CN109971787A

CN109971787A - 一种cybb慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109971787A
Application number: CN201910310154.3A
Authority: CN
Inventors: 王硕
Original assignee: Beijing American Kinge Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing American Kinge Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2019-07-05
Also published as: EP3956458A4; US20220177919A1; JP2022529271A; WO2020211828A1; GB202115560D0; EP3956458A1; JP7278656B2; GB2597161A

Abstract

本发明提供了一种CYBB慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用，所述慢病毒载体包括hEF1α启动子和CYBB串联共表达。本发明的慢病毒载体携带CYBB基因，在hEF1α启动子的启动下，实现了携带的CYBB基因在已分化或未分化的干细胞中的安全高效表达，同时，干细胞作为潜在的传送载体，提高了CYBB基因在转基因细胞中的表达量。

Description

一种CYBB慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用，具体涉及一种CYBB慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用。

背景技术

慢性肉芽肿病(CGD)是一种NADPH氧化酶在中性粒细胞(neutrophilicgranulocytes)和单核细胞(monocytes)中功能缺失而引起的遗传性原发免疫缺陷病，其特点是病人会发生反复感染、炎症及自身免疫。NADPH氧化酶由p47phox、p40phox、p67phox和qp91-phox组成，其中任何一部分功能缺失均会引发CGD。该病多数为性联隐性遗传，少数为常染色体隐性遗传，常有家族史，多见于儿童。其中较常见的是细胞色素b的qp91-phox亚单位基因突变，病人数约占总病人的65％。突变的基因被命名为CYBB(MIM306400)，含有13个外显子，位于X染色体xp21.1，约占30kb。

NADPH氧化酶复合物由膜结合蛋白和细胞质蛋白组成，它们在吞噬细胞活化时具有协同作用，协助产生活性氧(ROS)杀灭细菌和真菌。通常情况下，正常粒细胞吞噬细菌后脱颗粒产生过氧化氢，释放新生态氧，使碘、氯化合物氧化为游离的碘和氯，形成完整的过氧化氢-过氧化物酶-碘离子杀菌系统。而CGD患者缺乏NADPH氧化酶而不能产生过氧化氢，无法发挥体内的杀菌作用，由此造成全身各部位反复发生脓性感染，导致化脓性淋巴结炎、鼻炎、鼻窦炎以及心包、肺、肝神经系统等化脓性炎症。患者可表现为皮肤肉芽肿，湿疹性皮炎，肝、脾大，同时在各受累器官可见含有色素脂类的组织细胞形成的肉芽肿，患者多数在年轻时期死于重度感染。[参考文献7]

目前，能完全治愈CGD的唯一手段是接受造血干细胞移植。然而，找到适合配型的供者只是其中一个问题。移植预处理的剂量，移植时患者的感染情况，移植後GVHD的控制，以及CGD患者移植後免疫重建的能力都是影响移植成功与否的关键[参考文献8]。

由于CGD为单一基因突变导致的疾病，因此基因治疗成为治愈的另外一种可能性。目前国内外有许多应用病毒载体进行基因治疗的研究报道，然而不同的病毒载体、甚至相同的病毒载体由于制备方法的不同，往往具有差异明显的基因传递效率，直接影响了疾病的治疗效果。现在大多数针对遗传性疾病的细胞治疗方法存在效率过低的问题，且这些方法仅适用于血液干细胞，临床效果达不到预期[参考文献8]。

在韩国进行的一二期临床试验使用反转录病毒作为载体，虽然没有明显副作用，然而基因修改细胞在患者体内无法长期存在[参考文献9]。Ravin等采用CRISPR-Cas9修复CGD患者的突变CYBB基因，然而CRISPR-Cas9系统具有靶向性问题，存在安全隐患，且该方法条件严苛，建立成本高，结果不稳定[参考文献10]。

慢病毒载体介导的自体干细胞基因治疗已经成功应用于X染色体连锁重度免疫缺陷综合征(X-linked severe combined immunodeficiency，X-SCID)、β-地中海贫血(β-thalassemia)、镰刀状细胞贫血症(sickle cell disease，SCD)等疾病的治疗。虽然从90年代以来，已经尝试将腺病毒载体应用于血友病的基因治疗，然而迄今为止尚无一项动物实验得到凝血因子终生持续表达的阳性结果报告，其难度可归咎于载体引起的免疫反应、外源基因不能持续高效表达以及外源基因不能在适当区域表达等方面。近10年的临床基因治疗方法多采用反转录病毒载体(gamma-oncoretroviral vector)，其病毒特性为嵌合插入致癌基因的启动子区域，具有启动沉默机制，安全性堪虑，无法长期表达。

因此，急需一种基因传递效率高、适用于多种干细胞的病毒载体，提高CGD的治疗效果。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种CYBB慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用，所述慢病毒载体中的hEF1α启动子启动CGD相关基因CYBB的表达，安全性好，基因传递效率高，为提高CGD的治疗效果奠定了基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括hEF1α启动子和CYBB串联共表达。

本发明中，在hEF1α启动子的启动下，携带CYBB基因的慢病毒载体在保障安全性的同时实现了高效的基因传递，有利于提高转基因细胞中CYBB基因的表达量。

优选地，所述hEF1α启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述SEQ ID NO.1的核酸序列为：

gctagcatgcctaggtcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcgaggatccacc.

优选地，所述CYBB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SEQ ID NO.2的氨基酸序列为：

MGNWAVNEGLSIFVILVWLGLNVFLFVWYYRVYDIPPKFFYTRKLLGSALALARAPAACLNFNCMLILLPVCRNLLSFLRGSSACCSTRVRRQLDRNLTFHKMVAWMIALHSAIHTIAHLFNVEWCVNARVNNSDPYSVALSELGDRQNESYLNFARKRIKNPEGGLYLAVTLLAGITGVVITLCLILIITSSTKTIRRSYFEVFWYTHHLFVIFFIGLAIHGAERIVRGQTAESLAVHNITVCEQKISEWGKIKECPIPQFAGNPPMTWKWIVGPMFLYLCERLVRFWRSQQKVVITKVVTHPFKTIELQMKKKGFKMEVGQYIFVKCPKVSKLEWHPFTLTSAPEEDFFSIHIRIVGDWTEGLFNACGCDKQEFQDAWKLPKIAVDGPFGTASEDVFSYEVVMLVGAGIGVTPFASILKSVWYKYCNNATNLKLKKIYFYWLCRDTHAFEWFADLLQLLESQMQERNNAGFLSYNIYLTGWDESQANHFAVHHDEEKDVITGLKQKTLYGRPNWDNEFKTIASQHPNTRIGVFLCGPEALAETLSKQSISNSESGPRGVHFIFNKENF.

优选地，所述CYBB的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述SEQ ID NO.3的核酸序列为：

atggggaactgggctgtgaatgaggggctctccatttttgtcattctggtttggctggggttgaacgtcttcctctttgtctggtattaccgggtttatgatattccacctaagttcttttacacaagaaaacttcttgggtcagcactggcactggccagggcccctgcagcctgcctgaatttcaactgcatgctgattctcttgccagtctgtcgaaatctgctgtccttcctcaggggttccagtgcgtgctgctcaacaagagttcgaagacaactggacaggaatctcacctttcataaaatggtggcatggatgattgcacttcactctgcgattcacaccattgcacatctatttaatgtggaatggtgtgtgaatgcccgagtcaataattctgatccttattcagtagcactctctgaacttggagacaggcaaaatgaaagttatctcaattttgctcgaaagagaataaagaaccctgaaggaggcctgtacctggctgtgaccctgttggcaggcatcactggagttgtcatcacgctgtgcctcatattaattatcacttcctccaccaaaaccatccggaggtcttactttgaagtcttttggtacacacatcatctctttgtgatcttcttcattggccttgccatccatggagctgaacgaattgtacgtgggcagaccgcagagagtttggctgtgcataatataacagtttgtgaacaaaaaatctcagaatggggaaaaataaaggaatgcccaatccctcagtttgctggaaaccctcctatgacttggaaatggatagtgggtcccatgtttctgtatctctgtgagaggttggtgcggttttggcgatctcaacagaaggtggtcatcaccaaggtggtcactcaccctttcaaaaccatcgagctacagatgaagaagaaggggttcaaaatggaagtgggacaatacatttttgtcaagtgcccaaaggtgtccaagctggagtggcacccttttacactgacatccgcccctgaggaagacttctttagtatccatatccgcatcgttggggactggacagaggggctgttcaatgcttgtggctgtgataagcaggagtttcaagatgcgtggaaactacctaagatagcggttgatgggccctttggcactgccagtgaagatgtgttcagctatgaggtggtgatgttagtgggagcagggattggggtcacacccttcgcatccattctcaagtcagtctggtacaaatattgcaataacgccaccaatctgaagctcaaaaagatctacttctactggctgtgccgggacacacatgcctttgagtggtttgcagatctgctgcaactgctggagagccagatgcaggaaaggaacaatgccggcttcctcagctacaacatctacctcactggctgggatgagtctcaggccaatcactttgctgtgcaccatgatgaggagaaagatgtgatcacaggcctgaaacaaaagactttgtatggacggcccaactgggataatgaattcaagacaattgcaagtcaacaccctaataccagaataggagttttcctctgtggacctgaagccttggctgaaaccctgagtaaacaaagcatctccaactctgagtctggccctcggggagtgcatttcattttcaacaaggaaaacttctaa.

第二方面，本发明提供了一种慢病毒，所述慢病毒导入有如第一方面所述的慢病毒载体。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有如第二方面所述的慢病毒。

优选地，所述宿主细胞包括干细胞。

本发明的干细胞作为传送载体，运输携带CYBB基因的慢病毒载体，提高了CYBB基因在已分化或未分化的干细胞中的表达效率和表达量。

优选地，所述干细胞包括造血干细胞。

根据本发明，造血干细胞来源于血液或者骨髓，具有分化成为一系列体细胞以及更新各种组织细胞的能力。本发明的造血干细胞作为潜在的运输工具，携带含有CYBB基因的慢病毒实现对CGD的基因治疗。

第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述宿主细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建如第一方面所述的慢病毒载体；

(2)将步骤(1)所述的慢病毒载体与包装质粒共转染哺乳细胞，进行慢病毒包装；

(3)将步骤(2)包装的慢病毒转化入宿主细胞基因组，得到所述宿主细胞。

优选地，步骤(1)所述构建的方法为将hEF1α启动子和CYBB经限制性酶切位点连接入TYF慢病毒载体。

优选地，步骤(2)所述包装质粒包括pNHP和pHEF-VSVG。

优选地，步骤(2)所述哺乳细胞包括293T细胞。

优选地，在步骤(2)之后还包括纯化慢病毒的步骤。

优选地，所述纯化为将慢病毒经过过滤浓缩成为高效价病毒。

本发明中，纯化、过滤和浓缩步骤显著提高了慢病毒的效价和浓度。

优选地，步骤(3)所述宿主细胞包括干细胞。

优选地，所述干细胞包括造血干细胞。

作为优选技术方案，本发明提供了一种如第三方面所述宿主细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将hEF1α启动子和CYBB经限制性酶切连接入TYF慢病毒载体，进行载体构建；

(2)将步骤(1)所述的慢病毒载体与pNHP和pHEF-VSVG包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒包装，将包装后的慢病毒在1000～1100g下离心3～5min去除细胞碎片，得到的上清液采用0.45～0.5μm低蛋白结合过滤器过滤，在2000～2500g下离心30～40min，震荡过滤管，300～400g离心2～5min；

(3)将步骤(2)所述慢病毒转化入造血干细胞基因组，得到所述造血干细胞。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的慢病毒或如第三方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

本发明的药物组合物从基因水平上修复CGD患者的突变CYBB基因，有利于实现对患者自体干细胞的修复，具有长期稳定治疗CGD的潜能。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的慢病毒、如第三方面所述的宿主细胞或如第五方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括慢性肉芽肿病。

第七方面，本发明提供了一种采用如第一方面所述的慢病毒载体、如第二方面所述的慢病毒、如第三方面所述的宿主细胞或如第五方面所述的药物组合物治疗慢性肉芽肿病的方法。

根据本发明，所述方法包括以下步骤：

(1’)患者经粒细胞集落刺激因子动员CD34干细胞，并进行多次骨髓采集；

(2’)实验室方面于回输前从患者采集的骨髓中分离CD34阳性细胞并培养；

(3’)回输前临床上对患者进行预处理；

(4’)实验室方面于回输前采用携带有CYBB基因的慢病毒感染CD34细胞，进行两次基因转导，进行细胞培养；

(5’)回输当天，对细胞进行清洗、悬浮后，回输患者；

(6’)回输患者后，每个星期进行随访追踪，收集患者外周血，检测氧化酶功能，免疫细胞比例和基因拷贝数。

优选地，步骤(3’)所述预处理采用白消安40毫克每公斤体重和氟达拉滨60毫克每平方米身体表面积进行。

优选地，步骤(5’)所述清洗采用含有1％人类血清蛋白的生理盐水清洗细胞两遍。

优选地，步骤(5’)所述悬浮采用含有2.5％人类血清蛋白的生理盐水。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的慢病毒载体在hEF1α启动子的启动下，实现了携带的CYBB基因在已分化或未分化的干细胞中的安全高效表达；

(2)本发明中，采用携带CYBB基因的慢病毒转染干细胞，实现了患者自体干细胞的高效修复，同时，干细胞作为潜在的传送载体，提高了CYBB基因在转基因细胞中的表达量；

(3)本发明将转染有CYBB慢病毒的干细胞回输入患者体内，患者的单核细胞和中性粒细胞中的氧化酶表达量得到显著提高，表达氧化酶的中性粒细胞数量和单核细胞数量能够维持较高水平，CYBB基因在外周血细胞中稳定性好，达到了长期稳定治疗慢性肉芽肿病的效果，安全性高，该方法在治疗慢性肉芽肿病上具有应用潜能。

附图说明

图1为慢病毒载体构成示意图，其中，Lentiviral Vector-慢病毒载体，PackagingPlasmids-包装质粒，Transducing Lentivector-基因传送慢病毒载体；

图2治疗流程图；

图3(a)为患者的正常基因型父亲的外周血分析，图3(b)为患者的杂合子母亲的外周血分析，图3(c)为患者回输前外周血分析，图3(d)为患者接受治疗后第28天的外周血分析；

图4(a)为罗丹明123染色的平均荧光强度倍数，图4(b)为发出荧光的中性粒细胞的比例；

图5(a)为回输后CD45阳性细胞中的中性粒细胞的数量，图5(b)为回输后CD45阳性细胞中的单核细胞的数量；

图6为患者回输后外周血中CYBB基因拷贝数的变化；

图7为患者回输前后的肺部CT扫描影像。

具体实施方式

本发明主要为对慢病毒的结构及生产方法的改进，为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1携带CYBB基因的慢病毒载体的构建

通过全基因合成正常CYBB基因序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核酸序列如SEQ ID NO.3所示)经限制性酶切位点连接入TYF-EF1α慢病毒载体(NHP/TYF lentivirusvector system)中，位于人类EF1α(hEF1α)启动子序列(核酸序列如SEQ ID NO.1所示)后，通过测序和双酶切(5’在BamHI位点克隆，3’在SpeI位点克隆，最佳反应条件参照NEB原厂建议)等方式对获得的产物进行鉴定，获得正确连接的hEF1α启动下携带CYBB基因的慢病毒载体。如图1所示为NHP/TYF慢病毒载体系统，包括病毒包装质粒(NHP，EF-VSV-G)和载体质粒(pTYF-EF-CYBB)，其中，包装质粒包括pNHP和pHEF-VSV-G(env)，pNHP表达Gag-Pol蛋白，pHEF-VSV-G表达外套蛋白，基因传送质粒pTYF-EF的5’端带有嵌合CMV-IE启动子，结合HIV-1病毒TAR-突变U5加上右端附属序列(CMV-IE-TAR-dl.U5/attR)，后面接带有引物结合位点(primer binding site，PBS)与慢病毒载体包装信号(psi)和突变gag序列。EF1a-CYBB后面接有突变的3’LTR(self-inactivating SIN LTR)，polypurine track序列(PPT)，左端附着位点(attachment site，attL)，以及牛的生长因子polyA信号(bovine growth hormonepolyA，bGHpA)。详细介绍见参考文献[1]-[3]。

实施例2慢病毒包装

本实施例采用多质粒包装系统，将携带CYBB基因的慢病毒载体经293T细胞包装成为完整的慢病毒。具体步骤为：

(1)将293T细胞株培养17-18小时，加入新鲜的DMEM，内含10％的FBS；

(2)在无菌离心管中依次加入DMEM、pNHP、pHEF-VSV-G和实施例1构建的慢病毒载体，漩涡振荡；

(3)将Superfect转染试剂(QIAGEN)加入离心管，室温静置7-10min；

(4)将离心管中的慢病毒载体-Superfect混合液逐滴加入至293T细胞中，漩涡打匀，37℃、5％CO₂培养4-5小时；

(5)去除细胞培养液，冲洗细胞，并加入培养液继续培养；

(6)将培养基放回5％CO₂培养箱中培养过夜，后续用荧光显微镜观察转染效率。

实施例3慢病毒的纯化与浓缩

慢病毒的纯化与浓缩过程，具体为：

(1)慢病毒纯化

将包装后的慢病毒在1000g下离心5min去除细胞碎片，得到的上清液采用0.45μm低蛋白结合过滤器过滤，分装后储存在-80℃下；

(2)慢病毒浓缩

将慢病毒上清液加入Centricon过滤管中，2500g下离心30min；震荡过滤管，400g离心2min，收集浓缩的病毒到收集杯中。

实施例4慢病毒的纯化与浓缩

慢病毒的纯化与浓缩过程，具体为：

(1)慢病毒纯化

将包装后的慢病毒在1100g下离心3min去除细胞碎片，得到的上清液采用0.5μm低蛋白结合过滤器过滤，分装后储存在-80℃下；

(2)慢病毒浓缩

将慢病毒上清液加入Centricon过滤管中，2000g下离心40min；震荡过滤管，300g离心5min，收集浓缩的病毒到收集杯中。

实施例5慢病毒转染造血细胞

将造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)接种到培养皿中，加入浓缩的携带有CYBB目标基因的慢病毒，以100g离心100min，置于37℃培养24h，加入含有干细胞生长因子的培养基，培养2-3天后，得到携带有正常CYBB基因的干细胞。

实施例6携带CYBB基因的慢病毒感染CD34干细胞治疗X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)患者

如图2所示为治疗流程图。

(1)患者经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员CD34干细胞，并进行两次骨髓采集，第一次于回输前第37天，第二次于回输前第4天。由于CGD患者对于动员的反应普遍较差，两次骨髓采集有利于得到足量的CD34干细胞[参考文献4]；

(2)实验室方面于回输前第4天，从患者两次采集的骨髓中分离CD34阳性细胞(Miltenyi CD34beads)，并以HSC培养液(Sigma Stemline II HSC expansion medium)培养一夜；

(3)回输前第3天及第2天，临床上分别采用白消安40毫克每公斤体重(busulfan40mg/kg)和氟达拉滨60毫克每平方米身体表面积(fludarabine 60mg/m²)对患者进行预处理。根据文献显示，适当的预处理能够有效延长转基因CD34干细胞在患者体内的存续[参考文献5]；

(4)实验室方面于回输前第3天及第2天，采用携带有CYBB基因的慢病毒感染CD34细胞，进行两次基因转导，之后将感染完成的细胞培养一天；

(5)回输当天，采用含有1％人类血清蛋白的生理盐水清洗细胞两遍，将细胞悬浮于含有2.5％人类血清蛋白的生理盐水中并回输患者；

(6)回输患者后，每个星期进行随访追踪，收集患者外周血，检测氧化酶功能，免疫细胞比例和基因拷贝数。

结果分析

将采集的外周血进行二氢罗丹明123(DHR123)染色实验并加染CD14及CD15，采用流式细胞仪分析外周血中中性粒细胞和单核细胞内的氧化酶功能，这两种细胞主要利用氧化酶来执行免疫功能。二氢罗丹明123受过氧化氢氧化为罗丹明123，被488nm镭射激发后，发出515nm的黄绿色荧光。将二氢罗丹明123与受佛波酯(PMA)刺激的细胞共同培养后，荧光强度便代表氧化酶功能强度[参考文献6]。

图3(a)为患者的正常基因型父亲的外周血分析，单核细胞(CD14+)和中性粒细胞(CD15+)表达的氧化酶的比例大于90％；图3(b)为患者的杂合子母亲的外周血分析，70％的单核细胞表达氧化酶，57％的中性粒细胞表达氧化酶，均略低于健康人的比例；图3(c)为患者回输前外周血分析，可以看出，患者于治疗前完全不表达氧化酶；图3(d)为患者接受治疗后第28天，外周血中35％的单核细胞表达氧化酶，47％的中性粒细胞表达氧化酶，与回输前比较，有大幅的提高。

X连锁慢性肉芽肿病主要是由于中性粒细胞中氧化酶缺陷所致，回输后每周观察中性粒细胞中氧化酶的功能强度及表达程度，结果如图5所示。图4(a)显示罗丹明123染色的平均荧光强度倍数，此倍数是将经佛波酯(PMA)刺激的细胞的平均荧光强度除以未经佛波酯刺激的细胞的平均荧光强度，也就是细胞受刺激后的氧化酶的功能强度。接受治疗前，患者的比值为1.08，细胞接受刺激后几乎没有氧化酶的反应，接受治疗后，氧化酶的功能随时间有所波动，但整体得到提升，其中以回输后第28天及第73天为最高，分别达到1.44倍及1.62倍；图4(b)为发出荧光的中性粒细胞的比例，即表达氧化酶的中性粒细胞的比例，回输前患者未表达任何氧化酶，回输后第28天及第73天，患者分别有47％及66％中性粒细胞表达氧化酶，而自回输后第49天开始，表达氧化酶的细胞比例一直维持在20％以上(其中回输后第7天，患者接受输血治疗，不予讨论)。

由于患者回输前经过清髓预处理，发明人在患者回输后持续监测其CD45阳性细胞中的中性粒细胞和单核细胞的数量。如图5(a)所示，回输后第14天，中性粒细胞数到达最低点，仅为CD45阳性细胞的0.2％，相较于中性粒细胞维持在60％的正常基因型父亲，明显受到清髓预处理的影响，但14天之后，中性粒细胞百分比逐渐回升，至回输后第49天已经恢复到健康人的正常比例，并持续维持到最新一次随访，即回输后第103天；如图5(b)所示，回输后第7天，单核细胞数到达最低点，仅为CD45阳性细胞的2％。

图6显示患者回输后，外周血中CYBB基因拷贝数的变化。回输后第21天及第35天，拷贝数分别达到3.75％及2.41％，为监测到的最高值。由此可知，CYBB基因在外周血细胞中稳定存在，直至回输后第103天，仍然有0.23％外周血细胞中携带有CYBB基因。

除了分子学及细胞学上的证据，患者的临床感染症状也有大幅改善。图7显示患者回输前后的肺部CT扫描影像。患者于回输前第39天，肺部有严重感染，并以抗真菌药物和抗细菌药物辅助治疗；回输后第55天，肺部感染情况有明显好转；回输后第105天，肺部感染已经缓解，且无需重度药物支持。

综上所述，本发明的慢病毒载体在EF1α启动子的启动下，实现了CYBB基因的高效传递；采用携带CYBB基因的慢病毒转染干细胞，并共同作为CGD疾病治疗的传递载体，使CYBB基因在已分化或未分化的干细胞中表达量增高；采用携带CYBB基因的慢病毒感染CD34干细胞，对X-CGD具有治疗潜能。

参考文献：

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[5]Manuel Grez,Janine Reichenbach,Joachim Reinhard Seger,Mary C Dinauer,and Adrian J Thrasher.(2011)Gene Therapy of ChronicGranulomatous Disease:The Engraftment Dilemma.Molecular Therapy 19,28-35.

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申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 北京美康基免生物科技有限公司

<120> 一种CYBB慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用

<130> 20190404

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1536

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

gctagcatgc ctaggtcgac caattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttgg 60

agctaagcca gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg gcctccccgt 120

caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa aaggactcgc 180

ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag aacccagaga 240

tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg gagaagagca 300

tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa 360

gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aagtggcgcg gggtaaactg 420

ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat 480

aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacaggt 540

aagtgccgtg tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc cttgcgtgcc 600

ttgaattact tccacgcccc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg 660

gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag 720

ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct 780

gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc 840

tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg 900

tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc 960

ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg 1020

ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc 1080

ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct 1140

caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa 1200

gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca 1260

ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt 1320

tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc 1380

acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca 1440

agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga aaactctaga 1500

gcggccgcgg aggccgaatt ccgtcgagga tccacc 1536

<210> 2

<211> 570

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 2

Met Gly Asn Trp Ala Val Asn Glu Gly Leu Ser Ile Phe Val Ile Leu

1 5 10 15

Val Trp Leu Gly Leu Asn Val Phe Leu Phe Val Trp Tyr Tyr Arg Val

20 25 30

Tyr Asp Ile Pro Pro Lys Phe Phe Tyr Thr Arg Lys Leu Leu Gly Ser

35 40 45

Ala Leu Ala Leu Ala Arg Ala Pro Ala Ala Cys Leu Asn Phe Asn Cys

50 55 60

Met Leu Ile Leu Leu Pro Val Cys Arg Asn Leu Leu Ser Phe Leu Arg

65 70 75 80

Gly Ser Ser Ala Cys Cys Ser Thr Arg Val Arg Arg Gln Leu Asp Arg

85 90 95

Asn Leu Thr Phe His Lys Met Val Ala Trp Met Ile Ala Leu His Ser

100 105 110

Ala Ile His Thr Ile Ala His Leu Phe Asn Val Glu Trp Cys Val Asn

115 120 125

Ala Arg Val Asn Asn Ser Asp Pro Tyr Ser Val Ala Leu Ser Glu Leu

130 135 140

Gly Asp Arg Gln Asn Glu Ser Tyr Leu Asn Phe Ala Arg Lys Arg Ile

145 150 155 160

Lys Asn Pro Glu Gly Gly Leu Tyr Leu Ala Val Thr Leu Leu Ala Gly

165 170 175

Ile Thr Gly Val Val Ile Thr Leu Cys Leu Ile Leu Ile Ile Thr Ser

180 185 190

Ser Thr Lys Thr Ile Arg Arg Ser Tyr Phe Glu Val Phe Trp Tyr Thr

195 200 205

His His Leu Phe Val Ile Phe Phe Ile Gly Leu Ala Ile His Gly Ala

210 215 220

Glu Arg Ile Val Arg Gly Gln Thr Ala Glu Ser Leu Ala Val His Asn

225 230 235 240

Ile Thr Val Cys Glu Gln Lys Ile Ser Glu Trp Gly Lys Ile Lys Glu

245 250 255

Cys Pro Ile Pro Gln Phe Ala Gly Asn Pro Pro Met Thr Trp Lys Trp

260 265 270

Ile Val Gly Pro Met Phe Leu Tyr Leu Cys Glu Arg Leu Val Arg Phe

275 280 285

Trp Arg Ser Gln Gln Lys Val Val Ile Thr Lys Val Val Thr His Pro

290 295 300

Phe Lys Thr Ile Glu Leu Gln Met Lys Lys Lys Gly Phe Lys Met Glu

305 310 315 320

Val Gly Gln Tyr Ile Phe Val Lys Cys Pro Lys Val Ser Lys Leu Glu

325 330 335

Trp His Pro Phe Thr Leu Thr Ser Ala Pro Glu Glu Asp Phe Phe Ser

340 345 350

Ile His Ile Arg Ile Val Gly Asp Trp Thr Glu Gly Leu Phe Asn Ala

355 360 365

Cys Gly Cys Asp Lys Gln Glu Phe Gln Asp Ala Trp Lys Leu Pro Lys

370 375 380

Ile Ala Val Asp Gly Pro Phe Gly Thr Ala Ser Glu Asp Val Phe Ser

385 390 395 400

Tyr Glu Val Val Met Leu Val Gly Ala Gly Ile Gly Val Thr Pro Phe

405 410 415

Ala Ser Ile Leu Lys Ser Val Trp Tyr Lys Tyr Cys Asn Asn Ala Thr

420 425 430

Asn Leu Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Phe Tyr Trp Leu Cys Arg Asp Thr

435 440 445

His Ala Phe Glu Trp Phe Ala Asp Leu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gln

450 455 460

Met Gln Glu Arg Asn Asn Ala Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Ile Tyr Leu

465 470 475 480

Thr Gly Trp Asp Glu Ser Gln Ala Asn His Phe Ala Val His His Asp

485 490 495

Glu Glu Lys Asp Val Ile Thr Gly Leu Lys Gln Lys Thr Leu Tyr Gly

500 505 510

Arg Pro Asn Trp Asp Asn Glu Phe Lys Thr Ile Ala Ser Gln His Pro

515 520 525

Asn Thr Arg Ile Gly Val Phe Leu Cys Gly Pro Glu Ala Leu Ala Glu

530 535 540

Thr Leu Ser Lys Gln Ser Ile Ser Asn Ser Glu Ser Gly Pro Arg Gly

545 550 555 560

Val His Phe Ile Phe Asn Lys Glu Asn Phe

565 570

<210> 3

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

atggggaact gggctgtgaa tgaggggctc tccatttttg tcattctggt ttggctgggg 60

ttgaacgtct tcctctttgt ctggtattac cgggtttatg atattccacc taagttcttt 120

tacacaagaa aacttcttgg gtcagcactg gcactggcca gggcccctgc agcctgcctg 180

aatttcaact gcatgctgat tctcttgcca gtctgtcgaa atctgctgtc cttcctcagg 240

ggttccagtg cgtgctgctc aacaagagtt cgaagacaac tggacaggaa tctcaccttt 300

cataaaatgg tggcatggat gattgcactt cactctgcga ttcacaccat tgcacatcta 360

tttaatgtgg aatggtgtgt gaatgcccga gtcaataatt ctgatcctta ttcagtagca 420

ctctctgaac ttggagacag gcaaaatgaa agttatctca attttgctcg aaagagaata 480

aagaaccctg aaggaggcct gtacctggct gtgaccctgt tggcaggcat cactggagtt 540

gtcatcacgc tgtgcctcat attaattatc acttcctcca ccaaaaccat ccggaggtct 600

tactttgaag tcttttggta cacacatcat ctctttgtga tcttcttcat tggccttgcc 660

atccatggag ctgaacgaat tgtacgtggg cagaccgcag agagtttggc tgtgcataat 720

ataacagttt gtgaacaaaa aatctcagaa tggggaaaaa taaaggaatg cccaatccct 780

cagtttgctg gaaaccctcc tatgacttgg aaatggatag tgggtcccat gtttctgtat 840

ctctgtgaga ggttggtgcg gttttggcga tctcaacaga aggtggtcat caccaaggtg 900

gtcactcacc ctttcaaaac catcgagcta cagatgaaga agaaggggtt caaaatggaa 960

gtgggacaat acatttttgt caagtgccca aaggtgtcca agctggagtg gcaccctttt 1020

acactgacat ccgcccctga ggaagacttc tttagtatcc atatccgcat cgttggggac 1080

tggacagagg ggctgttcaa tgcttgtggc tgtgataagc aggagtttca agatgcgtgg 1140

aaactaccta agatagcggt tgatgggccc tttggcactg ccagtgaaga tgtgttcagc 1200

tatgaggtgg tgatgttagt gggagcaggg attggggtca cacccttcgc atccattctc 1260

aagtcagtct ggtacaaata ttgcaataac gccaccaatc tgaagctcaa aaagatctac 1320

ttctactggc tgtgccggga cacacatgcc tttgagtggt ttgcagatct gctgcaactg 1380

ctggagagcc agatgcagga aaggaacaat gccggcttcc tcagctacaa catctacctc 1440

actggctggg atgagtctca ggccaatcac tttgctgtgc accatgatga ggagaaagat 1500

gtgatcacag gcctgaaaca aaagactttg tatggacggc ccaactggga taatgaattc 1560

aagacaattg caagtcaaca ccctaatacc agaataggag ttttcctctg tggacctgaa 1620

gccttggctg aaaccctgag taaacaaagc atctccaact ctgagtctgg ccctcgggga 1680

gtgcatttca ttttcaacaa ggaaaacttc taa 1713

Claims

1.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括hEF1α启动子和CYBB串联共表达。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述hEF1α启动子的核酸序列如SEQID NO.1所示；

优选地，所述CYBB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述CYBB的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒导入有如权利要求1或2所述的慢病毒载体。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转染有如权利要求3所述的慢病毒；

优选地，所述宿主细胞包括干细胞；

优选地，所述干细胞包括造血干细胞。

5.一种如权利要求4所述宿主细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)构建如权利要求1或2所述的慢病毒载体；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法为将hEF1α启动子和CYBB经限制性酶切接入TYF慢病毒载体；

优选地，步骤(2)所述包装质粒包括pNHP和pHEF-VSVG；

优选地，步骤(2)所述哺乳细胞包括293T细胞。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后还包括纯化慢病毒的步骤；

优选地，所述纯化为将慢病毒过滤与离心浓缩；

优选地，步骤(3)所述宿主细胞包括干细胞；

优选地，所述干细胞包括造血干细胞。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将hEF1α启动子和CYBB经限制性酶切位点连接入TYF慢病毒载体，进行载体构建；

(2)将步骤(1)所述的慢病毒载体与pNHP和pHEF-VSVG包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒包装，将包装后的慢病毒纯化后获得浓缩的慢病毒；

(3)将步骤(2)得到的慢病毒转化入造血干细胞基因组，得到所述造血干细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的慢病毒载体、如权利要求3所述的慢病毒或如权利要求4所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合；

10.一种如权利要求1或2所述的慢病毒载体、如权利要求3所述的慢病毒、如权利要求4所述的宿主细胞或如权利要求9所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用；

优选地，所述疾病包括慢性肉芽肿病。