CN109576304A

CN109576304A - 一种通用型转录组编辑载体及其构建方法

Info

Publication number: CN109576304A
Application number: CN201811445445.5A
Authority: CN
Inventors: 刘旭; 王英美; 张涌
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2019-04-05

Abstract

本发明公开了一种通用型转录组编辑载体及其制备方法，对Cas13d基因进行序列优化，并且对Cas13d进行点突变，使HEPN失活；在pCas13d‑gRNA的多克隆位点处定向插入靶向目的基因的guide RNA序列，在guide RNA的辅助作用下将Cas13d蛋白定点结合到特定的目的基因序列上；利用Cas13d蛋白结合在剪接受体的作用，进行转录组编辑。本发明基于CRISPR‑Cas13d，将HEPN无活性的dCas13d设计为灵活的RNA结合模块以靶向特定的RNA元件，实现基因组编辑并且不扰乱蛋白质翻译，为RNA研究提供了一个通用工具。

Description

一种通用型转录组编辑载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，更具体的说是涉及通用型转录组编辑载体及其构建方法，主要是在哺乳动物转录组水平进行编辑的一种通用工具。

背景技术

基因组编辑技术作为一种新型分子生物学技术自上世纪80年代末发现以来就受到广泛关注，它的迅速发展正改变着人们对真核生物基因组进行高效和定向改变的能力。其中包括对内源基因或等位基因的功能性敲除，对特定突变或基因的多态性进行靶向诱导或校正，以及对正常细胞功能的遗传贡献进行精确的建模。基因编辑技术使得人们可以按照特定的要求对基因组进行精确的修饰，这对基础科学研究、工业生物技术，特别是医学领域产生了巨大影响并得到了广泛的应用。

DNA工程技术如CRISPR-Cas9，使研究人员能够剖析特定遗传元件的功能或纠正引起疾病的突变。然而，用于研究和操作RNA的简单工具显著落后于DNA工程技术。现有的RNA干扰技术能够切割或抑制所需的转录物，但是具有显著的脱靶效应，并且由于它们在内源性过程发挥作用，使其成为仍然具有挑战性的工程目标，直接研究RNA的功能作用的方法仍然有限。

研究RNA即在转录组水平进行，在转录组水平有一至关重要的过程为可变剪接。有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接。可变剪接被认为是导致蛋白质功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码获得多个不同的转录产物和蛋白产物，可变剪接在产生受体多样性、控制调节生长发育等方面起决定性作用，许多遗传疾病都与剪接繁盛异常紧密相关。剪接需要区分外显子及内含子，识别信号主要包括内含子5’及3’末端序列及中间分支点附近的序列。内含子5’剪接点称为供体点，3’剪接点称为受体点。内含子开始和末端的两对碱基最为保守。通过不同的剪接因子与剪接位点的识别与结合完成剪接过程。可变剪接通常通过调节顺式作用在元件前mRNA具有正的或负的反式作用剪接因子，介导的外显子包含或排除。

因此，构建一种高效实用的通用型转录组编辑载体及其制备方法，在转录组水平上对基因序列编辑，介导外显子包含或排除，为研究和操作RNA提供工具，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种高效实用的通用型转录组编辑载体，在转录组水平上对基因序列编辑，介导外显子包含或排除，为研究和操作RNA提供工具。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种通用型转录组编辑载体，通过在多克隆位点处插入目的基因对应的guideRNA，即可对其转录组进行编辑。

进一步，一种通用型转录组编辑载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)对Cas13d基因的序列进行优化；优化后的Cas13d基因序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将优化后的Cas13d基因克隆到PX459载体上，同源置换出Cas9序列，获得载体pCas13d；

(3)在pCas13d的U6 promoter下游引入多克隆位点，获得载体pCas13d-gRNA；

具体地，在U6启动子的后面引入多个酶切位点作为多克隆位点，以便插入不同的guide RNA，guide RNA根据CRISPR序列中的DR序列设计，即DR序列-sgRNA-DR序列-sgRNA，结合在排除外显子两边的剪切位点处，则为DR序列-sgRNA1-DR序列-sgRNA2或者多个重复。多克隆位点(MCS)为稀少的酶切位点，从而便于将不同的目的基因对应的guide RNA插入到载体中。通用型转录组编辑载体应用人工构建的组合启动子，即CAG启动子，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。在3×FLAG下游插入经过密码子优化以及HEPN点突变后的Cas13d序列，并且在Cas13d序列的上游和下游分别存在SV40 NLS和nucleoplasmin NLS，使得通用型转录组编辑载体在转染进入细胞后顺利进入细胞核发挥有效作用。

(4)在载体pCas13d-gRNA的多克隆位点处插入目的基因对应的guide RNA，获得通用型转录组编辑载体；

(5)对通用型转录组编辑载体进行验证。

进一步，步骤(1)所述Cas13d基因来自瘤胃球菌，菌株XPD3002。

进一步，步骤(2)所述载体pCas13d，利用XbaⅠ和NotⅠ两个酶切位点，通过重叠延伸的方法，引入XhoⅠ和SalⅠ酶切位点的同时，将Cas9置换出来并且将序列优化的Cas13d基因克隆到PX459载体上。

进一步，步骤(4)所述guide RNA由Cas13d基因座中的直接重复序列和靶向目的基因的序列组成。

进一步，步骤(5)所述验证的具体方法为：将通用型转录组编辑载体和报告载体pEGFP-ASR共转染宿主细胞，进行验证。

具体地，将通用型转录组编辑载体与报告载体pEGFP-ASR共转染牛成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因绿色荧光蛋白EGFP的表达情况，经PCR鉴定，证实Cas13d蛋白定点靶向到剪切位点从而干扰EGFP的表达，检验通用型转录组编辑载体的靶向效率；通过体外转录Cas13d序列以及对应PRPF39基因的guide RNA序列，显微注射进入牛的克隆胚，通过PCR验证PRPF39基因的转录本被干扰的效率。

优选地，所述宿主细胞为2～3代的牛胎儿成纤维细胞。

优选地，所述共转染方法为电穿孔法。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种通用型转录组编辑载体及其构建方法，Cas13d在guide RNA的引导下有效靶向目的基因，与传统的RNA干扰技术相比，大大降低了脱靶效应；Cas13d经过密码子优化，在哺乳动物中可用，并且HEPN(HEPN是Cas13d的结构域)经过点突变后失去剪切功能，通过占据剪切位点从而介导外显子包含或排除。

本发明基于CRISPR-Cas13d，将HEPN无活性的dCas13d设计为灵活的RNA结合模块以靶向特定的RNA元件，实现基因组编辑并且不扰乱蛋白质翻译，为RNA研究提供了一个通用工具。在介导外显子排除时，guide RNA由Cas13d基因座中的直接重复序列和靶向目的基因的序列组成，当Cas13d蛋白在guide RNA的指导下与目的基因序列结合后，由于HEPN点突变后失去剪切能力，所以Cas13d蛋白占据可变剪切因子的结合位点，使得剪切因子无法正常结合在剪切位点，从而介导外显子排除。构建编辑载体的Cas13d来自瘤胃球菌，经过密码子优化后在哺乳动物中可用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明密码子优化前后，密码子适应指数(CAI)的变化；

图2附图为本发明密码子优化前后，最佳密码子的频率变化；

图3附图为本发明密码子优化前后GC含量的调整；

图4附图为本发明克隆CMV enhancer，chicken β-actin promoter，3×FLAG，SV40NLS序列的PCR结果；

其中，1为DNA Marker；2，3，4，5为P1产物；

图5附图为本发明克隆bGH ployA序列的PCR结果；

其中，1为DNA Marker；2，3，4为P2产物；

图6附图为本发明利用重叠延伸得到CMV enhancer，chicken β-actin promoter，3×FLAG，SV40 NLS，bGH ployA序列的PCR结果；

其中，1为DNA Marker；2，3，4为P3产物；

图7附图为本发明SalⅠ单酶切鉴定正确连接的单克隆pCAG-NLS-bGH；

其中，1为DNA Marker；2，3为单酶切结果；

图8附图为本发明克隆Cas13d基因序列的PCR产物；

其中，1为DNA Marker；2，3为P4产物；

图9附图为本发明XhoⅠ，SalⅠ双酶切鉴定正确连接的单克隆pCas13d；

其中，1为DNA Marker；2，3为正确连接的单克隆；

图10附图为本发明克隆U6 promoter原件以及引入八个酶切位点的PCR产物；

其中，1为DNA Marker；2，3，4为P5产物；

图11附图为本发明HindIII，NotⅠ双酶切鉴定正确连接的单克隆pCas13d-gRNA；

其中，1为DNA Marker；2，3为正确连接的单克隆；

图12附图为本发明pCas13d-gRNA的载体图谱；

图13附图为本发明荧光显微镜观察通用型转录组编辑载体pCas13d-gEGFP和报告载体pEGFP-ASR共转染牛胎儿成纤维细胞的结果图；

图14附图为本发明PCR验证编辑载体pCas13d-gEGFP和报告载体pEGFP-ASR共转染牛胎儿成纤维细胞的结果图；

其中，1为DNA Marker，2为pEGFP-ASR(5μg)转染的牛胎儿成纤维细胞，3为pCas13d-gEGFP(20μg)和pEGFP-ASR(5μg)转染的牛胎儿成纤维细胞；

图15附图为本发明PCR验证pCas13d-gPRPF39在胚胎上的应用；

其中，1为DNA Marker，2为注射Cas13d和getPRPF3片段的克隆胚，3为正常发育的克隆胚。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

质粒提取试剂盒和细胞基因组提取试剂盒(天根公司)，胶回收试剂盒(上海生工)，DMEM培养基(美国GIBICO(Invitrogen)公司)，Opti-I Reduced Serum Media(Invitrogen公司)，体外转录试剂盒mMESSAGET7 Ultra Kit(美国赛默飞公司)，引物由上海生工合成。

实施例1通用型转录组编辑载体pCas13d-gRNA的构建

1)Cas13d基因的序列优化

Cas13d来自瘤胃球菌，菌株XPD3002。将Cas13d的DNA序列(如SEQ ID NO.1所示)，根据牛的密码子偏爱性进行密码子优化，优化后的序列如SEQ ID NO.2所示，序列优化后的结果如图1-图3所示：图1，在密码子优化后，密码子适应指数(CAI)为0.97，其中CAI为1.0被认为在所需的表达生物中是完美的，并且就高基因表达水平而言，大于0.8被认为是良好的；图2，在密码子优化后，最佳密码子的频率增加，其中对于所需表达生物体中具有最高使用频率的密码子，设定值100；图3，在密码子优化后，GC含量增加且更加集中化，其中GC含量的理想百分比范围在30-70％之间。优化后的序列由南京金斯瑞公司合成。

2)将Cas13d克隆到PX459上，并且同源置换出Cas9序列

(1)设计引物F1(XbaⅠ)及引物R1(XhoⅠ，SalⅠ)，以PX459为模板，克隆CMVenhancer，chicken β-actin promoter，3×FLAG，SV40 NLS原件序列，产物为P1，结果如图4所示，可以看到PCR扩增了930bp的P1序列，产物P1在SV40 NLS下游引入两个酶切位点XhoⅠ，SalⅠ；将PCR扩增产物P1胶回收纯化。

其中，引物F1及引物R1的序列分别为：

F1：5’-GTCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTA-3’；SEQ ID NO.3；

R1：5’-GCTCGAGGTCGACGACCTTCCGCTTCTTCTTTG-3’；SEQ ID NO.4。

(2)设计引物F2(XhoⅠ，SalⅠ)及引物R2(NotⅠ)，以PX459为模板，扩增bGH ployA原件序列，产物为P2，结果如图5所示，可以看到PCR扩增了282bp的P2序列，产物P2在bGHployA上游引入两个酶切位点XhoⅠ，SalⅠ；将PCR扩增产物P2胶回收纯化。

其中，引物F2及引物R2的序列分别为：

F2：5’-AAGAAGAAGCGGAAGGTCGTCGACCTCGAGTGAGAATTCTA

ACTAGAGCT-3’；SEQ ID NO.5；

R2：5’-GGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTA-3’；SEQ ID NO.6。

(3)利用重叠延伸的原理，以纯化后的P1、P2为模板，F1、R2为引物，PCR产物为P3，结果如图6所示，可以看到PCR扩增了1199bp的P3序列；将PCR扩增产物P3胶回收纯化。

(4)XbaⅠ，NotⅠ双酶切纯化后的PCR产物P3和载体PX459，0.8％凝胶回收PCR酶切产物P3和酶切载体PX459，T4 DNA连接酶连接PCR酶切产物P3和酶切载体PX459，4℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，单酶切(SalⅠ)鉴定正确连接的单克隆，结果如图7所示，可以看到4383bp的正确酶切条带，命名载体为pCAG-NLS-bGH。

(5)设计引物F3(SalⅠ-Cas13d)，R3(Cas13d-nucleoplasmin NLS-XhoⅠ)，以南京金斯瑞公司完成密码子优化的Cas13d的克隆载体为模板，扩增产物为P4(5’-SalⅠ-Cas13d-nucleoplasmin NLS-XhoⅠ-3’)，结果如图8所示，可以看见一条2958bp的条带，为Cas13d的PCR产物，胶回收纯化，将纯化后的PCR产物与pMD-19T在4℃过夜连接，过夜后转化感受态细胞E.coli DH5α，摇菌、提质粒，构建重组质粒pCas13d-19T，重组质粒pCas13d-19T送交西安擎科公司测序，载体pCas13d-19T测序结果显示，Cas13d的测序结果与南京金斯瑞公司密码子优化的Cas13d基因序列同源性为100％，表明Cas13d基因克隆成功。

其中，引物F3及引物R3的序列分别为：

F3：5’-CGTCGACATCGAGAAGAAGAAGAGCTT-3’；SEQ ID NO.7；

R3：5’-GCTCGAGCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTTTTCGTGGCCGCCGGCCTTTTGCTGTTGCCGCTCACCTTCT-3’；SEQ ID NO.8。

(6)XhoⅠ，SalⅠ双酶切PCR产物P4，胶回收纯化产物P4，同时用相同的酶酶切载体pCAG-NLS-bGH并且0.8％凝胶回收骨架载体片段，T4DNA连接酶连接P4和胶回收酶切骨架载体pCAG-NLS-bGH，4℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，双酶切(XhoⅠ，SalⅠ)鉴定正确连接的单克隆，结果如图9所示，将正确的载体命名为pCas13d。

3)在pCas13d的U6 promoter下游引入多克隆位点，以便guide RNA的插入。

(1)设计引物F4(PciⅠ)及引物R4(BglII，ClaI，EcoRV，HindIII，NheI，SpeI，KpnI)，以pCas13d为模板，克隆U6 promoter原件并且新引入六个酶切位点，得到产物P5。由于模板pCas13d的序列中已有酶切位点PciⅠ和KpnI，所以称为新引入六个酶切位点，引物中添加酶切位点PciⅠ和KpnI的序列是为了下一步PciⅠ，KpnI双酶切PCR产物P5和载体pCas13d从而进行下一步连接反应，从而达到引入新的酶切位点的目的，结果如图10所示，可以看见一条315bp的条带，为U6 promoter原件以及八个酶切位点序列(其中包括新引入的六个酶切位点)。

其中，引物F4及引物R4的序列分别为：

F4：5’-GACATGTGAGGGCCTATTTCCCATGAT-3’；SEQ ID NO.9；

R4：

(2)PciⅠ，KpnI双酶切PCR产物P5和载体pCas13d，0.8％凝胶回收PCR酶切产物P5和酶切载体pCas13d，T4 DNA连接酶连接PCR酶切产物P5和酶切载体pCas13d，4℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，单酶切(HindIII)鉴定正确连接单克隆，结果如图11所示，测序结果正确，命名载体为pCas13d-gRNA，pCas13d-gRNA的载体图谱如图12所示。

4)pCas13d-gEGFP的构建

在pCas13d-gRNA的多克隆位点处插入靶向EGFP的guide RNA序列，guide RNA的序列如下：

CAAGTAAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAACGTCCAGCTAAAGAGAAAAAAAAACACTTTACA AGTAAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAACATAAAAATATCTTACCTTGAAGTTGGCCTT，SEQ IDNO.11，下划线处为DR序列；载体命名为pCas13d-gEGFP。

5)pCas13d-gPRPF39的构建

在pCas13d-gRNA的多克隆位点处插入靶向牛的PRPF39的guide RNA序列，guideRNA的序列如下：

CAAGTAAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAACGTTTCAGACCATATAATTTACTTACCAAGTAA ACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTGAAACCTACATACAGAAACAGAGGAAATAC，SEQ ID NO.12，下划线处为DR序列；载体命名为pCas13d-gPRPF39。

实施例2通用型转录组编辑载体pCas13d-gRNA的验证

通用型转录组编辑载体pCas13d-gEGFP和报告载体pEGFP-ASR共转染牛胎儿成纤维细胞，并且进行PCR验证。

(1)牛胎儿成纤维细胞的培养

从液氮中取一管第三代荷斯坦奶牛的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，离心。弃去废液，加3ml细胞悬浮液(含10％FBS的DMEM)重悬，接种于60mm的培养皿中(含10％FBS的DMEM)，置于CO₂培养箱中37℃条件下培养。

待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞，加入胰酶消化液，在倒置显微镜下观察细胞。待大多数细胞变圆、细胞间隙扩大时，用等体积含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打混匀后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例分别接种在三个60mm培养皿上，放入CO₂培养箱中培养，选取3～10代传代的细胞达到90％汇合的牛胎儿成纤维细胞，作为用于转染的宿主细胞。

(2)通用型转录组编辑载体pCas13d-gEGFP和报告载体pEGFP-ASR共转染牛胎儿成纤维细胞

采用电转染法，将转录组编辑载体pCas13d-gRNA和报告载体pEGFP-ASR共转染牛胎儿成纤维细胞。

细胞达到90％汇合时，消化细胞后离心(1000r/min，4min)收集细胞，然后用Opti-I Reduced Serum Media洗涤细胞2次，每次清洗的过程中要轻轻慢慢的吹打细胞，防止细胞受到损害，将电转染液(cell盐：opti＝3:1V/V；cell盐:KCl:120mm；CaCl2:0.15mm；K₂HPO₄:10mm；MgCl₂:50mm；调pH至7.6；opti即Opti-I Reduced SerumMedia)和通用型转录组编辑载体pCas13d-gEGFP(0μg、20μg、20μg分别三组)和报告载体pEGFP-ASR(各5μg)的混合液(400μl)分别加到经离心弃去培养液的离心管中(加完质粒后加opti至400μL)，轻轻吹打细胞，使其完全吹散，混匀。将上述细胞悬液转移到BTX电击杯中(4mm间隙，黄色盖子，800μL容积)，静置10min；将电转染参数设置如下：电压：510V；脉冲时间：1ms；电击次数3次，静置完成之后进行电转染。

转染完成后，细胞静置10min，然后将细胞悬液全部转移到60mm培养皿中；加入37℃预温的含10％胎牛血清的DMEM完全培养液2mL，将培养液置于37℃、5％的CO₂培养箱中，待细胞贴壁后，弃去培养液(培养液中含有电转染液影响细胞生长)，换成经37℃温育的DMEM完全培养液2mL。

电转染细胞48h后，报告载体pEGFP-ASR中的EGFP基因被表达之后，能够在荧光显微镜下看到绿色荧光。pCas13d-gEGFP(0μg)和pEGFP-ASR(5μg)共转的细胞荧光强度最亮，pCas13d-gEGFP(20μg)和pEGFP-ASR(5μg)共转的细胞荧光强度较暗，表明pCas13d-gEGFP进入细胞并且起作用，结果如图13所示。

(3)通用型转录组编辑载体pCas13d-gEGFP和报告载体pEGFP-ASR共转染牛胎儿成纤维细胞的PCR验证

取共转染48h以后的牛胎儿成纤维细胞，提取细胞RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，PCR鉴定EGFP基因的转录本的被干扰效率。阴性对照为pCas13d-gEGFP(0μg)和pEGFP-ASR(5μg)共转染的细胞，PCR鉴定所用引物对为F5和R5；

其中，引物F5及引物R5的序列分别为：

F5：ACTGTGGGAACTAAAGTGTT；SEQ ID NO.13；

R5：TCTACAAATGTGGTATGGC；SEQ ID NO.14。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40S，35个循环；72℃再延伸10min；回收PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图14所示，其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为pEGFP-ASR(5μg)转染的牛胎儿成纤维细胞，泳道3为pCas13d-gEGFP(20μg)和pEGFP-ASR(5μg)转染的牛胎儿成纤维细胞，泳道2与泳道3共有一条587左右的条带，其为正常剪切后产物的大小，泳道3与泳道2相比，明显可以看到一条140bp左右的条带，而作为阴性对照的泳道2并没有看到，表明目的基因EGFP的转录本被pCas13d-gEGFP干扰。

实施例3通用型转录组编辑载体pCas13d-gRNA在胚胎上的应用。(pCas13d-gPRPF39的应用)

(1)PRPF39基因

利用生物信息技术分析得到，PRPF39基因在正常受精卵中第10和11外显子之间的内含子，在转录后加工过程中会被全部剪切掉，但在克隆胚中此内含子中一部分未被剪切从而形成一个外显子，因此用pCas13d-gPRPF39来验证克隆胚中PRPF39基因的转录本的被干扰效率。

(2)卵母细胞的成熟培养

卵巢采自西安市屠宰场，无菌采取荷斯坦奶牛卵巢，在37℃无菌生理盐水中4～6小时内运回实验室，抽取3～8mm直径的卵泡，收集卵丘卵母细胞复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。卵母细胞的成熟培养液为：TCM199(Gibico)加10％胎牛血清，10ng/ml的表皮生长因子，培养条件为：38.5℃，5％CO₂、95％空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用0.2％透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体的排放作为卵母细胞成熟的判定标志，挑选成熟卵母细胞用于核移植试验。

(3)克隆胚的构建

采用体细胞核移植(SCNT)技术将供体细胞转移到去除细胞核的成熟卵母细胞中，其中，本发明将供体细胞控制到10代以内。核移植具体为：显微操作液为含10％FBS，5g/ml细胞松弛素B的PBS，用内径20um的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以10g/ml Hoechst 33342染色10min，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。

卵母细胞的注核与融合，具体过程如下：0.25％胰蛋白酶消化接触抑制3d的6～10代的荷斯坦牛胎儿成纤维细胞用做供核细胞；用去核管将供体细胞注入去核成功的卵母细胞透明带下；核质复合体在电融合液中平衡3min，用微电极法进行融合，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予电脉冲进行电融合。融合电压为28V，融合时间为10min。融合后的重组体放入10％FBS的M199中，38.5℃、5％CO₂、饱合湿度下培养，2h后观察融合情况。

(4)克隆胚的激活及体外培养

融合的重组胚在含10％FBS的M199中平衡2h后，用含5mol/L离子霉素(Ionomycin，购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液(购自SIGMA公司)处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养4h，清洗3次后转入矿物油覆盖并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h的mSOFaa中培养，培养密度为5L每个重组胚，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度下培养。

(5)pCas13d-gPRPF39的注射

通过在引物上加T7启动子，以载体pCas13d-gPRPF39为模板，将Cas13d和getPRPF3分别克隆下来，胶回收时以无RNase的核酸洗脱液洗脱，且保证回收浓度在160ng/μL左右，以此为体外转录模板。通过体外转录试剂盒mMESSAGET7 Ultra Kit(美国赛默飞公司)，将Cas13d和getPRPF3分别体外转录，分装后-80℃保存待用。

将Cas13d和getPRPF3片段混合后显微注射进入激活后6h的克隆胚，在第5天收发育到八细胞的克隆胚，对照组为正常激活后发育到八细胞的克隆胚，裂解样品，反转录得到cDNA，保存备用。

(6)PCR验证

PCR鉴定所用引物对为F6和R6；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸10min。

其中，引物F6及引物R6的序列分别为：

F6：TGTCATATCATGTGCCCTCTA；SEQ ID NO.15；

R6：CATGGGTTTCTTTGGGAG；SEQ ID NO.16。

回收PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图15所示，其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为注射Cas13d和getPRPF3片段的克隆胚，泳道3为正常发育的克隆胚，泳道2与泳道3相比，明显可以看到一条130bp左右的条带，而作为阴性对照的泳道3可以看到一条230bp左右的条带(中间成为外显子部分的内含子长度为100bp)，表明目的基因PRPF39的转录本被pCas13d-g PRPF39干扰。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种通用型转录组编辑载体及其构建方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2904

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgatcgaaa agaagaagtc atttgcaaag ggcatgggag taaaatcaac acttgtatcc 60

ggttcaaagg tatacatgac gacgttcgca gaaggaagcg atgccagact tgaaaagatc 120

gttgaaggcg attctatcag atctgtcaac gaaggagaag cgttctcagc tgaaatggct 180

gataagaatg caggctacaa gatcggtaac gcaaagttca gccacccaaa gggctatgct 240

gtagttgcaa acaacccctt atacaccgga ccggtacagc aggatatgct cggtctgaag 300

gaaacgcttg aaaagagata ttttggagag tctgccgacg gaaatgataa tatctgtatt 360

caggtcatcc ataatatcct cgatatcgaa aagatcctcg ctgaatatat aaccaatgct 420

gcttatgcgg taaacaatat ttccggtctt gataaggata tcatcggttt tggtaagttc 480

agtacggtct atacttatga tgagttcaag gatcctgaac atcacagagc agctttcaac 540

aataacgata agttaattaa tgccatcaag gcacagtatg atgaatttga caatttcctt 600

gataatcctc gtctcggcta ctttggacag gcttttttca gtaaggaagg cagaaattac 660

attatcaatt acggcaacga gtgttatgat attcttgctt tactcagcgg attgcgtcac 720

tgggtagtac ataataatga ggaagaatca aggatttccc gtacatggct ttataatctc 780

gacaagaatc ttgacaacga atatatctct actctcaatt atctgtatga tagaattaca 840

aacgaattaa caaattcctt ctcaaagaat agtgcagcca acgtaaacta tatcgctgaa 900

acccttggta ttaatcctgc tgaatttgca gagcagtatt tcagattcag tatcatgaag 960

gaacagaaga atctcggttt caatattact aagctgagag aagtaatgct tgacagaaag 1020

gatatgtctg agatccgtaa aaatcataag gtctttgatt caatccgtac taaggtctat 1080

actatgatgg atttcgttat ctacagatat tacattgaag aggatgcaaa ggttgctgct 1140

gccaacaagt ctctgccgga taacgaaaaa agcctcagtg aaaaggatat ctttgttata 1200

aatctcagag gaagctttaa cgatgatcag aaggatgccc tttattatga tgaggccaat 1260

cgtatttgga gaaagctcga aaacattatg cacaatatca aggaattcag aggcaataag 1320

acacgtgaat acaagaagaa ggatgctcca agactcccca gaattcttcc tgccggaagg 1380

gatgtttccg cgttctcaaa gttgatgtac gctcttacca tgttccttga tggtaaggag 1440

atcaatgatc ttctcaccac gctcatcaat aagttcgata acatccagag tttcctcaag 1500

gtaatgcctc ttatcggagt gaatgcaaag tttgttgagg aatatgcctt cttcaaggac 1560

agcgcaaaga ttgctgacga actcaggctg attaagagct ttgccagaat gggagaacct 1620

atcgcagatg caagacgtgc tatgtatatc gatgctatca ggattctcgg aacaaacctc 1680

agctatgatg agcttaaggc ccttgccgat actttttcgc ttgatgaaaa cggcaacaag 1740

cttaagaagg gcaagcacgg catgagaaac ttcatcatta ataatgtaat cagtaacaag 1800

cgcttccatt atctcattcg ttacggtgat cctgcacatc tccatgagat cgccaagaat 1860

gaagctgttg taaagttcgt cctcggcagg atagctgata tccagaagaa gcagggacag 1920

aacggaaaga atcagatcga caggtactat gagacctgta tcggcaagga caagggcaag 1980

tctgtctccg aaaaggttga tgccctcaca aagattatca ccggtatgaa ctacgatcag 2040

ttcgataaga agagaagcgt tattgaggat actggaagag aaaacgctga gagagaaaag 2100

ttcaagaaga tcatcagcct ctatcttact gtcatttatc acatccttaa gaatattgtt 2160

aatatcaatg cgcgttacgt tatcggcttc cattgcgttg agcgtgatgc acagctctat 2220

aaggaaaagg gctatgatat caacctcaag aagctcgaag aaaaggggtt ttcatcagtc 2280

acaaagctgt gtgcaggtat tgatgagact gctcctgaca agcgtaagga tgttgaaaag 2340

gaaatggctg agcgtgcaaa ggaatctatc gatagccttg aatctgcaaa tcctaagctt 2400

tacgcaaact atatcaagta ttctgacgag aagaaggctg aggaatttac tagacagatc 2460

aaccgtgaga aggcaaagac cgctctgaat gcatatctca gaaatactaa gtggaatgtg 2520

ataatcaggg aagatcttct tagaatcgat aataagacat gtacgctctt tagaaataag 2580

gccgttcatc ttgaagttgc aagatatgtt catgcatata tcaacgatat tgccgaagta 2640

aacagctatt tccagcttta tcattacatc atgcagagaa tcatcatgaa cgaaagatat 2700

gaaaagtctt ctggaaaggt aagcgaatac ttcgatgctg tgaacgatga aaagaagtac 2760

aacgacaggc ttctgaagct gttgtgcgtt ccatttggtt actgcatccc gagattcaag 2820

aatctctcca ttgaagcttt gttcgacagg aacgaagcag ctaagtttga caaggaaaag 2880

aagaaagtat caggtaattc atag 2904

<210> 2

<211> 2904

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgatcgaaa agaagaagtc atttgcaaag ggcatgggag taaaatcaac acttgtatcc 60

ggttcaaagg tatacatgac gacgttcgca gaaggaagcg atgccagact tgaaaagatc 120

gttgaaggcg attctatcag atctgtcaac gaaggagaag cgttctcagc tgaaatggct 180

gataagaatg caggctacaa gatcggtaac gcaaagttca gccacccaaa gggctatgct 240

gtagttgcaa acaacccctt atacaccgga ccggtacagc aggatatgct cggtctgaag 300

gaaacgcttg aaaagagata ttttggagag tctgccgacg gaaatgataa tatctgtatt 360

caggtcatcc ataatatcct cgatatcgaa aagatcctcg ctgaatatat aaccaatgct 420

gcttatgcgg taaacaatat ttccggtctt gataaggata tcatcggttt tggtaagttc 480

agtacggtct atacttatga tgagttcaag gatcctgaac atcacagagc agctttcaac 540

aataacgata agttaattaa tgccatcaag gcacagtatg atgaatttga caatttcctt 600

gataatcctc gtctcggcta ctttggacag gcttttttca gtaaggaagg cagaaattac 660

attatcaatt acggcaacga gtgttatgat attcttgctt tactcagcgg attggctcac 720

tgggtagtag ctaataatga ggaagaatca aggatttccc gtacatggct ttataatctc 780

gacaagaatc ttgacaacga atatatctct actctcaatt atctgtatga tagaattaca 840

aacgaattaa caaattcctt ctcaaagaat agtgcagcca acgtaaacta tatcgctgaa 900

acccttggta ttaatcctgc tgaatttgca gagcagtatt tcagattcag tatcatgaag 960

gaacagaaga atctcggttt caatattact aagctgagag aagtaatgct tgacagaaag 1020

gatatgtctg agatccgtaa aaatcataag gtctttgatt caatccgtac taaggtctat 1080

actatgatgg atttcgttat ctacagatat tacattgaag aggatgcaaa ggttgctgct 1140

gccaacaagt ctctgccgga taacgaaaaa agcctcagtg aaaaggatat ctttgttata 1200

aatctcagag gaagctttaa cgatgatcag aaggatgccc tttattatga tgaggccaat 1260

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aaggaaaagg gctatgatat caacctcaag aagctcgaag aaaaggggtt ttcatcagtc 2280

acaaagctgt gtgcaggtat tgatgagact gctcctgaca agcgtaagga tgttgaaaag 2340

gaaatggctg agcgtgcaaa ggaatctatc gatagccttg aatctgcaaa tcctaagctt 2400

tacgcaaact atatcaagta ttctgacgag aagaaggctg aggaatttac tagacagatc 2460

aaccgtgaga aggcaaagac cgctctgaat gcatatctca gaaatactaa gtggaatgtg 2520

ataatcaggg aagatcttct tagaatcgat aataagacat gtacgctctt tgcaaataag 2580

gccgttgctc ttgaagttgc aagatatgtt catgcatata tcaacgatat tgccgaagta 2640

aacagctatt tccagcttta tcattacatc atgcagagaa tcatcatgaa cgaaagatat 2700

gaaaagtctt ctggaaaggt aagcgaatac ttcgatgctg tgaacgatga aaagaagtac 2760

aacgacaggc ttctgaagct gttgtgcgtt ccatttggtt actgcatccc gagattcaag 2820

aatctctcca ttgaagcttt gttcgacagg aacgaagcag ctaagtttga caaggaaaag 2880

aagaaagtat caggtaattc atag 2904

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

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<400> 3

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<210> 4

<211> 33

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<400> 4

gctcgaggtc gacgaccttc cgcttcttct ttg 33

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

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<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ggcggccgct ccccagcatg cctgcta 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

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<400> 7

cgtcgacatc gagaagaaga agagctt 27

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gctcgagctt tttctttttt gcctggccgg cctttttcgt ggccgccggc cttttgctgt 60

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<210> 9

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cggtacccac tagtgctagc aagcttgata tcatcgatag atctggtctt ctcgaagacc 60

cggg 64

<210> 11

<211> 132

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

caagtaaacc cctaccaact ggtcggggtt tgaaacgtcc agctaaagag aaaaaaaaac 60

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gaagttggcc tt 132

<210> 12

<211> 122

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

caagtaaacc cctaccaact ggtcggggtt tgaaacgttt cagaccatat aatttactta 60

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ac 122

<210> 13

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

actgtgggaa ctaaagtgtt 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tctacaaatg tggtatggc 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tgtcatatca tgtgccctct a 21

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

catgggtttc tttgggag 18

Claims

1.一种通用型转录组编辑载体，其特征在于，通过在多克隆位点处插入目的基因对应的guide RNA，即可对其转录组进行编辑。

2.一种通用型转录组编辑载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(3)在pCas13d的U6promoter下游引入多克隆位点，获得载体pCas13d-gRNA；

(5)对通用型转录组编辑载体进行验证。

3.根据权利要求1所述的一种通用型转录组编辑载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述Cas13d基因来自瘤胃球菌，菌株XPD3002。

4.根据权利要求1所述的一种通用型转录组编辑载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述载体pCas13d，利用XbaⅠ和NotⅠ两个酶切位点，通过重叠延伸的方法，引入XhoⅠ和SalⅠ酶切位点的同时，将Cas9置换出来并且将序列优化的Cas13d基因克隆到PX459载体上。

5.根据权利要求1所述的一种通用型转录组编辑载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)所述guide RNA由Cas13d基因座中的直接重复序列和靶向目的基因的序列组成。

6.根据权利要求1所述的一种通用型转录组编辑载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述验证的具体方法为：将通用型转录组编辑载体和报告载体pEGFP-ASR共转染宿主细胞，进行验证。

7.根据权利要求5所述的一种通用型转录组编辑载体的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为2～3代的牛胎儿成纤维细胞。

8.根据权利要求5所述的一种通用型转录组编辑载体的构建方法，其特征在于，所述共转染方法为电穿孔法。