CN110863009A

CN110863009A - 一种牛kcnj12基因真核过表达载体的构建与应用

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Publication number: CN110863009A
Application number: CN201911167804.XA
Authority: CN
Inventors: 黄永震; 王健; 徐嘉威; 李运嘉; 张子敬; 施巧婷; 刘贤; 吕世杰; 王献伟; 蔡翠翠; 贺花; 雷初朝; 陈宏�
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110863009B

Abstract

本发明公开了一种牛KCNJ12基因真核过表达载体的构建与应用。针对秦川牛KCNJ12基因编码区设计引物，并扩增对应的牛KCNJ12基因；构建pcDNA3.1‑KCNJ12重组过表达载体，并转染细胞。本发明通过克隆牛KCNJ12基因并构建真核过表达载体，可应用于牛KCNJ12基因功能研究、鉴定和调控肌肉生长发育。

Description

一种牛KCNJ12基因真核过表达载体的构建与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种质粒型重组过表达载体pcDNA3.1-KCNJ12及其构建方法，该过表达载体可以在改造种子细胞和牛KCNJ12功能鉴定中应用。

背景技术

目前，基因表达已经成为生物学、医学和药物开发研究中的主流技术。基因过度表达为基因敲除的“合理逆转”。基因的过表达可以确保产生更多的信使RNA，也就会产生更多的蛋白质或下游产物，其能正调节一个基因的性能，便于研究基因在生物体内的功能。

目前已开发出许多可实现基因过表达的质粒载体。pcDNA3.1(+/-)载体是最常用的哺乳动物表达载体之一，其利用CMV promoter强启动子调控外源基因表达，载体拷贝数、表达量均较高，且无荧光标记，也不携带tag。并具有Amp+原核筛选抗性和Neo+真核筛选抗性，可以利用G418筛选稳定细胞株。pcDNA3.1(+/-)载体质粒大小为5.4Kb，具有多克隆位点区，含多种限制酶酶切位点，可以通过双酶切法整合目的基因以构建实现目的基因表达的重组质粒。

在分子生物学实验中，一般都会使用两种不同的限制酶同时处理目的基因和载体，以防止目的基因和载体出现自连或反向连接的现象。双酶切法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸序列的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。

KCNJ12(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily J Member 12)基因是Kir2亚族中一种编码Kir2.2蛋白的基因。内向整流性钾离子通道(Kir)是一类在多种组织中广泛分布的钾离子通道，自1993年克隆了第一个Kir通道至今，已经发现有约20个成员，构成了一个由七个亚家族(Kir1.x-Kir7.x)组成的超家族。Kir通道的共同特点是它们的内向整流特性，即钾离子内流较外流容易得多。这一特点使其在维持细胞正常兴奋性、保持血钾平衡等方面发挥重要的生理作用。同时各Kir通道亚家族在功能上也有各自的特点，其中Kir2.x主要表达于心脏、骨骼肌和神经系统。

研究表明KCNJ12基因与人心肌收缩有关。也有研究发现KCNJ12基因的四个单核苷酸多态性位点与黄牛(晋南牛、皮南牛、夏南牛)的体重、体长、体高等重要生长性状显著相关。KCNJ12基因为GABAB受体激活通道，通过对胎牛的KCNJ12基因在mRNA水平的表达进行分析，发现该基因在骨骼肌中表达量最高。

尽管KCNJ12基因对牛生长发育具有重要意义，但目前牛肌肉质量的增加主要是通过神经、激素和营养因子刺激肌肉纤维生长和横截面积的增加来实现。KCNJ12基因编码的Kir2.2蛋白对黄牛肉质性能的影响规律尚不清楚，亟需提出可以用于调控黄牛肌肉生长发育性状和牛肉品质的理论依据和实践途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛KCNJ12基因真核过表达载体的构建与应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种质粒型过表达载体，该表达载体为利用穿梭质粒构建的用于在牛体细胞(例如，牛肌肉细胞及其前体细胞、牛脂肪细胞及其前体细胞)中表达牛KCNJ12基因的重组载体。

优选的，所述重组载体是通过将穿梭质粒与克隆得到的外源性或内源性牛KCNJ12基因，利用双酶切法构建得到的。

优选的，所述穿梭质粒选自pcDNA3.1。

优选的，所述重组载体包括牛KCNJ12基因重组表达盒，牛KCNJ12基因重组表达盒包括CMV启动子以及位于该启动子下游的牛KCNJ12基因编码区(例如，序列如SEQ.ID.NO.1所示的秦川牛KCNJ12基因编码区)。

优选的，所述重组载体还包括原核氨苄抗性基因(可用于后续载体构建中的筛选)。

上述质粒型过表达载体的制备方法，包括以下步骤：

用高保真酶PCR扩增牛KCNJ12基因编码区序列，对PCR产物进行加A处理，然后连接到pMD-19T载体，然后将连接产物经转化、涂板(抗性筛选)后，挑取单克隆进行鉴定，得到重组载体pMD-19T-KCNJ12；将重组载体pMD-19T-KCNJ12和穿梭质粒(例如，pcDNA3.1载体)分别经Kpn I和Xba I双酶切，将双酶切获得的牛KCNJ12基因编码区序列和线性化pcDNA3.1载体利用DNA连接酶进行连接反应，连接产物经转化、涂板(抗性筛选)后，挑取单克隆进行鉴定，得到重组载体pcDNA3.1-KCNJ12。

上述质粒型过表达载体在秦川牛等黄牛品种的KCNJ12基因功能鉴定中的应用。

优选的，在秦川牛等黄牛品种的KCNJ12基因功能鉴定中，将重组载体pcDNA3.1-KCNJ12转染从对应黄牛品种个体中分离的牛肌肉细胞(例如，牛原代肌肉细胞)，12-24h后检测该牛肌肉细胞中KCNJ12基因的mRNA和对应蛋白表达水平；同时，检测过表达KCNJ12基因后牛肌肉细胞增殖、分化标志基因(PCNA、CDK2、MyoD、MyoG、MyHC)的表达情况。

上述质粒型过表达载体在细胞改造中的应用。

优选的，除了转染牛肌肉细胞，将重组载体pcDNA3.1-KCNJ12转染牛脂肪细胞、293细胞、C2C12细胞、3T3L细胞等细胞系。

上述质粒型过表达载体在体内或体外肌肉生长发育调控中的应用。

优选的，将重组载体pcDNA3.1-KCNJ12转染从对应黄牛品种个体中分离的牛肌肉细胞(例如，牛原代肌肉细胞)，在牛肌肉细胞中检测到KCNJ12基因过表达后继续对牛肌肉细胞进行培养，发现KCNJ12基因过表达可以促进肌细胞的增殖，从而加快肌肉发育进程和再生。

本发明的有益效果体现在：

本发明构建了能够过表达牛KCNJ12基因的重组载体，本发明所构建的载体转染原代培养牛肌肉细胞等同源或异源宿主细胞后，可获得KCNJ12基因mRNA和对应蛋白在宿主细胞中的高效表达，为KCNJ12基因功能鉴定和改造细胞，及调控肌肉代谢和生长发育奠定基础。

进一步的，本发明发现pcDNA3.1在转染宿主细胞、引发过表达水平、标志基因激活能力等方面优于pcDNA3等其他载体骨架，通过选择的酶切位点，解决了载体骨架产生的发卡结构影响插入基因的表达效率的问题。

附图说明

图1为秦川牛KCNJ12基因PCR扩增产物电泳图；其中，M为D2000 Marker，条带分别为100、250、500、750、1000、2000bp。

图2为pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒测序鉴定结果。

图3为pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒mRNA水平过表达效率检测结果(**P<0.01)。

图4为pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒蛋白水平过表达效率检测结果；其中，以β-actin为内参。

图5为转染pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒后对肌肉细胞增殖、分化等肌肉发育过程标志基因mRNA检测结果(*P<0.05；**P<0.01)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)pcDNA3.1-KCNJ12重组过表达质粒的构建

1、材料和方法：

1.1、仪器：

超净工作台、生化培养箱、基因扩增仪、PTC-200单槽梯度基因扩增仪、Heraeus冷冻高速离心机(德国)、Bio-Rad凝胶成像分析仪(USA)、CO₂培养箱、HZS-H水浴振荡器(哈尔滨)、Eppendorf移液器、DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪(北京六一)、DYY-Ⅲ31A和DYY-Ⅲ28D电泳槽(北京六一)、制冰仪、MDF-382E超低温冰箱(日本三洋)、Eppendorf台式高速离心机、Sartorious电子天平(德国)、常规冰箱等。

1.2、生化试剂和试剂盒：

Long Taq聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、DNA限制性内切酶(Kpn I、Xba I等)、胶原蛋白、胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、DNA Marker、T4 DNA Ligase、Trizol、反转录试剂盒、表达载体(pMD-19T，Takara；pcDNA3.1(+)，Thermo)、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、胎牛血清等。

1.3、培养基：

1)抗性筛选

LB培养基：胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl，及琼脂粉；950mL去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用5mol/LNaOH调pH至7.0，加15g琼脂粉。

抗性：氨苄青霉素(1:100比例添加)。

2)细胞培养

DMEM完全培养基。

1.4、普通试剂：

肝素钠、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯菁FF、乙酸、蔗糖、去离子甲酰胺、硝酸、盐酸、硝酸银、无水碳酸钠、硫代硫酸钠、甲醛、硼酸、琼脂糖、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚(pH＝8.0)、氯仿、异戊醇、甘油、石蜡油。

1.5、秦川牛KCNJ12基因PCR引物的合成：

参照GenBank公布的KCNJ12基因mRNA序列(NM_001024690.2)，设计扩增KCNJ12基因编码区的引物：

上游引物：5'>GGGGTACCGGATGACTGCGTCCGGCCGC<3'

下游引物：5'>GCTCTAGACTCAGATCTCAGACTCCCGT<3'

其中，上、下游引物的下划线部分为Kpn I，Xba I的酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6、PCR扩增秦川牛的KCNJ12基因片段：

(1)、秦川牛肌肉组织cDNA获取

采集秦川牛肌肉组织(陕西秦宝牧业有限公司屠宰场，2019年3月)，利用Trizol法提取RNA，使用PrimeScript^TM反向转录RT试剂盒(Clontech,TaKaRa)，依据提取的RNA合成cDNA。

(2)、PCR反应体系为50μL，见表1：

表1.PCR反应体系

(3)、PCR反应程序，见表2：

表2.PCR反应程序

将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收扩增的KCNJ12基因片段。

1.7、pMD-19T-KCNJ12重组质粒的构建：

使用高保真酶PrimeSTAR扩增的KCNJ12基因片段无法进行TA克隆，需做加A处理，才可以连到pMD-19T载体上；因此对PCR扩增的KCNJ12基因片段进行加A反应(反应条件：72℃水浴，10分钟)，反应体系如表3所示：

表3.加A反应体系

将PCR扩增的KCNJ12基因片段经加A反应后，与pMD-19T载体经T4 DNA Ligase于16℃过夜连接，转化E.coli DH5α感受态细胞(西安擎科生物)，挑取菌落进行扩增，质粒回收后经Kpn I和Xba I双酶切鉴定(20μL酶切反应体系见表4，酶切消化条件：37℃，3-10h)，测序验证，得到携带KCNJ12基因的pMD-19T-KCNJ12质粒(即pMD-19T-KCNJ12重组质粒)。

表4.Kpn I和Xba I酶切反应体系

1.8、携带KCNJ12基因的pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒的构建：

Kpn I和Xba I双酶切pMD-19T-KCNJ12重组质粒和pcDNA3.1质粒，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收后将KCNJ12基因编码区片段与pcDNA3.1质粒骨架，经T4DNA Ligase 16℃过夜连接(25μL连接体系见表5)，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取菌落进行扩增，质粒回收后经Kpn I和Xba I双酶切鉴定，测序验证，得到pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒。

表5.连接反应体系

2、结果：

2.1、KCNJ12基因PCR扩增结果：

以秦川牛肌肉组织cDNA为模板，参考NCBI上公布的牛KCNJ12基因mRNA序列(登录号：NM_001024690.2)设计引物，利用PrimeSTAR DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR产物的电泳分析结果如图1所示，图1左侧泳道显示了KCNJ12基因扩增产物为1281bp。

2.2、pMD-19T-KCNJ12重组质粒的酶切鉴定结果：

为了鉴定pMD-19T-KCNJ12重组质粒(即含有秦川牛KCNJ12基因编码区序列的阳性质粒)，以Kpn I和Xba I双酶切回收的质粒，经过琼脂糖凝胶电泳分析，显示Kpn I和Xba I双酶切得到KCNJ12基因编码区片段和pMD-19T骨架(2692bp)。

2.3、pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒鉴定结果：

采用Sanger测序，证明成功获得pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒(阳性克隆)，结果如图2所示。

(二)KCNJ12基因在秦川牛肌肉细胞中的过表达

1、秦川牛肌肉细胞的原代培养

将胎牛置于操作盘中，以含有1％双抗(青霉素-链霉素)的无菌PBS冲洗3遍，沿着胎牛背脊切开表皮组织，剪出背肌，置于含有1％双抗的PBS(6cm培养皿)中，用剪刀尽量剪碎肌肉块，随后收集到50mL离心管中，加入胶原酶Ⅰ，37℃水浴消化1.5h后，用200目尼龙网过滤，收集滤液于离心管中，1000r/min离心10min，去除上清液，沉淀即为肌肉细胞，用含15％FBS及1％双抗的DMEM完全培养基重悬细胞，通过细胞计数，按60％比例接种细胞悬液于6cm培养皿中，37℃，5％CO₂培养箱中培养2h后，吸取上层培养液于新的6cm培养皿中继续培养，至细胞密度达到80％-90％左右，细胞传代或冻存以备后续实验用。

2、KCNJ12重组过表达载体转染牛肌肉细胞

当培养的秦川牛原代肌肉细胞密度达到60％，加入脂质体包裹的pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒(按Lipofectamine^TM 2000 Transfection Reagent试剂盒说明进行操作)转染细胞。将携带秦川牛KCNJ12基因的pcDNA3.1-KCNJ12重组质粒转染原代培养的秦川牛肌肉细胞后，经qRT-PCR检测KCNJ12基因的表达情况，以及过表达KCNJ12基因下肌肉细胞增殖标志基因(PCNA、CDK2)和肌肉细胞分化标志基因(MyoD、MyoG、MyHC)在牛肌肉细胞中的表达情况；另外，利用Western-blot技术检测KCNJ12基因编码蛋白的表达情况。

3、结果

细胞转染后24h时，qRT-PCR检测证明，与阴性对照相比(阴性对照为pcDNA3.1(+)空载体，没有携带KCNJ12基因，简称NC)，KCNJ12基因mRNA及对应蛋白的表达量明显增加(图3、图4)。

通过检测增殖、分化相关标志基因的表达，表明在牛原代肌肉细胞中过表达KCNJ12可促进肌细胞增殖，并抑制其分化进程(图5)。即过表达KCNJ12基因使得肌肉细胞增殖、分化标志基因(MyoD、MyoG、PCNA、MyHC等)在牛肌肉细胞中差异表达。

(三)EdU试验检测细胞增殖

EdU检测试剂盒购买于广州锐博生物公司，按说明书步骤进行：

(1)细胞培养和转染：将牛肌原代细胞接种于96孔板当中，每孔(约1×10⁴个细胞)加入100μL DMEM完全培养基，当细胞密度达到70％左右，分别用pcDNA3.1-KCNJ12、pcDNA3.1(+)空载体转染细胞，转染后培养18-24h。

(2)EdU染色：每孔中加入100μL 50μmol/L浓度含EdU的培养基，孵育2h后去除培养基，PBS清洗细胞3次，每次3-5min。

(3)细胞固定：每孔加入50μL 4％多聚甲醛溶液进行固定，脱色摇床室温孵育30min后吸除，加入50μL甘氨酸溶液，同样室温孵育5min后弃除，PBS清洗细胞3次，每次3-5min。

(4)Apollo染色：每孔加入100μL的Apollo染色反应液，室温避光摇床上孵育30min，弃去后，加入100μL含0.5％Triton X-100的PBS溶液孵育3次，10min/次，弃去后，每孔加入100μL甲醛清洗2次，5min/次，再PBS清洗5min。

(5)DNA染色：每孔加入100μL 1×Hoechst33342反应液，室温避光摇床孵育30min后，弃除反应液，PBS清洗3次，5min/次。

(6)EdU成像：染色完立即使用荧光倒置显微镜观察成像，并进行细胞数目的分析。发现过表达KCNJ12后，DNA复制阳性细胞数目增加，即牛肌原代细胞增殖速率提高。

(四)检测过表达KCNJ12基因对相应细胞结构和功能的影响，如小鼠C2C12细胞系，结果发现过表达KCNJ12后，可同样促进细胞增殖。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种牛KCNJ12基因真核过表达载体的构建与应用

<160> 3

<210>1

<211>1281

<212> DNA

<213> 秦川牛

<400> 1

gccggggcca ggaacagccg cccggagctc ggaggacgcg gagcgcgcag tgtccagggc 60

actgaccgag ggtcttccag ccgctgaggc ctctccagcc ggtggggcaa tggcagccac 120

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<210>2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

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<210>3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gctctagact cagatctcag actcccgt 28

Claims

1.一种质粒型过表达载体，其特征在于：该表达载体为利用穿梭质粒构建的用于在牛体细胞中表达牛KCNJ12基因的重组载体。

2.根据权利要求1所述一种质粒型过表达载体，其特征在于：所述重组载体是通过将穿梭质粒与克隆得到的外源性或内源性牛KCNJ12基因，利用双酶切法构建得到的。

3.根据权利要求1所述一种质粒型过表达载体，其特征在于：所述穿梭质粒选自pcDNA3.1。

4.根据权利要求1所述一种质粒型过表达载体，其特征在于：所述重组载体包括牛KCNJ12基因重组表达盒，牛KCNJ12基因重组表达盒包括CMV启动子以及位于该启动子下游的牛KCNJ12基因编码区。

5.根据权利要求4所述一种质粒型过表达载体，其特征在于：所述重组载体还包括原核抗性基因表达盒。

6.一种如权利要求1所述的质粒型过表达载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

PCR扩增牛KCNJ12基因编码区序列，对PCR产物进行加A处理，然后连接到pMD-19T载体，得到重组载体pMD-19T-KCNJ12；将重组载体pMD-19T-KCNJ12和pcDNA3.1载体分别经Kpn I和Xba I双酶切，将双酶切获得的牛KCNJ12基因编码区序列和线性化pcDNA3.1载体利用DNA连接酶进行连接，得到重组载体pcDNA3.1-KCNJ12。

7.一种如权利要求1所述的质粒型过表达载体在黄牛KCNJ12基因功能鉴定中的应用。

8.一种如权利要求1所述的质粒型过表达载体在细胞改造中的应用。

9.一种如权利要求1所述的质粒型过表达载体在体内或体外肌肉生长发育调控中的应用。