CN108753776A - 一种参与鸡肌肉生长发育的环状RNA circGHR及检测引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡环状RNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；并提供了其检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。本发明验证了GHR的环状转录本circGHR的存在，并克隆获得了该环状RNA的分子序列全长，确定了circGHR环结构，该分子对核酸外切酶RNase R存在抗性。定量发现随着机体生长发育呈现不同的趋势，在胸肌和腿肌组织中逐渐下调，在成肌细胞核中高表达，表明circGHR对出壳后怀乡鸡的肌肉发育过程具有抑制作用；同时，鸡环状RNAcircGHR在检测或评估鸡的肌肉率方面的应用也有很大的应用价值。

Description

一种参与鸡肌肉生长发育的环状RNA circGHR及检测引物

技术领域

本发明涉及鸡肌肉生长发育技术领域，更具体地，涉及一种参与鸡肌肉生长发育的环状RNA circGHR及检测引物。

背景技术

环状RNA（Circular RNA，circRNA）是一类共价环形的RNA分子，不存在游离的5’端帽子和3’端Poly(A)尾巴结构，对RNA外切酶RNase R存在耐受性，稳定性高，不易降解。CircRNA主要来源于RNA前体（pre-RNA）的反式剪接，即下游外显子同上游外显子反向结合形成一个环形结构。不同序列来源的circRNA可发挥不同的生物学功能。

最新研究发现RNA的环化与pre-mRNA的剪接可竞争剪接因子，以此调控目的基因的表达。也有文献报道circRNA可吸附miRNA 参与内源性竞争调控网络（competingendogenous，ceRNA）。Jeck等在人类的成纤维细胞中检测出超过25 000个circRNA，Memczak等利用高通量测序结合人类白细胞数据库鉴定出1950种人类circRNAs，1903种小鼠circRNAs和724种线虫circRNAs，其中人和小鼠中有81种circRNAs高度保守。随着大量研究表明，circRNA广泛存在真核生物等高等动物体内，并且在基因表达和机体生长发育中发挥重要作用。例如circFUT10可抑制牛成肌细胞增殖，促进分化；circEIF3J和circPAIP2能促进母基因的线性转录本的表达；circZNF609具有编码起始点和终止点的开放阅读框；circCDR1as和circSry可与AGO蛋白形成沉默复合体抑制翻译起始。circMbl会结合MBL蛋白，正向促进circMbl和Mbl mRNA的生成。

大量实验表明circRNA在动物的生长发育中发挥重要作用。随着RNA-seq技术的发展，越来越多的circRNA被发现，且逐渐成为研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种参与鸡肌肉生长发育的环状RNA circGHR及检测引物

本发明的第一个目的是提供一种鸡环状RNA。

本发明的第二个目的是提供鸡环状RNA的荧光定量PCR检测引物。

本发明的第三个目的是提供所述检测引物在检测所述鸡环状RNA中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述鸡环状RNA在抑制肌肉发育中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述鸡环状RNA的抑制剂在促进肌肉发育中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明首次发现环状转录本circGHR的存在，并发现其与鸡肌肉生长密切相关，因此本发明要求保护以下内容：

一种鸡环状RNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

以上所述鸡环状RNA的荧光定量PCR检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：3～4所示。

以上所述检测引物在检测以上所述鸡环状RNA中的应用。

以上所述鸡环状RNA在抑制肌肉发育中的应用。

以上所述鸡环状RNA的抑制剂在促进肌肉发育中的应用。

进一步，本发明要求保护所述鸡环状RNA在检测或评估鸡的肌肉率方面的应用。

优选地，所述肌肉率包括胸肌率和腿肌率。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明验证了GHR基因的环状转录本circGHR的存在，并克隆获得了该环状RNA的分子序列全长，确定了circGHR环结构，该分子对核酸外切酶RNase R存在抗性。定量发现随着机体生长发育呈现不同的趋势，在胸肌和腿肌组织中逐渐下调，在成肌细胞核中高表达，表明circGHR对出壳后怀乡鸡的肌肉发育过程具有抑制作用；同时，鸡环状RNAcircGHR在检测或评估鸡的肌肉率方面的应用也有很大的应用价值。

附图说明

图1为组织总RNA检测。

图2为circGHR位置引物示意图，蓝色箭头表示Divergent primers；黑色箭头表示Convergent primers。

图3为测序峰图与线性序列比对。

图4为circGHR结构示意图。

图5为RNase R处理后circGHR和GHR-S的定量变化。

图6为鸡胸肌和腿肌组织circGHR表达变化。

图7为鸡circGHR在成肌细胞中的核质分布表达变化。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实验动物来源及饲养规范

由广东盈富农业有限公司提供种蛋，采用标准程序（温度：37.8℃±0.5，相对湿度：50%-70%）进行孵化，出壳后笼养并进行常规免疫。

主要试剂耗材

无酶枪头、离心管、PCR管、核酸染料、DNA Marker、Loading Buffer均购于生工生物工程（上海）股份有限公司，也包括引物合成。RNA酶抑制剂（天净沙）购于北京天恩泽基因科技有限公司，Hipure Tissue RNA Mini Kit购于美基生物科技有限公司，RNase R购于中北林格生物技术公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect RealTime)购于TaKaRa生物公司，EasyPure Quick Gel Extraction Kit和2×EcoTaq PCRSuperMix(+dye)购于北京全式金生物技术有限公司。pMD18-T载体购于TaKaRa生物公司。培养细菌所用的琼脂粉、蛋白胨、NaCl、酵母粉、氨苄青霉素（Amp）均购自鼎国昌盛生物技术公司。

主要仪器设备

高压灭菌锅 （Hirayama，Japan）；StepOne Plus Real-Time PCR System（ABI）；-80℃超低温冰箱（BCD-537WT，青岛海尔有限公司）；4 ℃冰箱（BCD-539WT，青岛海尔有限公司）；-20 ℃冰箱（BCD-534WT，青岛海尔有限公司）；C1000 Touch Thermal Cycler（BIO-RAD）；制冰机（Scotsman，意大利）；干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；通风柜（广州湘仪机电设备有限公司）；漩涡振荡器（SK-1，金坛市国旺实验仪器厂）；电泳仪（DYY-6C，北京六一）；微波炉（美的）；电动匀浆器（OSE-Y30/Y40，天根生化科技有限公司）；恒温空气摇床（美国精骐有限公司）；恒温酶连仪（广州方统生物科技有限公司）；移液器（351170A，Eppendorf公司）、凝胶成像系统（WFH-201B，上海精科实业有限公司）；电泳仪、电泳槽（DYCP-31D，泰州市星火生化仪器制造有限公司）。

统计分析

实时荧光定量结果的数据用Microsoft Excel 2003进行整理并保存，运用IBM SPSSStatistics 19软件进行t检验和相关性分析。

引物序列

引物序列见表1：

表1 引物序列

实施例1 circGHR的环状鉴定

一、实验操作

（1）样品采集

采集1 D-1-2-3W怀乡鸡公鸡腿肌和胸肌，1 D-1-3-5W怀乡鸡公鸡肝脏组织，每个时间点各14-16个。样品采集过程中，要使用外科手术解剖采集肝脏和胸肌和腿肌组织，迅速放入液氮中，待样品采集结束后，将样品放入-80 ℃冰箱保存备用。

（2）组织总RNA抽提

① 取出保存在-80℃冰箱的组织，用眼科剪剪取米粒大小的组织块置于一新的无酶离心管中，然后迅速投入液氮中；

② 从液氮中取出一个样品，先加入200 μL的Trizol，然后迅速用预冷的组织研磨器研磨，研磨完全之后再加入800 μL的Trizol，颠倒混匀，室温静置5 min；

③ 接下来严格按照Hipure Tissue RNA Mini Kit试剂盒说明进行。

（3）反转录

参照按照PrimeScript™ RT-PCR Kit说明书进行，首先在冰上配制表2所示的去除gDNA反应体系。

表2 除gDNA反应体系：

反应程序为42 ℃孵育2 min，用于除去gDNA，并立即配制表3所示的反转录体系。

表3 反转录反应体系：

反应程序为42 ℃孵育20 min，85 ℃孵育5 s，将反应后的cDNA于-20 ℃保存或进行下一步试验。

（4）目的片段的扩增

根据circGHR基因（NM_001001293.1.1，如其核苷酸序列SEQ ID NO：1所示），按照表4进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，连接pMD18-T载体，转到E.coli DH5α内，菌液PCR鉴定阳性克隆测序验证。PCR引物见表1。

表4 PCR反应体系：

（5）切胶回收步骤

将所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将目的条带按照EasyPure Quick GelExtraction Kit进行切胶回收。

①切下含有目的条带的凝胶，称重后装入1.5 mL离心管中，如凝胶中100 mg，可视为100 μL；

②按照1 g凝胶加3 mL的比例加入GSB溶液；

③将离心管放到55 ℃的恒温仪上加热，使凝胶完全溶解，观察溶液颜色，如果呈紫色，加入适量的3 mol/L（pH 5.2）,调整颜色和GSB颜色相同（黄色）；

④待融化的凝胶溶液降至室温（高温时离心柱结合DNA能力弱），加入到吸附柱中静止1min，10000 r/min，室温离心1 min，弃流出液；

⑤加入650 μL溶液WB，10 000 r/min离心1 min，弃流出液，再10 000 r/min离心2min，去除残留的WB；

⑥将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置1 min，使残留的乙醇挥发干净，在柱的中央加入30 μL的去离子水（事先加热至65-75 ℃），静置1 min；

⑦10000 r/min离心1 min洗脱DNA，将洗脱出的DNA做好标记，放入冰箱-20 ℃保存备用。

（6）与pMD18-T载体连接转化及验证

将上述切胶回收的PCR产物按照表5的连接体系连入pMD18-T载体。

表5 pMD18-T载体连接反应体系：

连接反应条件为16 ℃ 8-10 h。

将连接反应产物按照下述步骤转入E.coliDH5α中。

从超低温保存的E.coliDH5α感受态细胞中取出后放置在冰上融化，融化后将20 μL感受态细胞加入到10 μL的连接体系中，混匀后冰浴30 min；

将上述液体放到42 ℃的水浴锅中热激45 s（时间控制好），再次冰浴30 min；

向其中加入500 μL的LB液体培养基中（Amp^-），放到摇床上震荡培养60 min；

将LA固体培养基（Amp⁺）提前30 min放入培养箱中预热；

在超净工作台中，将上述的100 μL的菌液均匀涂布到固体培养基中，随后放到37 ℃恒温培养箱中培养；

30 min后，将培养皿的底部反转到上面来继续培养10-12 h。

将上述培养皿培养10-12 h后，用白色的灭菌小枪头挑取单克隆菌落，接种于1 mL的液体培养基（Amp⁺）中，放到摇床中震荡培养6-8 h后，抽取部分菌液按照表4进行菌液PCR反应，选取有目的条带的菌液送到生工生物（上海）测序。

二、实验结果

抽提组织总RNA后用1%琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图1所示。可以看出28S和18S条带清晰，说明所抽提的RNA完整性和质量较好，可用于后续实验。

以反转录后的cDNA为模板，分别使用Divergent primers和Convergent primers进行扩增（图2为circGHR位置引物示意图），对circGHR的Junction进行PCR反应，将所得片段切胶回收后连接到pMD18-T载体上，菌液PCR后挑选阳性菌液送到生工生物公司测序，序列比对发现circGHR的Junction位置是存在的，Junction位置由5'UTR的5'端和外显子2的3'端连接形成，其位置峰图单一，没有出现杂峰（图3）。

通过对向和反向两对引物扩增和T载体测序，获得了鸡circGHR序列全长，共165bp，具体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。生物信息学分析发现，该序列来源于鸡GHR基因的线性转录本AF254952.1（Genbank accession number）。依据该序列，我们获得了鸡circGHR的分子结构模式图，见图4。

实施例2 鸡circGHR分子RNase R耐受性分析

一、实验操作

按照1μg RNA添加2 U/μg的RNase R酶，如表6，37 ℃反应30 min。

表6 RNase R处理体系：

将所得的上述RNA反应液按照表2和表3进行反转录，并用circGHR-B-F（SEQ ID NO：3）和circGHR-B-R（SEQ ID NO：4）（Divergent primers）进行qPCR定量检测。

二、实验结果

因为circRNA是不存在游离的5'端和3'端的环状结构，对核酸外切酶具有耐受性，将总RNA用RNase R处理后，定量发现处理前后circGHR的量变化不显著，而线性对照组GHR-S的变化达到极显著水平（图5）。

实施例3 怀乡鸡肌肉组织circGHR时序和亚细胞表达规律

一、实验操作

采用比较Ct值法检测目的基因mRNA的表达情况，所使用的qPCR反应体系如表7所示，反应时每个样品设计三个重复。反应程序为：95 ℃ 30 s，40 个循环（95 ℃ 5 s，退火53 ℃30 s）于53 ℃ 30 s收集荧光信号。采用2^-△△Ct法度量基因在各样品中的表达情况，此外△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct。

表7 qPCR反应体系

如表1所示，内参基因GAPDH的扩增使用引物：GAPDH-F和GAPDH-R；circGHR 的扩增使用引物：circGHR-B-F（SEQ ID NO：3）和circGHR-B-R（SEQ ID NO：4）。

二、实验结果

采集怀乡鸡公鸡1D，1，2和3 W的胸肌和腿肌组织，qPCR定量结果显示，随着怀乡鸡机体生长，circGHR在胸肌和腿肌组织中的表达量呈逐渐下调趋势（图6），表明circGHR对出壳后怀乡鸡的肌肉发育过程具有抑制作用。

在成肌细胞中，分离细胞核和细胞质，定量结果（图7）表明circGHR在细胞核中表达量显著大于细胞质中的量。

综上结果，因为circRNA没有游离的5'和3'端，对核酸外切酶RNase R存在抗性。环状引物circGHR-R—非环状引物GHR-R的PCR反应后在RNase R^-组中可检测到相应的产物片段，在RNase R⁺组中未检测出相应片段，表明RNase R将线性RNA消化完全，低于PCR可检测的水平。定量显示circGHR的变化量不显著，而线性对照GHR-S的变化达到极显著水平。这两种检测方式可有效验证RNase R对线性转录本的消化，消除了circRNA的Junction位置是可变剪接产生线性RNA的可能性。

高等动物的生长发育受到“下丘脑-垂体-生长激素-靶器官”神经内分泌生长轴的调控。下丘脑根据机体需要分泌生长激素释放激素（Growth Hormone Releasing Hormone，GHRH）和生长抑素（Somatostatin，SS）双重作用于垂体，控制GH分泌。经垂体前叶释放的GH与GHBP结合经血液循环至肝脏等各组织器官，与靶器官的细胞膜表面的GHR二聚体结合，主要通过JAK-STAT途径启动细胞内的信号转导机制，促进IGF1的表达。IGF1会激活靶细胞内的RNA聚合酶II，促进非组蛋白磷酸化，调节RNA和DNA的合成。随后蛋白质合成加快，细胞分裂增殖和分化加强。GH-GHR-IGF1信号通路涉及肌肉生长和组织发育，对哺乳动物骨骼肌为主的组织细胞生长和分化具有重要意义。

circGHR在出壳后肝脏组织中表达逐渐升高，在肌肉组织中表达逐渐降低，这与GHR mRNA的转录变化趋于一致。CircGHR通过调控GHR基因的mRNA的表达调控机体生长发育和新陈代谢。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120> 一种参与鸡肌肉生长发育的环状RNA circGHR及检测引物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2057

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 1

acacacgccc ctgctgacat ttgagaatta gaggtatgga tcttcggcat ctgctgttta 60

ctttggcact ggtgtgtgca aatgactcac tttctgcaag tgatgatctt ctgcagtggc 120

cacaaatcag caagtgcagg tcacctgagc tggagacatt ttcgtgttat tggactgatg 180

gaaaggtcac tacttcagga acaatacaac tgttgtatat gaaaaggagt gatgaagact 240

ggaaagaatg tccggattat atcactgcag gagaaaatag ctgttacttc aacacatcct 300

acacctcgat ttggatacca tattgtgtta agcttgccaa taaagatgaa gtatttgacg 360

aaaagtgttt cagtgttgat gaaatagtac tacctgatcc ccctgtgcac cttaactgga 420

ctctgctaaa tactagtcaa actgggatcc atggggatat tcaagtacga tgggatccac 480

caccaacagc agatgttcag aaaggatgga ttactctgga gtatgaattg cagtacaaag 540

aagttaatga gacaaaatgg aaggagttag aacccaggct ctcaacagtg gttccactgt 600

attctctgaa gatgggaaga gattatgaga tccgagtccg atcaagacaa cgtacctccg 660

aaaagtttgg ggagttcagt gaaatcctct atgtttcctt tactcaagca ggcattgaat 720

ttgttcattg tgctgaagaa atcgagtttc cctggttctt agttgttgtc ttcggagtgt 780

gtgggctggc cgtaacagcg atcttaatcc tgttgtctaa acagccaagg ttaaaaatgc 840

tgatttttcc tcctgtgcca gttccaaaga ttaaagggat tgacccagat ctcttaaaga 900

aaggaaagct agatgaagtg aactccatct tagccagcca tgacaactac aagacacagc 960

tatacaatga tgacttgtgg gttgagttta ttgaattgga catagatgac tccgatgaaa 1020

agaacagagt ctcagatact gacaggctcc tgagtgacga tcatctgaag tcacacagtt 1080

gcttgggagc caaggatgat gattctggac gtgccagttg ttatgaacca gatattccag 1140

agacagactt cagtgcaagc gacacatgtg atgccatctc tgatattgat cagttcaaga 1200

aggtaactga aaaagaagag gatctcttgt gccttcatag gaaagatgat gttgaggcac 1260

ttcaaagtct tgccaacaca gatacccaac agccgcatac tagtactcag tctgaaagca 1320

gagagtcatg gccacctttt gcagacagca ctgactcagc taatccatca gtccaaactc 1380

agctaagtaa ccagaattcc ctgacaaaca ctgacttcta tgctcaagtg agtgatatta 1440

ctcctgctgg aagtgttgta ctttctccag ggcagaaatc caaggtggga agagcacagt 1500

gtgaaagctg cacagaacaa aacttcacca tggacaatgc ctatttctgt gaggcagatg 1560

tgaaaaaatg tattgctgtg atttcacagg aagaggatga gccgcgtgtt caggagcaaa 1620

gctgtaacga ggacacttac ttcaccacag aaagccttac cactaccggt atcaatcttg 1680

gagcttcaat ggcagaaacc ccaagtatgg aaatgcctgt cccagactac acttctattc 1740

atattgttca ctctccacaa ggccttgtgc tcaatgcaac tgcactgcct gtgccagaga 1800

aagaatttaa catgtcttgt ggctatgtga gcacagacca gctgaacaaa atcatgccgt 1860

agcaattctt tgactagatg tgagtattta gcagcagagt cagctttggg ttgggtgctg 1920

aaacccaaaa tgaggtctaa accttgccgt ggttcttaca agtttatact attgttgaac 1980

ataaaatatt catcagaata ttcctcttga gctgtaaata ttatctatta tctatgaatg 2040

tgttatctat gaatgtg 2057

<210> 2

<211> 165

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 2

gtgctgggat ggctggagaa ggccgcattt tgcagttgag ctgagggacg tgtgaagcat 60

catccacccc ctgctgacat ttgagaatta gaggtatgga tcttcggcat ctgctgttta 120

ctttggcact ggtgtgtgca aatgactcac tttctgcaag tgatg 165

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 3

gtccctcagc tcaactgc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<400> 4

atcttcggca tctgctgt 18

Claims (7)

1.一种鸡环状RNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述鸡环状RNA的荧光定量PCR检测引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。

3.权利要求2所述检测引物在检测权利要求1所述鸡环状RNA中的应用。

4.权利要求1所述鸡环状RNA在抑制肌肉发育中的应用。

5.权利要求1所述鸡环状RNA的抑制剂在促进肌肉发育中的应用。

6.权利要求1所述鸡环状RNA在检测或评估鸡的肌肉率方面的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述肌肉率包括胸肌率和腿肌率。