CN104372024A - 一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，克隆牛转录因子CCAAT增强子结合蛋白C/EBPβ基因，构建C/EBPβ基因过表达载体并包装获得重组腺病毒。腺病毒侵染牛成纤维细胞、成肌细胞实现上述细胞快速转分化为脂肪细胞。该脂肪细胞具有明显的脂滴形成和成脂关键基因表达。本发明可为研究脂肪细胞分化、家畜脂肪沉积机理提供一个很好的细胞模型。同时，为培育“大理石花纹”明显、富含肌内脂肪的优质肉牛新品种提供了新思路和新候选功能基因，具有重要应用前景。

Description

一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法

技术领域

本发明属于哺乳动物成体细胞转分化技术领域，涉及一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法。

背景技术

随着生活质量的提高，人们对口感鲜嫩多汁、大理石花纹丰富，并含有大量人体需要脂肪酸的优质牛肉的需求量与日俱增。和牛是日本十分珍贵的优质肉牛品种资源，因其脂肪沉积好、牛肉细嫩等优点被公认为是世界最优秀的良种肉牛。和牛牛肉在北京、上海等地的部分餐厅售价高达2000元/千克，远高于我国本土牛肉的价格。相比国外肉牛品种，我国肉牛产肉性能、肉脂品质等基础指标差距明显，造成我国牛肉特别是优质牛肉仍依赖于进口的局面长期存在(杨蔚，2013)。提高肉牛脂肪沉积，增加大理石花纹比例，增强我国肉牛品种的国际竞争力已成为目前我国肉牛产业发展中亟待解决的问题。

在细胞水平，肉牛脂肪沉积主要表现为脂肪细胞数量增加(增殖)和体积的增大(分化)。而脂肪细胞分化在肉牛出生后脂肪沉积中起关键作用(Rosen et al.2000)。所以肉牛脂肪细胞的分化研究至关重要。

目前脂肪细胞分化研究的细胞模型使用较多的是来源小鼠细胞系(3T3-L1、3T3-F442A)，由于细胞系的非整倍性以及不同物种间脂肪形成调控存在的差异，不能很好的反应家畜真实的脂肪沉积调控过程(Yamada etal.2007；Wei et al.2012)。通过家畜脂肪组织分离原代脂肪细胞存在着采样困难(屠宰)、原代脂肪细胞分离难度较大以及分离得到的脂肪细胞异质性问题(细胞种类不纯)(Matsumoto et al.2008)，制约了关于家畜脂肪细胞分化调控机理的研究。此外，筛选获得能促进牛肌内脂肪的沉积关键基因和转录因子，是目前转基因动物育种领域的一个研究热点。

近年来，诱导多能干细胞(iPSCs)的出现，实现了终末分化细胞去分化为类胚胎干细胞(Okita et al.2007；Yu et al.2007)。将iPSCs细胞在体外分化为不同类型的成体干细胞和终末分化细胞(从一种类型成体细胞-诱导多能干细胞-另外一种成体(干)细胞)，用于机理研究及人类疾病治疗，具有重要现实意义。然而，诱导多能干细胞仍存在着效率低、致瘤性高、与胚胎干细胞存在差异等问题(Puri et al.2012)。实现不同类型的成体细胞间直接转分化，从一种分化状态进入另外一种分化状态，是对诱导多能干细胞研究的思路拓展和方法的变革(He et al.2014)。CCAAT增强子结合蛋白C/EBPβ是一种重要的转录因子。研究发现，C/EBPβ可通过调控histone H4，终止细胞的有丝分裂，可促使小鼠3T3L-1前脂肪细胞进入终末分化(Zhang et al.2011)。发明内容

本发明解决的问题在于提供一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，基于C/EBPβ基因的重组腺病毒载体进行转染，实现了牛原代成纤维细胞/成肌细胞的快速转分化为脂肪细胞，有助于脂肪细胞分化、家畜脂肪沉积乃至动物转基因育种。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，包括以下操作：

克隆牛C/EBPβ基因序列并在其上游添加Kozak序列，然后将克隆的C/EBPβ基因构建到穿梭载体中，再通过穿梭载体与腺病毒骨架载体的同源重组，将C/EBPβ基因构建到腺病毒骨架载体当中，得到重组腺病毒载体；

将重组腺病毒载体转染宿主细胞，在重组腺病毒载体被表达后，获取包含C/EBPβ基因的重组腺病毒Ad-C/EBPβ；

将重组腺病毒Ad-C/EBPβ侵染原代牛成纤维细胞/成肌细胞进行诱导转分化，在侵染6天后，牛成纤维细胞/成肌细胞被诱导转分化为牛脂肪细胞。

所述的牛C/EBPβ基因序列如SEQ.ID.NO.1所示；所述的Kozak序列为GCCACC。

所述的穿梭载体为pAdTrack-CMV，所述的腺病毒骨架载体为pAdEasy-1，所述的宿主细胞为HEK293A细胞。

所述在重组腺病毒Ad-C/EBPβ侵染后，包括PPARγ、ACCα、FAS、LPL在内的与脂肪细胞分化相关的关键基因表达被上调，成脂分化过程被激活。

所述在侵染6天后，所诱导转分化的牛脂肪细胞中有脂滴形成。

牛C/EBPβ基因在诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为牛脂肪细胞中的应用。

所述牛C/EBPβ基因通过构建重组腺病毒侵染进入到细胞中进行诱导转分化。

所述牛C/EBPβ基因通过激活脂肪细胞转分化相关基因进行诱导转分化。

所述的转分化相关基因包括PPARγ、ACCα、FAS和LPL。

在转基因动物育种中牛C/EBPβ基因诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为牛脂肪细胞的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，是一种不同类型的成体细胞间直接转分化：实现了成纤维细胞/成肌细胞直接转分化为脂肪细胞，而脂肪细胞对肉牛品质的提高至关重要。

本发明基于C/EBPβ所构建的重组腺病毒Ad-C/EBPβ能够实现成纤维细胞/成肌细胞的快速转分化为脂肪细胞，在侵染第6天有明显脂滴形成。油红O染色结果呈红色，表明成纤维细胞/成肌细胞转化为脂肪细胞。尤为重要的是诱导分化是在原代细胞之间进行的，而原代成纤维细胞、成肌细胞转染效率很低。为此，本发明在所构建重组C/EBPβ腺病毒载体及重组腺病毒Ad-C/EBPβ中，C/EBPβ上游连接有提高目的基因翻译起始效率的Kozak序列，Kozak序列的添加更利于目的基因C/EBPβ的基因表达量，在转染之后形成C/EBPβ基因过表达。

进一步的，本发明中腺病毒转染系统的使用，提高了C/EBPβ基因导入细胞的效率，促进了C/EBPβ的表达，有利于其激活与脂肪细胞转分化相关基因，尤其是一些关键基因比如PPARγ、ACCα、FAS和LPL，更利于细胞转分化。

本发明转录因子-CCAAT增强子结合蛋白C/EBPβ基因的诱导转分化使用，表明牛C/EBPβ基因对调控牛脂肪细胞的转分化具有重要作用，实现了牛原代成纤维细胞、成肌细胞的快速转分化为脂肪细胞，可为研究脂肪细胞分化，家畜脂肪沉积机理提供一个很好的模型。同时，为培育“大理石花纹”明显、富含肌内脂肪的优质肉牛新品种提供了新思路和新候选功能基因。

附图说明

图1为牛C/EBPβ基因CDS区域的PCR扩增结果；

图2为pAdEasy-C/EBPβ载体示意图；

图3为pAdEasy-C/EBPβ载体酶切鉴定结果；

图4为重组腺病毒的显微观察结果；

图5-1～图5-2为组织块法和胶原酶消化法分离获得原代成纤维细胞和成肌细胞示意图；

图6为C/EBPβ基因诱导牛原代成纤维细胞转分化为脂肪细胞的检测结果；

图7为C/EBPβ基因诱导牛原代成肌细胞转分化为脂肪细胞的检测结果；

图8为转化后的脂肪细胞的关键基因表达检测结果。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施做详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的实施例的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例载体、菌株、细胞、试剂来源：

实施例中涉及到的组织样品来自西北农林科技大学国家肉牛改良中心良繁场秦川牛。HEK293A细胞购自中科院上海细胞库，TOPO10感受态细菌、BJ5183感受态细胞、腺病毒重组载体均购自Invitrogen公司，DH5α购自天根生化科技有限公司，RT-PCR试剂盒购自Fermantas公司，质粒提取、胶回收试剂盒购自OMEGA公司，19-T、内切酶、连接酶、实时荧光定量PCR试剂盒均购自Takara公司，KOD-PLUS高保真PCR酶购自东洋纺公司，DMEM、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)均购自Hyclone公司，油红O购自sigma公司，引物合成在南京金斯瑞公司和Invitrogen公司完成。酶切、连接、回收、转化、RNA提取、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

1、CCAAT增强子结合蛋白基因C/EBPβ的克隆

根据GenBank牛C/EBPβ基因序列信息(NM_176788)设计引物序列，用于克隆牛C/EBPβ基因1047bp编码区序列。其中，上下游引物分别添加BglⅡ和XhoⅠ酶切位点，用于下一步克隆。同时，上游引物翻译起始(ATG)上游添加Kozak序列(GCCACC)，以进一步提高C/EBPβ基因表达。

正向引物：GGAC AGATCT GCCACC CAACGCCTGGTGGTCTGGGBglⅡ  Kozak

反向引物：GCGTCTCGAGGCAGTGGCCGGAGGAGGCGXho  Ⅰ

以上述引物对进行以下扩增：

以秦川牛脂肪组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板，采用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-PCR,RT-PCR)技术，利用KOD-Plus高保真酶扩增C/EBPβ目标基因的完整CDS区；

扩增反应条件为：预变性95℃/10min。98℃/12s、65℃/30s、68℃/35s，30个循环。68℃/10min。4℃/10min。

将上述过程取扩增得到的PCR产物(其电泳图谱如图1所示)5μL加入1μL Taq DNA聚合酶，72℃条件下加“A”反应10min。加“A”产物使用DNA凝胶回收试剂盒进行片段纯化并进行BglⅡ和XhoⅠ酶切，然后与同样酶切的19-T Simple载体在16℃连接，30min得到连接产物。将连接产物转化DH5α感受态细菌。培养约16h后提取质粒送Takara公司测序验证。测序正确的载体称为19-T-C/EBPβ载体，其中C/EBPβ的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2、C/EBPβ基因腺病毒过表达载体构建

利用BglⅡ和XhoⅠ内切酶双酶切19-T-C/EBPβ质粒和pAdTrack-CMV穿梭载体，胶回收1047bp C/EBPβ片段和线性化的pAdTrack-CMV片段，并用T4连接酶将胶回收片段4℃连接过夜。

取上述连接产物10μL转化入TOP10感受态细胞中，挑取经菌落PCR初步鉴定成阳性的单克隆进行摇菌、提质粒。经BglⅡ和XhoⅠ双酶切鉴定正确的质粒并测序，所获取的穿梭载体为pAdTrack-CMV-C/EBPβ。

利用PmeI内切酶对pAdTrack-CMV-C/EBPβ质粒线性化，然后转化入含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞中进行同源重组(同源重组发生在穿梭载体与腺病毒骨架载体的同源左臂和同源右臂之间)，经kan抗性筛选、挑取重组后的单克隆菌落，扩繁并提取质粒，利用PacI内切酶鉴定腺病毒重组载体pAdEasy-C/EBPβ质粒正确性(见图2)。酶切鉴定结果如图3所示，PacⅠ酶切腺病毒重组载体pAdEasy-C/EBPβ可分别切下约30kb和4.5kb两条DNA片段，与预期结果相符，表明重组腺病毒载体构建成功。然后利用PacI内切酶线性化pAdEasy-C/EBPβ载体，异丙醇沉淀法沉淀线性化片段用于腺病毒包装。

3、过表达C/EBPβ基因重组腺病毒包装

采用罗氏FuGENE HD转染试剂进行细胞转染操作，具体步骤可参照试剂盒说明书。本发明中，线性化的腺病毒重组片段(pAdEasy-C/EBPβ)按照pAdEasy-C/EBPβ(μL)：FuGENE HD(μg)＝3:2比例转染HEK293A细胞。如图3所示，24h后荧光显微镜下可观察到部分细胞有绿色荧光蛋白GFP表达(绿色荧光蛋白表达，表明pAdEasy-C/EBPβ载体成功转入细胞并正常表达)，随着时间的延长，转染细胞形成典型的彗星状聚集现象(7天)，并伴随出现细胞病变效应CPE(12天)(表明腺病毒包装成功)。当有超过70％的细胞从培养瓶底脱落收集第一代腺病毒，之后用收集的腺病毒反复感染HEK293A细胞2～4次，获得高滴度病毒(命名为Ad-C/EBPβ)。空载Ad-NC病毒为对照(不含有C/EBPβ基因)。

实施例4：牛成纤维细胞、成肌细胞分离培养

成纤维细胞：剪取健康犊牛的耳尖，投入装有灭菌PBS溶液(37℃)的50mL离心管中，2h内带回实验室。取出牛耳尖，用手术刀逆毛生长方向将表面毛刮干净，用碘酊擦拭两遍后用75％酒精迅速脱碘。用手术刀切1cm²处理后的表皮层组织并将组织块放入75％酒精消毒20-30秒，再用含2×双抗(青霉素和链霉素)的PBS反复冲洗。将清洗后的表皮组织放在培养皿中剪成1mm³，并用眼科针将组织块铺于细胞培养皿底部，添加10％血清培养基倒置培养。4-6h后，将培养瓶翻转并继续培养。培养3～5天，显微镜下可见组织块旁有成纤维细胞爬出(如图5-1所示)。待细胞汇合度达90％时传代或冻存。

成肌细胞：取健康犊牛后腿肌肉，用75％酒精清洗30s，转移到1×双抗的PBS中清洗三遍带回实验室。在超净台中用PBS将取回的肌肉块清洗3遍后，将肌肉块剪成1mm³大小的肉糜。加入含2mg/mL的Ⅳ型胶原酶的DMEM，放入37℃培养箱中进行消化。每隔30min取出培养皿并用移液器进行吹打，直至将组织块吹散，大约消化2.5～3h。之后加入等体积的混合培养液(DMEM+20％FBS+10％HS)混匀后离心(1000r/min×5min)。弃去上清液后用混合培养液重悬细胞，400目细胞筛过滤后将细胞接种至培养瓶中，置于37℃培养箱中(记为PP1)。培养1h后，将未贴壁的细胞悬液转移至一个新的培养瓶中继续培养(记为PP2)。1h后重复并记为PP3。培养24h后，将未贴壁的悬液离心(1000r/min×5min)弃上清，用混合培养基重悬细胞，并转入新的培养瓶中培养(记为PP4)。培养48h后，将细胞悬液重复离心、重悬步骤一次(记为PP5)。经过上述五次差速贴壁培养后，获得纯度较高的牛原代成肌细胞(如图5-2所示的显微观察图)。3天后，细胞汇合度达到80％以上时进行传代或冻存。

5、C/EBPβ基因诱导成纤维细胞、成肌细胞向脂肪细胞转分化

原代牛成纤维细胞、成肌细胞接种至6孔板中(含体积分数10％的胎牛血清高糖DMEM培养基)培养24h后，将6孔板中的培养液吸出，换新鲜的培养液，同时加入PBS稀释的病毒液1ml(病毒感染数MOI＝10)侵染细胞(Ad-C/EBPβ组、Ad-NC组、未处理细胞组每个组各三个重复)。病毒侵染24h后换普通培养基培养。在侵染的第2、4、6、8天镜检观察荧光并利用油红O染色法对诱导后的脂肪细胞进行鉴定。

油红O染色步骤如下：①PBS洗涤第2、4、6、8天各处理组细胞2次；②加入4％中性甲醛覆盖细胞层，固定细胞膜30min后PBS洗2次；③加入油红O工作液，覆盖细胞处理30min后PBS洗涤3～5次后观察拍照。

荧光显微镜镜检结果表明，腺病毒侵染成纤维细胞、成肌细胞的效率高达90％以上。油红O染色结果见图6、图7，与未侵Ad-C/EBPβ重组腺病毒的成纤维细胞、成肌细胞(Normal control组)和侵染空病毒的成纤维细胞、成肌细胞(Ad-NC组)两个对照组相比较，过表达C/EBPβ基因的病毒组(Ad-C/EBPβ组)成纤维细胞、成肌细胞在侵染约第6天有明显脂滴形成。油红O染色结果呈红色，表明所获得的细胞为脂肪细胞。结果表明表明C/EBPβ可快速诱导牛成纤维细胞、成肌细胞转分化为脂肪细胞。

为了进一步验证所获得的脂肪细胞的正确性和可靠性，本发明对脂肪细胞分化相关关键基因设计了四对引物，通过实时荧光定量PCR(Real-timePCR)方法进行了定量检测。其中检测的四个基因及其引物分别是：

过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ：

正向引物：5’GAGATCACAGAGTACGCCAAG 3’

反向引物：5’GGGCTCCATAAAGTCACCAA 3’

乙酰辅酶A羧化酶ACCα：

正向引物：5’CTCCAACCTCAACCACTACGG 3’

反向引物：5’GGGGAATCACAGAAGCAGCC 3’

脂肪酸合成酶FAS：

正向引物：5’TAAGGTTCAAATTGCTGCGT 3’

反向引物：5’TCCAGAGCGAAGGAGAGATT 3’

脂蛋白酯酶LPL：

正向引物：5’ACGATTATTGCTCAGCATGG 3’

反向引物：5’ACTTTGTACAGGCACAACCG 3’

如图8所示，与两个对照组相比较(Normal control组和Ad-NC组)，上述4个关键基因在C/EBPβ处理组(Ad-C/EBPβ组)均有不同程度的上调，表明牛成纤维细胞、成肌细胞在C/EBPβ基因的诱导下成脂分化过程被激活并成功的转分化为脂肪细胞。

PPARγ是调控脂肪细胞分化和代谢的关键转录因子，PPARγ的激活促进脂肪细胞分化(Evan et al.2002；Martina et al.2014)。本发明专利应用C/EBPβ基因处理成纤维细胞、成肌细胞转分化过程中发现，相比对照组(Normal control组和Ad-NC组)，处理组C/EBPβ的上调促使成纤维细胞、成肌细胞从3.5天开始，PPARγ基因的表达明显上调，进而促进了成纤维细胞的转分化。

脂蛋白酯酶基因LPL的表达是脂肪细胞分化的早期标记，预示着脂肪开始积累(Ailhaud et al.1995；Van et al.2010)。本发明专利实时荧光定量PCR结果发现，C/EBPβ基因的上调，使成纤维细胞、成肌细胞从第3天开始LPL基因的表达明显上调，这表明成纤维细胞开始向脂肪细胞转分化。

而ACCα、FAS基因编码蛋白作为脂肪酸合成的限速酶，在C/EBPβ处理组细胞中得到明显上调，表明上述两个细胞脂肪酸的合成能力提高。实时荧光定量PCR结果也进一步证明了本专利应用C/EBPβ基因成功地实现了成纤维细胞、成肌细胞转分化为脂肪细胞。

根据上述脂肪细胞分化及脂肪酸合成关键基因的检测结果可以推测，成纤维细胞、成肌细胞中过表达C/EBPβ基因可能是通过激活脂肪细胞分化关键转录因子PPARγ基因，进而激活了成纤维细胞、成肌细胞开始向脂肪细胞发生转分化。同时这种作用进一步激活了LPL、ACCα、FAS等脂肪酸合成代谢关键基因，促进了脂肪细胞进一步分化和脂滴的形成。

牛C/EBPβ基因对调控牛脂肪细胞的转分化具有重要作用，实现了牛原代成纤维细胞、成肌细胞的快速转分化为脂肪细胞，可为研究脂肪细胞分化，家畜脂肪沉积机理提供一个很好的模型。同时，为培育“大理石花纹”明显、富含肌内脂肪的优质肉牛新品种提供了新思路和新候选功能基因。

因此，牛C/EBPβ基因可以应用于诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为牛脂肪细胞，而且还可应用到转基因动物育种中的牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为牛脂肪细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，包括以下操作：

克隆牛C/EBPβ基因序列并在其上游添加Kozak序列，然后将克隆的C/EBPβ基因构建到穿梭载体中，再通过穿梭载体与腺病毒骨架载体的同源重组，将C/EBPβ基因构建到腺病毒骨架载体当中，得到重组腺病毒载体；

将重组腺病毒载体转染宿主细胞，在重组腺病毒载体被表达后，获取包含C/EBPβ基因的重组腺病毒Ad-C/EBPβ；

将重组腺病毒Ad-C/EBPβ侵染原代牛成纤维细胞/成肌细胞进行诱导转分化，在侵染6天后，牛成纤维细胞/成肌细胞被诱导转分化为牛脂肪细胞。

2.如权利要求1所述的诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，所述的牛C/EBPβ基因序列如SEQ.ID.NO.1所示；所述的Kozak序列为GCCACC。

3.如权利要求1所述的诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，所述的穿梭载体为pAdTrack-CMV，所述的腺病毒骨架载体为pAdEasy-1，所述的宿主细胞为HEK293A细胞。

4.如权利要求1所述的诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，在重组腺病毒Ad-C/EBPβ侵染后，包括PPARγ、ACCα、FAS、LPL在内的与脂肪细胞分化相关的关键基因表达被上调，成脂分化过程被激活。

5.如权利要求1所述的诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，在侵染6天后，所诱导转分化的牛脂肪细胞中有脂滴形成。

6.牛C/EBPβ基因在诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为牛脂肪细胞中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，牛C/EBPβ基因通过构建重组腺病毒侵染进入到细胞中进行诱导转分化。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，牛C/EBPβ基因通过激活与脂肪细胞转分化相关基因进行诱导转分化。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的转分化相关基因包括PPARγ、ACCα、FAS和LPL。

10.在转基因动物育种中牛C/EBPβ基因诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为牛脂肪细胞的应用。