JP7341230B2 - Ｉｇｆ－１遺伝子突然変異小人症動物モデルおよびその製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ＩＧＦ－１遺伝子突然変異小人症動物モデルおよびその製造方法に関する。
本発明は、韓国未来創造科学部の課題番号ＫＧＭ４２５１８２４、「ミニブタ資源活用の汎用／オーダーメード型人工血液開発事業」による韓国政府の支援を受けて行われた。
ラロン（Ｌａｒｏｎ）症侯群の主な特徴は、異常な低身長（小人症；ｄｗａｒｆｉｓｍ）を示し、身体症状としては、目立つ突出額、小さな頭蓋骨、下顎発達障害、体幹肥満、不足な髪の毛、骨発達異常（歯、頭蓋、大腿）、鞍鼻、二重顎、小さな生殖器、軟骨形成不全性小人症（手足が小さい）および思春期遅発症（ｄｅｌａｙｅｄ ｐｕｂｅｒｔｙ）などの複合的な表現型を示す。このような症状の原因は、主に成長ホルモン（ＧＨ；ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）およびＧＨ受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子の突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）に関連しており、結果的に、ＩＧＦ－１の減少または欠乏によってこのような症状などが現れることが知られている。よって、ラロン症侯群治療剤の開発において、治療剤の有効性および安全性を評価できるように、ラロン症侯群と類似の表現型を反映できる動物モデルの開発が必要な状況である。
これまでは、遺伝疾患の薬物治療や機序研究のための疾病モデルとして、ほとんど齧歯類を用いているが、動物疾患モデルの病理様相と症状がヒトから観察されるのと多くの差を示していて、齧歯類疾患モデルから出た結果に基づいて臨床試験を行う場合、多くの問題点があった。
すなわち、効果的な疾患モデルとして使用できるほどヒトの遺伝疾患の症状をすべて発現するモデル動物は未だに確立していないのが現状である。そのため、ヒトとの解剖／生理、繁殖、寿命および行動様相の確実な差による問題点によって、よりヒトと近い種を用いた疾患動物モデルに対する必要性が持ち上がっており、難治疾患研究を行えるブタを新たなモデル動物としてバイオ医薬分野に活用しようとする要求が高まっている。
現在まで開発されたラロン症侯群モデル動物として、ＩＧＦ－１ノックアウトマウスがあるが、ＩＧＦ－１ノックアウトマウスは生まれて１日で呼吸困難の原因によって死ぬことが報告された。これを克服するために、Ｃｒｅ／ｌｏｘｐ条件付きシステムを用いてＩＧＦ－１生成の７５％を担う肝において特異的にＩＧＦ－１がノックアウトされたマウスが開発されており、前記マウスは血液上における循環ＩＧＦ－Ｉレベルが７５％以上減少したが、表現型は正常なマウスと差がないという問題点が存在した。
最近、成長ホルモン受容体遺伝子を遺伝子ハサミによりノックアウトさせた形質転換クローンミニブタが生産されたが、ラロン症侯群患者から見られる表現型のうち一部の表現型（小人症、肥満）だけが観察された。すなわち、効果的な疾患モデルとして使用できるほどラロン症侯群の症状をすべて発現するモデル動物は未だに確立していないのが現状である。
そこで、本発明者らは、ラロン症侯群などの小人症で現れる多様な表現型を有する形質転換動物を開発するための研究を行い、本発明を完成した。
ＫＲ１０－２００９－００５１７１６Ａ ＫＲ１０－２０１８－００９１２９１Ａ ＷＯ０１－７２１１９Ａ２
本発明の一つの目的は、ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子をコードするＤＮＡにハイブリダイズするｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列；Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターを提供することである。
本発明の他の目的は、組換え発現ベクターが導入された小人症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）動物モデル作製用形質転換細胞株を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、小人症動物モデル作製用形質転換細胞株を、ヒトを除いた動物から得た脱核卵子に移植して核移植卵を形成するステップと、前記核移植卵を、ヒトを除いた動物である代理母の卵管に移植するステップとを含む小人症動物モデルの製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ＩＧＦ－１遺伝子突然変異小人症動物モデルを提供することである。
本発明の一態様は、ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子をコードするＤＮＡにハイブリダイズするｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列；Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明の一具体例によれば、前記ｇＲＮＡは、配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列を含むことができる。
本発明の他の態様は、組換え発現ベクターが導入された小人症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）動物モデル作製用形質転換細胞株を提供する。
本発明のさらに他の態様は、小人症動物モデル作製用形質転換細胞株を、ヒトを除いた動物から得た脱核卵子に移植して核移植卵を形成するステップと、前記核移植卵を、ヒトを除いた動物である代理母の卵管に移植するステップとを含む小人症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）動物モデルの製造方法を提供する。
本発明の一具体例によれば、前記動物は、ミニブタであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記小人症は、ＩＧＦ－１ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）によるものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記ノックアウトは、配列番号２に相当する塩基配列が、配列番号５～配列番号９からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列に突然変異して発生したものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記小人症は、ラロン（Ｌａｒｏｎ）症侯群であってもよい。
本発明のさらに他の態様は、ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子突然変異小人症動物モデルを提供する。
本発明の一具体例によれば、前記動物モデルは、ＩＧＦ－１遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）されたものであるＩＧＦ－１遺伝子突然変異小人症動物モデル。
請求項１０において、前記ノックアウトは、配列番号２に相当する塩基配列が、配列番号５～配列番号９からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列に突然変異して発生したものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記動物モデルは、ＥＩＦ４Ｈ、ＣＬＩＰ２、ＥＬＮ、ＬＩＭＫ１およびＲＦＣ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現が減少したものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記動物モデルは、ラロン（Ｌａｒｏｎ）症侯群またはウィリアムズ・ボイレン（Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｂｅｕｒｅｎ）症侯群モデル用であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記動物は、ミニブタであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記ミニブタは、ペット用であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記ミニブタは、異種臓器移植用であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記ミニブタは、人工血液開発用であってもよい。
ＩＧＦ－１遺伝子突然変異小人症動物モデルおよびその製造方法によれば、出生直後に死亡する問題が改善され、ラロン症侯群患者から見られる大多数の表現型の観察が可能なだけでなく、性格遺伝子の減少した発現を示すので、小人症関連疾患モデルの用途に有用に活用することができる。
ブタＩＧＦ－１エクソン（ｅｘｏｎ）２に位置するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ハサミのガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）がハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列を示す図である。 ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミＳｕｒｒｏｇａｔｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ中、ブタＩＧＦ－１レポーターベクターの構造を示す図である。 ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミＳｕｒｒｏｇａｔｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ中、ブタＩＧＦ－１ ｇＲＮＡベクターの構造を示す図である。 ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミＳｕｒｒｏｇａｔｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ中、Ｃａｓ９ベクターの構造を示す図である。 ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムの導入および作動の有無を検証した蛍光顕微鏡写真である。 ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムの導入および作動の有無を検証したフローサイト分析の結果を示すグラフである。 ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムが導入された正常ミニブタ供与細胞株（ＷＴ）において、ｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列の突然変異（＃３～＃２１）を示す図である。 ＩＧＦ－１ノックアウト（ＫＯ）形質転換供与細胞＃７番において、塩基配列の挿入によるＩＧＦ－１遺伝子のアミノ酸のコドン（ｃｏｄｏｎ）の変化を示す図である。赤色表示された部分は終結コドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）である。 ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換供与細胞＃１５番において、塩基配列の挿入によるＩＧＦ－１遺伝子のアミノ酸のコドンの変化を示す図である。赤色表示された部分は終結コドンである。 ＩＧＦ－１ノックアウト（ＫＯ）形質転換供与細胞＃７番の核型分析の結果を示す図である。 ＩＧＦ－１ノックアウト（ＫＯ）形質転換供与細胞＃１５番の核型分析の結果を示す図である。 体細胞複製および代理母移植によるＩＧＦ－１ノックアウト形質転換ミニブタの生産過程を示す模式図である。 妊娠３５日目に流産したＩＧＦ－１ノックアウト形質転換ミニブタの胎児（ｆｅｔｕｓ）および出生２日目に代理母によって圧死されたＩＧＦ－１ノックアウト形質転換ミニブタの写真である。黄色い円は代理母によって圧死された部位を示す。 生後５６日頃のＩＧＦ－１ノックアウト（ＫＯ）形質転換ミニブタおよび正常（ＷＴ）ミニブタを比較して示す写真である。 ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換ミニブタの流産した胎児（Ａｂｏｒｔｅｄ）、圧死（Ｄｉｅｄ）および生存（Ａｌｉｖｅ）個体、および形質転換供与細胞株＃１５番において、ｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列が同一であることを示す図である。 ＩＧＦ－１標的配列以外のＩＧＦ－１標的配列と類似の塩基配列におけるオフ－ターゲット突然変異が発生しないことを確認した塩基配列分析の結果である。 ＩＧＦ－１標的配列以外のＩＧＦ－１標的配列と類似の塩基配列におけるオフ－ターゲット突然変異が発生しないことを確認した塩基配列分析の結果である。 出生後２日頃、代理母圧死によって死んだＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの相対的なＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２およびＩＧＦＢＰ３遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 生きているＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタにおける成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン（ＩＮＳ）およびＩＧＦ－１ホルモンの血液学的変化レベルを比較したグラフである。 正常ミニブタおよびＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタに対する出生時から出生後２７日までの体重を示すグラフである。 出生後２０日頃、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタおよび同じ時期に正常ミニブタを安楽死させた後、大きさを比較した写真である。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの大きさを比較した写真である。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの体幹肥満を比較した写真である。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト個体の腹囲（ｇｉｒｔｈ）を、正常個体の腹囲を基準（１００％）として、体長（ｌｅｎｇｔｈ）および体高（ｈｅｉｇｈｔ）を用いて補正および比較した結果を示すグラフである。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの頭部のＣＴ写真を比較した写真である。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの頭蓋骨の縫合の有無を比較した写真である。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト個体の頭回りを、正常個体の頭回りを基準（１００％）として、横回り（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）および縦回り（ｖｅｒｔｉｃａｌ）を用いて補正および比較した結果を示すグラフである。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの後頭部側の髪の毛を比較した写真である。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの前足足首の厚さを比較した写真である。 生後２０日頃のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタ（腹腔内睾丸または潜伏睾丸；ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｓｉｓｍ）と正常ミニブタの睾丸（正常下降）を比較した写真である。 生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの睾丸の厚さを比較した写真である。 生後２０日齢のＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの脳（ｂｒａｉｎ）、心臓（ｈｅａｒｔ）、肺（ｌｕｎｇ）、肝（ｌｉｖｅｒ）、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、大腿骨（ｆｅｍｕｒ）および睾丸（ｔｅｓｔｅｓ）を比較した写真である。 出生後２日頃、代理母圧死によって死んだＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタと正常ミニブタの性格遺伝子であるＥＩＦ４Ｈ、ＣＬＩＰ２、ＥＬＮ、ＬＩＭＫ１およびＲＦＣ２遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを比較した写真である。
本発明の一態様は、ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子をコードするＤＮＡにハイブリダイズするｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列；Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターを提供する。
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを活用したＩＧＦ－１特異的遺伝子ハサミを用いてＩＧＦ－１遺伝子をノックアウトさせ、形質転換体細胞複製手法の適用によって、小人症、具体的には、ラロン（Ｌａｒｏｎ）症侯群で現れる多様な表現型を有する形質転換動物を生産する方法が提供される。
本発明で使われる用語、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」は、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）で構成されている第３世代遺伝子ハサミであって、微生物の免疫体系として知られたＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）システムを用いて、所望の遺伝子塩基配列を切断するように考案された人工制限酵素をいう。
本発明で使われる用語、「Ｃａｓ９タンパク質」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおける必須のタンパク質要素であって、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス－活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成して、活性エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）として作用することができる。前記Ｃａｓ９タンパク質は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属由来のものであってもよい。
本発明で使われる用語、「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）」は、標的ＤＮＡに特異的なＲＮＡで、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成することができ、Ｃａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに持ち込むことができる。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡであってもよく、または、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが１つに連結されたｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ）であってもよい。
本発明の組換え発現ベクターを用いて細胞を形質転換すれば細胞内にガイドＲＮＡ断片を伝達することができ、伝達されたガイドＲＮＡ断片はＩＧＦ－１遺伝子を認識することができる。前記組換え発現ベクターは、ｔｒａｃｅｒＲＮＡをさらに含むことができる。したがって、組換え発現ベクターを用いて細胞を形質転換すれば、細胞内にガイドＲＮＡ断片およびｔｒａｃｒＲＮＡ断片、またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが１つに連結されたｓｇＲＮＡを伝達することができ、伝達されたｔｒａｃｒＲＮＡ断片または部分は、ｃｒＲＮＡ断片または部分と複合体または結合構造を形成してＣａｓ９タンパク質が認識可能な構造を形成する役割を果たすことができる。
ＩＧＦ－１は、成長ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）の作用を調節するインスリン様および分裂促進性生物学的活性を有するソマトメジン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ）Ａ系に属する８４ｐＩ（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ）を有する７０個のアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）の７６４９Ｄａタンパク質である。ＩＧＦ－１による成長促進は、成長ホルモンが成長を調節する最も大きな方式で、成長ホルモンの濃度が正常であってもＩＧＦ－１の分泌に障害がある場合、一般的な小人症よりも深刻なラロン症侯群が発生可能である。本発明の組換え発現ベクターは、オフ－ターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）の問題なしに、体細胞の複製による形質転換動物モデルの生産過程において、供与細胞株（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ）のＩＧＦ－１遺伝子のみを特異的にノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ：ＫＯ）させることができるため、小人症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）、特に、ラロン症侯群動物モデルの製造に有用に活用可能である。
本発明で使われる用語、「ノックアウト」は、塩基配列のうち特定の遺伝子が発現できないように、これを変形または除去することを意味する。
本発明で使われる用語、「組換え発現ベクター」は、目的のコーディング配列と、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列を発現するのに必須の適正核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を意味する。真核細胞で利用可能なプロモーター、エンハンサー、終結シグナルおよびポリアデニレーションシグナルは公知である。
本発明で使われる用語、「作動可能に連結された」は、遺伝子発現調節配列と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記遺伝子発現調節配列は、複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）、プロモーターおよび転写終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）などからなる群より選択される１種以上であってもよい。転写終結配列は、ポリアデニル化配列（ｐＡ）であってもよいし、複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点またはＢＢＶ複製原点などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明で使われる用語、「プロモーター」は、構造遺伝子からのＤＮＡアップストリームの領域を意味し、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ分子をいう。
本発明の一具体例によるプロモーターは、特定の遺伝子の転写開始を調節する転写調節配列の一つで、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐの長さのポリヌクレオチド断片であってもよい。プロモーターは、細胞、例えば、真核細胞（例えば、植物細胞、または動物細胞（例えば、ヒト、マウスなどの哺乳類細胞など）など）で転写開始を調節できれば、制限なく使用可能である。例えば、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（例えば、ヒトまたはマウスＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙプロモーター）、Ｕ６プロモーター、ＥＦ１－ａｌｐｈａ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １－ａ）プロモーター、ＥＦ１－ａｌｐｈａ ｓｈｏｒｔ（ＥＦＳ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＳＶ４０Ｅ１プロモーター、呼吸器細胞融合ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ；ＲＳＶ）プロモーター、メタロチオニンプロモーター（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、β－アクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ヒトＩＬ－２（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン（ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）遺伝子プロモーターおよびヒトＧＭ－ＣＳＦ（ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）遺伝子プロモーターからなる群より選択されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例による組換え発現ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ－関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターからなる群より選択されるものであってもよい。組換え発現ベクターとして使用可能なベクターは、当業界で使用されるプラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、Ｍ１３など）またはウイルスベクター（例えば、アデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなど）などをベースとして作製されてもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の組換え発現ベクターは、１つ以上の選択性マーカーをさらに含むことができる。前記マーカーは、通常化学的な方法で選択可能な特性を有する核酸配列で、形質注入された細胞を非形質注入細胞から区別できるすべての遺伝子がこれに相当する。例えば、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の組換え発現ベクターの作製は、当該技術分野でよく知られた遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位－特異的ＤＮＡの切断および連結は、当該技術分野で一般的に知られた酵素などを用いて行われる。
本発明の一具体例によれば、前記ｇＲＮＡは、配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列を含むものであってもよい。
配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列を含むｇＲＮＡを使用することにより、ＩＧＦ－１をコーディングするアミノ酸のコドン（ｃｏｄｏｎ）の変化および／または早期終結コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）の生成を効率的に誘導することができる。
本発明の他の態様は、ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子をコードするＤＮＡにハイブリダイズするｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターが導入された小人症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）動物モデル作製用形質転換細胞株を提供する。
本発明で使われる用語、「小人症」は、個体の年齢に合った身体の大きさに比べて小さい状態を示す症状を意味する。本発明の小人症動物モデルは、成長ホルモンの生産と分泌が正常範囲であるか高いにもかかわらず、成長ホルモンの生物学的な効果が減少または消失した遺伝疾患である「ラロン症侯群」の表現型を特に類似して反映することができる。
本発明の一具体例による組換え発現ベクターが導入された形質転換細胞株を製造するために、核酸分子を有機体、細胞、組織または器官に導入する当分野で公知の方法を用いることができ、当分野で公知のように、宿主細胞によって好適な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオン性リポソーム法、および酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが含まれるが、これに限定されるものではない。
形質転換細胞株として使用される細胞の種類は、動物細胞または動物細胞由来の細胞であってもよく、好ましくは、哺乳類、最も好ましくは、ブタまたはミニブタ由来の体細胞であってもよい。形質転換細胞株としてミニブタ由来の体細胞を用いる場合、出生直後にミニブタが死亡する問題を改善できるだけでなく、小人症、特に、ラロン症侯群の表現型を類似して反映することができる。
本発明のさらに他の態様は、ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子をコードするＤＮＡにハイブリダイズするｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターが導入された小人症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）動物モデル作製用形質転換細胞株を、ヒトを除いた動物から得た脱核卵子に移植して核移植卵を形成するステップと、前記核移植卵を、ヒトを除いた動物である代理母の卵管に移植するステップとを含む小人症動物モデルの製造方法を提供する。
前記小人症動物モデルの製造方法は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ；ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によるものであってもよい。「体細胞核移植」は、生殖過程で一般的に行われる減数分裂および半数染色体保有生殖細胞を経由しなくても子孫を誕生させられる遺伝子操作技術であって、成体が有する倍数体保有体細胞を核の除去された卵子に移植して受精卵を生産し、前記受精卵を生体内に移植して新たな個体を発生させる方法である。
本発明で使われる用語、「核移植卵」は、核供与細胞が導入または融合された卵子をいい、「融合」は、核供与細胞と卵子の脂質膜部分との結合を意味する。例えば、脂質膜は、細胞のプラズマ膜または核膜であってもよい。融合は、核供与細胞と卵子とが互いに隣接して位置している場合、または核供与細胞が受核卵子の卵黄周囲空間（ｐｅｒｉｖｉｔｅｌｌｉｎｅ ｓｐａｃｅ）内に位置している場合に電気的刺激を加えることにより起こることができる。前記形質転換細胞株は核供与細胞であって、核受容体である卵子に核を伝達する細胞または細胞の核をいう。卵子は、好ましくは、第２次減数分裂中期まで到達した成熟卵子をいい、好ましくは、ブタの卵子であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記動物は、ミニブタであってもよい。
ブタは、解剖生理学的にヒトと類似性が認められてすでに各種疾患の病理学的機序と治療のための研究に用いられており、特に長い間経済動物として価値が認められ、他の中／大型動物を疾患モデルとして用いる時より倫理的な問題点を避けることができ、安定した飼育システムが構築されていて、実験動物モデルの開発時に維持および管理が容易であるという利点がある。
本発明の一具体例によれば、前記小人症は、ＩＧＦ－１ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）によるものであってもよい。
ＩＧＦ－１遺伝子を構成する塩基中、一部の置換、欠失、または一部の塩基の挿入によるＩＧＦ－１ノックアウトによって、小人症動物モデルの製造が可能である。
本発明の一具体例によれば、前記ノックアウトは、配列番号２に相当する塩基配列が、配列番号５～配列番号９からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列に突然変異して発生したものであってもよい。
配列番号５は、配列番号２の塩基配列中、５番目～７番目の塩基である「ＧＧＣ」が欠失した塩基配列である。配列番号６は、配列番号２の塩基配列の７番目の塩基の次に「Ｃ」が添加された塩基配列である。配列番号７は、配列番号２の塩基配列の８番目の塩基の次に「ＣＴ」が添加された塩基配列である。配列番号８は、配列番号２の塩基配列中、７番目の塩基である「Ｃ」が欠失した塩基配列である。配列番号９は、配列番号２の塩基配列中、９番目の塩基の次に「ＣＴＧ」が添加された塩基配列である。
本発明の一具体例によれば、前記小人症は、ラロン（Ｌａｒｏｎ）症侯群であってもよい。
従来の成長ホルモン受容体ノックアウト形質転換ミニブタでは、大きさ減少、肥満関連の部分が主に報告されており、出生時に正常な大きさで生まれるが、後の成長過程で問題が生じて大きさ／体重の差を示し、思春期遅発症は観察されないと報告された。これに対し、本発明の動物モデルは、ラロン症侯群の患者から見られる多様な表現型が現れ、具体的には、出生時から現れる出生時からの成長発育（大きさ、体重）の問題、突出額、閉じていない頭蓋骨縫合、短い鼻の長さ、小さな頭蓋骨、不足な歯、不足な毛、軟骨形成不全性小人症および思春期遅発症などが現れる。したがって、本発明の動物モデルは、小人症、特に、ラロン症侯群モデルとして好適である。
本発明のさらに他の態様は、ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子突然変異小人症動物モデルを提供する。
本発明で使われる用語、「動物モデル」は、ヒトの疾病と非常に類似する形態の疾病を有する動物をいう。ヒトの疾病研究において疾患モデル動物が意味を有することは、ヒトと動物との間の生理的または遺伝的な類似性による。疾病研究における生体医学疾患モデル動物は、疾病の多様な原因と発病過程および診断に関する研究用材料を提供できるので、疾患モデル動物の研究を通じて疾病に関連する遺伝子を見出し、遺伝子間の相互作用を理解することができ、開発された新薬候補物質の実際の効能および毒性検査により実用化可能性の有無を判断する基礎資料を得ることができる。
本発明の小人症動物モデルにおいて、前述した内容と重複する部分は、前述した意味と同一の意味で使用可能である。
本発明で使われる用語、「突然変異」は、遺伝子をなす塩基配列の変化により遺伝情報が変わることで遺伝形質が変化した状態をいい、このような突然変異には、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異が含まれる。本発明では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＩＧＦ－１遺伝子の突然変異によるＩＧＦ－１遺伝子の発現が減少した小人症動物モデルが提供される。
本発明の一具体例によれば、前記動物モデルは、ＩＧＦ－１遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）されたものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記ノックアウトは、配列番号２に相当する塩基配列が、配列番号５～配列番号９からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列に突然変異して発生したものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記動物モデルは、ＥＩＦ４Ｈ、ＣＬＩＰ２、ＥＬＮ、ＬＩＭＫ１およびＲＦＣ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現が減少したものであってもよい。
本発明で使われる用語、「性格遺伝子」は、過度の親密性／社会性（ｈｙｐｅｒ ｓｏｃｉａｌｉｔｙ）に関する遺伝子であって、ヒトにおけるウィリアムズ・ボイレン（Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｂｅｕｒｅｎ）症侯群で発現が減少していることから、性格に関連していることが確認された。
本発明の一具体例によれば、前記動物モデルは、ラロン（Ｌａｒｏｎ）症侯群またはウィリアムズ・ボイレン（Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｂｅｕｒｅｎ）症侯群モデル用であってもよい。
本発明で使われる用語、「ウィリアムズ・ボイレン（Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｂｅｕｒｅｎ）症侯群」は、ヒトに過度に親切で、見知らぬヒトに会ってもヒト見知りをしないだけでなく、社会性が非常に良いが、やや知能が低く健康と外貌に障害が現れる症状をいう。本発明の小人症動物モデルは、性格遺伝子であるＥＩＦ４Ｈ、ＣＬＩＰ２、ＥＬＮ、ＬＩＭＫ１およびＲＦＣ２遺伝子の発現が減少していて、ウィリアムズ－ボイレン症侯群と類似の様相を示す。
本発明の一具体例によれば、前記動物は、ミニブタであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記ミニブタは、ペット用であってもよい。
本発明のミニブタは、正常ミニブタに比べて大きさが小さくて太っているため、外見的に可愛さを提供することができ、性格遺伝子の発現の減少によって人懐っこいので、ペット用動物として有用に活用可能である。
本発明の一具体例によれば、前記ミニブタは、異種臓器移植用であってもよい。
本発明のミニブタは、正常ミニブタに比べて個体の大きさが小さいため、限られた空間で一般のブタに比べて多い個体数で飼育が可能であり、正常ミニブタに比べて臓器の大きさが小さいため、小さい臓器を必要とする患者の異種間臓器移植のための供与動物として有用に飼育および活用可能である。
本発明の一具体例によれば、前記ミニブタは、人工血液開発用であってもよい。
本発明で使われる用語、「人工血液」は、人体内の酸素供給、老廃物運搬、抗菌作用および／または営養分運搬などの機能を行うことができる、ヒト血液を代替できるものをいい、例えば、遺伝子操作された組換えヒトヘモグロビンを有する人工赤血球などが人工血液に含まれる。
本発明のミニブタは、正常ミニブタに比べて個体の大きさが小さいため、限られた空間で一般のブタに比べて多い個体数で飼育が可能なため、例えば、遺伝子操作による組換えヒトヘモグロビンを生産するための形質転換動物またはヒト造血母移植のための代理母として有用に活用できる。
以下、本発明を１つ以上の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されない。
実施例１．ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現システムの作製
１－１．ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステム
ブタＩＧＦ－１遺伝子の４個のエクソン中、２番エクソンを標的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ハサミをデザインした。具体的なブタＩＧＦ－１遺伝子座は図１に示す通りであり、標的ＩＧＦ－１塩基配列およびＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列およびｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列（標的ＩＧＦ－１塩基配列と相補的な配列）は表１の通りである。
Figure 0007341230000001
ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミシステムは、計３個のベクターのＳｕｒｒｏｇａｔｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで作製した。
具体的には、図２に示すように、ｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）にｍＲＦＰ１（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ１）コーディング配列が位置し、ｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列の下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）コーディング配列が位置するレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）ベクターを作製した。また、図３に示すように、ｓｇＲＮＡをコーディングする塩基配列を挿入してｓｇＲＮＡベクターを製造し、図４に示すように、ｓｇＲＮＡベクターから発現してｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列に結合したｓｇＲＮＡを認識してＩＧＦ－１の標的配列を切断するためのＣａｓ９タンパク質をコーディングする配列を挿入してＣａｓ９ベクターを作製した。
ＩＧＦ－１遺伝子ターゲットｓｇＲＮＡベクターは、ＣＲＩＳＰＲを用いてＩＧＦ－１コーディング領域で最大のノックアウト効率を達成するために、より高いフレーム外部点数を有する４個の標的特定部位を、公開されているｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌｓを通して生成し（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｄｅｓｉｇｎｅｒ／）、このようにデザインされたＣａｓ９、ｓｇＲＮＡおよびＲＧＳレポーターベクターをツールゼン（ＴｏｏｌＧｅｎ，Ｉｎｃ．Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で合成および購入した。
本発明の遺伝子ハサミシステムが導入された細胞ではｍＲＦＰ（赤色蛍光）が発現するので、本発明の遺伝子ハサミシステムが細胞に導入されたか否かを検証することができる。一方、Ｃａｓ９ベクターで発現したＣａｓ９タンパク質によってレポーターベクターに含まれたＩＧＦ－１標的配列が切断される場合、本発明の遺伝子ハサミシステムが導入された細胞でＥＧＦＰ（緑色蛍光）が発現する。したがって、緑色蛍光の発色の有無を確認することにより、本発明の遺伝子ハサミシステムが正常に作動するか否かを検証することができる。
１－２．ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムの検証－蛍光顕微鏡分析
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタ生産のために、体細胞複製のための正常ミニブタ供与細胞株に、実施例１－１で製造したＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムを導入させた後、ベクターシステムの導入および作動の有無を蛍光顕微鏡分析により確認した。
具体的には、供与細胞は、ＫＳＰミニブタ（２日齢、雄）の腎臓組織から得ており、腎臓組織を分離するまで１０％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含有されたＤＰＢＳ洗浄緩衝液に入れて冷蔵状態に保管した。以後、滅菌された手術道具（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｂｌａｄｅ）を用いて腎臓組織を小さくし、０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で前処理した１００ｍｍの培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）に載せた後、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（１６０００－０４４、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含有されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で供与細胞を十分に得るまで培養した。
ＡｍａｘａＴＭ Ｐ３ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ）のバッファー１００μｌに、１μｇ Ｃａｓ９、１μｇ ｓｇＲＮＡおよび２μｇ ＲＧＳレポータープラスミドＤＮＡと２×１０６の供与細胞を予め混合した後、４Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ（Ｌｏｎｚａ）のプログラムＥＨ－１１３を用いて、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によってベクターシステムを導入し、２４時間後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で蛍光が発現する細胞を確認した。
その結果、レポーターベクターのみを導入した供与細胞株では赤色蛍光が検出されて、細胞にレポーターベクターが導入されたことを確認した。一方、実施例１－１で製造したＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムを導入した供与細胞株では赤色蛍光および緑色蛍光がすべて検出された。したがって、本発明のベクターシステムが供与細胞株に導入され、供与細胞株で作動可能であることを確認した（図５）。
１－３．ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムの検証－フローサイト分析
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタ生産のために、体細胞複製のための正常ミニブタ供与細胞株に、実施例１－１で製造したＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムを導入した後、ベクターシステムの導入および作動の有無を確認するために、フローサイト分析を行って、全体細胞のうち赤色蛍光および緑色蛍光が発現する細胞を定量的に確認した。
具体的には、フローサイト分析のために、供与細胞に赤色蛍光、緑色蛍光、ｅｍｐｔｙベクターを形質注入してそれぞれの陽性および陰性対照群を作った後、赤色蛍光と緑色蛍光とが重なる波長帯（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｂａｎｄ）を補償（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）過程により除去し、それぞれの固有の蛍光が測定されるセッティング値を得た。以後、セッティングされた条件下、遺伝子ハサミベクターシステムが導入された供与細胞を用いて蛍光発現を確認した。
その結果、形質転換されない供与細胞株では赤色蛍光および緑色蛍光がほとんど検出されないのに対し、レポーターベクターのみを導入した供与細胞株では赤色蛍光が検出されて、細胞にレポーターベクターが導入されたことを確認した。一方、実施例１－１で製造したＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムを導入した供与細胞株では赤色蛍光および緑色蛍光がすべて検出された。したがって、本発明のベクターシステムが供与細胞株に導入され、供与細胞株で作動可能であることを確認した（図６）。
実施例２．ＩＧＦ－１突然変異形質転換供与細胞株の作製
２－１．ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換供与細胞株の検証－塩基配列分析
体細胞複製のための正常ミニブタ供与細胞株にＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミベクターシステムを導入した後、単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）で培養した形質転換ミニブタ供与細胞株に対して塩基配列分析法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行って、ＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミベクターシステムによってｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列に突然変異が発生したかを確認した。
具体的には、緑色蛍光が発現する細胞をＦＡＣＳＡｒｉａｌ ＩＩＩ分類器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて成長培地を含む９６ウェルプレートで単一細胞に分類した。分類２週間後、９６ウェルプレートから選択された単一コロニー細胞を継代培養過程により６ウェルプレートで培養した後、それぞれのクローン細胞株の一部をＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡ抽出した。ＩＧＦ－１遺伝子のｓｇＲＮＡ周辺でＰＣＲ産物の大きさが５００ｂｐ程度となるようにプライマーをデザインし、ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）装置により遺伝子を増幅した。増幅されたＰＣＲ産物を電気泳動により確認した後、ｇｅｌ ｅｌｕｔｉｏｎ過程により回収した。Ｉｎｄｅｌ（ｍｕｔａｔｉｏｎ、ｉｎｓｅｒｔｉｏｎなど塩基配列上の変化）形態を確認するために、ＰＣＲ増幅に使用されたプライマー（表２）を用いてｇｅｌ ｅｌｕｔｉｏｎで回収したＤＮＡの塩基配列を確認した。
Figure 0007341230000002
その結果、表３および図７に示すように、供与細胞株中、＃３、＃７、＃１５、＃１８および＃２１において、ｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列に対応する塩基配列内に突然変異が発生したことを確認した。
Figure 0007341230000003
２－２．ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換供与細胞株の検証－アミノ酸配列分析
実施例２－１で確認したｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列内の塩基配列の突然変異がＩＧＦ－１タンパク質の構造にどのように影響を及ぼすかを確認するために、形質転換供与細胞株の突然変異ＩＧＦ－１のコーディング配列によってコードされるアミノ酸を分析した。
その結果、ｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列が突然変異した＃７（＋１ｂｐ）（図８）および＃１５（＋２ｂｐ）（図９）番の形質転換供与細胞株において、塩基配列の挿入によって、ＩＧＦ－１をコーディングするアミノ酸のコドン（ｃｏｄｏｎ）が変化し、早期終結コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）が生成されたことを確認した。終結コドンは図８および図９に赤色表示した。
２－３．ＩＧＦ－１突然変異形質転換供与細胞株の核型の分析
実施例２－１で確認したｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列内の塩基配列の突然変異が形質転換ミニブタ供与細胞株の常染色体および性染色体に影響を及ぼすかを確認するために、形質転換供与細胞株の染色体の核型をＧ－ｂａｎｄｉｎｇ核型分析方法により分析して、染色体の安定性を検査した。
具体的には、細胞が７０～８０％のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙになった時、３７℃の５％ＣＯ２培養器で５０分間０．１ｍｇ／ｍｌのコルセミド（ｃｏｌｃｅｍｉｄ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理して、中期段階で細胞分裂を停止させた。分裂停止された細胞に、０．０６Ｍ ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）低浸透圧溶液で２０℃で１０分間処理して細胞を膨張させ、メタノール／酢酸（３：１）定着液に３０分間固定させた後、１５０ｇで１０分間遠心分離した。固定手順を３回繰り返した後、固定された細胞をガラススライド上に落として６５℃で一晩空気乾燥させた。最後に、０．２５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で前処理した後、Ｇｉｅｍｓａ染色により染色体を染色して核型を確認した。
その結果、ｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列が突然変異した＃７（図１０）および＃１５（図１１）番の形質転換供与細胞株の常染色体および性染色体は正常染色体像を示すことを確認して、形質転換ミニブタ供与細胞株で正常な二倍体の核型が維持されることを確認した。
実施例３．ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの生産
実施例２で作製したＩＧＦ－１ノックアウト形質転換供与細胞株中、ｅｍｂｒｙｏを用いた体細胞核移植（ＳＣＮＴ；Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を行った時、胚（ｅｍｂｒｙｏ）発達率により優れていることが確認された＃１５番の供与細胞株を用いてＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタを生産した。
図１２は、体細胞複製および代理母移植によるＩＧＦ－１ノックアウト形質転換ミニブタの生産過程を示す模式図である。
まず、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換＃１５供与細胞株の体細胞の核を、摘出された卵子（ｅｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｅｇｇ）に形質転換した。
具体的には、体外成熟（ＩＶＭ；ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）後、ＳＣＮＴのために目に見える最初の極体がある成熟卵子を選択した。４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、７５μｇ／ｍｌペニシリンＧ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩および７．５μｇ／ｍｌ ＣＢが含有されたＤＰＢＳにおいて卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌｓ）の除去された卵母細胞をピペット切断してスリットを作り、約１０％（ＮＴ－８８－Ｖ３、Ｎｉｋｏｎ－Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）装着された自動化された位相差顕微鏡（ＤＭＩ ６０００Ｂ、Ｌｅｉｃａ）下で卵母細胞から細胞質および第１極体を除去した。供与細胞は培地を変えずに３日間培養させて、細胞周期がＧ０～Ｇ１段階で同期化するように誘導し、卵母細胞は電気融合するまでＩＶＣ培地に入れて５％ＣＯ２、３８．５℃のインキュベータで維持した。単一供与細胞／卵母細胞は０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏと０．０１％ＰＶＡを含有する２８０ｍＭのマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で構成された融合培地で平衡をなすようにした後、付着した２つの平行電極（直径１００μｍ、ＣＵＹ５１００－１００、Ｎｅｐａｇｅｎｅ）の間に入れた。電気細胞融合生成器を用いて２３Ｖの１つの直流パルスによって５０μｓｅｃ間活性化させた後、５％ＣＯ２および３８．５℃のインキュベータに入れた。２時間後、位相差顕微鏡下で完全に融合した卵母細胞の対を選択し、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．０１％ＰＶＡが含有された１０μｌ ２８０ｍＭのマンニトール溶液で重なった１ｍｍのギャップワイヤチャンバに移した後、電気フュージョン生成器（ｅｌｅｃｔｒｏ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）を用いて１１０Ｖ ＤＣで５０μｓｅｃ間活性化させた。電気的融合で活性化された卵母細胞を化学的に活性化させるために、５０ｎＭのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）が添加された培地に入れて、４時間５％ＣＯ２および３８．５℃のインキュベータで維持した。４時間後、活性化された胚を５０ｎＭ ＴＳＡが補充されたＩＶＣ培地に移し、２０時間培養を継続した。２０時間後、ＳＣＮＴ胚をＩＶＣ培地で洗浄し、５％ＣＯ２および３８．５℃のインキュベータに入れた。その後、分裂および胚盤胞期の形成をそれぞれ２日および６日目に評価し、代理母への移植を準備した。
その後、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換＃１５番の供与細胞株の体細胞核が形質転換された卵子を代理母に移植した。
具体的には、融合したクローン卵は５００μｌの培養液入りの４ウェルプレートで１～２日間培養した後、同じ培養液２ｍｌ入りの凍結チューブにクローン卵を入れて、３９℃に加温されている受精卵運送装置（Ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｋｉｔ、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ、ＵＳＡ）で受精卵移植場所まで運送した。クローン卵移植のための代理母は発情の始まった個体を選別して用意し、代理母を洗浄後、ペントタールソジウム（Ｐｅｎｔｏｔｈａｌ Ｓｏｄｉｕｍ、中外製薬）０．５ｇを耳静脈に投与して一時痲酔させた。痲酔された代理母を手術台に固定した後、５％イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を供給して吸入痲酔を実施した。痲酔された代理母は腹中線に沿って約５ｃｍ程度切開後に子宮と卵巣を体外に露出させて準備した。この時、クローン卵をカテーテル（Ｔｏｍ ｃａｔ ｃａｔｈｅｔｅｒ、Ｍｏｎｏｊｅｃｔ、ＵＳＡ）で吸入して卵管の峡部まで押し入れてクローン卵を移植した。ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンブタ生産のために、２匹の代理母に計６００個のクローン卵を移植した。クローン卵の移植が完了した代理母は３０日間超音波を利用して姙娠検定を実施し、姙娠が確認された個体は１１４日後に分娩を誘導した。
代理母はＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）施設でミニブタの特性を考慮して、床材はプラスチックを用いてミニブタの動きと動線を楽にして飼育し、飼育ケージの床部分に温度維持用パッドを設けて、ミニブタ子豚の一定の温度維持に寄与した。ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタは出産後２日齢から、水５００ｍｌにセーフミルキー７０ｇ、初乳スティック１ｇおよびビタミン１ｇを入れた飼料を２時間間隔で給餌する人工哺乳を実施し、２回にわたって鉄分注射接種を実施した。ミニブタの出産後、３ヶ月間個体別の体重および飼料供給量を作成し、微生物モニタリングにより飼育するＩＧＦ－１ノックアウトミニブタの体系的な維持管理を行った。
図１３から確認できるように、代理母に移植して３５日目にＩＧＦ－１ノックアウト個体１匹が流産し、出生２日目にＩＧＦ－１ノックアウト個体１匹が代理母によって圧死され、代理母によって圧死された部位は図１３の黄色い円部分であることを確認した。
一方、他のＩＧＦ－１ノックアウト個体は生存し、生後５６日頃のＩＧＦ－１ノックアウトミニブタおよび正常ミニブタを比較した写真は図１４の通りである。
実施例４．形質転換クローンミニブタのＩＧＦ－１ノックアウトの確認
４－１．ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの塩基配列の分析
生産したクローンミニブタがＩＧＦ－１のノックアウトされた形質転換ミニブタであるか否かを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの塩基配列を分析した。
具体的には、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの流産した個体、圧死した個体および生存した個体由来細胞およびＩＧＦ－１ノックアウト形質転換＃１５番の供与細胞株を用いたことを除けば、実施例２－１の方法と同様の方法で、塩基配列を分析した。
その結果、図１５から確認できるように、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの流産した個体、圧死した個体および生存した個体とも、ｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列は形質転換供与細胞株＃１５番の塩基配列と同一であることを確認して、生産したクローンミニブタはＩＧＦ－１ノックアウト形質転換されたクローンミニブタであることを確認した。
４－２．ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタのオフ－ターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）の検証
実施例１－１で作製したＩＧＦ－１ノックアウト遺伝子ハサミ発現ベクターシステムがＩＧＦ－１標的配列でない他の塩基配列を標的にしたか否かを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタにおけるオフ－ターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）を検証した。
具体的には、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの圧死した個体由来細胞を用いたことを除けば、実施例２－１の方法と同様の方法で、ＩＧＦ－１標的配列（ｓｇＲＮＡがハイブリダイズされるＩＧＦ－１塩基配列と相補的な配列）と類似の配列（表４）を含む遺伝子に対する塩基配列を分析した。
Figure 0007341230000004
その結果、図１６および図１７から確認できるように、ＩＧＦ－１標的配列以外のＩＧＦ－１標的配列と類似の塩基配列では突然変異が発生しないことを確認して、オフ－ターゲットの問題は発生しないことを確認した。
４－３．ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタのｍＲＮＡ発現レベルの分析
ＩＧＦ－１とＩＧＦ－２はＩＧＦＢＰとして知られたタンパク質によって調節される。このようなタンパク質は受容体への伝達を助け、ＩＧＦ半減期を増加させることにより、可能なＩＧＦの作用を促進するだけでなく、ＩＧＦ－１受容体に対する結合を防止してＩＧＦの作用を抑制することをすべて含む複雑な方式でＩＧＦの作用を調節することを助ける。
したがって、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２およびＩＧＦＢＰ３の発現を確認するために、正常個体と代理母圧死によって死んだＩＧＦ－１ノックアウト個体の肝組織からｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、下記表４のプローブを用いて、これら遺伝子の発現を分析した。
具体的には、製造会社から提供された方法に従い、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて細胞および組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（１μｇ）をＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ○Ｒ ＲＴ試薬キット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてｃＤＮＡの合成に使用し、遺伝子の相対的発現レベルはＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲで測定し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。定量的ＲＴ－ＰＣＲ分析のための反応変数は９５℃で１０分間、９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で３０秒、そして７２℃で５分間最終ｃｙｃｌｅ段階を４０回繰り返した。比較分析のために、ｍＲＮＡ発現レベルをＧＡＰＤＨで定量化した後、ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅで示した。ＷＴを対照群ΔＣｔ（ＣΔＣｔ）値として用い、サンプルデルタＣｔ（ＳΔＣｔ）値はＧＡＰＤＨと標的遺伝子のＣｔ値の間の差から計算した。サンプルと対照群との間の相対的遺伝子の発現レベルは２－（ＳΔＣｔ－ＣΔＣｔ）公式を用いて決定し、ブタｃＤＮＡの増幅のために、ＰＣＲプライマーはＰｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを用いて下記表５のようにデザインした。
Figure 0007341230000005
その結果、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタにおいて、ＩＧＦ－１の発現はほとんど観察されておらず、ＩＧＦ－２は欠乏したＩＧＦ－１遺伝子によって補償的に増加し、ＩＧＦ－１の反対作用の機能をするＩＧＦＢＰ１（ＩＧＦ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１）は大きな水準に増加したことを確認した（図１８）。
４－４．ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの血液学的ホルモンの変化レベルの分析
ＩＧＦ－１は成長ホルモン（ＧＨ）を陰性フィードバックで抑制し、インスリン（ＩＮＳ）はＩＧＦ－１と受容体を共有するため、ＩＧＦ－１の不在時にその機能を補償（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）するために増加することが知られている。
したがって、ＩＧＦ－１の発現を確認するために、正常個体と生きているＩＧＦ－１ノックアウト個体の血液に対してＥＬＩＳＡ分析を行って、これらホルモンの変化レベルを分析した。
具体的には、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社のＰｏｒｃｉｎｅ ＩＧＦ－１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．ＭＢＳ７６１３８８）、Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．ＭＢＳ０２６４０３）およびＰｏｒｃｉｎｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ（ＩＮＳ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．ＭＢＳ２６０１７３５）を用いて、製造会社の指示に従い実験を行って結果値を導出した。
その結果、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタにおいて、ＩＧＦ－１の発現はほとんど観察されておらず、ＩＮＳはＩＧＦ－１の欠乏によって補償的に増加し、ＧＨのレベルは著しく増加したことを確認した（図１９）。
実施例５．形質転換クローンミニブタのＩＧＦ－１ノックアウト表現型の確認
５－１．出生時の少ない体重の確認
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタがＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すかを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト個体が出生時から正常体重を有するか否かを確認した。
具体的には、ＩＧＦ－１ノックアウト個体と正常個体の体重を、生まれる時から生後２７日まで比較した。
その結果、個体が生まれた時の体重の場合、正常個体の平均は８３５±９１ｇであるのに対し、生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体は４００ｇ、圧死したＩＧＦ－１ノックアウト個体は２７３ｇであることを確認した。また、個体の生後２７日の体重の場合、正常個体の平均は４６０８±２５６ｇであるのに対し、生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体は８９２ｇであることを確認した（図１９）。
このような結果を通して、生まれた時からＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの体重の差が発生し、成長しながら体重増加が正常個体とは異なって著しく減少するので、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタはＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すことを確認した。
５－２．出生時の小さい大きさおよび出生後の小さい身長の確認
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタがＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すかを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト個体が出生時から小さい大きさおよび出生後に小さい身長を有するか否かを確認した。
具体的には、出生時のＩＧＦ－１ノックアウト個体と正常個体の大きさを比較し、生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト個体と正常個体の大きさを比較した。
その結果、正常個体に比べて、圧死したＩＧＦ－１ノックアウト個体の出生時に小さい大きさを確認し（図２０）、生後２０日頃、対照群に比べて明確な発達の差を確認した（図２１）。また、正常個体に比べて、生後３ヶ月齢の生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体の小さい体長（ｌｅｎｇｔｈ）および体高（ｈｅｉｇｈｔ）を確認した（図２２）。
このような結果を通して、生まれた時からＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタの大きさの差が発生し、成長しながら身長増加が正常個体とは異なって著しく減少するので、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタはＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すことを確認した。
５－３．体幹肥満の確認
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタがＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すかを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の体幹肥満の有無を確認した。
具体的には、生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト個体と正常個体の体幹（前足肩甲骨／後足骨盤帯の基準線）の幅を比較した。
その結果、生後３ヶ月齢の生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体の体幹肥満を確認した（図２３）。また、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の腹囲（ｇｉｒｔｈ）を測定し、これを、正常個体を基準（１００％）として、体長および体高を用いて腹囲を補正して比較した結果、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の腹囲は正常個体に比べて２１６％であることを確認した（図２４）。
このような結果を通して、正常個体とは異なって著しい体幹肥満を示すので、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタはＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すことを確認した。
５－４．突出額、閉じていない頭蓋骨縫合、短い鼻の長さ、小さな頭蓋骨および不足な歯の確認
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタがＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すかを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の突出額、閉じていない頭蓋骨縫合、短い鼻の長さ、小さな頭蓋骨および不足な歯の有無を確認した。
具体的には、生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト個体と正常個体に対して、頭蓋骨コンピュータ断層撮映（ＣＴ；ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を進行させて映像を比較した。
その結果、ＩＧＦ－１は突出した形態であり、正常個体は偏平な額形態を示すことを確認した。図２５から確認できるように、生まれる時から頭蓋骨が閉じている正常個体とは異なり、生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体は閉じていない頭蓋骨縫合を示し（矢印）、正常個体に比べて、生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体は相対的に短い鼻の長さ（ヒトの鞍鼻表現型）および小さな頭蓋骨の大きさを確認し、相対的に少ない歯数（上下の前奥歯未発達）を確認した（図２５）。
また、図２６から確認できるように、解剖学的に頭蓋骨を露出した時、ＧＦ－１ ＫＯ個体（＃００２、＃００３）で縫合が閉じておらず（赤色矢印）、ＷＴ個体（＃０３１、＃０３２）より頭蓋骨が突出していることを確認した。
さらに、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の頭回りを測定し、これを、正常個体基準（１００％）として、頭の横回り（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）および縦回り（ｖｅｒｔｉｃａｌ）を用いて補正して比較した結果、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の頭回りは正常個体に比べて５８％であることを確認した（図２７）。
このような結果を通して、正常個体と異なり、突出額、閉じていない頭蓋骨縫合、短い鼻の長さ、小さな頭蓋骨および不足な歯を示すので、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタはＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すことを確認した。
５－５．不足な毛の確認
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタがＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すかを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の不足な毛の有無を確認した。
具体的には、生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト個体と正常個体の後頭部側の髪の毛を比較した。
その結果、生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体の著しく不足な毛の数および良くない毛の状態を確認し（図２８）、これを通して、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタはＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すことを確認した。
５－６．軟骨形成不全性小人症、潜伏睾丸および小さい生殖器の確認
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタがＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すかを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の軟骨形成不全性小人症および小さい生殖器の有無を確認した。
具体的には、生後２０日齢または生後３ヶ月齢のＩＧＦ－１ノックアウト個体と正常個体の前足足首の厚さおよび睾丸の大きさを比較した。
その結果、生後３ヶ月齢の正常個体の前足足首の厚さは４２．７５ｃｍであるのに対し、生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体の足首の厚さは２７．１６ｃｍであることを確認した（図２９）。
また、生後２０日頃、生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体では臓器内に睾丸がある潜伏睾丸が観察され（図３０）、生後３ヶ月齢の正常個体の睾丸の大きさは４２．７５ｃｍであるのに対し、生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体の睾丸の大きさは２７．１６ｃｍであることを確認した（図３１）。
このような結果を通して、正常個体とは異なって、軟骨形成不全性小人症が現れ、睾丸発達遅延による思春期遅発症が予測されるので、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタはＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すことを確認した。
５－６．小さい臓器の大きさおよび重量の確認
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタがＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すかを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の臓器の大きさおよび重量を確認した。
具体的には、生後２０日齢の生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体と正常個体の心臓（ｈｅａｒｔ）、肺（ｌｕｎｇ）、肝（ｌｉｖｅｒ）、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓ）、腎臓（ｋｉｄｎｙ）および睾丸（ｔｅｓｔｅｓ）の大きさおよび重量を比較した。
その結果、生後２０日頃の正常個体に比べて生存したＩＧＦ－１ノックアウト個体のすべての臓器が有意に小さいことが確認され、すべての臓器の重量も正常個体に比べて１６～３６％水準の重量を有することが確認された（表６および図３２）。
Figure 0007341230000006
このような結果を通して、正常個体とは異なって、小さい臓器の大きさおよび重量を示すので、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタはＩＧＦ－１ノックアウト表現型を示すことを確認した。
実施例６．形質転換クローンミニブタの性格遺伝子発現の変化の確認
性格遺伝子は過度の親密性／社会性（ｈｙｐｅｒ ｓｏｃｉａｌｉｔｙ）に関する遺伝子であって、ヒトにおけるウィリアムズ・ボイレン（Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｂｅｕｒｅｎ）症侯群で発現が減少していることから、性格に関連していることが確認され、２０１０年のＮａｔｕｒｅジャーナルにイヌとウィリアムズ・ボイレン症侯群を誘発する誘電体との間の類似性が確認されたという内容が発表された。ウィリアムズ・ボイレン症侯群はヒトに過度に親切で、見知らぬヒトに会ってもヒト見知りをしないだけでなく、過度に良い社会性を示すが、低い知能および健康と外貌の障害を伴う場合が多い。
ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタがウィリアムズ・ボイレン症侯群の特徴を示すかを確認するために、ＩＧＦ－１ノックアウト個体の性格遺伝子の発現を分析した。
具体的には、正常個体と圧死したＩＧＦ－１ノックアウト個体の肝組織からｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、下記表７のプローブを用いたことを除けば、実施例４－３の方法と同様の方法で、性格遺伝子であるＥＩＦ４Ｈ、ＣＬＩＰ２、ＥＬＮ、ＬＩＭＫ１およびＲＦＣ２遺伝子の発現を分析した。
Figure 0007341230000007
その結果、正常個体に比べて、ＩＧＦ－１ノックアウト個体で性格遺伝子の発現が大部分減少することを確認した（図３３）。
このような結果を通して、正常個体とは異なって、ＩＧＦ－１ノックアウト形質転換クローンミニブタはウィリアムズ・ボイレン症侯群の特徴を示すことを確認した。
これまで本発明についてその実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現可能であるを理解するであろう。そのため、開示された実施例は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。

Claims (8)

  1. ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子をコードするＤＮＡにハイブリダイズするｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列；
    Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および
    前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター
    を含む組換え発現ベクターであって、前記ｇＲＮＡは、配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列を含むものである、組換え発現ベクター、が導入されたミニブタ小人症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）動物モデル作製用形質転換細胞株を、ヒトを除いた動物から得た脱核卵子に移植して核移植卵を形成するステップと、
    前記核移植卵を、ヒトを除いた動物である代理母の卵管に移植するステップと
    を含むミニブタ小人症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）動物モデルの製造方法であって、
    前記小人症は、ＩＧＦ－１ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）によるものであり、
    前記ノックアウトは、配列番号２に相当する塩基配列が、配列番号６及び配列番号７からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列に突然変異して発生したものである、ミニブタ小人症動物モデルの製造方法。
  2. 前記小人症は、ラロン（Ｌａｒｏｎ）症侯群である、請求項１に記載のミニブタ小人症動物モデルの製造方法。
  3. ＩＧＦ－１（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１）遺伝子突然変異を有するミニブタ小人症動物モデルであって、前記動物モデルは、ＩＧＦ－１遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）されたものであり、前記ノックアウトは、配列番号２に相当する塩基配列が、配列番号６及び配列番号７からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列に突然変異して発生したものである、ＩＧＦ－１遺伝子突然変異を有するミニブタ小人症動物モデル。
  4. 前記動物モデルは、ＥＩＦ４Ｈ、ＣＬＩＰ２、ＥＬＮ、ＬＩＭＫ１およびＲＦＣ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現が減少したものである、請求項３に記載のＩＧＦ－１遺伝子突然変異を有するミニブタ小人症動物モデル。
  5. 前記動物モデルは、ラロン（Ｌａｒｏｎ）症侯群またはウィリアムズ・ボイレン（Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｂｅｕｒｅｎ）症侯群モデル用である、請求項３に記載のＩＧＦ－１遺伝子突然変異を有するミニブタ小人症動物モデル。
  6. 前記ミニブタは、ペット用である、請求項３に記載のＩＧＦ－１遺伝子突然変異を有するミニブタ小人症動物モデル。
  7. 前記ミニブタは、異種臓器移植用である、請求項３に記載のＩＧＦ－１遺伝子突然変異を有するミニブタ小人症動物モデル。
  8. 前記ミニブタは、人工血液開発用である、請求項３に記載のＩＧＦ－１遺伝子突然変異を有するミニブタ小人症動物モデル。
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