CN107746859A - 靶向血红蛋白hbb突变基因的造血干细胞基因修饰方法 - Google Patents

靶向血红蛋白hbb突变基因的造血干细胞基因修饰方法 Download PDF

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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明公开了一种靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，方法一：gRNA1、gRNA2和spCas9‑2.0的mRNA电转进入含血红蛋白HBB突变基因的CD34+细胞；细胞培养1天后，以rAAV‑HBB转染CD34+细胞，收获细胞；方法二：Cas9蛋白与gRNA1、gRNA2混合重组，电转进入CD34+细胞；细胞培养1天后，以rAAV‑HBB转染CD34+细胞，收获细胞。本发明以中国广东广西最常见的HBB突变中CD41/42(‑CTTT)为靶，基因编辑完成后，不在染色体上留下任何其他突变或插入序列，基因编辑效率可达15％～20％。

Description

靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法
技术领域
本发明涉及靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，属于新型的基因编辑纠正遗传突变领域。
背景技术
地中海贫血(Thalassemia)于1925年由Cooley和Lee首先描述了这种发生在意大利儿童的严重贫血，由于最早发现于地中海区域，故称为地中海贫血或海洋性贫血(简称地贫)，据全国医学名词审定委员会规定应称为“珠蛋白生成障碍贫血”。地中海贫血是由于一种或多种珠蛋白肽链合成受阻或完全抑制，使血液中血红蛋白成分组成异常，导致的一种慢性遗传性溶血性贫血。地中海贫血是一种常见的常染色体隐性遗传病，是世界上最常见和发病率最高的遗传性溶血性贫血，也是危害最严重的血红蛋白病之一。其中研究比较透彻的一种是镰刀型细胞贫血病，病人的大部分红细胞呈镰刀状，其特点是病人的血红蛋白β—亚基N端的第六个氨基酸残基是缬氨酸(val)，而不是正常的谷氨酸残基(Glu)。但在中国广东广西最常见的是HBB突变中CD41/42(-CTTT)。
据WHO估计，每年出生的各类重型地中海贫血患儿数至少有20万。目前尚无治疗地中海贫血的有效方法，而且医疗费用昂贵，患者和家庭承受着巨大的经济压力和精神痛苦。
20世纪80年代曾溢滔院士主持开展了我国20省市自治区近60万人口的地中海贫血病的调查工作。根据12省地中海贫血的流调结果，该病主要分布在我围长江沿岸及以南的地区，包括11个省区以及陕西、甘肃、新疆等地。按当时的调查结果，该病的检出率为3.62％，其中α和β地中海贫血的检出率分别为2.95％及0.67％。近30年来未再开展全国范围内地中海贫血症的调查工作，只有广东、广西、云南等省开展区域性的调查工作。我国南方地区各地报道的地中海贫血基因缺陷率为2.5％～20％，而广东及广西两省地中海贫血基因缺陷发生率分别高达10％及20％，两省地中海贫血的病例占全国总数的2/5以上。
目前国内外对地中海贫血治疗分类(1)主要方法：规范性长期输血和去铁治疗；(2)根治方法：HLA相合的造血干细胞移植；(3)姑息方法：脾切除术或脾动脉栓塞术等。轻型地中海贫血一般不需治疗。
近年来，由于基因工程技术的突飞猛进，CRISPR/Cas技术俨然已经成为科学界的热点之一，被广泛应用于各类体内和体外的遗传学改造、构建转基因模式动物，以及基因治疗等领域。2013年Science上连载了两篇具有重要意义的CRISPR技术论文，麻省理工学院Zhang Feng的研究组，II型原核CRISPR适应性免疫系统已显示促进RNA指导的位点特异性DNA切割。研究人员设计两个不同的II型CRISPR系统，并证明Cas9核酸酶可以通过短RNAs诱导精确切割在人类和小鼠细胞内源基因组基因位点。Cas9也可以转化为切口酶促进具有最小诱变活性的同源定向修复。最后，可以将多个引导序列编码到单个CRISPR阵列中，以使得能够同时编辑哺乳动物基因组内的多个位点，展示CRISPR技术的容易操作的可编程性和广泛的适用性。Church的研究组首次使用CRISPR技术完成了RNA介导的人类基因组编辑。他们使用基因工程方法修改细菌的II类CRISPR系统，并比较了这种新系统与传统TALEN方法在基因组编辑方面的效率差异，结果发现这种方式比TALEN有更快的时效性。仅这一年内，CRISPR/Cas领域就取得了如此多鼓舞人心的突破，为其在基因治疗等多领域发展奠定基础。
在2013年后CRISPR-cas9基因编辑技术兴起之前，细胞治疗的主要技术是对CD34+造血干细胞进行转基因表达正常的血红蛋白。据bluebird公司临床试验显示，患者体内能产生25％～30％含量的正常血红蛋白，就能如正常人一样生活，免除其他治疗。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法。本发明着力于用基因编辑技术，纠正基因组的突变，以中国广东广西最常见的HBB突变中CD41/42(-CTTT)为靶，基因编辑完成后，不在染色体上留下任何其他突变或插入序列。本发明的技术能扩展到其他突变类型(需要针对突变位点，逐一设计gRNA和HDRssDNA)。
本发明是通过以下技术方案实现的：
靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，为以下方案之一：
方案一：gRNA1、gRNA2和spCas9-2.0的mRNA电转(electroporation)进入含血红蛋白HBB突变基因的CD34+细胞；细胞以StemSpan基础培养基培养1天后，以rAAV-HBB(含修复HBB CD41/42delCTTT序列的ssDNA)转染CD34+细胞，细胞以添加有生长因子的Stemspan培养基培养，每2天计数和添加培养基维持CD34+细胞浓度在1×106cells/ml；10天后，收获细胞，进行基因组测序分析或CFU分析。
方案二：Cas9蛋白与gRNA1、gRNA2混合重组形成功能性的核苷酸蛋白复合物，电转进入CD34+细胞；细胞以StemSpan基础培养基培养1天后，以rAAV-HBB(含修复HBB CD41/42delCTTT序列的ssDNA)转染CD34+细胞，细胞以添加有生长因子的Stemspan培养基培养，每2天计数和添加培养基维持CD34+细胞浓度在1×106cells/ml；10天后，收获细胞，进行基因组测序分析或CFU分析。
所述gRNA1和gRNA2的核苷酸序列如下所示(如SEQ ID NO.1、2所示)：
gRNA1：
gRNA2：
所述spCas9-2.0的mRNA，是通过体外转录spCas9-2.0得到。spCas9-2.0为现有技术中已有的序列，为张峰(ZhangFeng)所发表，也可以对张锋的序列进行优化，优化后的spCas9-2.0的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(序列所示为相对应的DNA序列)。所述Cas9蛋白，即为spCas9-2.0表达后得到的蛋白。
所述rAAV-HBB，是由rAAV(重组腺相关病毒)和HDR450bp组成的(将HDR450bp克隆到rAAV中)，HDR450bp的核苷酸序列如下所示(如SEQ ID NO.4所示)，加粗的CTTT就是患者基因缺失的核苷酸，而在正常人基因中具备的：
所述含血红蛋白HBB突变基因的CD34+细胞，通过以下方法获得：取HBB突变地贫患者的脐带血100ml或骨髓50～100ml，经过Ficoll分离单个核细胞后，以CD34磁珠(MiltenyiCD34 MultiSort kit)获取CD34+细胞，重悬在培养基(优选StemSpan基础培养基)中。
所述电转条件为：电转在4mm cuvette中，550V/cm,38ms。
所述添加有生长因子的Stemspan培养基，是在Stemspan基础培养基上添加TOP、IL6、SCF、Flt3以及SR1得到的，TOP、IL6、SCF、Flt3的终浓度均为100ng/ml，SR1的终浓度为1.0uM。
所述Cas9蛋白，是通过以下方法制备得到的：在ecoli表达质粒中，克隆cas9 cDNA到GST-7xHis-TEV site的下游，经过表达和纯化，经过TEV蛋白酶切获取高纯度的Cas9蛋白。
所述混合重组的条件为：50mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，37℃，60min。
本发明的靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，以中国广东广西最常见的HBB突变中CD41/42(-CTTT)为靶，采用CRISPR-cas9技术对基因进行编辑，基因编辑完成后，不在染色体上留下任何其他突变或插入序列。CRISPR-cas9工具系统使用张锋博士(Zhang Feng)发布的版本：pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0，addgene Plasmid#62988，该Cas9蛋白有两种使用方式：
1、克隆SpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(简称为：spCas9-2.0)的cas9 cDNA进入pUC19质粒中，经过in vitro转录和5加帽反应，形成成熟的mRNA供细胞转染；
2、在ecoli表达质粒中，克隆cas9 cDNA到GST-7xHis-TEV site的下游，经过表达和纯化，酶切获取高纯度的Cas9蛋白，和gRNA混合重组形成功能性的核苷酸蛋白复合物，电转进入HSC细胞。
术语解释：
HSC：Hematopoietic stem cell，造血干细胞。
rAAV:Recombinant adeno-associated virus,重组腺相关病毒。
TPO：Thrombopoietin。
IL6：Interleukin 6,白介素6。
SCF：Stem cell factor，干细胞因子。
Flt3L：Fms-related tyrosine kinase 3 ligand，Fms相关酪氨酸激酶3配体。
SR1：StemRegenin 1，干细胞生成因子1(一种刺激HSC生长的小分子化合物)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1 gRNA的设计
根据中国广东广西最常见的HBB突变中CD41/42(-CTTT)，设计gRNA。
HBB基因exon2附近的正常序列如下(如SEQ ID NO.5所示)：
5’-tcccaccctt agGCTGCTGG TGGTCTACCC TTGGACCCAG AGGTTCTTTG AGTCCTTTGG-3’。
HBB基因exon2附近的突变序列如下(斜体部分就是缺失的4bp，CD41/42del CTTT类型)(如SEQ ID NO.6所示)：
设计靶向HBB exon2附近位置的gRNA的序列如下(序列所示为相对应的DNA序列)(如SEQ ID NO.7、8所示)(利用软件进行设计，针对突变位置上游下游各250～500bp设计)：
gRNA1-20：5’-GACCACCAGCAGCCUAAGGG-3’；
gRNA2-21：5’-GCCCAUAACAGCAUCAGGAG-3’。
克隆gRNA的序列进入T7 promoter载体pcDNA3.1，体外T7 RNA polymerase转录出gRNA，去除DNA，纯化gRNA后备用。所得到的gRNA1，gRNA2序列如下所示(斜体部分就是识别目标基因组的配对序列)(如SEQ ID NO.1、2所示)：
gRNA1：
gRNA2：
实验2
电转染CRISPR-cas9进行CD34+细胞的基因编辑，体外合成的CRISPR-cas9 mRNA和gRNA，电转CD34+细胞(400V，0.5ms)。细胞在Stemspan完全培养基(Stemspan基础培养基，添加TOP、IL6、SCF、Flt3以及SR1得到的完全培养基，TOP、IL6、SCF、Flt3的终浓度均为100ng/ml，SR1的终浓度为1.0uM)。培养72hr后，收获基因组DNA(Qiagen DNeasy Blood&TissueKit)。然后做genomic PCR(靶向HBB exon2周围区域的引物，ForwardTGGATGAAGTTGGTGGTGAG，Reverse AAACATCAAGCGTCCCATAGA)。PCR产物经过Agarose胶纯化后，进行TA克隆(thermo公司Kit)，挑取单个细菌克隆后测序获取DNA修复信息，计算突变和非突变序列的信息，基因编辑效率15％～20％。
实施例
脐带血100ml或地贫患者骨髓50-100ml，经过Ficoll分离单个核细胞后，以CD34磁珠(Miltenyi CD34 MultiSort kit)获取CD34+细胞，重悬在StemSpan基础培养基中。
将HDR450bp序列克隆到rAAV(重组腺相关病毒)中，形成rAAV-HDR450bp。
实验分两种方案：
方案1：体外转录(in vitro transcription)的spCas9-2.0 mRNA；体外合成的gRNA；克隆和制备rAAV-HDR450bp(重组腺相关病毒)含修复HBB CD41/42 delCTTT序列的ssDNA。上述mRNA和gRNA电转(electroporation)进入CD34+细胞(电转在4mm cuvette中，550V/cm,38ms)。培养1天后以rAAV-HBB转染CD34+细胞，细胞在Stemspan培养基(加TOPIL6SCF Flt3各100ng/ml SR1 1.0uM的5因子)培养，每2天计数和添加培养液维持CD34+细胞浓度(1x10e6 cells/ml)10天后，收获细胞后，进行基因组测序分析或CFU分析。
方案2：在ecoli表达质粒中，克隆cas9 cDNA到GST-7xHis-TEV site的下游，经过表达和纯化，经过TEV蛋白酶切获取高纯度的Cas9蛋白。
克隆spCas9基因在E coli表达，纯化后，和gRNA1或gRNA2混合重组(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，37C 60min)，混合物电转(electroporation)进入CD34+细胞(电转在4mm cuvette中，550V/cm,38ms)。培养1天后以rAAV--HDR450bp转染CD34+细胞，细胞在Stemspan培养基(加TOP IL6SCF Flt3各100ng/ml SR1 1.0uM的5因子)培养，每2天计数和添加培养液维持CD34+细胞浓度(1x10e6 cells/ml)10天后，收获细胞后，进行基因组测序分析或CFU分析。
序列表
<110> 银丰生物工程集团有限公司
<120> 靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法
<141> 2017-10-18
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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ggaccaccag cagccuaagg gguuuuagag cuagaaauag caaguuaaaa uaaggcuagu 60
ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag ucggugcu 98
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<211> 4869
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 360
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ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aatggcctgt tcggaaacct gattgccctg 780
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tttttcaaga ccgagattac cctggccaac ggcgagatcc ggaagcggcc tctgatcgag 3240
acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggcc gggattttgc caccgtgcgg 3300
aaagtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 3360
ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgata agctgatcgc cagaaagaag 3420
gactgggacc ctaagaagta cggcggcttc gacagcccca ccgtggccta ttctgtgctg 3480
gtggtggcca aagtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 3540
gggatcacca tcatggaaag aagcagcttc gagaagaatc ccatcgactt tctggaagcc 3600
aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 3660
gagctggaaa acggccggaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 3720
gaactggccc tgccctccaa atatgtgaac ttcctgtacc tggccagcca ctatgagaag 3780
ctgaagggct cccccgagga taatgagcag aaacagctgt ttgtggaaca gcacaagcac 3840
tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 3900
gctaatctgg acaaagtgct gtccgcctac aacaagcacc gggataagcc catcagagag 3960
caggccgaga atatcatcca cctgtttacc ctgaccaatc tgggagcccc tgccgccttc 4020
aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4080
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ctgggaggcg acaaaaggcc ggcggccacg aaaaaggccg gccaggcaaa aaagaaaaag 4200
gaattcggca gtggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 4260
cctggcccaa tgaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc 4320
agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc 4380
gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc 4440
gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc 4500
acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag 4560
ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg 4620
cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggagtct cgcccgacca ccagggcaag 4680
ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc 4740
gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct cggcttcacc 4800
gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc 4860
ggtgcctga 4869
<210> 4
<211> 450
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caaggtgaac gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca 60
agacaggttt aaggagacca atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt 120
ttctgatagg cactgactct ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg 180
tggtctaccc ttggacccag aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg 240
ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg 300
atggcctggc tcacctggac aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact 360
gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt 420
ttctttcccc ttcttttcta tggttaagtt 450
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<400> 8
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Claims (7)

1.一种靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，其特征在于：为以下方法之一：
方法一：gRNA1、gRNA2和spCas9-2.0的mRNA电转进入含血红蛋白HBB突变基因的CD34+细胞；细胞以StemSpan基础培养基培养1天后，以rAAV-HBB转染CD34+细胞，细胞以添加有生长因子的Stemspan培养基培养，每2天计数和添加培养基维持CD34+细胞浓度在1×106cells/ml；10天后，收获细胞；
方法二：Cas9蛋白与gRNA1、gRNA2混合重组形成功能性的核苷酸蛋白复合物，电转进入CD34+细胞；细胞以StemSpan基础培养基培养1天后，以rAAV-HBB转染CD34+细胞，细胞以添加有生长因子的Stemspan培养基培养，每2天计数和添加培养基维持CD34+细胞浓度在1×106cells/ml；10天后，收获细胞；
所述gRNA1和gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、2所示；
所述rAAV-HBB，是由rAAV和HDR450bp组成的，HDR450bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，其特征在于：所述spCas9-2.0的mRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，其特征在于：所述含血红蛋白HBB突变基因的CD34+细胞，通过以下方法获得：取HBB突变地贫患者的脐带血100ml或骨髓50～100ml，经过Ficoll分离单个核细胞后，以CD34磁珠获取CD34+细胞，重悬在培养基中。
4.根据权利要求1所述的靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，其特征在于：所述电转条件为：电转在4mm cuvette中，550V/cm,38ms。
5.根据权利要求1所述的靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，其特征在于：所述添加有生长因子的Stemspan培养基，是在Stemspan基础培养基上添加TOP、IL6、SCF、Flt3以及SR1得到的，TOP、IL6、SCF、Flt3的终浓度均为100ng/ml，SR1的终浓度为1.0uM。
6.根据权利要求1所述的靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，其特征在于：所述Cas9蛋白，是通过以下方法制备得到的：在ecoli表达质粒中，克隆cas9cDNA到GST-7xHis-TEV site的下游，经过表达和纯化，经过TEV蛋白酶切获取高纯度的Cas9蛋白。
7.根据权利要求1所述的靶向血红蛋白HBB突变基因的造血干细胞基因修饰方法，其特征在于：所述混合重组的条件为：50mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，37℃，60min。
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