CN111118045B - 基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用 - Google Patents

基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用，所述的单碱基基因编辑系统包含能够表达融合蛋白的mRNA和目的编辑位点对应的gRNA，所述融合蛋白包含D10A缺陷型Cas9蛋白和脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA，所述的脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA对应的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明为研究甲壳动物SNP位点的功能提供了新的技术手段，有利于甲壳动物基因功能的研究，并对经济甲壳动物分子精准育种的实施和发展提供了基础。

Description

基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和 应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用。
背景技术
以虾蟹为代表的十足目甲壳动物是水产养殖的重要品种，在渔业发展中占有重要地位。随着社会经济的发展，人们对水产品多样化的需求逐渐提高，也对新品种培育和品种改良提出了更高的要求。如何获得更多更优质的海水养殖品种一直是国内外科学家致力于研究的重要内容。传统育种方法周期长、效率低，逐渐不能满足人们对良种选育的要求。基于此，快捷、高效且能够实现关键生产性状基因定向的分子育种技术具有十分广阔的发展空间。
随着高通量测序技术的发展，多种甲壳动物基因组测序已经完成或即将完成，大量功能基因被挖掘出来。深入分析基因的功能，将有助于从分子水平上揭示甲壳动物的生命活动规律。对功能基因与生产性状之间关系的阐释，可以为育种关键基因的选择与评价提供可靠依据。研究发现，甲壳动物基因组中存在大量单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)位点，深入研究这些SNP位点(尤其是一些引起功能基因异义突变的SNP位点)的作用，对阐释甲壳动物的繁殖发育、生长和抗逆等生理生化过程具有重要意义。
目前，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因编辑工具应用广泛，为功能基因的研究提供了有力工具。但由于它们都是基于双链断裂和同源重组、非同源末端连接实现基因编辑的，会产生随机indels，无法实现特点基因位点单个碱基的替换，对研究SNP位点的功能存在先天不足。此外，不同基因编辑工具对特定编辑对象的编辑效率也有较大差异，目前还没有关于针对甲壳类动物基因编辑的专门基因编辑系统。
发明内容
本发明的目的就是提供一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用，以为甲壳动物的基因定向分子育种提供专门的基因编辑系统。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因，所述基因的序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA的单碱基基因编辑系统，所述单碱基基因编辑系统包含能够表达融合蛋白的mRNA和目的编辑位点对应的gRNA，所述融合蛋白包含D10A缺陷型Cas9蛋白和脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA，所述的脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA对应的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
上述的单碱基基因编辑系统的构建方法，包括以下步骤：
a、利用RACE技术，从脊尾白虾cDNA文库中克隆脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因；
b、以pCMV-Cas9质粒为模板，利用反向PCR引物，将Cas9蛋白RuvC结构域的第10位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，使RuvC结构域失活，从而得到含有D10A缺陷型Cas9蛋白基因的质粒pCMV-nCas9；
c、通过PCR技术在EcCDA基因两端加上与D10A缺陷型Cas9蛋白基因两端同源的序列，并利用infusion无缝克隆试剂盒将EcCDA基因和D10A缺陷型Cas9蛋白基因进行连接，得到pn Cas9-EcCDA重组质粒；
d、将构建的pnCas9-EcCDA重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆并进行扩大培养，利用质粒小提试剂盒提取重组质粒；
e、利用XbaⅠ限制性内切酶将pnCas9-EcCDA重组质粒线性化，并通过体外转录试剂盒进行nCas9-EcCDAmRNA的体外转录；转录所得到的nCas9-EcCDA mRNA与目的编辑位点对应的g RNA共同构成所述的单碱基基因编辑系统。
步骤a中，EcCDA基因扩增的上游引物如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQ IDNO.4所示。
步骤b中，所述的反向PCR引物为：p-D10A-F：如SEQ ID NO.5所示；p-D10A-R：如SEQ ID NO.6所示。
上述构建的单碱基基因编辑系统的应用，具体为将nCas9-EcCDA mRNA和目的编辑位点对应的gRNA通过显微注射技术共注射到甲壳动物受精卵中，可以实现甲壳动物功能基因特定位点C→T的单碱基替换。
本发明相对现有技术的有益效果在于：
1、本发明提供了一种脊尾白虾胞苷脱氨酶(EcCDA)基因的全部编码序列，同时也提供了其所编码的氨基酸序列及其信号肽切割位点。
2.本发明构建了EcCDA与D10A缺陷型Cas9蛋白的融合表达重组质粒(pnCas9-EcCDA)，并成功进行了体外转录，获得了nCas9-EcCDA mRNA。
3.本发明利用显微注射技术将nCas9-EcCDA mRNA和目的编辑位点对应的gRNA共注射到甲壳动物受精卵，实现了甲壳动物功能基因特定位点的单碱基替换。
4.本发明为研究甲壳动物SNP位点的功能提供了新的技术手段，有利于甲壳动物基因功能的研究，并对经济甲壳动物分子精准育种的实施和发展提供了基础。
附图说明
图1为EcCDA的核苷酸与编码氨基酸序列信息(上图)及SMART:Main page(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测的蛋白结构域(下图)。
图2为中华锯齿米虾蜕皮抑制激素基因NdMIH靶向位点的单碱基编辑结果。其中，Wild为野生型样品测序峰图，M1-M5为单碱基编辑发生碱基转变的测序峰图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术效果进行详细阐述。本发明中未提及的实验方法和实验条件均为本领域技术人员公知的常规实验操作。
实施例1 nCas9-EcCDA mRNA的获取
a、基因克隆：
从脊尾白虾(购于青岛沙子口市场)cDNA文库中筛选到一种胞苷脱氨酶基因(EcCDA)(序列如SEQ ID NO.1所示)，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。对其氨基酸序列进行结构域的预测，发现EcCDA氨基酸序列存在1个典型的胞苷脱氨酶结构域(dCMP_cyt_deam_1)。
EcCDA基因的扩增体系为：
Figure BDA0002352479560000031
其中，EcCDA-F序列如SEQ ID NO.3所示，EcCDA-R序列如SEQ ID NO.4所示。
反应条件为：
Figure BDA0002352479560000032
PCR产物进行1％凝胶电泳，切下目的条带并进行纯化。纯化产物连入pMD19-TVector，转化大肠杆菌DH5α感受态，长出菌落后进行菌落PCR，判断质粒是否成功转化；将阳性菌落进行sanger测序分析，获得EcCDA的准确cDNA序列；对应的菌液保种备用。
b、突变Cas9蛋白RuvC结构域：
Cas9蛋白的两个核酸酶结构域同时切断DNA分子两条链时，生物体会启动同源重组或非同源末端连接的修复机制，产生随机indels，不利于SNP位点的突变和研究。因此，本发明利用PCR引物设计，将Cas9蛋白RuvC结构域的第10位氨基酸由天冬氨酸突变为了丙氨酸(D10A)，使该结构域失活。这样Cas9蛋白就可以在gRNA序列引导下实现特定基因位点定位功能的同时，只切割DNA分子的一条链，降低随机indels产生的可能性。为顺利探究EcCDA实现单碱基替换的能力提供了保障。
设计的一对反向PCR引物：p-D10A-F如SEQ ID NO.5所示，p-D10A-R如SEQ ID NO.,6所示。引物5’端具有磷酸基团修饰，便于后续自连成环操作。模板为Sigma pCMV-Cas9质粒。
反应体系为：
Figure BDA0002352479560000041
反应条件为：
Figure BDA0002352479560000042
使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带进行纯化。根据其可以自连成环的特性进行连接，体系如下：
连接酶 2.5μL
DNA纯化产物 2.5μL
16℃保温1h。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，长出菌落后进行菌落PCR，判断质粒是否成功转化；将阳性菌落进行sanger测序，进一步判断是否成功引入目的突变。确认引入突变的质粒称为pCMV-nCas9。
c、重组质粒的构建
(1)设计一对NLS-EcCDAF/R引物，正向引物的5’端添加了核定位序列(nuclearlocalization signal,NLS)接头，以便注射到卵中以后能够入核表达；反向引物的5’端添加了Linker短肽序列接头，便于EcCDA和nCas9蛋白的连接。
引物序列如下：
NLS-EcCDA-F：
GCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTGAGAATCAGGTATCCAAGT；
NLS-EcCDA-R：
GGAGCCGCCTCCTCCTGATCCGCCGCCTCCATTACCGAGTGAGACCCAC。
反应体系为：
Figure BDA0002352479560000051
反应条件：
Figure BDA0002352479560000052
使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带进行纯化，纯化产物称为NLS-EcCDA。
(2)设计一对Infu-EcCDAF/R引物，通过PCR技术在EcCDA基因两端加上与pCMV-nCas9同源的接头序列，用于二者的无缝克隆。
引物序列如下：
Infu-EcCDA-F：
CTAGCCGCCACCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGA；
Infu-EcCDA-R：
GCTGTACTTCTTGTCGGAGCCGCCTCCTCCTGATC。
反应体系为：
Figure BDA0002352479560000053
反应条件：
Figure BDA0002352479560000061
使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带进行纯化，纯化产物称为Infu-EcCDA。
(3)设计一对引物nCas9F/R，将pCMV-nCas9质粒从起始密码子后线性化。引物序列如下：
nCas9-F：GACAAGAAGTACAGCATCG；
nCas9-R：CATGGTGGCGGCTAGCCAGC。
反应体系：
Figure BDA0002352479560000062
反应条件：
Figure BDA0002352479560000063
使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带进行纯化，纯化产物记为nCas9。
(4)使用无缝克隆试剂盒对Infu-EcCDA和nCas9进行连接，反应体系如下：
Figure BDA0002352479560000064
50℃保温45min，反应结束后将离心管置于冰上用于转化。重组质粒命名为pnCas9-EcCDA。
d、转化与质粒提取
将构建得到的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态。长出菌斑后，首先通过菌落PCR筛选阳性克隆；琼脂糖凝胶电泳显示有目的条带的菌落再进行sanger测序分析，确保序列的准确性。确认无误的含有目的质粒的菌落进行扩大培养，按照TIANGEN质粒小提试剂盒说明提取重组质粒。
e、重组质粒体外转录
利用XbaⅠ限制性内切酶对提取的重组质粒进行单酶切，将质粒线性化，并通过乙醇沉淀进行纯化。按照Thermo
Figure BDA0002352479560000074
T7 ULtra Kit说明书进行nCas9-EcCDA mRNA的体外转录。反应体系如下：
Figure BDA0002352479560000071
37℃反应2小时，然后在反应体系中加入1μL TURBO Dnase，37℃消化15min，除去体系中的DNA模板，用于加尾反应。反应体系如下：
Figure BDA0002352479560000072
37℃反应45min，置于冰上。
使用酚/氯仿抽提与异丙醇沉淀方式对转录得到的mRNA进行纯化，用1％的琼脂糖凝胶检测合成的mRNA是否完整。
实施例2 gRNA设计和体外转录
以中华米虾蜕皮抑制激素基因NdMIH为靶基因，分析其序列特征，并根据结构域序列设计gRNA。
本实验室已在先前研究工作中构建过gRNA框架序列的质粒pMD19-gRNA(将人工合成的gRNA框架序列连接至pMD19-T vector中得到)，并设计过CRISPR-R反向引物。因此，本发明仅需设计NDMIH-gRNAF正向引物。引物序列如下：
NDMIH-gRNA-F
Figure BDA0002352479560000073
CAATAGAGATCTATACGAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(其中双下划线标注的为T7启动子序列，单下划线标注的是与NDMIH基因gRNA 位点相对应的靶向互补位点)。
CRISPR-R
AAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
反应体系：
Figure BDA0002352479560000081
反应条件：
Figure BDA0002352479560000082
PCR产物通过乙醇沉淀进行纯化，然后依照Thermo Scientific TranscriptAidT7 High Yield Transcription Kit说明书进行体外转录。反应体系如下：
Figure BDA0002352479560000083
37℃反应2小时，然后在反应体系中加入1μL TURBO Dnase，37℃消化15min，除去体系中的DNA模板。
使用酚/氯仿抽提与异丙醇沉淀方式对转录得到的gRNA进行纯化，用2％的琼脂糖凝胶检测合成的gRNA是否完整。
实施例3 nCas9-EcCDA mRNA和NDMIH-gRNA的显微共注射
将NDMIH-gRNA与nCas9-EcCDA mRNA混合，使NDMIH-gRNA终浓度100ng/μl，nCas9-EcCDA mRNA终浓度100ng/μl，加入0.05％的酚红作为指示剂，对脊尾白虾1细胞期受精卵进行显微注射。
注射后的受精卵置于0.22μm孔径滤膜抽滤过的水中，并在摇床上进行离体孵化。
单碱基突变位点的检测
收集编辑个体蜕皮后的虾皮，按照TIANGEN DNA提取试剂盒说明提取编辑个体基因组DNA作为PCR模板，以NdMIHF/R引物进行PCR扩增。体系及反应条件与扩增NdMIH基因时相同。对PCR产物进行测序，若靶位点附近出现双峰，则将纯化后的PCR产物连入pMD19-TVector，转化大肠杆菌DH5a感受态，挑取单克隆进行sanger测序，分析C→T单碱基突变的情况。
结果表明基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统能够有效实现靶标位点C→T的转换(如图2所示)。
基于胞苷脱氨酶(Cytidine deaminase，CDA)的单碱基基因编辑技术为研究功能基因中SNP位点的作用提供了新思路。它可以将胞嘧啶(C)的氨基去除，从而使得C变成尿嘧啶(U)，随着DNA的复制，U又会被胸腺嘧啶(T)替代，最终实现G-C碱基对到A-T碱基对的精确、高效突变。本发明首次在甲壳动物中实现了基于胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑，对研究经济甲壳动物功能基因SNP位点的功能和作用具有重要意义。
序列表
<120> 基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 492
<212> DNA
<213> 脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)
<400> 1
atggagaatc aggtatccaa gttacagcag gttggacctt ctaaggacga tgccacaacg 60
gctgaaatgg ataagaaact gtcagacagt gaaatcgagt cgctgataga cgccagcctc 120
cgtggacgcc agaattctta cagtccatac agcaagtttg cagttggagc cgccctcctg 180
accgaagacg gatcagtcat actaggatgc aacgtagaga acttgtccta tggcttggcc 240
atatgtgctg aaagaactgc cgttagccgc gctgtcgtgg aaggacaccg caaattcaaa 300
gccatagcaa tcacggcgga aatgggcgag aaattcgttg ggccgtgtgg catgtgtagg 360
cagacgctgg ctgagttcgg cctagacatg gaggtgtact tgtccatgcc taacaagaaa 420
tacatgaaga cgacggtggc gaaattactg cctgatagtt ttaatccaga gtgggtctca 480
ctcggtaatt aa 492
<210> 2
<211> 163
<212> PRT
<213> 脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)
<400> 2
Met Glu Asn Gln Val Ser Lys Leu Gln Gln Val Gly Pro Ser Lys Asp
1 5 10 15
Asp Ala Thr Thr Ala Glu Met Asp Lys Lys Leu Ser Asp Ser Glu Ile
20 25 30
Glu Ser Leu Ile Asp Ala Ser Leu Arg Gly Arg Gln Asn Ser Tyr Ser
35 40 45
Pro Tyr Ser Lys Phe Ala Val Gly Ala Ala Leu Leu Thr Glu Asp Gly
50 55 60
Ser Val Ile Leu Gly Cys Asn Val Glu Asn Leu Ser Tyr Gly Leu Ala
65 70 75 80
Ile Cys Ala Glu Arg Thr Ala Val Ser Arg Ala Val Val Glu Gly His
85 90 95
Arg Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ile Thr Ala Glu Met Gly Glu Lys Phe
100 105 110
Val Gly Pro Cys Gly Met Cys Arg Gln Thr Leu Ala Glu Phe Gly Leu
115 120 125
Asp Met Glu Val Tyr Leu Ser Met Pro Asn Lys Lys Tyr Met Lys Thr
130 135 140
Thr Val Ala Lys Leu Leu Pro Asp Ser Phe Asn Pro Glu Trp Val Ser
145 150 155 160
Leu Gly Asn
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagaatc aggtatccaa g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attaccgagt gagacccact c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccatcggca ccaactctgt 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggccgatg ctgtacttc 19

Claims (7)

1.一种脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因，其特征是，所述基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因，其特征是，所述基因编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
3.一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA的单碱基基因编辑系统，其特征是，所述单碱基基因编辑系统包含能够表达融合蛋白的mRNA和目的编辑位点对应的gRNA，所述融合蛋白包含D10A缺陷型Cas9蛋白和脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA，所述的脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA对应的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种权利要求3所述的单碱基基因编辑系统的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
a、利用RACE技术，从脊尾白虾cDNA文库中克隆脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因；
b、以pCMV-Cas9质粒为模板，利用反向PCR引物，将Cas9蛋白RuvC结构域的第10位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，使RuvC结构域失活，从而得到含有D10A缺陷型Cas9蛋白基因的质粒pCMV-nCas9；
c、通过PCR技术在EcCDA基因两端加上与D10A缺陷型Cas9蛋白基因两端同源的序列，并利用infusion无缝克隆试剂盒将EcCDA基因和D10A缺陷型Cas9蛋白基因进行连接，得到pnCas9-EcCDA重组质粒；
d、将构建的pnCas9-EcCDA重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆并进行扩大培养，利用质粒小提试剂盒提取重组质粒；
e、利用XbaⅠ限制性内切酶将pnCas9-EcCDA重组质粒线性化，并通过体外转录试剂盒进行nCas9-EcCDA mRNA的体外转录；转录所得到的nCas9-EcCDA mRNA与目的编辑位点对应的gRNA共同构成所述的单碱基基因编辑系统。
5.根据权利要求4所述的单碱基基因编辑系统的构建方法，其特征是，步骤a中，EcCDA基因扩增的上游引物如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求4所述的单碱基基因编辑系统的构建方法，其特征是，步骤b中，所述的反向PCR引物为：p-D10A-F：如SEQ ID NO.5所示；p-D10A-R：如SEQ ID NO.6所示。
7.一种权利要求4~6任一方法构建的单碱基基因编辑系统在甲壳动物分子育种中的应用，其特征是，将nCas9-EcCDA mRNA和目的编辑位点对应的gRNA通过显微注射技术共注射到甲壳动物受精卵中，即可对甲壳动物功能基因特定位点进行C→T的单碱基替换。
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