CN102154288B - 一种骨骼肌特异性capn3启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种骨骼肌特异性启动子及其应用，特别提供了一种骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用，该启动子只在骨骼肌中具有启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子只在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，因此能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为通过转基因技术来提高猪肉的品质提供了一种重要的元件。

Description

一种骨骼肌特异性CAPN3启动子及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用。

背景技术

真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达的调节由转录因子特异性结合于调控区相关元件，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。在特异高效表达的转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。

钙蛋白酶3(calpastatin 3，CAPN3)是典型的组织特异性钙蛋白酶，主要存在于肌Z线处，是导致肌原纤维蛋白降解的关键因素，与骨骼肌生长代谢密切相关，利用其基因调控区的相关元件构建骨骼肌特异性表达载体是一种有效的方法。但是上述的研究均还处在起步阶段，对于转基因猪的培育和肉品品质的提高均没有起到较好的促进作用。

发明内容

基于上述的原因，本发明的发明人经过研究发现猪钙蛋白酶3基因5′调控区具有骨骼肌特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种骨骼肌特异性表达启动子载体，该启动子可以在转基因猪的培育中应用。该启动子载体具有骨骼肌特异性启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在骨髂肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。

本发明所提供的骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子，其基因序列如Seq IDNo：1所示；

除了上述的启动子之外，还可以是该启动子的变体或者片段，均具有如Seq ID No：1所示的基因序列。

“变体”是指对猪CAPN3启动子Seq ID No：1序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于Seq ID No：1序列的活性。

“片段”是指基本DNA序列的一个或者多个区域，其仍然类似于猪CAPN3启动子Seq IDNo：1的活性。

具有上述序列的启动子或其变体，或者片段，具有骨骼肌特异性启动特性，而在骨骼肌之外的多种细胞中均无启动活性，该基因启动子在骨骼肌中能特异性地启动下游基因的表达，可以满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，并能应用于转基因猪的培育中。

应用上述的核酸时，一般采用重组核酸序列，其中含有上述的启动子或其变体，或者片段，这样就可以使于启动子下游的目的基因在骨骼肌中特异性表达，作为分析、开发、改造骨骼肌特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一种功能基因，主要包括提高肌肉品质基因，加快生长速度基因，抗病基因，提高饲料报酬的基因以及生产特定药物的基因，这样就可以在获得骨骼肌特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因猪的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值，如将去饱和脂肪酸酶基因在该启动子指导下表达可以特异性提高骨骼肌中不饱和脂肪酸的含量，提高肉品营养价值。

在获得了上述的重组核酸序列之后，还可以用其建立特殊的表达系统，以便更好的应用于转基因猪的培育过程。将目的基因重组至该启动子下游，通过基因转入技术使调控区与目的基因共同整合进染色体中，获得转基因动物，在该启动子作用下目的基因仅在骨骼肌中表达，在其他组织器官中不表达，降低目的基因对动物的影响，提高转基因的效果。

本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。首先构建无启动子绿色荧光蛋白载体，为保证报告基因正确翻译，在绿色荧光蛋白基因上游插入内部核糖体进入位点(IRES)。然后通过PCR或者片段捕获等技术获得骨骼肌中特异性表达的钙蛋白酶35′调控区，长度为1059bp，插入内部核糖体位点上游，得到启动子报告基因分析载体，将CMV启动子(589bp)连入空载体中作为阳性对照，空载体为阴性对照。质粒去内毒素后，转染C2C12小鼠成肌细胞系，同时转染猪原代肾上皮细胞等多种细胞为对照，转染24h后更换含马血清的诱导培养基至成肌细胞，诱导细胞分化融合，48h后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，分析启动子特性。

当上述的启动子，或者重组核酸序列或者表达系统被应用到转基因猪的培育中后，可以有效的提高培育的效果，且通过添加各种功能性基因，使得转基因猪可以获得更好的肌肉品质，更高的生长速度，更好的抗病性以及降低饲养成本，还可以在特定药物的生产中得到更为广泛的应用，对于该领域的研究有着很好的参考价值。

附图说明

图1为CAPN3F和CAPN3R引物PCR扩增CAPN35′调控区片段电泳图，泳道1为PCR产物，M为DL2000Maker；

图2为无启动子CMV Enhancer-IRES-AcGFP载体图谱；

图3为转染CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h小鼠C2C 12细胞照片，

左侧为200倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，CAPN3Promoter有启动活性；

图4为转染CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h猪PIEC细胞照片，

左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；

图5为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h猪PIEC细胞照片，

左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；

图6为转染CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h大鼠心肌细胞系H9c2照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；

图7为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h大鼠心肌细胞系H9c2照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；

图8为转染CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；

图9为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；

图10为转染CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h人肝细胞系HL-7702照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；

图11为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h人肝细胞系HL-7702照片，左侧为100倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；

图12为转染CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP 48h原代猪肾细胞照片，左侧为40倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，无GFP表达，CAPN3Promoter无启动活性；

图13为转染CMV Promoter-IRES-AcGFP 48h原代猪肾细胞照片，左侧为200倍光镜下照片，细胞状态良好，右侧为蓝色激发模块下照片，可见GFP表达，转染技术有效；

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1无启动子IRES-AcGFP载体构建

为了避免分析序列中ATG对报告基因翻译的影响，保证下游报告基因GFP的正确表达，特构建无启动子IRES-AcGFP载体，该载体包含一个内部核糖体进入元件，该方法有利于保留转录起始位点下游的调控元件，可以获得更大的调控区分析区间。以pIRES2-AcGFP1为骨架，用Ase I、Nhe I酶切，回收4723bp片段，得到无CMV启动子的载体；PCR扩增CMV Enhancer元件，下游引物加入Xba I酶切位点及保护性碱基，加粗表示。CMV Enhancer Forward核酸序列如Seq ID No：2所示，CMV Enhancer Reverse核酸序列如Seq ID No：3所示。

按照如下体系配制PCR反应液：

PCR程序设定如下：

31Cycles

将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至1％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收目的片段，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，用AseI(Fermentas)和Xba I(Fermentas)酶切纯化产物，酶切之后琼脂糖切胶回收得到粘性末端的CMV Enhancer，将CMV Enhancer元件与酶切后的载体用Rapid DNA Ligation(Fermentas)连接，克隆转化，获得含CMV Ehancer无启动子的pIRES-AcGFP，该载体同时作为阴性对照载体。将完整的CMV启动子正向连入该载体中，得到阳性对照载体。将包含阴性对照和阳性对照载体的菌液按照1∶500的比例分别接种至含卡那霉素50μg/ml LB培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。实施例2启动子报告基因载体的构建

基因组提取：取大约克夏猪耳组织，按照TIANamp genomic DNA(天根)试剂盒说明书进行基因组DNA提取。

跟据NCBI(Gene ID：NW_003299273.1)设计如下，上下游引物加入Bgl II酶切位点及保护性碱基，加粗表示，CAPN3F核酸序列如Seq ID No：4所示，CAPN3R核酸序列如Seq IDNo：5所示。

按照如下体系配制PCR反应液

PCR程序设定如下

32Cycles

将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至0.5％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收大片段，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，将纯化产物用Bgl II(Fermentas)酶切，琼脂糖切胶回收CAPN35′调控区如Seq ID No：1所示。

无启动子的pIRES-AcGFP载体用Bgl II(Fermentas)酶切，同时加入FastAP^TMThermosensitive Alkaline Phosphatase(Fermentas)进行去磷酸化处理，将CAPN35′调控区动子与去磷酸化的载体用Rapid DNA Ligation(Fermentas)连接，并转化DH5α，涂板后挑菌验证插入的正反向，将包含正确插入方向的菌液按照1∶500的比例接种至含卡那霉素50μg/mlLB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证CAPN3启动子的启动特点。

实施例3细胞培养与转染

将出生两日龄二元杂交小猪处死，无菌条件下取出肾脏至室温的生理盐水中，在生理盐水中轻轻漂洗后转移至37℃预热的1×PBS中，冲洗去除血污，脂肪，撕去表面筋膜，剪开肾脏，剪去肾盂仅留肾皮质约1g，将其剪碎成1mm³的小块，加入40ml 1×PBS(Hyclone)重悬组织块，静置3min，倒去上清，加入30ml 37℃0.1％胶原酶，上下颠倒10次，置于37℃孵育60min，加入2ml胎牛血清(Gibco)，用吸管轻轻吹打组织块，直至组织块消失，静置1min，取上层细胞悬液测定细胞活力并计数，将细胞按1×10⁴个/ml接种至完全培养基中，置于37℃，5％CO₂培养，每3d消化传代。

小鼠成肌细胞系C2C12培养在含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Hyclone)培养基中，培养条件为37℃，5％CO₂，消化传代保持细胞汇合度在50％，诱导培养基为含2％马血清(Hyclone)的DMEM培养基。

猪髋动脉内皮细胞系PIEC培养在含10％胎牛血清(Gibco)的RPMI1640(Hyclone)培养基中，培养条件为37℃，5％CO₂，消化传代保持细胞汇合度在50％。

大鼠心肌细胞系H9c2(2-1)培养在含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Hyclone)培养基中，培养条件为37℃，5％CO₂，消化传代保持细胞汇合度在50％。

小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1培养在含10％新生牛血清(Gibco)的DMEM(Hyclone)培养基中，培养条件为37℃，5％CO₂，消化传代保持细胞汇合度在70％。

人肝细胞HL-7702(L-02)培养在含10％胎牛血清(Gibco)的RPMI1640(Hyclone)培养基中，培养条件为37℃，5％CO₂，消化传代保持细胞汇合度在70％。

将待转染的细胞用1×PBS(Hyclone)漂洗贴壁细胞两次，加入37℃预热的0.05％胰酶(Hyclone)，消化10min，加入无抗生素的完全培养基重悬细胞，细胞计数后每孔按1×10⁴接种至24孔板，24h后用37℃无血清无抗生素DMEM培养基(Hyclone)洗涤细胞一次，每孔加入500μl新鲜的无抗生素的完全培养基，12h后进行转染，此时细胞汇合度为90％～95％。

将阳性对照载体CMV Promoter-IRES-AcGFP，阴性对照载体无启动子CMV EnhancerpIRES-AcGFP，实验载体CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP三种质粒同时转染小鼠成肌细胞系C2C12、猪髋动脉内皮细胞系PIEC、大鼠心肌细胞系H9c2(2-1)、小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1、人肝细胞HL-7702(L-02)和原代猪肾细胞，每孔取750ng质粒稀释至100μlopti-MEM中，加入0.75μl Lipofectamine^TM PLUS(Invitrogen)彻底混匀，5min后加入3μlLipofectamine^TM LTX(Invitrogen)转染试剂颠倒混匀，25℃孵育，30min后轻轻加至每一孔中，混匀。转染12h后更换诱导培养基至C2C12细胞系中，诱导细胞分化融合。转染48h后与荧光倒置显微镜下观察GFP表达情况。阳性对照载载体反映转染条件对各个细胞有效(图5、图7、图9、图11、图13)，阴性对照无绿色荧光蛋白表达。转染CAPN3PromoterpIRES-AcGFP载体的实验组只有诱导过的C2C12细胞系有绿色荧光蛋白表达(图3)，在猪髋动脉内皮细胞系PIEC、大鼠心肌细胞系H9c2(2-1)、小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1、人肝细胞HL-7702(L-02)和原代猪肾细胞均无绿色荧光蛋白表达(图4、图6、图8、图10、图12)。

转染结果表明只有在成熟的肌细胞中猪CAPN3启动子才有启动活性，在另一种横纹肌心肌细胞中并没有启动活性，同样是间充质干细胞的3T3-L1中无启动活性，在肾上皮细胞、内皮细胞和肝细胞中也无启动活性，表明猪CAPN3启动子具有骨骼肌特异性启动活性，可以驱动目的基因在骨骼肌特异性表达。

实施例4CAPN3启动子变体功能

根据制造商的说明，利用Stratagene QuikChange^TM定点突变试剂盒(Stratagene)，设计突变引物构建该启动子变体，包括核酸的缺失，取代和插入。变更的启动子通过序列测定验证突变。将突变后的启动子重组至目的基因上游，获得重组核酸，该重组核酸通过转基因技术导入动物细胞或胚胎中，可实现目的基因在骨骼肌中的特异性表达。

实施例5CAPN3启动子片段应用

跟据NCBI(Gene ID：NW_003299273.1)设计如下引物，CAPN32F基因序列如Seq ID No：6所示，CAPN32R基因序列如Seq IDNo：7所示。

按照如下体系配制PCR反应液

PCR程序设定如下：

32Cycles

将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至0.5％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收大片段，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，将纯化产物连入pJET1.2克隆载体(Fermentas)中，克隆转化DH5α，挑取单菌落测序，测序无误后获得CAPN3启动子片段-pJET1.2质粒，用Bgl II(Fermentas)酶切该质粒，琼脂糖切胶回收CAPN35′调控区如Seq ID No：8所示。

无启动子的pIRES-AcGFP载体用Bgl II(Fermentas)酶切，同时加入FastAP^TMThermosensitive Alkaline Phosphatase(Fermentas)进行去磷酸化处理，将CAPN35′调控区动子用Rapid DNA Ligation(Fermentas)与去磷酸化的载体连接，并转化DH5α，涂板后挑菌验证插入的正反向，将包含正确插入方向的菌液按照1∶500的比例接种至含卡那霉素50μg/mlLB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证CAPN3启动子片段的启动特点。

实施例6串联CAPN3启动子的应用

跟据NCBI(Gene ID：NW_003299273.1)设计如下引物，上下游引物分别包含Sac I、Sal I酶切位点及保护碱基，加粗表示。CAPN33F基因序列如Seq ID No：9所示，CAPN33R基因序列如Seq ID No：10所示。

按照如下体系配制PCR反应液

PCR程序设定如下

32Cycles

将扩增后的产物与6×Loading buffer混合上样至1％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳20min后切胶回收1kb片段，按Axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物。用Sac I与Sal I(Fermentas)酶切PCR纯化产物并回收酶切产物。

将CMV Enhancer-CAPN3Promoter-pIRES-AcGFP载体用Sac I与Sal I(Fermentas)酶切并纯化，将纯化过的CAPN3调控区用Rapid DNALigation(Fermentas)与酶切后的载体连接，并转化DH5α，涂板后挑菌验证插入的正反向，将包含正确插入方向的菌液按照1∶500的比例接种至含卡那霉素50μg/ml LB液体培养基中，200rpm剧烈摇晃14h。4℃6000×g收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8-1.9之间。得到重组核酸CMV Enhancer-doubleCAPN3Promoter-pIRES-AcGFP载体，并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证双CAPN3启动子的启动特点。

Claims (1)

1.一种骨骼肌特异性启动子，其特征在于：该启动子的基因序列如Seq ID No：1所示。

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