CN108753779A - 牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法 - Google Patents

牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108753779A
CN108753779A CN201810579627.5A CN201810579627A CN108753779A CN 108753779 A CN108753779 A CN 108753779A CN 201810579627 A CN201810579627 A CN 201810579627A CN 108753779 A CN108753779 A CN 108753779A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lncrna
muscle satellite
cell
satellite cell
differentiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810579627.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108753779B (zh
Inventor
刘新峰
郭宏
丁向彬
李新
张林林
李燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Agricultural University
Original Assignee
Tianjin Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Agricultural University filed Critical Tianjin Agricultural University
Priority to CN201810579627.5A priority Critical patent/CN108753779B/zh
Publication of CN108753779A publication Critical patent/CN108753779A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108753779B publication Critical patent/CN108753779B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1323—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from skeletal muscle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

本发明涉及一种牛lncRNA‑133a序列及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法。本发明提供了一种牛肌肉发育相关的长链非编码RNAlncRNA‑133a的序列，本发明首次发现了lncRNA‑133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的功能，能够将lncRNA‑133a应用在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中。

Description

牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应 用和验证方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其是一种牛lncRNA-133a序列及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法。
背景技术
骨骼肌作为动物躯体最重要的组织之一，占重比高达40％。肌细胞作为骨骼肌的基本形成单位，它的分化发育直接影响到骨骼肌的发育形成。肌细胞的分化和生长发育过程是内在遗传、表观遗传和外在各种信号互作的结果，受到机体肌肉发育调节因子和调控通路的多层次精细调节。LncRNAs作为一种长链非编码RNA可以参与细胞的生长发育等许多生命过程。随着人们对LncRNAs研究的不断深入，研究者已经发现许多LncRNAs可以参与肌细胞的增殖和分化过程。尽管LncRNAs参与肌肉发育的研究已有很多，但是多集中于模式动物小鼠的研究上。近年来，随着生物检测技术及生物信息学分析技术的发展，通过对牛骨骼肌肌肉组织进行高通量测序分析已经获得了大量的与肌肉发育潜在相关的LncRNAs。针对这些获得的肌肉发育潜在相关的LncRNAs，研究者也开展了一些功能研究，并且证实了一些LncRNA，如：LncRNA HZ-5、LncRNA H19、lncMD等，确实参与了对牛骨骼肌肌细胞分化发育的调节。但相较小鼠C2C12成肌细胞生长发育相关LncRNA的报道，参与调节牛骨骼肌细胞生长发育的LncRNAs的相关报道仍然较少，测序获得的与牛肌肉发育相关的海量LncRNAs，还需要研究者不断挖掘和证实它们的功能。
骨骼肌卫星细胞的成肌分化和增殖可作为体外模拟骨骼肌生长发育的模型，LncRNAs作为一类参与肌肉发育的调控因子，可以利用骨骼肌卫星细胞的模型，通过过表达或干扰LncRNAs后，研究其对肌肉发育的调控作用。lncRNA-133a是新发现的一个与肌肉发育相关的LncRNA，但其在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化和增殖过程中的作用尚不清楚。
肉牛作为一种重要的家畜动物，其产肉量和肉品质一直是人们关注的热点。通过研究lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化和增殖中的作用，可以积累更多的关于肉牛骨骼肌生长发育机理的资料，为提高肉牛产肉量和肉品质的研究提供科学依据。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种牛lncRNA-133a序列及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法，本发明首次发现了lncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的功能。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种牛lncRNA-133a，所述牛lncRNA-133a的核苷酸序列为SEQ1。
而且，所述牛lncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的功能。
如上所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用。
而且，所述应用为在促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化中的应用。
而且，所述应用为在促进牛骨骼肌卫星细胞增殖中的应用。
如上所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用的检测方法，步骤如下：
⑴在lncRNA-133a骨骼肌卫星细胞中转染lncRNA-133a真核细胞表达质粒，实现细胞内lncRNA-133a的过表达，设置对照组，诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天；收集细胞，检测对照组及实验组的骨骼肌卫星细胞分化标志基因MHC、MyoD和MyoG表达水平；
⑵在lncRNA-133a骨骼肌卫星细胞中转染lncRNA-133a真核细胞表达质粒，实现细胞内lncRNA-133a的过表达，设置对照组，转染后24h，即细胞增殖期，进行EdU细胞增殖检测牛骨骼肌卫星细胞增殖数；
当实验组过表达lncRNA-133a后，增殖细胞数显著高于对照组、实验组的MHC、MyoD和MyoG的表达水平显著高于对照组相时，则证明牛lncRNA-133a序列能够促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。
而且，所述真核细胞表达质粒为pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a，所述对照组为以空质粒pCDNA3.1-EGFP转染牛骨骼肌卫星细胞；
利用qRT-PCR及Westernblotting检测对照组及实验组的牛骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达水平。
而且，具体步骤如下：
⑴细胞培养
常规复苏冻存的原代牛骨骼肌卫星细胞，加入增殖培养基中并置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，该增殖培养基为含体积分数20％的胎牛血清、100IU·mL-1青霉素和链霉素的DMEM，待增殖细胞融合度达80-90％时更换分化培养基，该分化培养基为含体积分数2％马血清的DMEM；
⑵牛骨骼肌卫星细胞转染
增殖期细胞融合度达50％时，利用脂质体转染试剂转染pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a，为实验组，以空质粒pCDNA3.1-EGFP转染细胞作为对照组，转染后24h时，即细胞增殖期，增殖培养基更换为分化培养基，诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天；
⑶牛骨骼肌卫星细胞增殖、分化能力的检测
EdU细胞增殖检测：细胞在转染后24小时,即增殖期细胞，检测实验组和对照组细胞的增殖情况；
⑷牛骨骼肌卫星细胞中分化标记因子表达水平的检测
①mRNA水平检测：在诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天时，即DM2期，收集实验组和对照组细胞，Trizol裂解并提取总RNA,取4μg总RNA反转录为cDNA，采用qRT-PCR法检测各分化标记因子基因MHC、MYOD、MYOG的表达；
qRT-PCR反应体系为20μL：0.5μL上游引物F、0.5μL下游引物R、2.0μL 5×稀释cDNA、10μL 2×All-in-OneTM qPCR Mix、7.0μLRNase free water；反应条件：95℃10min；95℃10s、60℃20s、72℃15s，重复40个循环；
②蛋白水平检测：细胞在DM2期时被蛋白裂解液裂解，收集蛋白，通过Westernblotting检测分化标志基因MHC的蛋白表达。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明提供了一种牛肌肉发育相关的长链非编码RNA lncRNA-133a的序列，本发明首次发现了lncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的功能，能够将lncRNA-133a应用在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中。
2.本发明提供了lncRNA-133a在促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化和促进牛骨骼肌卫星细胞增殖中的应用，将pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a真核表达载体转染至牛骨骼肌卫星细胞内使细胞内lncRNA-133a的过量表达，过表达lncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞与过表达对照核苷酸序列的细胞相比，显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化。
附图说明
图1为本发明中将pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a真核表达载体转染牛骨骼肌卫星细胞24小时后与对照组比较细胞增殖情况的图片；
图2为本发明中将pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a真核表达载体转染牛骨骼肌卫星细胞后，在诱导分化2天时(DM2)与对照组间分化标记因子MHC、MYOD、MYOG在mRNA水平的表达情况比较图；
图3为本发明中将pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a真核表达载体转染牛骨骼肌卫星细胞后，在诱导分化2天时(DM2)与对照组间分化标记因子MHC在蛋白水平的表达情况比较图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种牛lncRNA-133a，所述牛lncRNA-133a的核苷酸序列为SEQ1。
进一步地，所述牛lncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的功能。
如上所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用。
进一步地，所述应用为在促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化中的应用。
进一步地，所述应用为在促进牛骨骼肌卫星细胞增殖中的应用。
如上所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用的检测方法，步骤如下：
⑴在lncRNA-133a骨骼肌卫星细胞中转染lncRNA-133a真核细胞表达质粒，实现细胞内lncRNA-133a的过表达，设置对照组，诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天；收集细胞，检测对照组及实验组的骨骼肌卫星细胞分化标志基因MHC、MyoD和MyoG表达水平；
⑵在lncRNA-133a骨骼肌卫星细胞中转染lncRNA-133a真核细胞表达质粒，实现细胞内lncRNA-133a的过表达，设置对照组，转染后24h，即细胞增殖期，进行EdU细胞增殖检测牛骨骼肌卫星细胞增殖数；
当实验组过表达lncRNA-133a后，增殖细胞数显著高于对照组、实验组的MHC、MyoD和MyoG的表达水平显著高于对照组相时，则证明牛lncRNA-133a序列能够促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。
较优地，所述真核细胞表达质粒为pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a，所述对照组为以空质粒pCDNA3.1-EGFP转染牛骨骼肌卫星细胞；
利用qRT-PCR及Westernblotting检测对照组及实验组的牛骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达水平。
更进一步地，如上所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用的检测方法，具体步骤可以如下：
1.细胞培养
常规复苏冻存(例如，可以为实验室前期冻存的)的原代牛骨骼肌卫星细胞，使用增殖培养基：含体积分数20％的胎牛血清、100IU·mL-1青霉素和链霉素的DMEM，置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。待增殖细胞融合度达80-90％时更换分化培养基：含体积分数2％马血清的DMEM。
2.牛骨骼肌卫星细胞转染
增殖期细胞融合度达50％时，利用转染试剂Lipfectamine3000按生产商家说明书转染pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a(pcDE-LNC组)，以空质粒pCDNA3.1-EGFP(pcDE-NC组)转染细胞作为对照，转染后24h时，即细胞增殖期(G期)，增殖培养基更换为分化培养基，诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天(DM2期)。
3.牛骨骼肌卫星细胞增殖、分化能力的检测
EdU细胞增殖检测：细胞在转染后24小时,即增殖期细胞(G期)，按Cell-Light EdUApollo 567 In Vitro Imaging Kit试剂盒说明书检测pcDE-LNC组和pcDE-NC组细胞的增殖情况。如图1所示，过表达LncRNA-133a后，pcDE-LNC过表达组增殖细胞数显著高于pcDE-NC对照组，表明LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的作用。
4.牛骨骼肌卫星细胞中分化标记因子表达水平的检测
(1)mRNA水平检测：在诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天时(DM2期)，收集pcDE-LNC组和pcDE-NC组细胞，Trizol裂解并提取总RNA,取4μg总RNA反转录为cDNA，采用qRT-PCR法检测各分化标记因子基因(MHC、MYOD、MYOG)的表达。qRT-PCR反应体系为20μL：0.5μL上游引物F、0.5μL下游引物R、2.0μL 5×稀释cDNA、10μL 2×All-in-OneTM qPCRMix、7.0μL RNase free water。反应条件：95℃10min；95℃10s、60℃20s、72℃15s，重复40个循环。qRT-PCR反应引物信息如表1所示。如图2所示，过表达LncRNA-133a后，MHC、MyoD及MyoG的mRNA水平表达均呈显著上调趋势，表明LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞分化的作用。
表1 qRT-PCR引物信息
(2)蛋白水平检测：细胞在DM2期时被蛋白裂解液裂解，收集蛋白，通过Westernblotting检测分化标志基因MHC(厂家：DSHB；货号：AB-2147781)的蛋白表达。如图3所示，过表达LncRNA-133a后，MHC在蛋白表达水平也呈显著上调，充分证明LncRNA-133a确实具有促进牛骨骼肌卫星细胞分化的作用。
序列SEQ1:
CGACTGGAGCACGAGGACACTGACCGGGATTCAGGGAGGTGGGGAGGGGTGAGACAAAGTCGCATCCGACGACCGAGACCCACGAAGGCACGCTGAAGGGTCGGGCGCGCCCTCCCCGGCCACCCGCGGAAGCAGGGTCCGGTCCATCCACGTCTCCGGACCCATCGGGACTTTGAAAAAGAAACAGCATGTGTGCCAGGAGACGCCTCGGGCGACCGGACCCCACGGGTTGGGGTGGGGCGGCCGCACACGCGCCCGCCTCTCCCCGTCAACCCTCACGACTCCGGCGGGCGGGTCCCCACCTCCGGAGTGGGGCCGAGGGCGAAGCAAACGCTCCTGAGGACGGCCCAGGAGGAGTCCGGACCGCCGAGCCCGAGTCCAGGCGCTCCGGGCAGGGAAGACCCTCTCCCTGCCCACCGCGGCGGCCCGGCCCAGGGAGGGTCCGGCCGGTCCTTCTCCGCGGCCACAGGGGCACGGGGAGATGCTGGTCGACCCGGTCCGGCCACCCCAGAACCTAACCCCGGAGCGCCGCGACGATCACCCTCCCCAGAAACCTAAAGAACCAATCTCCGACGACAGCAGGACGTCCCTAGGCCTCGGCGCCACCGGGACTGTCGCCGCCAGCATAGCCGGTGTCTGAGAGCTCTGCCTCGGGCCCGGCGGCTGAGTCACAACCCTCCTGAAGGGCTCGCCGAAGCTCCGGAGGGGGGGGGACAATATACAAGCGGCCGCCAGGTGGCTCCCGACAACCGGCTCGAACGTCCCGAGGACGGGTCGCTGTCGCCGGCCGCCGGGGACGCCACAGCGCCGGCCGCCCAAACGCCCGAGCTCGGCCCGGAGCCTCCGCCGCCGAGCGACGCGACGCGACGCGACCCCGGCCGCAGAGGAAGGGAGAGGAGCCGGGAGATCTCTCCCCTGGAGGCTGCCACGAAAGAGCCGCGATCCCCGCCCCCCCCCCGCCCCCCCCCCCCGCCACGCGATTCCAGGGTGGTGGGGGGACAATTCCACGGAGACGCGGGCGGGCGGGCGGGCGGCGGGGGCTCGGGGCGGGGTGGGCGGAGAGAGGGGGCACCAGTGACATCCCAGGAACCCCCGGCCCCCGGCCCCCCGAAAGAGGGGGGCGGGAGGGAGGGAGGGAGAAAAGGAGGGAGGGAGGGAGGGAGGGACCGGCAAAGCGAAACCAGGCAAGCGCTGCTGGGAGAACAAAGCAGGACTTTCGAAAGCAGACACGGACACAGACACACAAGCCTAGGAGTAAGAAAGGAAAAGAAGGAGACACTCGGACCCCCAAAAAAAAAAAAAAA。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法
<130> 2018-6-7
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1304
<212> DNA
<213> 牛lncRNA-133a的核苷酸序列SEQ1(Unknown)
<400> 1
cgactggagc acgaggacac tgaccgggat tcagggaggt ggggaggggt gagacaaagt 60
cgcatccgac gaccgagacc cacgaaggca cgctgaaggg tcgggcgcgc cctccccggc 120
cacccgcgga agcagggtcc ggtccatcca cgtctccgga cccatcggga ctttgaaaaa 180
gaaacagcat gtgtgccagg agacgcctcg ggcgaccgga ccccacgggt tggggtgggg 240
cggccgcaca cgcgcccgcc tctccccgtc aaccctcacg actccggcgg gcgggtcccc 300
acctccggag tggggccgag ggcgaagcaa acgctcctga ggacggccca ggaggagtcc 360
ggaccgccga gcccgagtcc aggcgctccg ggcagggaag accctctccc tgcccaccgc 420
ggcggcccgg cccagggagg gtccggccgg tccttctccg cggccacagg ggcacgggga 480
gatgctggtc gacccggtcc ggccacccca gaacctaacc ccggagcgcc gcgacgatca 540
ccctccccag aaacctaaag aaccaatctc cgacgacagc aggacgtccc taggcctcgg 600
cgccaccggg actgtcgccg ccagcatagc cggtgtctga gagctctgcc tcgggcccgg 660
cggctgagtc acaaccctcc tgaagggctc gccgaagctc cggagggggg gggacaatat 720
acaagcggcc gccaggtggc tcccgacaac cggctcgaac gtcccgagga cgggtcgctg 780
tcgccggccg ccggggacgc cacagcgccg gccgcccaaa cgcccgagct cggcccggag 840
cctccgccgc cgagcgacgc gacgcgacgc gaccccggcc gcagaggaag ggagaggagc 900
cgggagatct ctcccctgga ggctgccacg aaagagccgc gatccccgcc ccccccccgc 960
cccccccccc cgccacgcga ttccagggtg gtggggggac aattccacgg agacgcgggc 1020
gggcgggcgg gcggcggggg ctcggggcgg ggtgggcgga gagagggggc accagtgaca 1080
tcccaggaac ccccggcccc cggccccccg aaagaggggg gcgggaggga gggagggaga 1140
aaaggaggga gggagggagg gagggaccgg caaagcgaaa ccaggcaagc gctgctggga 1200
gaacaaagca ggactttcga aagcagacac ggacacagac acacaagcct aggagtaaga 1260
aaggaaaaga aggagacact cggaccccca aaaaaaaaaa aaaa 1304
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> MHC F(Unknown)
<400> 2
gtggaatccg gaggcagaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> MHC R(Unknown)
<400> 3
ttttcgaagg tagggagcgg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> MyoG F(Unknown)
<400> 4
ggctgacaaa tgccagacta tcc 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> MyoG R(Unknown)
<400> 5
tggtcccttg ctttatctcc ct 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> MyoD F(Unknown)
<400> 6
gacggctctc tctgcaactt 20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> MyoD R(Unknown)
<400> 7
cggcgcggat ccaggt 16
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> GAPDH F(Unknown)
<400> 8
acagtcaagg cagagaacgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> GAPDH R(Unknown)
<400> 9
ccagcatcac cccacttgat 20

Claims (8)

1.一种牛lncRNA-133a，其特征在于：所述牛lncRNA-133a的核苷酸序列为SEQ1。
2.根据权利要求1所述的牛lncRNA-133a，其特征在于：所述牛lncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的功能。
3.如权利要求1所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用。
4.根据权利要求3所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用，其特征在于：所述应用为在促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化中的应用。
5.根据权利要求3所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用，其特征在于：所述应用为在促进牛骨骼肌卫星细胞增殖中的应用。
6.如权利要求3所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用的检测方法，其特征在于：步骤如下：
⑴在lncRNA-133a骨骼肌卫星细胞中转染lncRNA-133a真核细胞表达质粒，实现细胞内lncRNA-133a的过表达，设置对照组，诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天；收集细胞，检测对照组及实验组的骨骼肌卫星细胞分化标志基因MHC、MyoD和MyoG表达水平；
⑵在lncRNA-133a骨骼肌卫星细胞中转染lncRNA-133a真核细胞表达质粒，实现细胞内lncRNA-133a的过表达，设置对照组，转染后24h，即细胞增殖期，进行EdU细胞增殖检测牛骨骼肌卫星细胞增殖数；
当实验组过表达lncRNA-133a后，增殖细胞数显著高于对照组、实验组的MHC、MyoD和MyoG的表达水平显著高于对照组相时，则证明牛lncRNA-133a序列能够促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。
7.根据权利要求6所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用的检测方法，其特征在于：所述真核细胞表达质粒为pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a，所述对照组为以空质粒pCDNA3.1-EGFP转染牛骨骼肌卫星细胞；
利用qRT-PCR及Westernblotting检测对照组及实验组的牛骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达水平。
8.根据权利要求6所述的牛lncRNA-133a在牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化调控中的应用的验证方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴细胞培养
常规复苏冻存的原代牛骨骼肌卫星细胞，加入增殖培养基中并置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，该增殖培养基为含体积分数20％的胎牛血清、100IU·mL-1青霉素和链霉素的DMEM，待增殖细胞融合度达80-90％时更换分化培养基，该分化培养基为含体积分数2％马血清的DMEM；
⑵牛骨骼肌卫星细胞转染
增殖期细胞融合度达50％时，利用脂质体转染试剂转染pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a，为实验组，以空质粒pCDNA3.1-EGFP转染细胞作为对照组，转染后24h时，即细胞增殖期，增殖培养基更换为分化培养基，诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天；
⑶牛骨骼肌卫星细胞增殖、分化能力的检测
EdU细胞增殖检测：细胞在转染后24小时,即增殖期细胞，检测实验组和对照组细胞的增殖情况；
⑷牛骨骼肌卫星细胞中分化标记因子表达水平的检测
①mRNA水平检测：在诱导牛骨骼肌卫星细胞向成肌方向分化2天时，即DM2期，收集实验组和对照组细胞，Trizol裂解并提取总RNA,取4μg总RNA反转录为cDNA，采用qRT-PCR法检测各分化标记因子基因MHC、MYOD、MYOG的表达；
qRT-PCR反应体系为20μL：0.5μL上游引物F、0.5μL下游引物R、2.0μL 5×稀释cDNA、10μL 2×All-in-OneTM qPCR Mix、7.0μLRNase free water；反应条件：95℃10min；95℃10s、60℃20s、72℃15s，重复40个循环；
②蛋白水平检测：细胞在DM2期时被蛋白裂解液裂解，收集蛋白，通过Westernblotting检测分化标志基因MHC的蛋白表达。
CN201810579627.5A 2018-06-07 2018-06-07 牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法 Active CN108753779B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810579627.5A CN108753779B (zh) 2018-06-07 2018-06-07 牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810579627.5A CN108753779B (zh) 2018-06-07 2018-06-07 牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108753779A true CN108753779A (zh) 2018-11-06
CN108753779B CN108753779B (zh) 2021-12-14

Family

ID=64000177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810579627.5A Active CN108753779B (zh) 2018-06-07 2018-06-07 牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108753779B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110747230A (zh) * 2019-11-27 2020-02-04 天津农学院 一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法
CN110777166A (zh) * 2019-11-25 2020-02-11 西北农林科技大学 一种牛klf3基因真核过表达载体的构建与应用
CN110863009A (zh) * 2019-11-25 2020-03-06 西北农林科技大学 一种牛kcnj12基因真核过表达载体的构建与应用
CN111154763A (zh) * 2020-01-30 2020-05-15 华中农业大学 长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用
CN111826451A (zh) * 2020-09-11 2020-10-27 中国肉类食品综合研究中心 实时荧光定量pcr检测猪肌肉调节因子的引物组及其应用
CN112695099A (zh) * 2021-01-11 2021-04-23 山西农业大学 一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的lncRNA标志物及其应用
CN113355434A (zh) * 2021-06-09 2021-09-07 山西农业大学 一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的标志物Lnc-482286及其应用
CN117384903A (zh) * 2023-10-23 2024-01-12 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种牦牛Lnc4047基因及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710387A (zh) * 2013-12-25 2014-04-09 天津农学院 一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法
CN104189921A (zh) * 2014-09-03 2014-12-10 中国医学科学院基础医学研究所 Linc-RAM在治疗肌肉疾病中的用途
CN105441448A (zh) * 2015-11-26 2016-03-30 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用
WO2018211510A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Exostem Biotec Ltd. Methods of inhibiting aging and treating aging-related disorders

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710387A (zh) * 2013-12-25 2014-04-09 天津农学院 一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法
CN104189921A (zh) * 2014-09-03 2014-12-10 中国医学科学院基础医学研究所 Linc-RAM在治疗肌肉疾病中的用途
CN105441448A (zh) * 2015-11-26 2016-03-30 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 miR-192对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖分化调控应用
WO2018211510A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Exostem Biotec Ltd. Methods of inhibiting aging and treating aging-related disorders

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI LI 等: "Long Non-coding RNA Profiling Reveals an Abundant MDNCR that Promotes Differentiation of Myoblasts by Sponging miR-133a", 《MOLECULAR THERAPY: NUCLEIC ACIDS》 *
周瑞 等: "LncRNA 调控骨骼肌发育的分子机制及其在家养动物中的研究进展", 《遗传》 *
王轶敏 等: "牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化", 《中国畜牧兽医》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110777166B (zh) * 2019-11-25 2021-11-30 西北农林科技大学 一种牛klf3基因真核过表达载体的构建与应用
CN110777166A (zh) * 2019-11-25 2020-02-11 西北农林科技大学 一种牛klf3基因真核过表达载体的构建与应用
CN110863009A (zh) * 2019-11-25 2020-03-06 西北农林科技大学 一种牛kcnj12基因真核过表达载体的构建与应用
CN110863009B (zh) * 2019-11-25 2021-12-07 西北农林科技大学 一种牛kcnj12基因真核过表达载体的构建与应用
CN110747230A (zh) * 2019-11-27 2020-02-04 天津农学院 一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法
CN110747230B (zh) * 2019-11-27 2022-01-04 天津农学院 一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法
CN111154763A (zh) * 2020-01-30 2020-05-15 华中农业大学 长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用
CN111154763B (zh) * 2020-01-30 2022-11-22 华中农业大学 长链非编码RNA lncMGPF在调控猪肌肉发育功能中的应用
CN111826451A (zh) * 2020-09-11 2020-10-27 中国肉类食品综合研究中心 实时荧光定量pcr检测猪肌肉调节因子的引物组及其应用
CN112695099A (zh) * 2021-01-11 2021-04-23 山西农业大学 一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的lncRNA标志物及其应用
CN112695099B (zh) * 2021-01-11 2023-04-28 山西农业大学 一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的lncRNA标志物及其应用
CN113355434A (zh) * 2021-06-09 2021-09-07 山西农业大学 一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的标志物Lnc-482286及其应用
CN117384903A (zh) * 2023-10-23 2024-01-12 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种牦牛Lnc4047基因及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108753779B (zh) 2021-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108753779A (zh) 牛lncRNA-133a及在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控中的应用和验证方法
Carrión et al. Protein kinase A-dependent derepression of the human prodynorphin gene via differential binding to an intragenic silencer element
Fedorov et al. Elevated expression of protein biosynthesis genes in liver and muscle of hibernating black bears (Ursus americanus)
Døssing et al. Down-regulation of miR-129-5p and the let-7 family in neuroendocrine tumors and metastases leads to up-regulation of their targets Egr1, G3bp1, Hmga2 and Bach1
Li et al. Identification and comparison of micro RNA s from skeletal muscle and adipose tissues from two porcine breeds
CN105087584B (zh) 一种与鸡腹脂沉积相关的miRNA及其应用
CN108753776A (zh) 一种参与鸡肌肉生长发育的环状RNA circGHR及检测引物
CN107400720A (zh) 一种klf3基因cnv标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其专用试剂盒
Li et al. Identification and analysis of differentially expressed long non-coding RNAs of Chinese Holstein cattle responses to heat stress
Qiu et al. TEAD1-dependent expression of the FoxO3a gene in mouse skeletal muscle
Sui et al. The expression and regulation of miR-1 in goat skeletal muscle and satellite cell during muscle growth and development
Feng et al. Weighted gene co-expression network analysis revealed that circMARK3 is a potential circRNA affects fat deposition in buffalo
Lin et al. Establishment and transcriptomic analyses of a cattle rumen epithelial primary cells (REPC) culture by bulk and single-cell RNA sequencing to elucidate interactions of butyrate and rumen development
Zhu et al. A long non-coding RNA lnc210 promotes adipogenic differentiation of buffalo intramuscular adipocytes
CN106244593B (zh) 一种调节鹿茸茸皮快速生长的microRNA及其应用
CN115161317A (zh) 牛lncRNA135494、应用和促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法
Rege et al. LADL: light-activated dynamic looping for endogenous gene expression control
Sudre et al. A collection of bovine cDNA probes for gene expression profiling in muscle
CN109536495A (zh) 抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用
Xiang et al. MiR-19 3b regulated the formation of coat colors by targeting WNT10A and GNAI2 in Cashmere goats
Zhan et al. LncR-133a suppresses myoblast differentiation by sponging miR-133a-3p to activate the FGFR1/ERK1/2 signaling pathway in goats
Hazelton et al. Cloning the genomic sequence and identification of promoter regions of bovine pyruvate carboxylase
Sun et al. Profiling and characterization of miRNAs associated with intramuscular fat content in Yorkshire pigs
Tang et al. Effect of bovine myosin heavy chain 3 on proliferation and differentiation of myoblast
Wang et al. Exploring of InDel in bovine PSAP gene and their association with growth traits in different development stages

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant