CN109536494A

CN109536494A - 一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒

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Publication number: CN109536494A
Application number: CN201811282325.8A
Authority: CN
Inventors: 祝海宝; 黄雨亭; 刘洁; 梁福才; 陶米林
Original assignee: Guangdong Medical Technology Co Ltd Chi Chi
Current assignee: Guangdong Medical Technology Co Ltd Chi Chi
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2019-03-29

Abstract

本发明提供了一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒。本发明同时针对β17(A→T)以及β41‑42(‑TCTT)定点修复，通过一次基因编辑即可修复HBB基因两个常见的突变位点，拓展了地中海贫血症和镰刀型贫血症的治疗方法；另外，本发明直接在造血干细胞(HSC)中进行编辑，与现有技术中对iPS细胞进行基因编辑相比，避免了细胞致癌和突变的安全风险，临床使用更为安全。

Description

一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒。

背景技术

我国是地中海贫血高发的国家，病例主要分布于广东、广西、海南、贵州、云南、四川、重庆、福建、湖南、湖北、江西等地。其中南方为地中海贫血症的高发地，而广东和广西两省地贫基因缺陷率分别高达10％和20％，病例数占全国总数的2/5以上，已经成为社会性的公共卫生问题。并且由于多省尚未将地中海贫血筛查纳入孕检常规项目，而且近年取消了强制性婚检制度，加上部分地区基层医务人员对该病认知水平不高，导致近年地贫患儿出生率有上升趋势。地中海贫血是一种珠蛋白基因缺陷而引起的遗传性慢性贫血，分为α、β、δβ和δ4种类型，以β和α较为常见。其中β地中海贫血基因突变类型目前已发现至少有186种，主要为β珠蛋白基因(HBB1)上的点突变。我国常见的突变型有6种：①β41-42(-TCTT)，约占45％；②IVS-Ⅱ654(C→T)，约占24％；③β17(A→T)，约占14％；④TATA盒-28(A→T)，约占9％；⑤β71-72(+A)，约占2％；⑥β26(G→A)，即HbE26，约占2％。

镰刀型贫血症是另外一种全球高发的血红蛋白病，临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛以致慢性局部缺血导致器官组织损害，甚至死亡。该病主要见于非洲黑人(基因携带率约20％)，也见于中东、希腊、意大利等地中海沿岸国家，以及印度、印第安人等，我国南方也有发现病例，发病范围分布很广。镰刀型贫血症为常染色体隐性遗传性疾病。患者血红蛋白β-肽链(由HBB1基因编码)第6位氨基酸由谷氨酸突变成缬氨酸，形成的镰状血红蛋白HbS取代了正常HbA，在氧分压下降时HbS分子间相互作用，成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞镰变。

地中海贫血和镰刀型贫血患者主要通过规范性长期输血和去铁治疗来缓解病症，但这种方式不但不能治愈，也带来较高的临床安全隐患。造血干细胞移植是目前唯一能根治地中海贫血和镰刀型贫血的治疗技术，多以骨髓造血干细胞和脐血干细胞异体移植为主。骨髓配型是限制干细胞异体移植的关键问题，即使配型成功还是有产生免疫排斥的风险，在临床上难以大范围应用。虽然理论上脐血配型相较骨髓更加简单，同胞脐血移植能够彻底治愈重型地中海贫血和镰刀型贫血症，非同胞的异体脐血干细胞移植配型成功的几率也相对较大，但在我国公共脐血库不完善的环境下，要在临床上大规模推广仍然非常困难。

自体造血干细胞移植可以解决上述配型和免疫排斥问题，但患者自身的造血干细胞也同样存在基因缺陷，无法直接用于治疗。然而，在体外通过基因编辑手段修复自体干细胞的基因突变缺陷，再将基因修复后的干细胞移植回患者体内，一方面可以修复基因缺陷，重塑患者造血系统，另一方面避免了免疫排斥风险，是最直接有效的治疗方式，是目前地中海贫血和镰刀型贫血临床治疗研究的前沿和热点，目前尚处于临床前研究阶段。

近几年基因编辑技术获得突破性的发展，目前发展相对成熟的基因编辑技术有ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)-Cas9。其中，CRISPR-Cas9被称为第三代基因编辑技术，相比ZFN和TALEN，其构建简单，突变效率高、使用成本低。目前开发出来的CRISPR系统主要由来源于Streptococcuspyogenes、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、Streptococcusthermophilus等微生物，相对应的酶分别为Sp Cas9、Sa Cas9、Nm Cas9、St Cas9。CRISPR系统均包含以下几个部分：1)PAM位点，位于靶序列的下游，只有几个nt(例如Sp CAS9/NGG；SaCAS9/NNGRRT)，根据此位点来选取靶序列；2)识别靶序列的RNA(gRNA或sgRNA)，与切割位点识别并结合的序列，一般在20nt左右；3)tracrRNA,靶序列之后的一段回文RNA序列；4)Cas9内切酶，具有独立核酸酶活性，Cas9含有2个独特的活性位点，分别为氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH。Cas9中的HNH活性位点剪切gRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链。而Nickase(缺口酶)为Cas9蛋白的突变体，其RuvC或HNH活性位点失活，使其只能切割目的序列的其中一条DNA链，从而形成DNA单链缺口。根据来源不同，又分为Sp Nickase和SaNickase等。其工作原理为：gRNA、tracrRNA和Nickase组成复合体，识别并结合于gRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使gRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Nickase中仍保留活性的HNH位点或RuvC位点剪切相应的DNA单链，最终引入DNA单链断裂(SSB)，形成单链缺口。该缺口有两种修复方式：一种是以未断裂的互补链为模板进行修复，而Cas9切割形成的DNA双链断裂是倾向于采用非同源末端连接(NHEJ)的方式进行修复，后者容易在修复过程中引入替换/确实/插入突变，造成目的基因的失活，增加临床使用上的安全风险；另一种是在同源重组片段存在的情况下以同源重组(HR)的方式进行修补。利用Nickase单链切割介导的同源重组，不但可以对目的基因进行定点编辑，还提高了临床使用的安全性(如发生脱靶切割，也不会引起非目的基因的突变)。

最接近现有技术：

收集患者来源的诱导性多能干细胞(iPS cells)，通过CRISPR-Cas9系统修正HBB基因上的β41-42(-TCTT)突变位点，再将基因工程化的iPS分化成造血干细胞(HSC)。

现有技术的缺点：

1、β地中海贫血和镰刀型贫血症主要由HBB基因上的突变引起，而该基因的突变类型有很多种，常见的至少6种。现有技术通过CRISPR-Cas9基因编辑系统仅修复其中一种突变型β41-42(-TCTT)，仅能针对少部分患病人群(约45％)。根据现有技术的思路，需要针对每一种突变类型设计、开发一套基因编辑系统，工作量繁琐，研发成本高。

2、现有技术使用iPS细胞进行基因编辑，iPS细胞诱导率低，且存在致癌、基因突变等安全性风险，导致其临床应用前景受限。

3、现有技术使用CRISPR-Cas9系统引入目的基因双链断裂从而介导同源重组，其引起非目的基因脱靶突变的安全风险较高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种能高效的，通过一次基因编辑同时修复β17(A→T)和β41-42(-TCTT)两种突变位点的基因编辑系统，将该系统用于不同来源的造血干细胞(HSC)中，可以用来治疗β17(A→T)和β41-42(-TCTT)突变型的地中海贫血患者，以及镰刀型贫血症患者。本发明还提供了该造血干细胞及其用途，采用本发明所述的造血干细胞能用于治疗地中海贫血症中两种最常见的突变型和镰刀型贫血症。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA，包括与Sp Nickase配合使用的gRNA和与Sa Nickase配合使用的gRNA中的至少一种；

所述与Sp Nickase配合使用的gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:11中的一种所示；

所述与Sa Nickase配合使用的gRNA的靶序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:27中的一种所示。

本发明提供了一种用于修复HBB1基因点突变的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括CRISPR-Nickase系统和同源重组片段；

所述CRISPR-Nickase系统包括Sp Nickase，以及与Sp Nickase配合使用的gRNA，或Sa Nickase，以及与Sa Nickase配合使用的gRNA；

所述与Sa Nickase配合使用的gRNA的靶序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:27中的一种所示；

所述同源重组片段包括上游同源臂和下游同源臂，所述上游同源臂用于修复HBB1基因β17(A→T)位点突变，所述下游同源臂用于修复HBB1基因β41-42(-TCTT)位点突变。本发明的同源重组片段是与本发明设计的gRNA配合使用，是基于gRNA的序列分别设计的，针对本发明设计的gRNA，其同源重组片段可以为：

(1)与靶序列如SEQ ID NO:3所示的gRNA配合使用的上游同源臂序列如SEQ IDNO:40所示(800bp)，下游同源臂序列如SEQ ID NO:41所示(800bp)。

(2)与靶序列如SEQ ID NO:6所示的gRNA配合使用的上游同源臂序列如SEQ IDNO:42所示(800bp)，下游同源臂序列如SEQ ID NO:43所示(800bp)。

(3)与靶序列如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:9所示的gRNA配合使用的上游同源臂序列如SEQ ID NO:44所示(800bp)，下游同源臂序列如SEQ ID NO:45所示(800bp)。

(4)与靶序列如SEQ ID NO:10所示的gRNA配合使用的上游同源臂序列如SEQ IDNO:46所示(800bp)，下游同源臂序列如SEQ ID NO:47所示(800bp)。

(5)与靶序列如SEQ ID NO:11所示的gRNA配合使用的上游同源臂序列如SEQ IDNO:48所示(800bp)，下游同源臂序列如SEQ ID NO:49所示(800bp)。

优选地，所述同源重组片段还包括tNGFR基因表达框和tNGFR基因启动子，所述tNGFR基因编码序列和tNGFR基因启动子均位于所述上游同源臂和下游同源臂之间，所述tNGFR基因启动子位于所述tNGFR基因编码序列的上游。

tNGFR基因启动子优选EFS，序列如SEQ ID NO:50所示，tNGFR基因编码序列如SEQID NO:51所示。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体表达上述所述的基因编辑系统。

本发明提供了一种基因编辑试剂盒，所述基因编辑试剂盒包括上述所述的表达载体。

优选地，所述基因编辑试剂盒包括用于表达所述与Sp Nickase配合使用的gRNA和与Sa Nickase配合使用的gRNA中的至少一种，以及Nickase蛋白的表达载体，以及含有所述同源重组片段的供体载体。

本发明提供了一种造血干细胞，所述造血干细胞含有上述所述的基因编辑系统或者上述所述的表达载体。

本发明提供了上述所述的基因编辑系统在制备治疗地中海贫血症和/或镰刀型贫血症的药物中的用途。

本发明提供了上述所述的表达载体在制备治疗地中海贫血症和/或镰刀型贫血症的药物中的用途。

本发明提供了上述所述的基因编辑试剂盒在制备治疗地中海贫血症和/或镰刀型贫血症的药物中的用途。

本发明提供了上述所述的造血干细胞在制备治疗地中海贫血症和/或镰刀型贫血症的药物中的用途。

有益效果：

1、本发明提供了的基因编辑系统是一种通用型修复HBB基因突变的基因编辑系统，该系统可用于治疗地中海贫血症和镰刀型贫血症的患者，拓展了地中海贫血症和镰刀型贫血症的治疗方法。

2、本发明的基因编辑系统可以针对β17(A→T)突变型的患者，也可以针对β41-42(-TCTT)突变型的患者，或者是β17和β41-42都发生了突变的患者，通过一套基因编辑技术即可修复HBB基因两个最常见的突变位点，覆盖59％的患病人群。与传统的HBB基因突变单点修复的基因治疗方法相比，采用本发明的基因编辑系统进行修复的方法适用的人群更广，从而降低了治疗成本。

3、本发明在利用同源重组技术修复HBB基因β17和β41-42突变的同时，在HBB基因的内含子区插入了自带启动子的tNGFR基因，该基因已被证实在临床实用上的安全性，利用该基因进行编辑后的造血干细胞纯化，有利于得到高纯度的经过工程化改造的自体造血干细胞，对后续治疗有积极作用。

4、利用本发明提供的通用型修复HBB基因突变的基因编辑系统，可以修复患者自体造血干细胞HBB基因的天然突变，使得患者可以利用自体造血干细胞进行治疗，完全避免了异体移植的配型局限和免疫排斥反应，为患者提供一种无需等待的治疗手段，同时也降低了治疗成本和治疗风险。

5、本发明直接在造血干细胞(HSC)中进行编辑，与现有技术中对iPS细胞进行基因编辑相比，避免了细胞致癌和突变的安全风险，临床使用更为安全。

6、本发明提供了一种针对β17(A→T)和β41-42(-TCTT)型地中海贫血症和镰刀型贫血症的通用型根治技术，操作简便，安全有效，耗时短。

7、本发明提供的修复HBB基因突变的基因编辑系统，脱靶突变的风险极低，临床使用的安全性高。

附图说明

图1为CRISPR-Cas9系统载体元件示意图；图中，该载体表达Cas9的突变体Nickase缺口酶。

图2为本发明同源重组载体元件示意图；图中：LHA代表上有同源臂，RHA代表下游同源臂。

图3为HBB1基因的切割和同源重组修复示意图；图中：灰色区域自左向右分别代表β17(A→T)和β41-42(-TCTT)相对应的突变序列。

图4为pX458质粒图。

图5为本发明实施例1中gRNA切割后的电泳图。

图6为pX601质粒图。

图7为本发明实施例2中gRNA切割后的电泳图。

图8为pX461质粒图。

图9本发明实施例3中SEQIDNO:3、SEQIDNO:9gRNA切割后的电泳图。

图10为本发明实施例4中HBB1基因SEQ ID NO:9位点同源重组载体示意图。

图11为本发明实施例4中(a)“双引物”法检测同源重组电泳图，(b)为同源重组效率统计图。

图12为本发明实施例4中SEQ ID NO:9位点同源重组测序示意图。

图13为本发明实施例5中β17(A→T)上游同源臂突变位点示意图。

图14为本发明实施例5中β17(A→T)突变同源重组载体示意图。

图15为本发明实施例5中Helaβ17(A→T)细胞系β17(A→T)突变位点测序结果图。

图16为本发明实施例5中β41-42(-TCTT)下游同源臂突变位点示意图。

图17为本发明实施例5中β41-42(-TCTT)突变同源重组载体示意图。

图18为本发明实施例5中Helaβ41-42(-TCTT)细胞系β41-42(-TCTT)突变位点测序结果图。

图19为本发明实施例5中定点修复同源重组载体示意图。

图20为本发明实施例5中(a)定点修复Helaβ17(A→T)细胞测序结果示意图，(b)定点修复Helaβ41-42(-TCTT)细胞测序结果示意图.

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明首先针对HBB1基因，在β17(A→T)以及β41-42(-TCTT)两个突变位点附近(包括内含子区)分别设计高效切割的Sp Nickase、Sa Nickase对应的guide RNA。CRISPR-Cas9系统载体元件示意图如图1所示，含有Nickase蛋白编码基因和guide RNA编码序列，以及各自的启动子。此外，还设计了能同时修复β17(A→T)和β41-42(-TCTT)两个突变位点的同源重组载体。该同源重组载体的元件和结构示意图如图2所示，两端分别为上下游同源臂(与正常的HBB1基因上的片段序列相同)，中间为tNGFR(已经广泛用于临床细胞分离的一种蛋白，已证实在造血干细胞表达不会影响细胞的生物学性能，同时不会引起机体的免疫排斥反应，有利于后期工程化HSC的分选和纯化)表达框。由于tNGFR表达框插入位点属于HBB1基因内含子区(位于β17和β41-42中间)，所以不会影响HBB1基因的表达。HBB1基因的切割和同源重组修复示意图如图3所示，利用Nickase缺口酶在β17和β41-42两个突变位点附近进行单链切割，形成DNA单链缺口，同时利用同源重组载体(同源臂包含了正常的HBB1序列，用于修复突变位点；上下游同源臂之间插入tNGFR，用于工程化细胞的筛选分离)进行同源重组，达到修复β17(A→T)和/或β41-42(-TCTT)位点的目的，同时在β17和β41-42之间的内含子区插入tNGFR以利于后续细胞分选。

以下实施例中使用到的实验材料包含：商品化的CRISPR-Cas9载体，如pX458(图4)，pX601(图6)；HEK293T细胞；大肠杆菌感受态细胞TOP10。

实施例1：采用CRISPR-Sp Nickase基因编辑系统切割HBB1基因

1.1 gRNA准备

(1)根据HBB1基因序列设计20nt的gRNA的靶序列；

(2)分别合成gRNA的靶序列的正义链和反义链(正义链的5’-端加cacc，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5’-端加caccG；在反义链的5’-端加aaac，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3’-端加C)；

(3)将上述gRNA正义链和反义链混合，90℃处理后自然冷却至室温进行退火处理，合成带粘性末端的双链gRNA的靶序列。

表1针对HBB1基因所设计的gRNA的靶序列正义链如下：

SEQ ID NO:1	gcaacctcaaacagacacca
		SEQ ID NO:2	ctcaggagtcagatgcacca
SEQ ID NO:3	catggtgcatctgactcctg
		SEQ ID NO:4	gtaacggcagacttctcctc
SEQ ID NO:5	agtctgccgttactgccctg
		SEQ ID NO:6	tctgccgttactgccctgtg
SEQ ID NO:7	cgttactgccctgtggggca
		SEQ ID NO:8	cacgttcaccttgccccaca
SEQ ID NO:9	gtggagacagagaagactct
		SEQ ID NO:10	aagactcttgggtttctgat
SEQ ID NO:11	gggtgggaaaatagaccaat

1.2载体准备

(1)pX458质粒(图4)扩增和提取，并测定质粒浓度；

(2)采用限制性内切酶Bbs I对pX458进行酶切，37℃酶切1h后加loading buffer终止反应。

(3)琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒pX458，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。

1.3连接转化

(1)将切胶回收的线性化pX458载体与退火后的gRNA双链进行连接反应；

(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。

(3)将复苏后的TOP10细胞涂布LB固体平板(Amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp+)中扩大培养。

(5)使用引物SeqF(5’-ATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3’)(SEQ ID NO:12)，对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

1.4细胞转染

(1)HEK293T细胞铺板；

(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将1.3(6)中提取的质粒分别转染HEK293T细胞；

(3)转染后的细胞培养48小时，离心收集细胞。

1.5 T7E1酶切分析突变效率

(1)将上述1.4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；

(2)分别在gRNA结合位点上下游设计PCR引物，HBB-T1-130-F(5’-GAAGTCCAACTCCTAAGCCAG-3’)(SEQ ID NO:13)和HBB-T1-918-R(5’-tgatgcaatcattcgtctgtttc-3’)(SEQ ID NO:14)；

(3)分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段；

(4)纯化回收PCR产物，并测定产物浓度；

(5)将上述纯化的PCR产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；

(6)上述每管退火产物分别加入T7核酸内切酶1(T7E1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照组CK(不加T7E1，用ddH2O代替)，37℃酶切1h。

(7)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，以购自康为世纪的100bp Ladder作为marker(M)，结果见图5：各泳道编号对应gRNA靶序列的编号，根据T7E1酶切的原理，切割效率越高表示gRNA的突变效率越高，由此确定靶序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的gRNA具有较高的突变效率，可用于HBB1基因的编辑和点突变修复。

实施例2：采用CRISPR-Sa Nickase基因编辑系统切割HBB1基因

2.1 gRNA准备

(1)根据HBB1基因序列设计21nt的gRNA的靶序列；

(2)分别合成gRNA靶序列的正义链和反义链(正义链的5’-端加cacc，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5’-端加caccG；在反义链的5’-端加aaac，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3’-端加C)；

(3)将上述gRNA靶序列的正义链和反义链混合，90℃处理后自然冷却至室温进行退火处理，合成带粘性末端的双链gRNA。

表2针对HBB1基因所设计的gRNA的靶序列正义链如下：

2.2载体准备

(1)pX601质粒(图6)扩增和提取，并测定质粒浓度；

(2)采用限制性内切酶Bsa I对pX601进行酶切，37℃酶切1h后加loading buffer终止反应。

(3)琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒pX601，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。

2.3连接转化

(1)将切胶回收的线性化pX601载体与退火后的gRNA双链进行连接反应；

(5)使用引物601-SeqF(5’-TTCCTTgACCCTggAAggTg-3’)(SEQ ID NO:28)，对上述菌液分别测序；

2.4细胞转染

(1)HEK293T细胞铺板；

(3)转染后的细胞培养48小时，离心收集细胞。

2.5 T7E1酶切分析突变效率

(3)分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段；

(4)纯化回收PCR产物，并测定产物浓度；

(7)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，以购自康为世纪的100bp Ladder作为marker(M)，结果见图7：各泳道编号对应gRNA靶序列的编号，根据T7E1酶切的原理，切割效率越高表示gRNA的突变效率越高，由此确定靶序列如SEQ ID NO:17所示的gRNA具有较高的突变效率，可用于HBB1基因的编辑和点突变修复。

实施例3采用CRISPR-Sp Nickase基因编辑系统切割HBB1基因

将实施例1中筛选出来突变效率较高的gRNA，用于Sp Nickase载体构建，以下实施例以gRNA靶序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:9为例，同理可证其他gRNA的实施效果。

3.1载体准备

(1)pX461质粒(图8)扩增和提取，并测定质粒浓度；

(2)按照1.2(2)-(3)用限制性内切酶Bbs I对pX461进行酶切后，切胶回收，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。

3.2连接转化

(1)将切胶回收的线性化pX461载体与1.1中合成的SEQIDNO:3和SEQIDNO:9的gRNA双链进行连接反应；

(2)按照1.3(2)-(6)将连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10后，挑取单菌落进行测序，并将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

3.3细胞转染

按照1.4(1)-(3)，将3.2(2)中提取的质粒转染HEK293T细胞，转染后的细胞培养48小时，离心收集细胞。

3.4 T7E1酶切分析突变效率

(1)将上述3.3收集的细胞提取细胞基因组，并按照1.5(2)-(6)，进行T7E1酶切检测。

(2)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，以购自康为世纪的100bp Ladder作为marker(M)，结果见图9：转染质粒pX458-SEQIDNO:3、pX458-SEQIDNO:9的实验组，可发生正常切割；而pX461为SpNickase，转染质粒pX461-SEQIDNO:3、pX461-SEQIDNO:9的实验组无切割效率，说明Sp Nickase不能切断双链，只能形成单链切口。

实施例4同源重组载体构建及HBBI基因的定点同源重组

4.1同源重组载体构建

4.1.1 SEQ ID NO:9上游同源臂载体构建

(1)以HEK293T细胞基因组为模板，以SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30为引物扩增SEQIDNO:9上游同源臂，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的片段；

表3 HBB1基因靶位点SEQ ID NO:9上下游同源臂及tNGFR扩增引物

(2)用SnaBI和SalI-HF双酶切质粒pDonor-TALEN-EGFP，37℃酶切1h，酶切后1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收；

(3)上述酶切产物与SEQ ID NO:9上游同源臂PCR产物进行同源重组，37℃重组30min，冰浴5min；

(4)取5μL上述重组产物和20μL DH5α大肠杆菌感受态混合后冰浴30min，42℃热击60s，冰上静置5min后，加入230μL LB培养基(不加抗生素)，37℃摇床45min，涂板，37℃培养过夜；

(5)从上述平板上分别挑取单菌落接种到500μL LB液体培养基(Amp)中扩大培养4h后测序；

(6)对测序正确的单菌落扩大培养并提取质粒pDonor-SEQIDNO:9-F。

4.1.2 SEQ ID NO:9下游同源臂载体构建

(1)以HEK293T细胞基因组为模板，以SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32为引物扩增SEQIDNO:9下游同源臂，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的片段；

(2)用NotI-HF酶切4.1.1(6)提取质粒pDonor-SEQIDNO:9-F，37℃酶切1h；然后加入BstBI，65℃酶切1h，酶切后1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收；

(3)依照4.1.1(3)-(5)进行重组；

(4)对测序正确的单菌落扩大培养并提取质粒pDonor-SEQIDNO:9-R。

4.1.3 tNGFR载体构建

(1)以保存tNGFR质粒为模板，以SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34为引物扩增tNGFR-polyA目的片段，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的片段；

(2)用AfeI和SbfI双酶切4.1.2(4)提取质粒pDonor-SEQIDNO:9-R，37℃酶切1h，酶切后1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收；

(3)依照4.1.1(3)-(5)进行重组；

(4)对测序正确的单菌落扩大培养并提取质粒pDonor-tNGFR-SEQIDNO:9(图10)。

4.2 CRISPR-Cas9介导的HBBI基因的定点同源重组

4.2.1细胞转染

(1)Hela细胞铺板；

(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将3.2(2)中提取的质粒pX461-SEQ ID NO:9和4.1.3(4)中提取的质粒pDonor-tNGFR-SEQIDNO:9共同转染Hela细胞；

(3)转染5d开始G418筛选，浓度为600微克/毫升。

(4)转染传代到14d做流式分筛，筛选tNGFR表达的单克隆细胞。

4.2.2单克隆检测重组效率

(1)将4.2.1(4)中筛选的单克隆进行扩增培养；

(2)将上述扩增培养的细胞提取基因组，并检测基因组浓度；

(3)“双引物”法鉴定单克隆：将上述提取的单克隆细胞基因组使用表4引物分别进行PCR检测，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小，以购自TAKARA的DL5000作为marker(M)，结果见图11(a)：HM表示双拷贝同源重组，即单克隆细胞两条染色体HBB1基因SEQ ID NO:9位点均进行tNGFR重组，则PCR产物大小为2583bp；HZ表示单拷贝同源重组，即只有一条染色体HBB1基因SEQ ID NO:9位点进行tNGFR重组，PCR检测有两条PCR产物，大小分别为2583bp和789bp；WT表示HBB1基因SEQ ID NO:9位点未发生重组，则PCR产物仅有一条，大小为789bp。

表4“双引物”法检测tNGFR重组效率引物

(4)对50个单克隆细胞进行检测，统计结果见图11(b)，单克隆细胞发生单拷贝整合的比例为54％，未发生整合的比例为46％。

(5)将上述2583bp PCR产物送测序，测序结果如图12所示：测序序列包含HBB1基因、SEQ ID NO:9上游同源臂和部分pDonor-tNGFR-SEQIDNO:9重组载体序列，表明pDonor-tNGFR-SEQIDNO:9载体在HBB1基因SEQ ID NO:9位点成功进行同源重组。测序序列如SEQIDNO:37所示。

实施例5CRISPR-Cas9介导的HBBI基因定点修复

5.1 β17(A→T)突变的细胞系构建

5.1.1 β17(A→T)突变载体构建

(1)合成SEQIDNO:9β17(A→T)上游同源臂(图13)。

(2)以上述合成片段为模板，以SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30为引物扩增SEQIDNO:9β17(A→T)上游同源臂，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的片段；

(3)用SnaBI和SalI-HF双酶切4.1.2(4)提取质粒pDonor-SEQIDNO:9-R，37℃酶切1h，酶切后1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收；

(4)依照4.1.1(3)-(5)进行重组；

(5)对测序正确的单菌落扩大培养并提取质粒pDonor-β17-SEQIDNO:9(图14)。

5.1.2 CRISPR-Cas9介导的HBB1基因β17(A→T)的定点突变

(1)Hela细胞铺板；

(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将3.2(2)中提取的质粒pX601-SEQ ID NO:9和5.1.1(5)中提取的质粒pDonor-β17-SEQIDNO:9共同转染Hela细胞；

(3)转染5d开始G418筛选，浓度为600微克/毫升；

(4)转染传代到14d做流式分筛，筛选EGFP表达的阳性细胞；

(5)将上述筛选到的EGFP阳性细胞铺板，采用Lipofectamine 3000试剂盒将带有Cre酶的质粒转染EGFP阳性细胞；

(6)转染传代到10d做流式分筛，筛选EGFP不表达的Helaβ17(A→T)细胞系；

(7)以Helaβ17(A→T)细胞为模板，以SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30为引物扩增SEQIDNO:9β17(A→T)上游同源臂送测序，测序结果如图15所示，图15表明HBB1基因第102位碱基由A定点突变为T。

5.2 β41-42(-TCTT)突变的细胞系构建

5.2.1 β41-42(-TCTT)突变载体构建

(1)合成SEQIDNO:9β41-42(-TCTT)下游同源臂(图16)。

(2)以上述合成片段为模板，以SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32为引物扩增SEQIDNO:9β41-42(-TCTT)下游同源臂，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的片段；

(3)用NotI-HF酶切4.1.1(6)提取质粒pDonor-SEQIDNO:9-F，37℃酶切1h；然后加入BstBI，65℃酶切1h，酶切后1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收；

(4)依照4.1.1(3)-(5)进行重组；

(5)对测序正确的单菌落扩大培养并提取质粒pDonor-β41-42-SEQIDNO:9(图17)。

5.2.2 CRISPR-Cas9介导的HBB1基因β41-42(-TCTT)的定点突变

(1)Hela细胞铺板；

(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将3.2(2)中提取的质粒pX461-SEQ ID NO:9和4.2.1(5)中提取的质粒pDonor-β41-42-SEQIDNO:17共同转染Hela细胞；

(3)按照5.1.2(3)-(6)筛选获得Helaβ41-42(-TCTT)细胞系；

(4)以Helaβ41-42(-TCTT)细胞为模板，以SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32为引物扩增SEQIDNO:17β41-42(-TCTT)下游同源臂送测序，测序结果如图18所示，图18表明HBB1基因第305位-308位碱基TCTT被删除。

5.3 CRISPR-Cas9介导的HBBI基因定点修复

5.3.1 HBBI基因定点修复载体构建

(1)以HEK293T细胞基因组为模板，以SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39为引物扩增SEQ ID NO:3上下游同源臂，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的片段；

表5 HBB1基因靶位点SEQ ID NO:3上下游同源臂扩增引物

引物类型	引物编号	引物序列
			上下游同源臂扩增引物-F	SEQIDNO:38	ttctagtggttggctacgtaactgcattaagaggtctctag
上下游同源臂扩增引物-R	SEQIDNO:39	tctgcaggctctagattcgaaattatgaatatgcaaataagcacaca

(2)用SnaBI酶切质粒pDonor-TALEN-EGFP，37℃酶切1h；然后加入BstBI，65℃酶切1h，酶切后1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收；

(3)依照4.1.1(3)-(5)进行重组；

(4)对测序正确的单菌落扩大培养并提取质粒pDonor-SEQIDNO:3(图19)。

5.3.2 CRISPR-Cas9介导的HBBI基因定点修复

(1)Helaβ17(A→T)细胞和Helaβ41-42(-TCTT)细胞分别铺板；

(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将3.2(2)中提取的质粒pX461-SEQ ID NO:3和5.3.1(4)中提取的质粒pDonor-SEQIDNO:3共同转染上述细胞；

(3)转染7d提取基因组，并检测基因组浓度；

(4)以上述基因组为模板，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39为引物分别扩增重组片段；

(5)上述PCR产物分别连接T载体送测序，测序结果见图20。由图20(a)可知Helaβ17(A→T)细胞HBB1基因突变位点T被定点修复为A；由图20(b)可知Helaβ41-42(-TCTT)细胞HBB1基因缺失被定点修复为TCTT。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广东赤萌医疗科技有限公司

<120> 一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑

试剂盒

<130> 2018

<160> 51

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaacctcaa acagacacca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcaggagtc agatgcacca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catggtgcat ctgactcctg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtaacggcag acttctcctc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agtctgccgt tactgccctg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctgccgtta ctgccctgtg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgttactgcc ctgtggggca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cacgttcacc ttgccccaca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtggagacag agaagactct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aagactcttg ggtttctgat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gggtgggaaa atagaccaat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atttttgtga tgctcgtcag 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaagtccaac tcctaagcca g 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgatgcaatc attcgtctgt ttc 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtaacggca gacttctcct c 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gccctgtggg gcaaggtgaa c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgtggagac agagaagact c 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtcagtgcct atcagaaacc c 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gaaaatagac caataggcag a 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agggtagacc accagcagcc t 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acccttggac ccagaggttc t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

actcaaagaa cctctgggtc c 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cccaaaggac tcaaagaacc t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cagaggttct ttgagtcctt t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agggttgccc ataacagcat c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tcttgccatg agccttcacc t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctcaagggca cctttgccac a 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ttccttgacc ctggaaggtg 20

<210> 29

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ttctagtggt tggctacgta aaatgaatgc atatatatgt atatgtatgt g 51

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

agcttatcga taccgtcgac gagtcttctc tgtctccaca 40

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

actagttcta gagcggccgc ttgggtttct gataggcact 40

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ctgcaggctc tagattcgaa gaagaaagca ttttttaaaa ttacaaatgc 50

<210> 33

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ctttcagatc cgctagcgct gccaccatgg acgggccgcg cctgctgctg t 51

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

taggtccctc gacctgcagg atctcatgct ggagttcttc gcc 43

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acgcagtatt cttagtggac tagagga 27

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

atcgccttct tgacgagttc ttctgag 27

<210> 37

<211> 2420

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1923)..(1923)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1949)..(1949)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2024)..(2025)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2032)..(2032)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 37

gagtcacaga ggctttttgt tcccccagac actcttgcag attagtccag gcagaaacag 60

ttagatgtcc ccagttaacc tcctatttga caccactgat taccccattg atagtcacac 120

tttgggttgt aagtgacttt ttatttattt gtatttttga ctgcattaag aggtctctag 180

ttttttatct cttgtttccc aaaacctaat aagtaactaa tgcacagagc acattgattt 240

gtatttattc tatttttaga cataatttat tagcatgcat gagcaaatta agaaaaacaa 300

caacaaatga atgcatatat atgtatatgt atgtgtgtat atatacacac atatatatat 360

atattttttc ttttcttacc agaaggtttt aatccaaata aggagaagat atgcttagaa 420

ccgaggtaga gttttcatcc attctgtcct gtaagtattt tgcatattct ggagacgcag 480

gaagagatcc atctacatat cccaaagctg aattatggta gacaaaactc ttccactttt 540

agtgcatcaa cttcttattt gtgtaataag aaaattggga aaacgatctt caatatgctt 600

accaagctgt gattccaaat attacgtaaa tacacttgca aaggaggatg tttttagtag 660

caatttgtac tgatggtatg gggccaagag atatatctta gagggagggc tgagggtttg 720

aagtccaact cctaagccag tgccagaaga gccaaggaca ggtacggctg tcatcactta 780

gacctcaccc tgtggagcca caccctaggg ttggccaatc tactcccagg agcagggagg 840

gcaggagcca gggctgggca taaaagtcag ggcagagcca tctattgctt acatttgctt 900

ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc tgactcctga 960

ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag ttggtggtga 1020

ggccctgggc aggttggtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca atagaaactg 1080

ggcatgtgga gacagagaag actcgtcgac ggtatcgata agctagcttg ggctgcaggt 1140

cgagggacct aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatattaa gggttccgga 1200

tcagcttgat ggggatccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 1260

tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 1320

aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 1380

ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat 1440

ggctgattat gatcctctag agtcgcagat ccagacatga taagatacat tgatgagttt 1500

ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 1560

attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 1620

cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc 1680

tacaaatgtg gtatggctga ttatgatcct ctagagtcgc agatccagac atgataagat 1740

acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 1800

aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca 1860

acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa 1920

gcnagtaaaa cctctacaaa atgtggtang gctgattatg atcctctaga gtcgcagatc 1980

ctctagagtc gcagatctgc aagctttctg atggaattag aacnnggcaa ancaatactg 2040

agaatgaagt gtatgtggaa cagaggctgc tgatctcgtt cttcaggcta tgaaactgac 2100

acatttggaa accacagtac ttagaaccac aaagtgggaa tcaagagaaa aacaatgatc 2160

ccacgagaga tctatagatc tatagatcat gagtgggagg aatgagctgg cccttaattt 2220

ggttttgctt gtttaaatta tgatatccaa ctatgaaaca ttatcataaa gcaatagtaa 2280

agagccttca gtaaagagca ggcatttatc taatcccacc ccacccccac ccccgtagct 2340

ccaatccttc cattcaaaat gtaggtactc tgttctcacc cttcttaaca aagtatgaca 2400

ggaaaaactt ccattttagt 2420

<210> 38

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

ttctagtggt tggctacgta actgcattaa gaggtctcta g 41

<210> 39

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tctgcaggct ctagattcga aattatgaat atgcaaataa gcacaca 47

<210> 40

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

actgcattaa gaggtctcta gttttttatc tcttgtttcc caaaacctaa taagtaacta 60

atgcacagag cacattgatt tgtatttatt ctatttttag acataattta ttagcatgca 120

tgagcaaatt aagaaaaaca acaacaaatg aatgcatata tatgtatatg tatgtgtgta 180

tatatacaca catatatata tatatttttt cttttcttac cagaaggttt taatccaaat 240

aaggagaaga tatgcttaga accgaggtag agttttcatc cattctgtcc tgtaagtatt 300

ttgcatattc tggagacgca ggaagagatc catctacata tcccaaagct gaattatggt 360

agacaaaact cttccacttt tagtgcatca acttcttatt tgtgtaataa gaaaattggg 420

aaaacgatct tcaatatgct taccaagctg tgattccaaa tattacgtaa atacacttgc 480

aaaggaggat gtttttagta gcaatttgta ctgatggtat ggggccaaga gatatatctt 540

agagggaggg ctgagggttt gaagtccaac tcctaagcca gtgccagaag agccaaggac 600

aggtacggct gtcatcactt agacctcacc ctgtggagcc acaccctagg gttggccaat 660

ctactcccag gagcagggag ggcaggagcc agggctgggc ataaaagtca gggcagagcc 720

atctattgct tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac tagcaacctc aaacagacac 780

catggtgcat ctgactcctg 800

<210> 41

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

aggagaagtc tgccgttact gccctgtggg gcaaggtgaa cgtggatgaa gttggtggtg 60

aggccctggg caggttggta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc aatagaaact 120

gggcatgtgg agacagagaa gactcttggg tttctgatag gcactgactc tctctgccta 180

ttggtctatt ttcccaccct taggctgctg gtggtctacc cttggaccca gaggttcttt 240

gagtcctttg gggatctgtc cactcctgat gctgttatgg gcaaccctaa ggtgaaggct 300

catggcaaga aagtgctcgg tgcctttagt gatggcctgg ctcacctgga caacctcaag 360

ggcacctttg ccacactgag tgagctgcac tgtgacaagc tgcacgtgga tcctgagaac 420

ttcagggtga gtctatggga cgcttgatgt tttctttccc cttcttttct atggttaagt 480

tcatgtcata ggaaggggat aagtaacagg gtacagttta gaatgggaaa cagacgaatg 540

attgcatcag tgtggaagtc tcaggatcgt tttagtttct tttatttgct gttcataaca 600

attgttttct tttgtttaat tcttgctttc tttttttttc ttctccgcaa tttttactat 660

tatacttaat gccttaacat tgtgtataac aaaaggaaat atctctgaga tacattaagt 720

aacttaaaaa aaaactttac acagtctgcc tagtacatta ctatttggaa tatatgtgtg 780

cttatttgca tattcataat 800

<210> 42

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tctcttgttt cccaaaacct aataagtaac taatgcacag agcacattga tttgtattta 60

ttctattttt agacataatt tattagcatg catgagcaaa ttaagaaaaa caacaacaaa 120

tgaatgcata tatatgtata tgtatgtgtg tatatataca cacatatata tatatatttt 180

ttcttttctt accagaaggt tttaatccaa ataaggagaa gatatgctta gaaccgaggt 240

agagttttca tccattctgt cctgtaagta ttttgcatat tctggagacg caggaagaga 300

tccatctaca tatcccaaag ctgaattatg gtagacaaaa ctcttccact tttagtgcat 360

caacttctta tttgtgtaat aagaaaattg ggaaaacgat cttcaatatg cttaccaagc 420

tgtgattcca aatattacgt aaatacactt gcaaaggagg atgtttttag tagcaatttg 480

tactgatggt atggggccaa gagatatatc ttagagggag ggctgagggt ttgaagtcca 540

actcctaagc cagtgccaga agagccaagg acaggtacgg ctgtcatcac ttagacctca 600

ccctgtggag ccacacccta gggttggcca atctactccc aggagcaggg agggcaggag 660

ccagggctgg gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac 720

aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac accatggtgc atctgactcc tgaggagaag 780

tctgccgtta ctgccctgtg 800

<210> 43

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg ggcaggttgg tatcaaggtt 60

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcatgt ggagacagag aagactcttg 120

ggtttctgat aggcactgac tctctctgcc tattggtcta ttttcccacc cttaggctgc 180

tggtggtcta cccttggacc cagaggttct ttgagtcctt tggggatctg tccactcctg 240

atgctgttat gggcaaccct aaggtgaagg ctcatggcaa gaaagtgctc ggtgccttta 300

gtgatggcct ggctcacctg gacaacctca agggcacctt tgccacactg agtgagctgc 360

actgtgacaa gctgcacgtg gatcctgaga acttcagggt gagtctatgg gacgcttgat 420

gttttctttc cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca taggaagggg ataagtaaca 480

gggtacagtt tagaatggga aacagacgaa tgattgcatc agtgtggaag tctcaggatc 540

gttttagttt cttttatttg ctgttcataa caattgtttt cttttgttta attcttgctt 600

tctttttttt tcttctccgc aatttttact attatactta atgccttaac attgtgtata 660

acaaaaggaa atatctctga gatacattaa gtaacttaaa aaaaaacttt acacagtctg 720

cctagtacat tactatttgg aatatatgtg tgcttatttg catattcata atctccctac 780

tttattttct tttattttta 800

<210> 44

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

aaatgaatgc atatatatgt atatgtatgt gtgtatatat acacacatat atatatatat 60

tttttctttt cttaccagaa ggttttaatc caaataagga gaagatatgc ttagaaccga 120

ggtagagttt tcatccattc tgtcctgtaa gtattttgca tattctggag acgcaggaag 180

agatccatct acatatccca aagctgaatt atggtagaca aaactcttcc acttttagtg 240

catcaacttc ttatttgtgt aataagaaaa ttgggaaaac gatcttcaat atgcttacca 300

agctgtgatt ccaaatatta cgtaaataca cttgcaaagg aggatgtttt tagtagcaat 360

ttgtactgat ggtatggggc caagagatat atcttagagg gagggctgag ggtttgaagt 420

ccaactccta agccagtgcc agaagagcca aggacaggta cggctgtcat cacttagacc 480

tcaccctgtg gagccacacc ctagggttgg ccaatctact cccaggagca gggagggcag 540

gagccagggc tgggcataaa agtcagggca gagccatcta ttgcttacat ttgcttctga 600

cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg tgcatctgac tcctgaggag 660

aagtctgccg ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg atgaagttgg tggtgaggcc 720

ctgggcaggt tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggca 780

tgtggagaca gagaagactc 800

<210> 45

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ttgggtttct gataggcact gactctctct gcctattggt ctattttccc acccttaggc 60

tgctggtggt ctacccttgg acccagaggt tctttgagtc ctttggggat ctgtccactc 120

ctgatgctgt tatgggcaac cctaaggtga aggctcatgg caagaaagtg ctcggtgcct 180

ttagtgatgg cctggctcac ctggacaacc tcaagggcac ctttgccaca ctgagtgagc 240

tgcactgtga caagctgcac gtggatcctg agaacttcag ggtgagtcta tgggacgctt 300

gatgttttct ttccccttct tttctatggt taagttcatg tcataggaag gggataagta 360

acagggtaca gtttagaatg ggaaacagac gaatgattgc atcagtgtgg aagtctcagg 420

atcgttttag tttcttttat ttgctgttca taacaattgt tttcttttgt ttaattcttg 480

ctttcttttt ttttcttctc cgcaattttt actattatac ttaatgcctt aacattgtgt 540

ataacaaaag gaaatatctc tgagatacat taagtaactt aaaaaaaaac tttacacagt 600

ctgcctagta cattactatt tggaatatat gtgtgcttat ttgcatattc ataatctccc 660

tactttattt tcttttattt ttaattgata cataatcatt atacatattt atgggttaaa 720

gtgtaatgtt ttaatatgtg tacacatatt gaccaaatca gggtaatttt gcatttgtaa 780

ttttaaaaaa tgctttcttc 800

<210> 46

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tatatgtata tgtatgtgtg tatatataca cacatatata tatatatttt ttcttttctt 60

accagaaggt tttaatccaa ataaggagaa gatatgctta gaaccgaggt agagttttca 120

tccattctgt cctgtaagta ttttgcatat tctggagacg caggaagaga tccatctaca 180

tatcccaaag ctgaattatg gtagacaaaa ctcttccact tttagtgcat caacttctta 240

tttgtgtaat aagaaaattg ggaaaacgat cttcaatatg cttaccaagc tgtgattcca 300

aatattacgt aaatacactt gcaaaggagg atgtttttag tagcaatttg tactgatggt 360

atggggccaa gagatatatc ttagagggag ggctgagggt ttgaagtcca actcctaagc 420

cagtgccaga agagccaagg acaggtacgg ctgtcatcac ttagacctca ccctgtggag 480

ccacacccta gggttggcca atctactccc aggagcaggg agggcaggag ccagggctgg 540

gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac aactgtgttc 600

actagcaacc tcaaacagac accatggtgc atctgactcc tgaggagaag tctgccgtta 660

ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg ggcaggttgg 720

tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcatgt ggagacagag 780

aagactcttg ggtttctgat 800

<210> 47

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

aggcactgac tctctctgcc tattggtcta ttttcccacc cttaggctgc tggtggtcta 60

cccttggacc cagaggttct ttgagtcctt tggggatctg tccactcctg atgctgttat 120

gggcaaccct aaggtgaagg ctcatggcaa gaaagtgctc ggtgccttta gtgatggcct 180

ggctcacctg gacaacctca agggcacctt tgccacactg agtgagctgc actgtgacaa 240

gctgcacgtg gatcctgaga acttcagggt gagtctatgg gacgcttgat gttttctttc 300

cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca taggaagggg ataagtaaca gggtacagtt 360

tagaatggga aacagacgaa tgattgcatc agtgtggaag tctcaggatc gttttagttt 420

cttttatttg ctgttcataa caattgtttt cttttgttta attcttgctt tctttttttt 480

tcttctccgc aatttttact attatactta atgccttaac attgtgtata acaaaaggaa 540

atatctctga gatacattaa gtaacttaaa aaaaaacttt acacagtctg cctagtacat 600

tactatttgg aatatatgtg tgcttatttg catattcata atctccctac tttattttct 660

tttattttta attgatacat aatcattata catatttatg ggttaaagtg taatgtttta 720

atatgtgtac acatattgac caaatcaggg taattttgca tttgtaattt taaaaaatgc 780

tttcttcttt taatatactt 800

<210> 48

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

atatatacac acatatatat atatattttt tcttttctta ccagaaggtt ttaatccaaa 60

taaggagaag atatgcttag aaccgaggta gagttttcat ccattctgtc ctgtaagtat 120

tttgcatatt ctggagacgc aggaagagat ccatctacat atcccaaagc tgaattatgg 180

tagacaaaac tcttccactt ttagtgcatc aacttcttat ttgtgtaata agaaaattgg 240

gaaaacgatc ttcaatatgc ttaccaagct gtgattccaa atattacgta aatacacttg 300

caaaggagga tgtttttagt agcaatttgt actgatggta tggggccaag agatatatct 360

tagagggagg gctgagggtt tgaagtccaa ctcctaagcc agtgccagaa gagccaagga 420

caggtacggc tgtcatcact tagacctcac cctgtggagc cacaccctag ggttggccaa 480

tctactccca ggagcaggga gggcaggagc cagggctggg cataaaagtc agggcagagc 540

catctattgc ttacatttgc ttctgacaca actgtgttca ctagcaacct caaacagaca 600

ccatggtgca tctgactcct gaggagaagt ctgccgttac tgccctgtgg ggcaaggtga 660

acgtggatga agttggtggt gaggccctgg gcaggttggt atcaaggtta caagacaggt 720

ttaaggagac caatagaaac tgggcatgtg gagacagaga agactcttgg gtttctgata 780

ggcactgact ctctctgcct 800

<210> 49

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

attggtctat tttcccaccc ttaggctgct ggtggtctac ccttggaccc agaggttctt 60

tgagtccttt ggggatctgt ccactcctga tgctgttatg ggcaacccta aggtgaaggc 120

tcatggcaag aaagtgctcg gtgcctttag tgatggcctg gctcacctgg acaacctcaa 180

gggcaccttt gccacactga gtgagctgca ctgtgacaag ctgcacgtgg atcctgagaa 240

cttcagggtg agtctatggg acgcttgatg ttttctttcc ccttcttttc tatggttaag 300

ttcatgtcat aggaagggga taagtaacag ggtacagttt agaatgggaa acagacgaat 360

gattgcatca gtgtggaagt ctcaggatcg ttttagtttc ttttatttgc tgttcataac 420

aattgttttc ttttgtttaa ttcttgcttt cttttttttt cttctccgca atttttacta 480

ttatacttaa tgccttaaca ttgtgtataa caaaaggaaa tatctctgag atacattaag 540

taacttaaaa aaaaacttta cacagtctgc ctagtacatt actatttgga atatatgtgt 600

gcttatttgc atattcataa tctccctact ttattttctt ttatttttaa ttgatacata 660

atcattatac atatttatgg gttaaagtgt aatgttttaa tatgtgtaca catattgacc 720

aaatcagggt aattttgcat ttgtaatttt aaaaaatgct ttcttctttt aatatacttt 780

tttgtttatc ttatttctaa 800

<210> 50

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

taggtcttga aaggagtggg aattggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg 60

cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc ctagagaagg 120

tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt 180

gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt 240

gccgccagaa cacagg 256

<210> 51

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

atggacgggc cgcgcctgct gctgttgctg cttctggggg tgtcccttgg aggtgccaag 60

gaggcatgcc ccacaggcct gtacacacac agcggtgagt gctgcaaagc ctgcaacctg 120

ggcgagggtg tggcccagcc ttgtggagcc aaccagaccg tgtgtgagcc ctgcctggac 180

agcgtgacgt tctccgacgt ggtgagcgcg accgagccgt gcaagccgtg caccgagtgc 240

gtggggctcc agagcatgtc ggcgccgtgc gtggaggccg acgacgccgt gtgccgctgc 300

gcctacggct actaccagga tgagacgact gggcgctgcg aggcgtgccg cgtgtgcgag 360

gcgggctcgg gcctcgtgtt ctcctgccag gacaagcaga acaccgtgtg cgaggagtgc 420

cccgacggca cgtattccga cgaggccaac cacgtggacc cgtgcctgcc ctgcaccgtg 480

tgcgaggaca ccgagcgcca gctccgcgag tgcacacgct gggccgacgc cgagtgcgag 540

gagatccctg gccgttggat tacacggtcc acacccccag agggctcgga cagcacagcc 600

cccagcaccc aggagcctga ggcacctcca gaacaagacc tcatagccag cacggtggca 660

ggtgtggtga ccacagtgat gggcagctcc cagcccgtgg tgacccgagg caccaccgac 720

aacctcatcc ctgtctattg ctccatcctg gctgctgtgg ttgtgggcct tgtggcctac 780

atagccttca agaggtggaa c 801

Claims

1.一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA，其特征在于，包括与Sp Nickase配合使用的gRNA和与Sa Nickase配合使用的gRNA中的至少一种；

2.一种用于修复HBB1基因点突变的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括CRISPR-Nickase系统和同源重组片段；

所述CRISPR-Nickase系统包括Sp Nickase，以及与Sp Nickase配合使用的gRNA，或SaNickase，以及与Sa Nickase配合使用的gRNA；

所述同源重组片段包括上游同源臂和下游同源臂，所述上游同源臂用于修复HBB1基因β17(A→T)位点突变，所述下游同源臂用于修复HBB1基因β41-42(-TCTT)位点突变。

3.根据权利要求2所述的基因编辑系统，其特征在于，所述同源重组片段还包括tNGFR基因编码序列和tNGFR基因的启动子，所述tNGFR基因编码序列和tNGFR基因启动子均位于所述上游同源臂和下游同源臂之间，所述tNGFR基因启动子位于所述tNGFR基因编码序列的上游。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体表达如权利要求1所述的gRNA或者表达如权利要求2-3任一所述的基因编辑系统。

5.一种基因编辑试剂盒，其特征在于，所述基因编辑试剂盒包括如权利要求4所述的表达载体。

6.一种造血干细胞，其特征在于，所述造血干细胞含有如权利要求2-3任一所述的基因编辑系统或者如权利要求4所述的表达载体。

7.如权利要求1所述的gRNA、如权利要求2-3任一所述的基因编辑系统在制备治疗地中海贫血症和/或镰刀型贫血症的药物中的用途。

8.如权利要求4所述的表达载体在制备治疗地中海贫血症和/或镰刀型贫血症的药物中的用途。

9.如权利要求5任一所述的基因编辑试剂盒在制备治疗地中海贫血症和/或镰刀型贫血症的药物中的用途。

10.如权利要求6所述的造血干细胞在制备治疗地中海贫血症和/或镰刀型贫血症的药物中的用途。