe Tyr Trp Leu Cys Arg Asp Thr 435 440 445 His Ala Phe Glu Trp Phe Ala Asp Leu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gln 450 455 460 Met Gln Glu Arg Asn Asn Ala Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Ile Tyr Leu 465 470 475 480 Thr Gly Trp Asp Glu Ser Gln Ala Asn His Phe Ala Val His His Asp 485 490 495 Glu Glu Lys Asp Val Ile Thr Gly Leu Lys Gln Lys Thr Leu Tyr Gly 500 505 510 Arg Pro Asn Trp Asp Asn Glu Phe Lys Thr Ile Ala Ser Gln His Pro 515 520 525 Asn Thr Arg Ile Gly Val Phe Leu Cys Gly Pro Glu Ala Leu Ala Glu 530 535 540 Thr Leu Ser Lys Gln Ser Ile Ser Asn Ser Glu Ser Gly Pro Arg Gly 545 550 555 560 Val His Phe Ile Phe Asn Lys Glu Asn Phe 565 570 <210> 20 <211> 1774 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ggttcaagtg attctgctgc ctcagcctcc caggcgggat tacaggtgcc tgccaccacg 60 cctggctaat ttttttgtct ttttagtaaa gatgaggttt caccatgttg ggcaggctgg 120 tttcaattgc tgacctcaag tgagccaccc cgcctcagcc tccaaaatgc taggattaca 180 ggcatgagcc accgcaccca gccaagtttg tacatatatt tttgactaca cttcttaact 240 attcttagga taaattacta gaagtgaaaa ttcttgggtg aagagcttga ggcctttaca 300 cacacacaca cacacacaca cacacacaca caaataggct ggatcgagtg gctcacacct 360 gtaatctcag cagtttggga ggctgaggaa ggaggatcac ttgagtccag gaggttgaga 420 atagcctgaa caacatagca agatcttgtc tctacaaaaa agtttaaaaa aaattagctg 480 gccatggcag catgtgcctg tagtaccagc tactcggaag gctgaggtag gaggatcgct 540 tgagcccagg aggtgattga agctgcagtg agctgtgatt acaccactgc actccagcct 600 gggcaacaga gctagactct gtctctaaaa aaaggcacaa aataatattt aaaaagcacc 660 aggtatgcct gtacttgagt tgtctttgtt gatggctaca aatgagacag ctctggctga 720 agggcggctt ccatttccat gggctggagg aggacatttt gcaaagtgtg ttttcaggaa 780 gacacagagt tttacctcct acacttgttt gatctgtatt aatgtttgct tatttattta 840 tttaattttt tttttgagac agagtctcac tctgtcacct gggctggagt gcagtggcat 900 tattgaggct cattgcagtc tcagactcct gagctcaaac aatcctcctg cctcagcctc 960 tggagtagct aggactacag gcatgtgcca ccatgcctgg ctaatttttt aaatgtattt 1020 ttttgtagag tcggggtctc cctatgttgc ccaggctgga gtgcagtggt gtgatcctag 1080 ctcactgcag cctggacctc gggctcaaga aattctcaca cctcagcctg tccagtagca 1140 ggggctacag gcgcgcacca ccatcccagc taattaaaaa tatttttttg tagagacagg 1200 gtctctctat gttgcccagg ctggtttcaa actcccaggc tcaagcaatc ctcctgcctt 1260 gcctcccaaa tgacatcgga ttacaggcgt gagccactga gcctggcccg tattaatgtt 1320 tagaacacga attccaggag gcaggctaag tctattcagc ttgttcatat gcttgggcca 1380 acccaagaaa caagtgggtg acaaatggca ccttttggat agtggtattg actttgaaag 1440 tttgggtcag gagctgggga ggaagggtgg gcaggctgtg ggcagtcctg ggcggaagac 1500 caggcagggc tatgtgctca ctgagcctcc gccctcttcc tttgaatctc tgatagactt 1560 ctgcctccta cttctccttt tctgcccttc tttgctttgg tggcttcctt gtggttcctc 1620 agtggtgcct gcaaccctgg ttcactcttc caggttctgg ctccttccag ccatggctct 1680 cagagtcctt ctgttaacag gtgcatgggg gtggggtggg ggactctggg tggggaggag 1740 ggtaactttt gggtctgtca taaatagagg gccc 1774

Claims (68)

  1. (a) 렌티바이러스gag,pol및rev유전자;
    (b) 사람 세포에서 전이유전자의 검출가능한 전사를 촉진할 정도로 활성인 프로모터의 조절하에 위치하는 전이유전자를 포함하는 발현 카세트 및
    (C) 발현 카세트의 상부에 위치하는 중심 폴리푸린 지역(central polypurine tract; cPPT)을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, cPPT가 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 약 20% 내지 약 80%의 세포를 형질도입시킬 수 있는 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 약 40% 내지 약 80%의 세포를 형질도입시킬 수 있는 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 약 60% 내지 약 80%의 세포를 형질도입시킬 수 있는 벡터.
  6. 제1항에 있어서, cPPT에 인접하여 위치하는 다수의 고유한 클로닝 부위를 추가로 포함하는 벡터.
  7. 제2항에 있어서, 다수의 고유한 클로닝 부위가 cPPT의 상부에 위치하는 벡터.
  8. 제2항에 있어서, 다수의 고유한 클로닝 부위가 cPPT의 하부에 위치하는 벡터.
  9. 제2항에 있어서, 다수의 고유한 클로닝 부위가 cPPT의 상부와 하부 둘다에 위치하는 벡터.
  10. 제1항에 있어서,gag,pol및rev유전자가 HIVgag,pol및rev유전자인 벡터.
  11. 제10항에 있어서,gag,pol및rev유전자가 HIV-1gag,pol및rev유전자인 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 자가-불활성화 벡터(SIN)인 벡터.
  13. 제1항에 있어서, LTR 영역이 3' LTR의 U3 영역에서의 결실로 인해 사실상 전사적으로 불활성화된 벡터.
  14. 제13항에 있어서, U3-R 영역 경계에 대해 -418 내지 -18 위치의 뉴클레오티드가 결실된 벡터.
  15. 제1항에 있어서, 재조합을 통해 야생형 렌티바이러스를 재구성할 수 없는 벡터.
  16. 제15항에 있어서,gag,pol및rev유전자 이외의 기능성 렌티바이러스 유전자를 발현하지 않는 벡터.
  17. 제1항에 있어서, 프로모터가 gp91-phox 프로모터, gp47-phox 프로모터, CD11b 프로모터, EF1-α프로모터, PGK 프로모터, 베타-글로빈 프로모터, MHC II형 프로모터, 응혈 인자 IX 프로모터, 인슐린 프로모터, PDX1 프로모터, CD4 프로모터 또는 CD2 프로모터인 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 프로모터가 gp91-phox 프로모터인 벡터.
  19. 제17항에 있어서, 프로모터가 gp47-phox 프로모터인 벡터.
  20. 제17항에 있어서, 프로모터가 CD11b 프로모터인 벡터.
  21. 제17항에 있어서, 프로모터가 EF1-α프로모터인 벡터.
  22. 제17항에 있어서, 하나 이상의 인핸서 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 인핸서 서열이 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 7로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 벡터.
  24. 제22항에 있어서, 하나 이상의 인핸서 서열이 cPPT에 인접하여 위치하는 벡터.
  25. 제22항에 있어서, 하나 이상의 인핸서 서열이 cPPT의 상부에 위치하는 벡터.
  26. 제24항에 있어서, 하나 이상의 인핸서 서열이 cPPT의 하부에 위치하는 벡터.
  27. 제24항에 있어서, 인핸서 서열이 cPPT의 상부와 하부 둘다에 위치하는 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 인핸서 서열이 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 및 서열 7로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 벡터.
  29. 제1항에 있어서, 프로모터가 약 10 내지 약 200의 시그날 대 노이즈 비로 전이유전자의 발현을 촉진할 수 있는 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 프로모터가 약 40 내지 약 200의 시그날 대 노이즈 비로 전이유전자의 발현을 촉진할 수 있는 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 프로모터가 약 150 내지 약 200의 시그날 대 노이즈 비로 전이유전자의 발현을 촉진할 수 있는 벡터.
  32. 제1항에 있어서, 프로모터가 전사 활성화인자에 반응하여 전이유전자의 발현을 촉진할 수 있는 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 전사 활성화인자가 INF-감마인 벡터.
  34. 제32항에 있어서, 프로모터가 특정 세포형에서 전이유전자의 발현을 촉진할 수 있는 벡터.
  35. 제1항에 있어서, 프로모터가 특정 세포형에서 전이유전자의 발현을 촉진할 수 있는 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 특정 세포형이 성숙한 혈구, 호중구, 단핵구, 과립구, 뉴런, 폐 세포, 근육 세포, 간 세포, 췌장 세포, 내피 세포, 심장 세포, 피부 세포,골수 간질 세포 및 안구 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 벡터.
  37. 제35항에 있어서, 특정 세포형이 성숙한 혈구인 벡터.
  38. 제35항에 있어서, 특정 세포형이 호중구인 벡터.
  39. 제35항에 있어서, 특정 세포형이 단핵구 또는 과립구인 벡터.
  40. 제35항에 있어서, 특정 세포형이 뉴런인 벡터.
  41. 제1항에 있어서, 전이유전자가 gp91-phox, gp47-phox, 에리트로포이에틴, 인터류킨, 콜로니-자극 인자, 인테그린 αIIbβ, 다중약물 내성 유전자, 항바이러스 유전자, 혈액 응고 인자 Ⅷ을 암호화하는 유전자, 혈액 응고 인자 Ⅸ를 암호화하는 유전자, T 세포 항원 수용체, B 세포 항원 수용체, 일본쇄 항체(ScFv), TNF, 감마 인터페론, CTLA4, B7, 멜라나(Melana), MAGE, 마커 유전자, 루시페라제 또는 GFP인 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 전이유전자가 gp91-phox인 벡터.
  43. 제41항에 있어서, 전이유전자가 gp47-phox인 벡터.
  44. 제41항에 있어서, 전이유전자가 마커 유전자를 암호화하는 유전자인 벡터.
  45. 제41항에 있어서, 전이유전자가 GFP를 암호화하는 유전자인 벡터.
  46. 제1항에 있어서, 전이유전자의 발현을 촉진하도록 위치하는 전사후 조절 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  47. 제46항에 있어서, 전사후 조절 서열이 발현 카세트내에 위치하는 인트론인 벡터.
  48. 제47항에 있어서, 인트론이 벡터 게놈 전사체와 반대 배향으로 위치하는 벡터.
  49. 제46항에 있어서, 전사후 조절 서열이 전사후 조절 요소인 벡터.
  50. 제49항에 있어서, 전사후 조절 요소가 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)인 벡터.
  51. 제50항에 있어서, 전사후 조절 요소가 B형 간염 바이러스 전사후 조절요소(HPRE)인 벡터.
  52. 제1항에 따른 벡터로 형질도입된 숙주 세포.
  53. 제52항에 있어서, 바이러스 생산 세포인 형질도입된 숙주 세포.
  54. 제53항에 있어서, 바이러스 생산 세포가 293T 세포인 형질도입된 숙주 세포.
  55. 제54항에 있어서, 사람 조혈 전구세포인 형질도입된 숙주 세포.
  56. 제55항에 있어서, 사람 조혈 전구세포가 CD34+세포인 형질도입된 숙주 세포.
  57. (a) 렌티바이러스gag,pol및rev유전자;
    (b) 전사 활성화인자와 접촉시에 사람 세포에서 전이유전자의 검출가능한 전사를 촉진할 정도로 활성인 프로모터의 조절하에 위치하는 전이유전자를 포함하는 발현 카세트;
    (C) 발현 카세트의 상부에 위치하는 중심 폴리푸린 지역(cPPT) 및
    (d) 전이유전자의 발현을 촉진하도록 위치하는 전사후 조절 요소를 포함하는자가-불활성화 재조합 렌티바이러스 벡터.
  58. (a) 렌티바이러스gag,pol및rev유전자;
    (b) 특정한 사람 세포형의 세포에서 전이유전자의 검출가능한 전사를 촉진할 정도로 활성인 프로모터의 조절하에 위치하는 전이유전자를 포함하는 발현 카세트;
    (C) 발현 카세트의 상부에 위치하는 중심 폴리푸린 지역(cPPT) 및
    (d) 전이유전자의 발현을 촉진하도록 위치하는 전사후 조절 요소를 포함하는 자가-불활성화 재조합 렌티바이러스 벡터.
  59. (a) 렌티바이러스gag,pol및rev유전자;
    (b) (i) 특정한 사람 세포형의 세포에서 전이유전자의 검출가능한 전사를 촉진할 정도로 활성이고 (ii) 전사 활성화인자와 접촉시에 특정한 사람 세포형의 세포에서 전이유전자의 검출가능한 전사를 촉진할 정도로 활성인 프로모터의 조절하에 위치하는 전이유전자를 포함하는 발현 카세트;
    (C) 발현 카세트의 상부에 위치하는 중심 폴리푸린 지역(cPPT) 및
    (d) 전이유전자의 발현을 촉진하도록 위치하는 전사후 조절 요소를 포함하는 자가-불활성화 재조합 렌티바이러스 벡터.
  60. (a) 렌티바이러스gag,pol및rev유전자;
    (b) (i) 특정한 사람 세포형의 세포에서 전이유전자의 검출가능한 전사를 촉진할 정도로 활성이고, (ii) 전사 활성화인자와 접촉시에 특정한 사람 세포형의 세포에서 전이유전자의 검출가능한 전사를 촉진할 정도로 활성인 프로모터의 조절하에 위치하는 전이유전자를 포함하는 발현 카세트;
    (C) 발현 카세트의 상부에 위치하는 중심 폴리푸린 지역(cPPT);
    (d) 전이유전자의 발현을 촉진하도록 위치하는 전사후 조절 요소 및
    (e) 하나 이상의 인핸서 요소를 포함하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터.
  61. 조혈 줄기 세포를 포함하는 사람 세포 집단을, 이러한 집단내의 사람 조혈 전구세포가 제1항에 따른 벡터에 의해 형질도입되도록 하는 조건하에 상기 제1항에 따른 벡터와 접촉시킴을 포함하는, 사람 조혈 줄기 세포의 형질도입 방법.
  62. 제61항에 있어서, 사람 조혈 줄기세포 집단이 CD34+세포를 포함하는 방법.
  63. 제61항에 있어서, 세포 집단이 줄기세포 다능성(pluripotency)의 실질적인 상실 없이 세포 증식을 촉진하도록 처리되는 방법.
  64. 제61항에 있어서, 줄기세포가 생체내에서 형질도입되는 방법.
  65. 제61항에 있어서, 줄기세포가 시험관내에서 형질도입되는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 형질도입된 줄기세포가 사람 피험자에게 주입되는 방법.
  67. 사람 세포를 제61항에 따른 방법으로 형질도입시키는 단계 및 목적하는 세포형의 성숙을 제공하는 단계를 포함하여, 제한된 세트의 세포형에서 전이유전자를 발현시키는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 프로모터와 전사 활성화인자를 접촉시킴으로써 전이유전자의 발현을 자극하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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