CN111849977A

CN111849977A - 一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备矮小型转基因鸡的sgRNA和制备方法

Info

Publication number: CN111849977A
Application number: CN202010485787.0A
Authority: CN
Inventors: 樊宝良; 褚素乔; 倪慧勇; 代敏敏; 李德娟; 催梦笛; 耿琳烨; 任子珍
Original assignee: Heibei Agricultural University
Current assignee: Heibei Agricultural University
Priority date: 2020-06-01
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-06-01
Also published as: CN111849977B

Abstract

本发明涉及转基因动物技术领域，具体涉及一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备转基因鸡的sgRNA和制备方法。该方法根据用于制备sgRNA的crRNA编码序列构建sgRNA与Cas9蛋白构建出共表达质粒，以精子为载体制备转基因动物。该方法通过精子载体与第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9的结合，使转基因动物的制备过程操作简单，成本低，效率高，既能够用于转基因禽类动物的制备，也可以用于其他有性繁殖的转基因动物的制备。

Description

一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备矮小型转基因鸡的sgRNA和制备方法

技术领域

本发明涉及转基因动物技术领域，具体涉及一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备转基因鸡的sgRNA和制备方法。

背景技术

转基因技术是指事先进行设计，然后通过一定的方法对目标物种按设计的方案进行遗传修饰，使目标物种基因型和表型发生改变，而且这种改变可稳定的遗传给后代的一项生物技术。因此转基因技术可以打破物种间的生殖隔离，实现定向诱导培育，进而大幅缩短育种时间。动物转基因技术目前主要应用于动物改良、新品种的培育、特殊疾病模型的建立、特定基因的功能性研究、疾病的基因治疗、生物生长发育调控、制造具有生物活性的产品。

动物转基因技术对畜禽育种具有重要意义。如，转基因鸡技术能够改善鸡的遗传性状，可用于改善肉品质、提高鸡的饲料转化率、提高产蛋率、提高个体自然抗病能力等。但目前制备转基因动物的技术普遍存在操作复杂、成本高的问题，外源基因随机整合还有导致内源基因突变的可能，且经常使用的病毒载体还存在潜在的致癌风险而导致生物安全问题。早期建立的精子载体法制备转基因动物的方法虽然具有操作简单成本低廉的优点，但存在外源基因不能整合到受体基组中而导致很难获得能够稳定遗传的转基因动物个体的问题。而且由于禽类特殊的生理结构，制备转基因哺乳动物的已经比较高效成熟的技术往往在应用于家禽上时面临种种挑战，无法推广用来制备转基因禽类，致使转基因家禽的制备技术还不够成熟。

基因编辑技术可有针对性的对特定基因位点进行修饰导致插入、缺失、碱基序列改变等突变，是转基因动物研究的重要方法之一，目前主导的基因编辑技术包括锌指蛋白核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)和通过sgRNA引导的CRISPR/Cas9核酸酶。锌指核酸酶和TALEN技术十分繁琐费力，操作过程相当复杂。相较于ZFNs和TALENs，CPISPR/Cas9核酸酶成本低、制作简单、实验周期短、作用更加高效、靶点分布广且可以同时对多个基因进行编辑。但CRISPR/Cas9系统虽然能够高效快速地实现基因编辑，却需要进入靶细胞才能发挥作用。

发明内容

针对现制备转基因动物的技术普遍存在操作复杂、成本高，而且转基因动物制作中外源基因的随机整合有导致内源基因突变的可能，经常使用的病毒载体又存在潜在的致癌风险而导致生物安全的问题，精子载体法制备转基因动物外源基因不能整合到基因组以及CRISP/Cas9系统需要进入靶细胞才能发挥作用等问题，本发明提供一种精子载体制备转基因动物的方法。

以及，本发明还提供精子载体制备矮小型转基因鸡的sgRNA。

以及，本发明还提供精子载体制备矮小型转基因鸡的sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒。

以及，本发明还提供矮小型转基因鸡的制备方法。

为实现上述目的，本发明实施例提供了精子载体制备转基因动物的方法，具体包括：

根据靶基因设计sgRNA的crRNA序列，根据所述crRNA序列构建所述sgRNA与Cas9蛋白的共表达质粒；

采集动物的精子，将所述共表达质粒与所述精子共同孵育，然后人工授精，获得受精卵，培育所述受精卵获得所述转基因动物。

本发明将精子载体与第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9相结合，以CRISPR/Cas9弥补制备转基因动物时精子载体法外源DNA整合困难缺陷，而精子载体具有操作简单，成本低廉，对卵原核无损伤，易于大量制备，CRISPR/Cas9系统一方面可以通过基因编辑使基因发生插入、缺失、碱基改变等的遗传修饰，而获得基因型和表型改变了的可遗传的转基因动物，另一方面在有同源打靶载体存在情况下能够将外源基因定点整合到基因组特定位置，避免随机整合导致内源基因突变的问题。该方法既能够用于转基因禽类动物的制备，也可以用于其他有性繁殖的转基因动物的制备。

以及，本发明实施例还提供精子载体制备矮小型转基因鸡的sgRNA，所述sgRNA中的crRNA部分的编码链和互补链序列如SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与SEQ IDNO:4，或SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6中任一对人工序列所示。

SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2为一对对应的编码链和互补链序列，SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4为一对对应的编码链和互补链序列，SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6为一对对应的编码链和互补链序列。以上crRNA的编码序列用于制备转基因鸡的sgRNA。

SEQ ID NO:1的序列为：GACATGTTAAATTCTTTCTC；

SEQ ID NO:2的序列为：GAGAAAGAATTTAACATGTC；

SEQ ID NO:3的序列为：GTGCAGTTGCATTGAGCACA；

SEQ ID NO:4的序列为：TGTGCTCAATGCAACTGCAC；

SEQ ID NO:5的序列为：GTTAAATTCTTTCTCTGGCAC；

SEQ ID NO:6的序列为：GTGCCAGAGAAAGAATTTAAC。

上述人工序列根据矮小型鸡生长激素受体基因(GeneBank登录号：NC_006127.5)缺失部分的外显子区设计得到，用上述crRNA得到的sgRNA经体外酶切试验证实具有较高的活性，所得sgRNA其体外切割效率分别可达到82.1％，92.5％和95.4％，细胞水平检测其引起基因编辑的效率分别可达12.5％、47.8％和54.2％。

Cas9蛋白对靶序列的识别主要是依靠一段近20bp的RNA，CRISPR/Cas9系统对打靶位点距离PAM区的5′端的识别的特异性较低，在生物体庞大的基因组中就很容易出现潜在脱靶位点，从而发生非预期基因突变。根据在线脱靶分析软件设计对得到的sgRNA分别选出5个可能性最大的潜在脱靶位点，并设计跨越相应脱靶位点的PCR扩增引物，以sgRNA/Cas9共表达质粒和跨越sgRNA靶位点的左右同源臂间插入了新霉素抗性基因的质粒共转染后经G418筛选得到的所有新霉素抗性的细胞克隆基因组为模板，PCR扩增出对应潜在脱靶位点序列并测序，结果发现分别选出的5个潜在脱靶位点均未检测到sgRNA发生脱靶。使用上述人工序列得到的sgRNA能够制备得到矮小型转基因鸡。

以及，本发明实施例还提供精子载体制备矮小型转基因鸡的sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒，所述共表达质粒用上述crRNA制备得到，制备方法为：将上述crRNA的编码链和互补链在合成相应的DNA单链时5′端添加与BbsI限制性内切酶线性化后的pX330质粒的粘性末端相匹配的粘性末端序列，然后两条互补单链DNA退火形成双链DNA；用BbsI限制性内切酶线性化pX330质粒，形成5′突出的粘性末端；将退火形成的所述双链DNA与线性化后的pX330质粒用T4 DNA连接酶连接，得到所述共表达质粒。经过该制备方法，将crRNA插入到了pX330质粒中。

线性化后的pX330质粒的5′突出的粘性末端为：上游为CACC，下游为AAAC。

其中退火形成双链DNA的方法优选为：将对应的编码链和互补链溶于超纯水，配成10μmol/L，95℃至25℃梯度下降，每5℃为一个梯度，每个温度保温1min，退火形成编码相应crRNA的双链DNA。退火形成的双链DNA具有与BbsI线性化后的pX330质粒相匹配的粘性末端。

以及，本发明实施例还提供矮小型转基因鸡的制备方法，包括以下步骤：

S1、用上述制备方法制备sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒；

S2、收集公鸡精液，分离精子，将所述精子与所述sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒共孵育；

S3、用S2完成共孵育的精子经人工授精制得受精蛋；

S3、孵化所述受精蛋，即可得到矮小型转基因鸡。

上述sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒作为外源DNA，与精子在合适的条件下共孵育后，精子能够成为外源DNA(sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒)进入鸡受精卵的载体，在S3中获得携带外源DNA的受精蛋，从而发挥外源基因的作用产生获得矮小型转基因鸡。

优选地，S2中所述共孵育以M199培养基为孵育液。以M199培养液做为孵育液，其孵育后有活力的精子所占比例为78.48％，而用稀释液(0.75g NaHCO₃、1gNaAC、0.15gNa₂HPO₄、1g葡萄糖、4.8g蔗糖、25μl乙酸、100.225ml，pH7.2)为孵育液时该比例仅为18.26％，DMEM培养基为孵育液时该比例为19.28％，1640培养基为孵育液时该比例为20.44％，PBS缓冲液为孵育液时该比例为21.57％。

优选地，所述孵育液中还含有脂质体，所述脂质体相对于精液的浓度为5～7.5μl/ml。使用脂质体能够显著提高精子携带外源DNA的效率。脂质体用量过低时对于精子活力以及受精率影响不显著，而脂质体用量过高时，有活力精子所占比例可明显下降。

优选地，所述孵育液中还含有脂质体，所述脂质体相对于精液的浓度为7.5μl/ml。该用量的脂质体使精子摄取外援DNA的量最高且对其活力的影响不显著。

优选地，S2中所述共孵育的时间为10～60min。

优选地，S2中所述共孵育的时间为60min。孵育时间越长则精子摄取外源DNA的能力增加，但孵育时间超过60min后，精子摄取外源DNA的能力不再显著增加，且精子活力会显著下降，故优选60min。

附图说明

图1为检验例中crRNA分别插入到pT7-BbsI-trac质粒载体中测序峰图；

图2为检验例中sgRNA转录模板的PCR扩增电泳图；其中，M为M5 Marker I DNA分子量标准；2-1、2-2为实施例1中sgRNA转录模板PCR结果；2-3、2-4为实施例2中sgRNA转录模板PCR结果PCR结果；2-5、2-6为实施例3中sgRNA转录模板PCR结果PCR结果；

图3为检验例中扩增体外切割底物电泳图；其中：M为1kb DNA ladder DNA分子量标准；1～3为切割底物扩增结果；

图4为检验例中不同sgRNA体外酶切结果；其中：M为1kb DNA ladder DNA分子量标准；N为对照组无sgRNA的Cas9酶切结果；1为sgRNA3介导的体外Cas9酶切结果；2为对比例2的sgRNA介导的体外Cas9酶切结果；3为sgRNA2介导的体外Cas9酶切结果；4为对比例1的sgRNA介导的体外Cas9酶切结果；5为sgRNA1介导的体外Cas9酶切结果；

图5为检验例中PCR鉴定目的基因定点插入结果；其中：M为1kb DNA ladder DNA分子量标准；a为sgRNA1引导的基因定点整合的上游插入鉴定；b为sgRNA1引导的基因定点整合的下游插入鉴定；c为sgRNA2引导的基因定点整合的上游插入鉴定；d为sgRNA2引导的基因定点整合的下游插入鉴定；e为sgRNA3引导的基因定点整合的上游插入鉴定；f为sgRNA4引导的基因定点整合的下游插入鉴定；

图6为检验例中未发生基定点整合的新霉素抗性细胞克隆靶点区发生编辑引起突变序列对比图；其中：wt为野生型序列；mu为突变样品序列；a中标注白色区为靶点序列，黑框内为突变缺失序列；b中黑框内为靶点序列，以下划线标注的为突变缺失序列；

图7为实施例7中PCR产物测序峰图；

图8为为实施例7中第一枚受精蛋基因编辑结果图；其中：a，b为单克隆PCR产物电泳图；c为发生基因编辑测序结果对比图；wt为野生型基因序列；mu为基因编辑后序列；

图9为实施例7中第二枚受精蛋基因编辑结果图；其中：a，b为单克隆PCR产物电泳图；c为发生基因编辑测序结果对比图；wt为野生型基因序列；mu为基因编辑后序列；

图10为实施例7中第三枚受精蛋基因编辑结果图；其中：a，b为单克隆PCR产物电泳图；c为发生基因编辑测序结果对比图；wt为野生型基因序列；mu为基因编辑后序列；

图11为实施例7中基因编辑样品父母本PCR测序峰图；

图12为实施例7中基因编辑样品性别鉴定电泳图；其中：M为GeneRuler1kb DNAladder DNA分子量标准；1～3为性别鉴定PCR电泳图；

图13为实施例7中组织表达EGFP和不表达EGFP对比图；

图14为对比例中不同孵育液对精子活力的影响；

图15为对比例中不同孵育时间精子摄取外源DNA半定量PCR结果，其中：M为M5Marker I DNA分子量标准；1～3为孵育90min精子DNA半定量PCR结果；4～6为孵育60min精子DNA半定量PCR结果；7～9为孵育30min精子DNA半定量PCR结果；10～12为孵育10min精子DNA半定量PCR结果；

图16为对比例中不同孵育时间对精子活力与摄取外源DNA的影响；

图17为对比例中不同孵育条件精子摄取外源DNA半定量PCR结果；其中：M为M5Marker I DNA分子量标准；1～3为2μL脂质体孵育精子DNA半定量PCR结果；4～6为1.5μL脂质体孵育精子DNA半定量PCR结果；7～9为1μL脂质体孵育精子DNA半定量PCR结果；10～12为普通孵育精子DNA半定量PCR结果。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本发明实施例提供了以精子为载体制备转基因鸡的sgRNA中crRNA部分的编码序列，所述crRNA编码链和互补链序列如人工序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

实施例2

本发明实施例提供了以精子为载体制备转基因鸡的sgRNA中crRNA部分的编码序列，所述crRNA编码链和互补链序列如人工序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

实施例3

本发明实施例提供了以精子为载体制备转基因鸡的sgRNA中crRNA部分的编码序列，所述crRNA编码链和互补链序列如人工序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

实施例4

本发明实施例提供了利用上述实施例1中的crRNA编码序列制备sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒，制备方法为：

将crRNA的编码链和互补链在合成相应的DNA单链时5′端添加与BbsI线性化后的pX330质粒的粘性末端相匹配的粘性末端序列，如表1所示，然后两条互补链经退火形成双链DNA；用BbsI限制性内切酶线性化pX330质粒，形成5′突出的粘性末端，上游CACC突出，下游AAAC突出；将退火形成的双链DNA与线性化后的pX330质粒用T4 DNA连接酶连接，转化入E.coli DH5α感受态细胞，提质粒，即得。

退火形成双链DNA的方法为：将对应的合成的编码链和互补链的单链DNA溶于超纯水，配成10μmol/L，95℃至25℃梯度下降，每5℃为一个梯度，每个温度保温1min，退火形成编码相应crRNA的双链DNA。退火形成的双链DNA具有与BbsI线性化后的pX330质粒相匹配的粘性末端。

实施例5

本发明实施例提供了利用上述实施例2中的crRNA编码序列制备sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒，制备方法同实施例4，其中crRNA的编码链和互补链在合成相应的DNA单链时5′端添加了与BbsI限制性内切酶线性化后的pX330质粒的粘性末端相匹配的粘性末端序列，序列如表1所示。

实施例6

本发明实施例提供了利用上述实施例3中的crRNA编码序列制备sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒，制备方法同实施例4，其中crRNA的编码链和互补链在合成相应的DNA单链时5′端添加了与BbsI限制性内切酶线性化后的pX330质粒的粘性末端相匹配的粘性末端序列，序列如表1所示。

表1形成退火双链DNA的序列

检验例

1、sgRNA体外酶切活性鉴定

(1)体外转录载体构建：将以上实施例1～3中的3对crRNA编码序列(实施例1中的crRNA编码序列标记为crRNA1，得到的sgRNA标记为sgRNA1；实施例2中的crRNA编码序列标记为crRNA2，得到的sgRNA标记为sgRNA2；实施例3中的crRNA编码序列标记为crRNA3，得到的sgRNA标记为sgRNA3)的编码链和互补链按表2重新合成相应的DNA单链(新合成相应的DNA单链时crRNA的编码链和互补链5′端添加了与BbsI线性化后的pT7-BbsI-trac质粒的相匹配的5′突出的粘性末端序列)，将新合成的DNA单链溶于超纯水，使其浓度为10μmol/L，每对互补序列各取10ul，混于一管95℃至25℃梯度下降，每5℃为一个梯度，每个温度保温1min，退火形成粘性末端的双链。用BbsI限制性内切酶线性化pT7-BbsI-trac质粒，形成5′突出的粘性末端，上游TAGG突出，下游AAAC突出，将所得双链DNA与所述线性化后的pT7-BbsI-trac质粒用T4 DNA连接酶连接，转化入E.coli DH5α感受态细胞中，摇菌提取质粒，获得可作为体外转录模板用的不同sgRNA的pT7-crRNA-trac质粒载体。以上crRNA分别插入到pT7-BbsI-trac质粒载体中测序峰图如图1所示。

表2形成退火双链DNA的序列

引物名称	序列(5′—3′)	作用
			T7sgRNA1up	TAGGGACATGTTAAATTCTTTCTC	编码链
T7sgRNA1low	AAACGAGAAAGAATTTAACATGTC	互补链
			T7sgRNA2up	TAGGGTGCAGTTGCATTGAGCACA	编码链
T7sgRNA2low	AAACTGTGCTCAATGCAACTGCAC	互补链
			T7sgRNA3up	TAGGGTTAAATTCTTTCTCTGGCAC	编码链
T7sgRNA3low	AAACGTGCCAGAGAAAGAATTTAAC	互补链

(2)sgRNA转录模板的PCR扩增：分别以插入不同crRNA编码序列的pT7-crRNA-trac质粒为模板，用引物T7BbsIPCRup/T7BbsIPCRlow(序列见表3)进行PCR扩增得到不同的sgRNA的转录模板。结果得出，电泳条带清晰，无拖尾，大小正确(如图2所示)，回收PCR产物，用NanoDrop2000定量，-20℃保存备用。

(3)体外切割底物的PCR扩增：以引物Gq500up/Gq500low(引物序列见表3)，太行鸡血液基因组DNA为模板扩增体外切割底物片段。产物1125bp，电泳条带清晰，无拖尾(如图3所示)，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后备用。

表3体外酶切引物序列

(4)sgRNA体外转录及纯化：全部用无RNA酶试剂耗材，用无RNA酶水稀释回收的不同sgRNA模板浓度均为20ng/μL，反应体系及条件：

37℃孵育4小时。

将20μL转录反应液中加入70μL无RNA酶水，10μL 3M NaAc(pH5.2)，混匀。加入100μL 1:1水饱和酚(pH4.7)/氯仿混合溶液，充分混匀。12000rpm离心10min。收集上层液体至新管。加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀10min。12000rpm、4℃离心10min。去除上清，加入1mL70％乙醇，震荡1min洗涤沉淀。12000rpm、4℃离心5min。尽量吸净液滴，打开管盖，室温放置3min挥发残留乙醇。加入20μL无RNA酶水溶解沉淀。-80℃保存备用。

(5)用Cas9体外酶切试剂盒进行sgRNA体外酶切活性鉴定，以图像条带Volume值分析判断不同sgRNA体外酶切效率，sgRNA引导Cas9蛋白未切割底物的Volume值见表2。结果如图4所示，sgRNA1的切割效率为82.1％，sgRNA2切割效率为92.5％，sgRNA3切割效率为95.4％，其中sgRNA1切完底物是532bp和593bp，sgRNA2切完底物是504bp和621bp，sgRNA3切完底物是535bp和590bp，切割效率均较高。

根据矮小型鸡生长激素受体基因(GeneBank登录号：NC_006127.5)缺失部分的外显子区通过计算机设计得到人工序列(对比例1和对比例2)，并按上述方法制备sgRNA并进行体外酶切活性鉴定，结果显示如表4所示。可见其切割效率均较低。

表4未切割底物条带Volume值

2、sgRNA活性的DF-1细胞内鉴定及sgRNA脱靶分析

(1)将EGFP基因表达结构插入pX330质粒载体，制得pX330-EGFP质粒载体。限制性内切酶BbsI酶切pX330-EGFP质粒载体，回收酶切产物。将5′端添加了与BbsI线性化的pX330-EGFP质粒相匹配的末端的各crRNA编码编码链和互补链退火成双链，与用BbsI线性化的pX330-EGFP质粒用T4 DNA连接酶连接，转化入E.coli DH5α感受态细胞，提质粒，质粒载体分别命名为pX330-g1-EGFP，pX330-g2-EGFP，pX330-g3-EGFP。

提取DF-1细胞基因组DNA，通过PCR扩增(引物序列见表5中的Zbup、Zblow和Ybup、Yblow)和一系列酶切链接等常规方法构建跨越sgRNA靶位点的打靶载体左右同源序列的质粒pMD19T-zyb，再通过酶切链接等常规操作将新霉素抗性基因表达结构插入到左右同源臂之间构建得到同源臂打靶载体pMD19T-Neo-zyb。

表5细胞sgRNA活性鉴定引物

将pMD19T-Neo-zyb质粒分别和pX330-g1-EGFP、pX330-g2-EGFP、pX330-g3-EGFP共转染DF-1细胞，转染后筛选G418抗性细胞克隆，sgRNA1获得16株细胞克隆，sgRNA2获得23株细胞克隆，sgRNA3获得24株细胞克隆。提取每个克隆细胞基因组DNA用PCR的方法进行定点整合鉴定(引物序列见表5中的scup、sclow和xcup、xclow，其中scup、sclow用于鉴定定点整合的上游侧鉴定，xcup、xclow用于定点整合的下游侧鉴定)，转染后筛选阳性克隆细胞，sgRNA1获得的16株细胞克隆有2株为定点整合，sgRNA2获得的23株细胞克隆中有9株为定点整合，sgRNA3获得的24株细胞克隆中有11株为定点整合。未发生定点整合的阳性细胞克隆，经Gq500up/Gq500low为引物PCR鉴定，sgRNA2和sgRNA3为引导sgRNA时各有2株靶点处基因突变。因此推测，sgRNA1的编辑效率为12.5％，sgRNA2的编辑效率为47.8％，sgRNA3的编辑效率为54.2％。如图5、图6所示。

(2)对sgRNA进行脱靶分析

每个sgRNA设计选择错配碱基数由少到多的5个潜在脱靶位点进行分析，潜在脱靶位点如表6所示。

以筛选到的阳性单克隆基因组DNA为模板，分别用其对应鉴定脱靶引物进行PCR扩增，扩增产物和未做转染的细胞基因组DNA为模板的扩增产物等比例混合后测序，如果发生编辑测序峰图会出现套峰，测序结果表明在潜在靶点处未发现有脱靶现象，则3个sgRNA在所设计的潜在脱靶处未发生脱靶。

表6 sgRNA潜在脱靶位点

注：靶点序列的小写字母碱基为潜在错配碱基。

实施例7

本实施例提供了利用上述实施例3中的sgRNA制备转基因鸡的方法。

1、按实施例6中的方法制备以EGFP为报告基因的sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒pX330-g3-EGFP。

2、精子孵育

选择生长状况良好，健康成年的30周龄的太行鸡。单笼科学饲养，鸡性成熟后饲喂种鸡料，以保证正常的受精率，定期打扫鸡舍，定期免疫。

挑选40只健康公鸡，400只健康产蛋正常的母鸡(1只公鸡分别对应10只母鸡)，采集新鲜公鸡精液，取200μL悬浮于M199培养基混匀洗涤精浆：2500rpm离心5min，弃上清，重复洗涤一次，分别加入1mL M199培养基作为孵育液，并加入1μg pX330质粒，脂质体1.5μL，混匀，移入12孔板，37℃培养箱共孵育60min，孵育后人工授精。连续输精2天，收集7天种蛋。孵化所述受精蛋，即可得到矮小型转基因鸡。

3、检验

(1)转基因鸡胚盘水平检测基因编辑：

共收集种蛋2109枚，其中受精蛋1087枚。以种蛋中胚盘提取的基因组DNA为模板，Gqxinup/Gqxinlow为引物扩增靶点处序列，扩增靶基因。引物序列见表7。

表7胚盘PCR检测引物

将PCR产物测序，发现胚盘中有发生基因编辑的个体其PCR产物测序峰图在sgRNA靶位点附近有套峰，见图7。

将测序结果峰图中靶点附近有套峰的PCR产物用T4 DNA连接酶与pMD19-T vector连接，转化入E.coli DH5α感受态细胞，摇菌扩大培养，以挑取单克隆菌液为模板，Gqxinup/Gqxinlow为引物进行PCR扩增，以获得单一基因编辑过的产物，达到将不同序列的PCR产物分离的目的。将PCR产物进行测序，并与野生型靶基因对比分析，共发现3枚受精蛋发生基因编辑，分别为：

①从第一枚受精蛋中挑取48个单克隆，其中5个单克隆的PCR产物大小发生变化，发生突变的克隆占比10.4％，说明PCR产物中有10.4％的突变产物，见图8-a的5、13、20泳道和图8-b的15、22泳道，将发生突变的PCR产物进行测序，见图8-c；

②从第二枚受精蛋中挑取48个单克隆，其中6个单克隆的PCR产物大小发生变化，发生突变的克隆占比12.5％，说明PCR产物中有12.5％的突变产物，见图9-a的3、14、19、20泳道和图9-b的8、20泳道，将发生突变的PCR产物进行测序，经测序对比基因编辑后较野生型缺失133bp，见图9-c。

③从第三枚受精蛋中挑取48个单克隆，其中5个单克隆的PCR产物大小发生变化，发生突变的克隆占比10.4％，说明PCR产物中有10.4％的突变产物，见图10-a的3、19、22泳道和图10-b的16、17泳道，将发生突变的PCR产物进行测序，经测序对比基因编辑后较野生型插入103bp，见图10-c。

针对有基因突变的样品，分别以提取其父本、母本的血液基因组DNA为模板，以Gqxinup/Gqxinlow为引物，PCR扩增靶基因，以同胚盘检测靶基因序列相同的方法分别检测其父本、母本的靶基因序列。未发现靶点处有突变，见图11。说明胚胎检测到的突变并非由于遗传造成的，而是由CRISPR/Cas9系统发生了基因编辑，造成靶序列突变。

将检测到发生基因编辑的胚盘通过PCR鉴定性别，引物为表7中的Sexup和Sexlow，电泳结果见图12，判断3枚受精蛋均为雌鸡，雌鸡为单Z染色体，发生基因编辑的细胞占各自细胞总数均为10％左右，推测CRISPR/Cas9发生基因编辑在鸡受精卵发育到8细胞时期。

(3)转基因鸡组织水平检测基因突变：

选择4只健康公鸡，40只健康产蛋正常母鸡，按上述方法进行精子脂质体孵育及人工授精，收集种蛋246枚，其中受精蛋122枚，受精率为49.6％。将受精蛋放入孵化器进行孵化，采用变温孵化：1～5天：温度为38.5℃，翻蛋频率是60min/次，湿度为65％；6～18天：温度为37.8℃，翻蛋频率为60min/次，湿度为65％；落盘后温度设为37.5℃，湿度设为70％，在孵化过程中、种蛋入孵时、孵化到第九天和落盘后都要用孵宝进行熏蒸一次，确保孵化环境的卫生。出壳107只雏鸡，孵化率为87.7％。雏鸡出壳后，将雏鸡解剖，并用荧光蛋白镜照射雏鸡各组织，采集发出绿色荧光的组织，同时采集其心脏、肝脏、脑、性腺、舌头，分别提取其基因组DNA，用与胚盘水平检测靶基因突变相同的方法PCR检测转基因鸡组织水平检测基因突变。发现有绿色荧光组织的18只雏鸡，外源DNA阳性率为16.8％。部分含有EGFP绿色荧光组织对比图见图13。经组织基因组DNA的PCR检测，未发现有基因突变的组织。

对比例

本对比例提供了精子孵育的条件对比结果。

1、精子孵育液

以稀释液、DMEM培养基、1640培养基、PBS缓冲液、M199培养基按上述方法进行孵育，37℃培养箱共培养90min，并分别在10min、30min、60min、90min时检测有活力精子所占比例。结果如图14所示，稀释液、DMEM培养基、1640培养基、PBS缓冲液中有活力精子所占比例明显下降(如60min时，各孵育液中有活力精子所占比例分别18.26％，19.28％，20.44％，21.57％)，极少量精子在运动，而且位移范围极小，而用M199培养基在37℃孵育精子在60min时有活力精子所占比例(78.48％)显著高于其他孵育液(p<0.05)，几乎所有精子都在快速运动。

2、精子摄取外源DNA最佳孵育时间

精子分别孵育10min，30min，60min，精子活力差异不显著(p>0.05)，精子摄取外源DNA整体上随着孵育时间的增加而增加，如图15所示，但是孵育时间超过60min后，精子吸附外源DNA的能力不再显著增加(p>0.05)，孵育时间为90min时有活力精子所占比例较孵育10min时也显著下降，如图16所示，结果表明并非孵育时间越长越好。

3、脂质体的加入量对比

用常规精子孵育进行人工受精，胚盘DNA以表7中的P3up和P3low为引物进行PCR扩增，鉴定外源DNA，结果显示87枚蛋有13枚PCR检测外源DNA阳性，阳性率为14.94％；用添加脂质体的孵育液孵育的精子进行人工受精，90枚蛋有26枚PCR检测外源DNA阳性，阳性率为28.89％，外源DNA阳性率差异显著(p<0.05)。

如图17所示，相较于不加脂质体的实验组，在孵育液中添加脂质体孵育精子能使精子摄取外源DNA能力显著提高(p<0.05)，当孵育时脂质体增加到2μL时，其精子摄取外源DNA数量较脂质体1.5μL时下降，而且精子活力也较不加脂质体组显著下降(p<0.05)，结果表明脂质体对精子有较大影响。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备矮小型转基因鸡的sgRNA和制备方法

<130> 2020.05.16

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> crRNA1编码链人工序列

<400> 1

gacatgttaa attctttctc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> crRNA1互补链人工序列

<400> 2

gagaaagaat ttaacatgtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> crRNA2编码链人工序列

<400> 3

gtgcagttgc attgagcaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> crRNA2互补链人工序列

<400> 4

tgtgctcaat gcaactgcac 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> crRNA3编码链人工序列

<400> 5

gttaaattct ttctctggca c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> crRNA3互补链人工序列

<400> 6

gtgccagaga aagaatttaa c 21

Claims

1.一种精子载体制备转基因动物的方法，其特征在于，具体包括：

根据靶基因设计sgRNA中的crRNA序列，根据所述crRNA序列构建sgRNA与Cas9蛋白的共表达质粒；

2.精子载体制备矮小型转基因鸡的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA中的crRNA部分的编码链和互补链序列如SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4，或SEQ IDNO:5与SEQ ID NO:6中任一对人工序列所示。

3.精子载体制备矮小型转基因鸡的sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒，其特征在于，所述共表达质粒用权利要求2所述crRNA制备得到，制备方法为：将权利要求2所述crRNA的编码链和互补链在合成相应的DNA单链时5′端添加与BbsI限制性内切酶线性化后的pX330质粒的粘性末端相匹配的粘性末端序列，然后两条互补单链经退火形成双链DNA；用BbsI限制性内切酶线性化pX330质粒，形成5′突出的粘性末端；将退火形成的所述双链DNA与线性化后的pX330质粒用T4 DNA连接酶连接，得到所述共表达质粒。

4.一种矮小型转基因鸡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、用权利要求3所述制备方法制备sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒；

S3、用S2完成共孵育的精子经人工授精制得受精蛋；

S3、孵化所述受精蛋，即可得到矮小型转基因鸡。

5.如权利要求4所述的矮小型转基因鸡的制备方法，其特征在于，S2中所述共孵育以M199培养基为孵育液。

6.如权利要求5所述的矮小型转基因鸡的制备方法，其特征在于，所述孵育液中还含有脂质体，所述脂质体相对于精液的浓度为5～7.5μl/ml。

7.如权利要求6所述的矮小型转基因鸡的制备方法，其特征在于，所述孵育液中还含有脂质体，所述脂质体相对于精液的浓度为7.5μl/ml。

8.如权利要求6所述的矮小型转基因鸡的制备方法，其特征在于，S2中所述共孵育的时间为10～60min。

9.如权利要求8所述的矮小型转基因鸡的制备方法，其特征在于，S2中所述共孵育的时间为60min。