CN111154763B - 长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用 - Google Patents

长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用。本发明构建了长非编码RNA lncMGPF的超表达载体及干涉载体，通过慢病毒感染的方式在细胞水平感染猪骨骼肌卫星细胞并在活体水平感染猪的股二头肌，在多次感染病毒后采集猪的股二头肌，在猪个体上验证lncMGPF对肌肉生长发育的影响，为培育出更高产量的瘦肉猪新品种奠定技术基础。

Description

长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一个长链非编码RNA lncMGPF序列在促进猪骨骼肌卫星细胞分化及其在提高猪肌肉量的应用。
背景技术
肌肉的生长发育是一个复杂的长期动态变化的过程，主要分为产前肌肉发育和产后的增长阶段。肌组织主要由肌纤维组成，大量的研究表明，动物的肌纤维数目在出生前已经确定，而肌肉量主要由肌纤维数目与大小决定。所以肌纤维的大小直接决定了肉类的产量，通过调控肌纤维的肥大来提高肉产量，是行之有效的方法和本领域研究的重点。
从第一个lncRNA H19被识别以来，越来越多的lncRNA被发现在哺乳动物中，对其功能研究发现LncRNAs参与到多种生物学过程中，例如染色体失活，基因印记，染色体状态和基因组稳定性，干细胞的维持和多能性，细胞命运的决定，肌肉的生长发育癌症的发生和多种疾病控制等。
目前在猪基因组中已经通过RNA-seq等技术识别了上万个lncRNAs，但在肌肉中的lncRNA的识别较少。Tang等(2017年)利用RNA-seq技术分析了贵州小型猪的lncRNA的表达，识别了10813个lncRNA，有57％的lncRNA表现出人和小鼠的保守性。此外，发现5455个lncRNA表现出高度的组织特异性。Ren等(2009年)利用Long SAGE构建猪lncRNA基因组文库发现TncRNA在猪胚胎其表达水平显著升高，在胚胎期90日龄的通城猪和长白猪胎儿骨骼肌中差异表达，这就表明其可能参与到猪胚胎期骨骼肌的发育(Ren et al 2009)。Zou等利用已有的猪转录组测序数据分析在猪的腿肌中识别了323个基因间lncRNA的表达。这些lncRNA相比mRNA具有更短的序列，更少的外显子和更低的表达水平，这些结果符合lncRNA的特性(Zou et al 2017a)。进一步的分析发现这些lncRNA可能参与到肌肉收缩和肌肉发育过程。因此推测这些lncRNA可能和猪肌肉发育相关。Colin Kern等(2018年)利用RNA-seq数据分析了不同物种肌肉特异表达lncRNA发现246个猪肌肉特异表达lncRNA，GO分析发现这些lncRNA和肌肉的发育显著相关(Kern et al 2018)。Zhao等利用RNA-seq技术系统性地分析了猪不同时间骨骼肌中lncRNA的表达，识别了570个多外显子lncRNA，这些lncRNA表现出和mRNA类似的特征(Zhao et al 2015)。保守性分析发现一个在人，鼠和猪中高度保守的lncRNA，即CUFF.8631。该lncRNA在具有四个转录本，其中CUFF.8631.1和CUFF.8631.3随着肌肉的发育表现出显著的差异表达，暗示该转录本可能参与到肌肉生长发育过程中。
最近的研究联合通过分析不同物种或者不同品种猪的转录组测序数据发现了大量的肌肉相关的lncRNA。Sun等在长白猪和蓝塘猪中利用Ribo-Zero RNA-Seq and miRNA-Seq技术整合分析了猪背最长肌中mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA转录组数据，发现了547个差异表达mRNA，5566个差异表达lncRNA和4360个差异表达circRNA。通过预测发现有19个lncRNA可能和miRNA结合发挥miRNA分子海绵的作用(Sun et al 2017)。Zou等在约克夏猪和皖南花猪两个品种中利用转录组数据分析发现了352个与肌肉生长和肉质性状相关联的lncRNA(Zou et al 2017b)。种种研究表明，长链非编码RNA在畜禽肌肉发育过程中存在重要作用，对畜牧业肉量生产具有重大的经济利用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，筛选一个长链非编码RNA lncMGPF，以调控猪骨骼肌卫星细胞的分化，进而提高猪肌肉量的生产量。
本发明的其中一个目的是在猪上克隆一个新的长链非编码RNA片段，申请人将该片段命名为lncMGPF。
本发明目的之二是验证lncMGPF片段调控猪骨骼肌卫星细胞分化中的功能验证。
进一步地，利用利用本发明的lncMGPF片段提高猪肌肉产量的应用。
本发明的技术方案如下：
一个长链非编码(Long noncoding RNAs,lncRNA)的RNA lncMGPF在促进猪骨骼肌卫星细胞分化，进而提高猪肌肉产量中的应用，所述的应用包括如下步骤：
(1)取1日龄仔猪肌肉组织，用胶原酶I消化，利用差速贴壁法纯化分离骨骼肌卫星细胞；
(2)以猪骨骼肌卫星细胞cDNA为模板，利用RACE方法获得lncMGPF的全长，该lncMGPF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
(3)将步骤(2)所述的序列构建到一种慢病毒载体上，得到病毒载体PCDH-CMV-copGFP上。
(4)利用步骤(3)所得的慢病毒载体PCDH-CMV-copGFP感染猪骨骼肌卫星细胞并诱导所述细胞分化，利用RT-qPCR，Western blotting以及免疫荧光方法检测分化相关标志基因在mRNA和蛋白水平上的表达量。
(5)将所得的慢病毒载体PCDH-CMV-copGFP注射到1月龄猪(例如大白猪，实施本本发明不限于该品种)的股二头肌中，每隔七天注射一次，连续注射四次后，采集猪的股二头肌肌肉样品，利用HE染色与组织免疫荧光染色对所述样品的肌纤维横截面积进行检测；
(6)提取肌肉组织的RNA和蛋白，利用RT-qPCR和Werstern Blot方法在RNA和蛋白水平上检测采集的肌肉样品中成肌分化相关的标志基因的表达水平的变化。
本发明的有益效果是：
(1)超表达lncMGPF后可以促进畜禽的肌肉产量，提高畜牧业生产效益，创造更多价值。
(2)本发明所使用的方法相较传统转基因猪品种培育来说，具有周期短，见效快，成本低，为在大动物上研究基因的生物学功能提供了新的技术方案。
(3)针对现今畜牧业生产上难以提高畜禽产肉量的现状，本发明可提供新的改良方法与手段。
附图说明
图1：本发明克隆的lncRNA lncMGPF的核苷酸序列(直观图)。
图2：本发明中利用RACE技术研究lncMGPF全长序列电泳结果。
图3：本发明中超表达lncMGPF后RT-qPCR检测成肌分化标志基因在RNA水平表达情况。以β-actin基因作为内参。
图4：本发明中超表达lncMGPF后WB检测成肌分化标志基因在蛋白水平上的表达情况，和显示各蛋白经β-actin内参校正后的相对表达量。附图标记说明：图4中的A图是本发明中超表达lncMGPF后WB检测成肌分化标志基因在蛋白水平上的表达情况；图4中的B图显示各蛋白经β-actin内参校正后的相对表达量。
图5：是本发明中超表达lncMGPF后检测MyoG、MyHC的免疫荧光结果。附图标记说明：图5中的A图为MyoG免疫荧光图，图5中的B图为MyoG免疫荧光量化图；图5中的C图为MyHC免疫荧光图，图5中的D图为MyHC免疫荧光量化图。
图6：本发明中干涉lncMGPF后，RT-qPCR检测成肌分化标志基因在RNA水平表达情况。以β-actin基因为内参基因。
图7：本发明中干涉lncMGPF后WB检测成肌分化标志基因在蛋白水平表达情况和各蛋白经β-actin内参基因校正后的相对表达量。附图标记说明：图7中的A图是本发明中干涉lncMGPF后WB检测成肌分化标志基因在蛋白水平表达情况；图7中的B图是各蛋白经β-actin内参基因校正后的相对表达量。
图8：本发明中干涉lncMGPF后检测MyoG、MyHC的免疫荧光结果。附图标记说明：图8中的A图为MyoG免疫荧光图；图8中的B图为MyoG免疫荧光量化图；图8中的C图为MyHC免疫荧光图；图8中的D图为MyHC免疫荧光量化图。
图9：本发明中在猪上超表达lncMGPF后检测肌纤维横截面积的组织免疫荧光染色结果和肌纤维横截面积量化图。附图标记说明：图9中的A图是本发明中在猪上超表达lncMGPF后检测肌纤维横截面积的组织免疫荧光染色结果。图9中的B图是组织免疫荧光染色量化图。
图10：本发明在猪上超表达lncMGPF后检测肌纤维横截面积的HE染色结果和肌纤维横截面积量化图。附图标记说明：图10中的A图是本发明中在猪上超表达lncMGPF后检测肌纤维横截面积的HE染色结果。图10中的B图HE染色量化图。
图11：本发明中在猪上超表达lncMGPF后RT-qPCR检测肌肉中成肌分化标志基因在RNA水平表达情况，以β-actin作为内参。
图12：本发明中在猪上超表达lncMGPF后WB肌肉中成肌分化标志基因在蛋白水平表达情况。附图标记说明：图12中的A图是本发明中在猪上超表达lncMGPF后WB肌肉中成肌分化标志基因在蛋白水平表达情况；图12中的B图是各蛋白经β-actin内参基因校正后的相对表达量。
图13：是质粒PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP图谱。
图14：是质粒pLKO.1-TRC图谱。
图15：是质粒psPAX2图谱。
图16：是质粒PDM2.G图谱。
具体实施方式
对序列表的说明：
SEQ ID NO：1是本发明克隆的一个长链非编码RNA lncMGPF的核苷酸序列。序列长度为1586bp。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料及其来源：
(1)PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP、pLKO.1-TRC、psPAX2、PDM2.G：购自Addgene公司；上述质粒图谱分别见图13,图14,图15和图16所示。
(2)1日龄仔猪(例如大白猪，实施本发明不限于该品种)为华中农业大学种猪测定中心核心猪场提供。
(3)Western Blot和免疫荧光染色所用抗体如下:MyoG(sc-12732；1:200,SantaCruz Biotechnology,USA)，MyoD(sc-760；1:200；Santa Cruz Biotechnology,USA)，MyHC(sc-376157；1:1000；Santa Cruz Biotechnology,USA)，β-actin(sc-4777；1:1000；SantaCruz Biotechnology,USA)，dystrophin(ab-15277；1:100；Abcam,UK)。
(4)引物合成：由上海生工生物技术服务有限公司合成；
(5)总RNA提取试剂盒(购自
Figure BDA0002378965300000051
HP Total RNA Kit)、普通质粒提取试剂盒(购自Plasmid Mini Kit I)、胶回收试剂盒(购自Gel Extraction kit)、DNA产物回收试剂盒(购自MicroElute Cycle-Pure Kit)、RNA纯化试剂盒(购自MicroElute RNA Clean-UpKit)和无内毒素小量质粒提取试剂盒(购自
Figure BDA0002378965300000052
Endo-Free Plasmid Mini Kit II)购自Omega Bio-tek公司；
(6)SYBR Green荧光定量试剂和化学发光剂ECL购自Bio-Rad公司；
(7)RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、免疫染色封闭液，免疫染色一抗稀释液，免疫染色二抗稀释液，DAPI染色液均购自上海碧云天生物技术有限公司；
(8)SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western blotting电泳缓冲液、转膜缓冲液、显影液、定影液和脱脂奶粉均购自武汉谷歌公司；
(9)PVDF膜购自Millipore公司。
实施例1：猪骨骼肌卫星细胞分离与培养
取1日龄仔猪(例如品种为大白猪，但不限于该品种)颈总动脉放血处死，浸泡于75％乙醇中10min杀灭细菌。剥离仔猪皮肤暴露的后肢肌肉，用眼科剪剪取肌肉组织，置于2％浓度双抗的磷酸盐缓冲液(PBS，于750ml的超纯水种溶解8g的NaCl，0.2g的KCl，2.89g的Na2HPO4·12H2O，0.2g的NaH2PO4，纯水定容到1000mL)溶液中，涮洗除去毛发、血液和脂肪。在双抗浓度为2％的PBS溶液中，彻底剪碎肌肉至1mm3大小。收集于15mL离心管，5000r/min离心2min。弃去PBS溶液，视肌肉组织沉淀的量，加入2倍体积的浓度为2％的胶原蛋白酶，37℃摇床160r/min震荡120min。加入2倍于其体积的细胞增殖培养基(20％胎牛血清DMEM培养基，1％的鸡胚提取物，1％成纤维生长因子，1％双抗)，用力吹打，促进肌卫星细胞从基底膜中的释放。将悬液分别经过100目、200目和400目细胞筛过滤，终滤液放入离心机于1200r/min离心10min，弃去上清液，沉淀即是分离得到的细胞。加入5mL细胞增殖培养基(成分同上)，吹打悬浮细胞，转移至细胞培养瓶内。放入37℃，5％CO2浓度的细胞培养箱培养2h，细胞差速贴壁。2h后，将培养瓶中的培养基转移至另一新的细胞增殖培养基的培养瓶内，静置培养3天(期间勿扰动)。3天后，将培养基吸走，直接再加入新的细胞增殖培养基，继续培养，直至细胞长满。用胰蛋白酶消化细胞，加入5mL细胞增殖培养基，转移至新的细胞增殖培养基的培养瓶中，差速贴壁1h。1h后将所述的细胞增殖培养基转移至新的培养瓶中，继续培养，直至长满培养瓶，获得高纯度的肌卫星细胞。
实施例2：利用RACE方法扩增并确定lncMGPF及其核苷酸序列
以猪骨骼肌卫星细胞cDNA为模板，利用宝生物工程大连有限公司(TAKARA)的RACE快速扩增试剂盒，根据试剂盒说明书进行操作。设计lncMGPF引物：5’RACE引物：5′-CCTGCCTCAAACCCCTCCTTTTACTCATCA-3′，3’RACE引物：5′-ATTGCCAGCATTTGTAAGTGATTGTGCAAT-3′。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的条带胶、测序。试验结果表明：通过5’RACE和3’RACE扩增，结果显示得到的序列lncMGPF全长为1586bp(其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO:1)。
实施例3：构建lncMGPF的超表达和干涉的慢病毒载体
以猪骨骼肌卫星细胞cDNA为模板，根据实施例2的RACE测序结果设计扩增引物，lncMGPF扩增全长引物如下：正向引物F:GCTCTAGAGCAGAGCATTATTTTTCTTCTTCA；反向引物R:CGGGATCCCGTGGCATTTACTTTTACTGGA。
针对lncMGPF核苷酸序列设计siRNA序列，siRNA序列引物如下：正向引物F:CCGGAAGCATGAGGTCACTTAATATCTCGAGATATTAAGTGACCTCATGCTTTTTTTG；反向引物
R:AATTCAAAAAAAGCATGAGGTCACTTAATATCTCGAGATATTAAGTGACCTCATGCTT。
将扩增得到的lncMGPF全长序列连接到慢病毒载体，得到超表达载体PCDH-CMV-copGFP，将其命名为LV-lncMGPF。进一步将合成的siRNA序列连接到pLKO.1-TRC载体上，将重组载体命名为LV-si-lncMGPF。
实施例4：利用超表达或干涉lncMGPF检测猪骨骼肌细胞的分化能力
将猪骨骼肌卫星细胞接种至6孔板中，至细胞密度达到60％以上可进行慢病毒感染。吸取适量的增殖培养基(20％胎牛血清DMEM培养基，1％的鸡胚提取物，1％成纤维生长因子，1％双抗)，配制病毒稀释液(每1mL增殖培养基中加入5uL的lncMGPF超表达载体(LV-lncMGPF)或干涉慢病毒和1uL的聚凝胺(Polybrene))，轻轻颠倒混匀。将细胞培养基洗干净，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次，然后每孔加入2mL的制备的病毒稀释液。同时设立对照(慢病毒包装的si-NC，对照)试验；病毒感染24h后，将培养基换成新鲜增殖培养基继续培养或者加入分化培养基(含2％的孕马血清的DMEM培养基)诱导细胞分化。此时可在荧光显微镜下观察慢病毒感染效果。诱导猪骨骼肌卫星细胞分化3天后，提取细胞总RNA，同时提取细胞总蛋白。利用宝生物工程大连有限公司反转录试剂盒进行反转录，将RNA反转录为cDNA，利用定量PCR技术检测成肌分化相关基因MyoD(Myoblasta determination factor)、MyoG(Myogenin)和MyHC(Myosin Heavy Chain)在RNA水平的表达变化情况。利用WB技术检测成肌分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC在蛋白水平的表达变化情况。将细胞接种至24孔板中，以与上述方法相同的步骤进行转染，在转染24h后诱导细胞分化，利用免疫荧光技术分别在分化3天检测MyoG和MyHC的蛋白表达。
试验结果表明：病毒感染后分化3天，分别检测成肌细胞分化相关基因MyoD、MyHC和MyoG mRNA和蛋白水平的变化，发现超表达lncMGPF后，MyoD、MyHC和MyoG mRNA(图2)和蛋白水平(图3)都显著升高了。利用免疫荧光技术，超表达lncMGPF后细胞原位水平检测在分化3天MyHC和MyoG的变化。结果显示超表达lncMGPF后，MyHC和MyoG的表达量显著增加(图4)。病毒感染后分化3天，分别检测成肌细胞分化相关基因MyoD、MyHC和MyoG mRNA和蛋白水平的变化，发现干涉lncMGPF后，MyoD、MyHC和MyoG mRNA(图5)和蛋白水平(图6)都显著降低了。利用免疫荧光技术，干涉lncMGPF后细胞原位水平检测在分化3天MyHC和MyoG的变化。结果显示干涉lncMGPF后，MyHC和MyoG的表达量显著增加(图7)。
实施例5：在猪上注射lncMGPF超表达病毒并检测肌肉生长发育情况
取1月龄仔猪(大白猪，但不限于该品种)4头，在同一头仔猪的左、右腿的股二头肌分别注射1mL的lncMGPF的慢病毒液以及对照病毒液，每隔7天，在同样部位再注射同样剂量的病慢毒液，一共注射4次。在最后一次注射后7天，屠宰后取得猪股二头肌肉样品，将肌肉组织修整为1cm3的小立方块，浸泡于肌肉组织固定液(常规)中36小时，然后通过脱水、浸蜡、包埋等工序制作石蜡切片。分别利用Dystrophin组织免疫荧光染色和HE染色对肌肉肌纤维横截面积进行检测。采用细胞水平一致的方法提取肌肉组织RNA和蛋白，利用定量PCR检测成肌分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC在RNA水平的表达变化情况。利用WB方法检测成肌分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC在蛋白水平的表达变化情况。
试验结果表明：慢病毒感染细胞28天后，利用组织免疫荧光染色和HE染色检测各部分肌肉的横截面积。组织免疫荧光染色显示超表达lncMGPF可显著增加肌纤维的横截面积(图8)。同样，利用肌肉组织HE染色试验揭示超表达lncMGPF可显著增加肌纤维面积(图9)。慢病毒感染28天后，提取RNA后利用qRT-PCR检测了MyoG、MyoD和MyHC基因mRNA的表达水平变化。结果发现超表达lncMGPF载体可以促进MyoG、MyoD和MyHC基因的表达(图10)。同时，提取肌肉组织蛋白检测了MyoG、MyoD和MyHC基因的蛋白表达水平，结果发现超表达lncMGPF可以显著增加MyoG、MyoD和MyHC基因蛋白表达水平(图11)。这些结果与lncMGPF基因在猪骨骼肌卫星细胞中的作用是一致的。
主要参考文献
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序列表
<110> 华中农业大学
<120> 长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用
<141> 2020-01-10
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1586
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1586)
<400> 1
agagcattat atttcgtctt cagtgatttc ctccatagtt gcatattccc atccctcacg 60
aattgattgc agtctgaaga atgacctgtt tggggcagtg aggtagattg taaactcttg 120
atttccctcc agctctagcc atactaatag caatgaccaa ggatgacatt atttgctcct 180
tatggtttta agacatgtca gatctttcat caacagtcag tactgcctca gttgtagccc 240
agttctaaag gttattttag tgagcgttcc tgatgagttt tgaagagctg attgaacaga 300
taaatattca gtgcgtcata attaataagt gagtcaatat atattcaaca tgtgttacat 360
tggaatattt tttacttttt aaaagaataa cttgaagttt ctcccaggtt gttttttggt 420
ttttgttttt tttaggaatc accttttacc tattcaatga taaagcattc tggtaatttt 480
ctaagtgtta ttttgatttt aatgatcatc aatattggtt tctgcttaaa actgcttctg 540
gaaaccatgg aattttatac tattcaagac tgaagtgtgc gtgaaaaatt atgacttatt 600
tttgtatgat ttatgtcatc tcattacttt gtagttatgc tttccatctc agttggactc 660
tttaaataaa actcaatttc acacggaggg acttccttaa aggggtctta ctctgaaagt 720
tctgatgagt aaaaggaggg gtttgaggca ggaatagtca gctctgatca caattcagtc 780
ggtcattggg ctaatgagct atgaaatgac tcccatagga gacgtggaac atgaaatatg 840
aaacagtctc tgtttggaaa agatgtgctt ggggaaggtg tcattccttt ggtcttccta 900
cccaagcaca tcaacatatt caccccagaa cttacttaat ttttcaccac tgggaagcat 960
ctcctatggc atcagccctt cctcattttc agtagagatg ggctgggcat gaggtcactt 1020
aatattgaaa caagaaagcg gaatatatca aagatctcaa actgatgata cacaaagcag 1080
caccttgcag tctccagtgt ttgaacacat ctggtgacac gttagatagg atttggtggg 1140
tagaaccaga attgataaga ccgttaaaac cacatgtgac ttatacccct ggctatgaaa 1200
aaagccagtg ggaaatggaa agaacatgaa catttaagct gctctcaaga cagacatccc 1260
ggtggaagag ttcctacccg aggtctggtg tgactcagtt acggaatgca gtgagcatgg 1320
ccagtgggat tgtgaatcca gcccaacagc tccgagaatc actttgtcag tgtgtggcac 1380
atggagaaaa cgaagacaag gactctgtga gactagccta cgtcccttta attgccagca 1440
tttgtaagtg attgtgcaat cttgtgtaat ggtcttttat tttgactctc ttgaaaaaag 1500
aaatgttgtg ttgttgttgg tttgtttgtt ttttttttcc agtaaaagta aatgccaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1586

Claims (1)

1.过表达长链非编码的RNA lncMGPF在促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化中的应用，其特征在于该lncMGPF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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