KR20090051716A - 개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키는 방법 - Google Patents

개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개과 (Canidae) 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하고 공여핵 세포를 상기 탈핵 난자에 융합시킴으로써 핵 이식란을 제조하여 이를 대리모의 난관에 이식함에 있어서, 상기 공여 핵 세포 배양시에 특정 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가함으로써 복제 개 생산 효율을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 개과 동물을 고효율로 복제할 수 있게 함으로써 우량 품종의 번식, 이종이식, 질환 모델동물 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있다.
복제개, 핵 이식, 세포 주기 동기화, 로스코비틴(Roscovitine)

Description

개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키는 방법{Methods for improvement of birth rates in Canidae on somatic cell nuclear transfer}
본 발명은 개과 (Canidae) 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하고 공여핵 세포를 상기 탈핵 난자에 융합시킴으로써 핵 이식란을 제조하여 이를 대리모의 난관에 이식하는 개과 동물의 복제방법에에 있어서, 상기 공여핵 세포제조시에 로스코비틴 등 특정 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양함으로써 복제된 개과 동물의 생산 효율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
근래에 생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 유용한 작물들을 원하는 형질들로 조합한 다양한 재조합 생명체들의 여러가지 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들이 속속 보고되었다. 복제동물의 생산은 현실적으로 생명공학 분야에서도 실로 고도로 축적된 기술적 뒷받침이 전제된 후에야 비로소 가능한 것이므로, 이러한 점에서 상기 복제동물의 생산은 당해 기술 수준의 척도가 되는 것이다.
그 중 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
일반적으로 체세포 핵이식 기술에서 체세포 공여 핵을 이식할 수핵 난자(recipient oocyte)는 인위적으로 시험관 내(in vitro)에서 배양하여 2차 감수분열 중기까지 도달하도록 성숙시켜 사용한다. 그 다음 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상 발생을 방지하기 위하여 체세포를 이식하기 전에 상기 성숙 난자의 핵을 제거하고 상기 탈핵 난자의 주란강 또는 세포질 내에 체세포를 주입한다. 그 후 상기 탈핵 난자와 주란강 또는 세포질에 주입된 체세포를 전기적 자극을 통하여 물리적으로 융합시키고 전기자극 또는 화학물질에 의하여 활성화시킨 후 대리모에 이식하여 산자를 탄생시킨다.
이러한 체세포 핵 이식 기술은 우량 동물의 번식, 희귀 멸종위기 동물의 보존, 특정영양물질의 생산, 치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포 유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수 있다.
체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577). 한편, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어 개 또는 다른 애완동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다. 최근 애완동물로는 처음으로 고양이가 복제되었으며 수백만 달러의 기금으로 개 복제의 연구가 수행되기도 하였다.
그러나 개의 경우 발정이 오지 않은 암캐의 난소에서 미성숙 난자를 채취하여, 이 난자를 체외에서 성숙 배양하는 것은 매우 어렵다. 이것은 독특한 종-특이적 생식 특성으로 인해 다른 동물에 비해 체세포 핵 이식에 의한 복제가 매우 어려운 이유 중 하나이다. 그럼에도 불구하고 개는 인간과 생리학적 특성이 비슷하고 사람과 동물의 유사한 질병 발생 패턴을 을 가지고 있어 병리학적, 생리학적으로도 유사하며, 실제로 인간 질병연구에 응용할 수 있는 유전 질병의 수가 65개의 돼지나 136개의 고양이와 비교해 개는 224개로 월등히 많아 (http://omia.angis.org.au/) 이러한 유전 형질을 이용하여 인간의 질병모델 복제개를 만들면 인간 질병연구에 큰 도움이 되는 중요한 의미가 있다. 그렇기 때문에 오랜 기간 개복제에 대한 시도가 이루어져왔으나, 현재까지 개 복제는 여전히 성공률이 극히 낮고, 성공하기 어려운 복제로 여겨지고 있으므로, 개과 동물의 복제 효율을 향상시키기 위한 효과적인 방법이 필요한 실정이다
이에 본 발명자들은 체세포 핵이식 방법에 의한 향상된 복제개의 생산방법을 연구하던 중 공여 핵 세포 제조에 있어서, 로스코비틴 등의 특정 물질을 첨가하는 방법에 의하여 고효율로 복제개를 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 체세포 핵이식 기술을 이용한 개과 동물의 핵 이식란 생산방법에 있어서, 개과 동물의 핵 이식란 생산 및 복제 산자 생산방법의 효율을 높이고자 함에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된, 복제된 개과 동물의 핵 이식란을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는, 생산 효율이 향상된 복제된 개과 동물의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 체세포 핵이식 기술을 이용한 개의 핵 이식란 생산방법에 있어서, 공여핵 세포 제조시에 로스코비틴(R-Roscovitine)과 같은 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 과정을 거쳐 특정 주기로 동기화된 공여핵세포를 이용하여 핵 이식란을 제조하는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란 생산방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조된 개과 동물의 핵 이식란을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계 를 포함하는, 생산 효율이 향상된 복제된 개과 동물의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법은 특정 물질에 의해 핵 이식용 공여세포의 세포주기 동기화를 유도하여 개과 동물의 복제에 있어서의 성공적인 핵이식 효율을 향상시킴으로써 우량 품종의 번식, 보존, 이종이식, 질환 모델동물 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식란'은 공여 핵 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동 일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '공여 핵 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '계대배양(Subcultury)' 은 세포는 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양 접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양 접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시키는데 이때 세포를 동물에서 떼어 내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양하는 방법 즉, 주기적으로 새로운 배지를 교환함으로써 세포주를 보존하는 방법을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '수핵 난자'는 탈핵 과정을 통해 본래의 핵이 제거되고 공여 핵 세포로부터 핵을 전달받는 난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '탈핵 난자'는난자의 핵이 제거된 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '융합'은 공여 핵 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 공여 핵 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 공여 핵 세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다. 바람직하게 는, 본 발명에서는 핵 전이 단계 후 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어 '산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.
본 발명에서 '개과 동물(canidae)'은 크게 개족(Tribe Canini)과 여우족(Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066). 본 발명에 있어서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.
본 발명은 일 관점에서 체세포 핵이식 기술에 의한 개과 동물의 핵 이식란 의 생산 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 개과 동물의 핵 이식란 생산방법은
(a) 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;
(b) 개의 조직으로부터 분리한 체세포를 배양시 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는 공여 핵 세포 제조단계;
(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 공여 핵 세포를 미세주입하고 융합시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계를 포함한다.
특히, 상기 개과 동물의 핵 이식란 생산방법 중 (b)단계는, 개의 조직으로부터 분리한 체세포를, 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가하여 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
세포주기 동기화 유도물질이란, 핵분열기(M기)·DNA합성전기(G1기)·DNA합성기(S기)·DNA합성후기(G2기)로 이루어진 세포주기 중 특정한 하나의 세포주기로 세포들을 일시정지 시키는 물질이며, 이 물질을 제거시에 특정주기로 정지된 세포주기가 다시 진행되어지게 된다. 이와 같은 특정 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가함으로써 개과 (canidae) 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시킬 수 있다.
상기 세포 주기 동기화 유도 물질로는 Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 G0/G1기를 블로킹하는 로스코비틴(Roscovitine)(화학식 1); G0/G1기를 블로킹하는 사이클로헥사마이드(Cycloheximide)(화학식 2); G0/G1기를 블로킹하는 디엠에스오 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO)(화학식 3); Cdk 저해제로 G1/S기를 블로킹하는 부티로락톤 I(Butyrolactone I)(화학식 4); DNA 폴리머라아제 A,D의 저해제로 S 초기를 블로킹하는 아피디콜린(Aphidicolin)(화학식 5); 유사분열 중기에서 M기를 블로킹하는 디메콜신(Demecolcine)(화학식 6);DNA 복제 저해제로서 S기를 블로킹하는 미모신(Mimosine)(화학식 7); 미소관 저해제로서 G2/M기를 블로킹하는 콜치신(colchicine)(화학식 8); 및 DNA 토포이소머라아제로서 훽스트 33342(Hoechst 33342)(화학식 9)등이 있고, 각각의 물질에 대한 화학 구조식은 이하와 같다. 바람직하게는 로스코비틴, 사이클로헥사마이드 또는 디엠에스오 (DMSO)이고, 가장 바람직하게는 로스코비틴이다.
[화학식 1]
Figure 112008079785187-PAT00001
[화학식 2]
Figure 112008079785187-PAT00002
[화학식 3]
Figure 112008079785187-PAT00003
[화학식 4]
Figure 112008079785187-PAT00004
[화학식 5]
Figure 112008079785187-PAT00005
[화학식 6]
Figure 112008079785187-PAT00006
[화학식 7]
Figure 112008079785187-PAT00007
[화학식 8]
Figure 112008079785187-PAT00008
[화학식 9]
Figure 112008079785187-PAT00009
본 발명의 일 구체예에서는 개의 조직으로부터 분리한 체세포에 로스코비틴(Roscovitine)을 첨가하여 배양함으로써 공여 핵 세포를 제조할 수 있다. 로스코비틴 첨가 유무에 따른 복제 개의 생산 효율을 비교, 확인해보면, 로스코비틴을 첨가하지 않은 대조군은 임신 성공율이 약 15%에 불과하나, 로스코비틴 처리군은 약 40%의 성공율을 나타내어, 공여 핵 세포 제조시 로스코비틴을 첨가하는 것이 개복제 생산율을 현저히 향상시킴을 알 수 있다. 따라서 본 발명은 상기와 같은 방법으로 제조한 핵 이식란을 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵 이식란을 이용하는 것을 특징으로 하는, 복제된 개과 동물의 생산방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 복제된 개과 동물의 생산방법은
(a) 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;
(b) 개의 조직으로부터 분리한 체세포들에 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는 공여 핵 세포 제조단계;
(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 공여 핵 세포를 미세주입하고 융합시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계
(e) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함한다.
이 때에도 역시, 상기 복제 개과 동물의 생산방법중 (b)단계에 있어서, 개과 (canidae) 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키기 위하여, 개의 조직으로부터 분리한 체세포를 세포 주기 동기화 유도 물질인 로스코비틴(Roscovitine), 사이클로헥사마이드(Cyclohesimide), 디엠에스오 (DMSO), 부티로락톤 I(Butyrolactone I), 아피디콜린(Aphidicolin), 디메콜신(Demecolcine), 미모신(Mimosine), 콜치신(colchicine), 또는 훽스트 33342(Hoechst 33342) 등을 첨가하여 배양함으로써 공여 핵 세포를 제조하는 것을 특징으로 한다. 상기 물질들에 대한 구체적인 설명은 상기와 같다.
본 발명에 따른 개과 동물의 핵 이식란 생산방법 및 복제된 개과 동물의 생산방법에 있어서, 구체적으로 각 단계들을 설명하면 다음과 같다.
제1단계: 수핵 난자의 탈핵
일반적으로 포유동물(예컨대 소, 돼지, 양 등)의 난자는 성숙난자, 즉 제2차 감수분열 중기(metaphase Ⅱ)에 배란되는 것에 반해, 개과 동물의 난자는 다른 동물과는 달리 제1차 감수분열의 전기에 배란되어 난관 내에서 48∼72시간 동안 머물면서 성숙되는 특징이 있다.
수핵 난자는 개과 동물의 미성숙난자, 성숙난자, 초기 노화, 중간노화, 심한 노화 단계의 난자일 수 있다. 바람직하게는, 개에서 회수된 미성숙 난자를 체외에서 성숙시켜 이용하거나 개과 동물의 체내에서 성숙된 난자를 회수하여 이용할 수 있다. 개과 동물의 미성숙 난자는 체외에서의 핵 성숙률이 매우 낮으며, 배란시기 및 번식 생리가 다른 포유동물과는 달라서, 개과 동물의 수핵 난자는 개과 동물의 생체 내에서 성숙된 난자를 회수하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로 개과 동물로부터 성숙 난자의 회수는 개과 동물의 배란이 이루어 진 후 약 48∼72시간째, 보다 바람직하게는 72시간째에 수행하는 것이 바람직하다.
상기에서 개과 동물의 배란일은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 배란일을 결정하는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 질세포 도말검사(vaginal smear), 혈장 성 호르몬 수준 측정 및 초음파 진단 시스템을 사용할 수 있다. 개과 동물의 발정의 시작은 외음부 팽창 및 장액성 혈액의 배출 여부를 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실험 예에서는 개과 동물의 배란일을 질세포 도말검사와 혈장 프로게스테론 농도 검사를 수행함으로써 결정한 결과 무각화 상피 세포가 80%이상 이고 혈장 프로게스테론 농도가 약 4.0ng/mL 이상으로 처음 도달할 때 배란이 이루어짐을 알 수 있었다.
생체 내 성숙 난자를 회수하는 방법으로는 대상 동물을 마취한 후 개복시키는 것을 포함하는 외과적 방법을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 생체 내 성숙 난자의 회수는 당업계에 공지된 방법인 난관 절제법을 사용할 수 있다. 상기 난관 절제법은 난관을 수술적으로 잘라낸 후 배아 수집 배지를 난관 내부에 관류시켜 관류액을 수득하고 상기 관류액으로부터 난자를 회수하는 방법이다.
또한, 생체 내 성숙 난자는 카테터를 난관채에 장착한 후 난관-자궁 접합부위에 주사침을 이용하여 관류액을 주입함으로써 회수할 수 있다. 이 방법은 난관을 손상시키지 않기 때문에 난자를 공여하는 동물을 다음 발정에도 이용할 수 있는 장점이 있다.
성숙한 난자를 회수한 다음에는 난자의 반수체 핵을 제거한다. 난자의 탈핵은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(미국특허 제4994384호, 미국특허 제5057420호, 미국특허 제5945577호, 유럽특허 공개공보 제0930009A1, 대한민국특허 제342437호, Kanda et al, J. Vet. Med. Sci., 57(4):641-646, 1995; Willadsen, Nature, 320:63-65, 1986, Nagashima et al., Mol. Reprod. Dev. 48:339-343 1997; Nagashima et al., J. Reprod Dev 38:37-78, 1992; Prather et al., Biol. Reprod 41:414-418, 1989, Prather et al., J. Exp. Zool. 255:355-358, 1990; Saito et al., Assis Reprod Tech Andro, 259:257-266, 1992; Terlouw et al., Theriogenology 37:309, 1992).
바람직하게는, 수핵 난자의 탈핵은 크게 두 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 방법으로는 성숙한 수핵 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵 난자의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고 이를 통하여 제1극체, 난자의 핵 및 세포질(가능한 적은 양)을 제거한다. 다른 방법으로는 수핵 난자의 난구 세포를 제거한 다음 난자를 염색하고 미세 흡입 피펫(aspiration pipette)을 이용하여 제1극체 및 난자의 핵을 제거한다. 보다 바람직하게는, 난자의 탈핵은 수핵 난자의 상태를 육안으로 평가하여 생존율이 높은 난자에 대해서 흡입 방법을 사용하고, 그렇지 않은 난자에 대해서는 절개창을 형성하는 방법을 사용한다.
제2단계: 공여 핵 세포의 준비
체세포 핵이식 기술에 의한 목적 유전자를 발현하는 형질전환동물의 생산에는 공여 핵 세포가 필요하다. 본 발명에서의 공여 핵 세포로는 개로부터 유래된 체세포를 사용한다. 구체적으로, 본 발명에서 사용된 체세포로는 개의 배아세포(embryonic cell), 태아 유래 세포(fetal derived cells), 유세포(juvenile cell), 성체 유래 세포(adult derived cell), 바람직하게는 성체 유래 세포로부터 수득될 수 있는 난구, 피부, 구강 점막, 혈액, 골수, 간, 폐, 신장, 근육 및 생식기관 등과 같은 형태의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연 골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 체세포로는 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.
공여 핵 세포로서 제공되는 상기 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 상기 표본으로부터 이하와 같은 방법을 사용하여 최적화된 조건으로 배양된 단일세포를 수득할 수 있다.
대상동물로부터 조직의 일부를 채취하여 세포를 분리한 다음 기본 조직 배양용 배지에서 배양한 후 세포주기 동기화 유도 물질을 첨가하여 재배양한 다음 완전히 자라면 트립신을 처리하여 회수한 후 공여 핵 세포로 사용할 수 있다.
본 발명은 복제 개의 생산 효율을 향상시키기 위하여, 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가하는 것을 특징으로 한다. 사용할 수 있는 세포 주기 동기화 유도 물질로는 Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 G0/G1기를 블로킹하는 로스코비틴(Roscovitine); G0/G1기를 블로킹하는 사이클로헥사마이드(Cycloheximide); G0/G1기를 블로킹하는 디엠에스오 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO); Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 G1/S기를 블로킹하는 부티로락톤 I(Butyrolactone I); DNA 폴리머라아제 A,D의 저해제로 S 초기를 블로킹하는 아피디콜린(Aphidicolin); 유사분열 중기에서 M기를 블로킹하는 디메콜신(Demecolcine);DNA 복제 저해제로서 S기를 블로킹하는 미모신(Mimosine); 미소관 저해제로서 G2/M기를 블로킹하는 콜치신(colchicine); 및 DNA 토포이소머라아제로서 훽스트 33342(Hoechst 33342) 등이 있고, 각각의 물질에 대한 화학 구조식은 앞서 설명한 바와 같다. 바람직하게는 로스코비틴, 사이클로헥사마이드, 디엠에스오을 사용하고, 더욱 바람직하게는 로스코비틴을 사용한다.
일 구체예를 들어 설명하면, 우선, 대상동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 조직 배양용 배지에서 배양한다. 상기 조직 배양용 배지로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이 있다.
조직 배양용 배지에서 3-4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 배양한 후 완전히 다 자라면 트립신 처리하여 일부는 추후 사용을 위하여 동결하여 액체 질소에 보관하며, 나머지는 핵 이식에 이용하기 위하여 계속 배양을 실시한다. 계속하여 배양하여 핵이식에 사용할 세포는 새로운 배양접시에서 배양한 후, 트립신 처리하여 세포를 단일세포로 제조한 후 핵이식에 사용한다.
마지막으로, 상기 세포에 로스코비틴을 첨가하여 추가 배양 한 후, 트립신 처리하여 세포를 회수하여 체세포 핵이식을 실시한다. 이 때 첨가하는 로스코비틴의 농도는 바람직하게는 5~30μM, 보다 바람직하게는 10~20μM이며, 배양시간은 바람직하게는 18~72시간, 보다 바람직하게는 24~48시간 동안 배양한다.
일 구체예로서, 새로운 배양접시에서 배양한 후, 세포의 농도가 약 60% 정도 에 달하였을 때 로스코비틴 15μM을 18-24시간 동안 처리한 후, 트립신 처리하여 세포를 단일세포로 제조한 후 핵이식에 사용한다
제3단계: 공여 핵 세포의 미세주입 및 융합 - 핵 이식란의 제조
제1단계에서 준비한 탈핵 난자에 제2단계에서 제조한 공여 핵 세포를 미세주입한다. 이 때, 상기 미세주입은 이식용 피펫을 사용하여 공여 핵 세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입함으로써 수행한다.
공여 핵 세포의 미세주입이 완료된 탈핵 난자는 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 공여 핵 세포와 융합시킨다. 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있다. 특히, 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있으며, 바람직하게는 전압이 2.0∼6.0 kV/cm 조건으로 수행할 수 있으며 보다 바람직하게는 직류전압이 3.0∼5.0 kV/cm 조건으로 10∼30 ㎲ 동안 1∼3 회 수행할 수 있다. 가장 바람직하게는, 전압 3.5∼5.0 kV/cm 조건으로 15㎲ 동안 2회 수행할 수 있다.
상기 전기적 융합시의 전압 범위는 지금까지 알려진 다른 종에서의 일반적인 전기적 융합시의 전압 범위보다 매우 높은 특징이 있다. 이같은 범위는 전기융합의 최적화된 조건으로서, 보다 높은 복제효율로 복제개를 생산할 수 있게 한다.
상기 공여 핵 세포와 난자의 전기적 자극에 의한 융합은 다양한 융합용 배지, 예를 들면 짐머맨 (Zimmerman) 또는 만니톨 등의 내에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 만니톨, MgSO4, 헤페스, BSA가 혼합된 배지를 사용할 수 있다.
탈핵된 난자에 체세포핵 이식을 하고, 전기 융합을 실시한 후, 난자의 핵은 리모델링 과정을 겪게 되는데, 이때 리모델링이 원활하게 잘 일어난 증거로, 전기융합 후 약 1시간이 지나면 융합란에서 조숙 염색체 응축 (premature chromosome condensation) 현상이 일어나게 된다. 그리고, 상기 조숙 염색체 응축 과정을 잘 겪은 융합란이 리모델링과 활성화 후 리프로그래밍까지 잘 일어나게 된다고 알려져 있다.
본 발명의 로스코비틴 등의 세포주기 동기화 유도물질을 처리한 공여 핵 세포를 이식한 경우에는, 그렇지 않은 경우에 비하여 더 높은 비율로 조숙 염색체 응축(premature chromosome condensation, PCC)가 일어나며, 융합란의 활성화 후에도 계속적인 핵의 팽윤과 재응축이 일어나게 된다(본 발명의 실험예 1 참조). 특히, PCC(premature chromosome condensation), NE(nuclear enlargement), NS(nuclear swelling)는 핵이 시간에 지남에 따라 정상적으로 발달할 때, 겪게되는 현상들로(핵 리모델링), 시간의 흐름에 따라서 PCC → NE → NS 의 순서대로 과정을 겪게 되는데, 로스코비틴 등의 세포주기 동기화 유도물질을 처리한 공여 핵 세포를 이식한 복제수정란에서 PCC가 유의하게 더 높은 비율로 일어나는 등 상기 핵 리모델링이 더욱 활성화되어 나타남을 특징으로 한다.
제4단계: 융합된 핵 이식란의 활성화
융합된 핵 이식란의 활성화는 성숙과정에서 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키는 단계이다. 이를 위해서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키타 제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시켜야 한다.
일반적으로 핵 이식란을 활성화하는 방법은 전기적 방법 및 화학적 방법이 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 핵 이식란의 활성화를 위한 방법으로 화학적 방법을 사용할 수 있다.
상기 화학적 방법은 전기적 활성화 방법에 비해 본 발명에 따른 핵 이식란의 활성화를 보다 많이 촉진할 수 있다. 상기에서 화학적 방법으로는 에탄올, 이노시톨 트리포스페이트, 2가 이온(예를 들어 Ca2+ 또는 Sr2+), 미소관 억제제(microtubule inhibitors, 예를 들어 사이토칼라신 B), 2가 이온 이오노포어(ionophore)(예를 들어, Ca2+ 이오노포어 이노마이신), 단백질 키나제 억제제(예를 들어, 6-디메틸아미노퓨린), 단백질 합성 억제제(예를 들어, 사이클로헥시미드), 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate)와 같은 물질을 처리하는 방법이 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 핵 이식란의 활성화를 위한 화학적 방법으로 칼슘 이오노포어와 6-디메틸아미노퓨린을 핵 이식란에 동시에 처리하거나 단계적으로 처리하는 방법을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 칼슘 이오노포어 5∼10μM을 37~39℃에서 3∼6분 동안 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린 1.5mM ~ 2.5mM을 37∼39℃에서 4∼5시간 동안 처리한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상술한 방법에 의해 제조된 개의 핵 이식란에 관한 것이다.
제5단계: 핵 이식란의 대리모 이식 및 산자생산
나아가, 본 발명에 따른 개의 핵 이식란은 대리모에 이식되어 산자를 출생시킴으로써 복제개를 생산하는데 사용될 수 있다.
개의 경우는 체외 배양하지 않고 활성화 후 바로 이식하는데, 상기 이식은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며 바람직하게는 카테터를 사용하여 복제 배아를 이식할 수 있다.
핵 이식란을 이식하여 정상적으로 태아로 발생시킬 수 있는 대리모를 선발한다. 성숙에 도달한 후 자연적 발정을 보인 개 또는 성성숙 전 또는 후의 개에서 인위적 호르몬 처치 등으로 발정이 유발된 개의 발정기 및 배란을 파악하여 이식적기를 선정한다. 일반적으로, 적당한 이식 시기는 핵이식에 사용된 난자를 제공한 난자제공 개와 배란시기가 1-2일 범위 내에서 일치하는 것을 선택할 수 있으며, 바람직하게는 난자제공견이 1일 먼저 배란 된 것, 가장 바람직한 것으로는 동일한 날짜에 배란이 된 것이다. 대리모의 바람직한 발정주기 평가는 프로게스테론 농도를 기준으로 할 수 있다.
핵 이식란의 대리모 이식은 개복 수술에 의하여 대리모의 난관에 이식을 수행한다. 상기 대리모 이식에 있어서 상기 핵 이식란은 1세포기, 즉 바로 만들어진 복제란이거나 2 세포기 또는 4 세포기의 것이 바람직하다. 이를 위해서 상기 핵 이식란의 대리모 이식은 활성화한 후 4시간 이내에 수행하는 것이 바람직하다. 또한 상기 핵 이식란은 대리모가 준비되기 전까지 미네랄 오일이 덮여진 mSOF 25㎕ 미세 유적(microdrop)에서 배양 후 이식할 수 있다.
핵이식란의 이식 후 3주 이후에 초음파 검사를 실시하여 임신여부를 확인한다. 이 후에도 2주일 간격으로 초음파검사를 통하여 임신지속여부 및 태아의 발육상태 등을 확인한다. 태아의 출산은 분만간격이 30분 이상이 지났는데도 산자가 태어나지 않으면 분만을 도와야 하며, 분만 예정일이 지난 경우는 호르몬 제제 주사 또는 제왕절개와 같은 수술방법을 통하여 산자를 생산하게 된다.
본 발명에 따른 복제개의 생산은 종래 극히 낮았던 임신 성공률을 높이는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 방법은 복제 효율이 너무 낮아 실용화가 어려웠던 이전에 공지된 방법의 단점을 개선하여 실질적으로 복제 개를 생산의 효율을 높이는데 적용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:개로부터 수핵 난자의 회수
난자 공여자로 실험에 사용한 개는 1~5년령의 발정주기가 일정하고, 생식기 에 질병이 없는 암캐를 사용하였다. 상기 난자 공여자로 사용한 개들은 서울대학교의 사육관리 기준에 따라 사육하였다. 자연적으로 발정기가 시작된 개를 대상으로 질세포 도말검사(vaginal smear)와 혈청 프로게스테론의 농도를 매일 측정하여 배란일을 결정하고, 배란일로부터 72시간 후에 수술을 실시하여 난자를 회수하였다.
혈청 프로게스테론의 농도는 혈액 3-5ml을 매일 채취하고 원심분리하여 혈청을 수득한 다음 DSL-3900 ACTIVE 프로게스테론 코팅된 튜브 방사선면역 분석 키트(Diagnostic Systems Laboratories, Inc., USA)를 사용하여 분석하였다. 프로게스테론 농도가 4.0 ng/ml 이상에 처음 도달되면 배란일로 간주하였다(Hase et al., J. Vet. Med. Sci., 62:243-248, 2000).
질세포 도말검사는 발정기의 초기 증후가 나타난 날로부터 매일 표본을 수득함으로써 수행하였다. 질세포 표본은 면봉을 외음부로 삽입함으로써 수집하였고 이를 슬라이드 글라스 위에 도말하였다. 그 다음 디프-퀴(Diff-Quik) 염색(International chemical co., Japan)으로 염색한 후 현미경으로 검경하여 표피세포가 상피세포 인덱스(cornified index, Evans J.M. et al., Vet. Rec, 7:598-599, 1970)의 80%이상인 경우를 배란시기로 간주하였다.
본 발명자들은 상술한 방법에 따라 배란시기를 확인한 후 개복술을 통하여 난자 공여자 개로부터 다음과 같은 방법으로 회수하였다.
먼저, 난자 공여자인 암캐에 케타민 HCl(ketamine HCl) 6mg/kg과 자일라진(xylazine) 1mg/kg을 투여하여 마취시키고, 이소플루란(isoflurane)을 흡입 투여 함으로써 마취상태를 유지하였다.
상기 마취된 개의 생식열구(bursal slit)를 통하여 난관의 술 모양의 말단에 접근하고 앞부분이 둥글게 처리된 니들을 삽관하였다. 삽입된 니들을 수술용 봉합사로 고정하였다. 이때 3cm 플라스틱 튜브(직경 2mm) 및 지혈겸자(hemostatic forceps)를 이용한 퀵-릴리즈 장치(quick-release device)를 사용하였다. 그 다음 난관의 도관을 잘 보이게 하기 위하여, 디지털 압력을 난관과 주위의 자궁-난관 접합부의 아랫부분에 가하고, 정맥 내 카테터(24 게이지)를 삽입한 다음 상기 카테터를 통해 10% (v/v) FBS, 2 mM NaHCO3, 5 mg/ml BSA (Invitrogen, Carlsbad, CA)가 첨가된 헤페스-버퍼 조직 배양 배지 표1의 난자 회수용 배지를 관류시켜 난자가 흘러나오도록 하였다.
성분 함량
TCM powder 1L 용 (Gibco 31100-027) 9.9g
P/S 항생제 1%(페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg)
HEPES 완충액 2.38g
FBS 10%(v/v)
NaHCO3 0.1680g
BSA 5mg/L
실시예 2: 수핵 난자의 탈핵
상기 수득한 난자를 표 1의 난자 회수용 배지에 넣고, 히알루로니다제(Sigma, USA)를 반복적으로 피펫팅함으로써 난구세포를 제거하였다. 그 다음 난구세포가 제거된 난자를 5㎍/mL 훽스트(Hoechst 33342)로 5분간 염색하고 형광 도립 현미경을 이용하여 x 200의 배율로 관찰하여 제1극체가 확인된 난자만을 선별하였다.
선별된 난자를 5㎍/mL 사이토칼라신 B가 첨가된 상기 배지(표 1)에 넣고 미세조작장치(micromanipulator, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 탈핵을 수행하였다. 즉, 홀딩 마이크로 피펫(약 150㎛ 직경)으로 수핵 난자를 고정한 후 제1극체와 난자 핵 그리고 일부 세포질(5% 이하)을 흡입 피펫(약 20 μm 직경)을 이용하여 제거하였다. 상기 과정을 거쳐 탈핵된 난자는 10%(v/v) FBS가 첨가된 TCM-199 배지(표 2)에 넣어 보관하였다.
TCM-199 배지
성분 함량
TCM199 liquid 89ml
pyruvic acid 0.0099g
P/S(항생제) 1ml
FBS 10%
실시예 3: 핵 공여세포의 준비
공여 핵 세포로는 개로부터 수득한 성체 섬유아세포를 사용하였다. 이를 위해 먼저 개의 귀 피부 조직을 분리하였다. 상기 귀 피부 조직 단편을 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 3회 세척하고 수술용 칼로 잘게 조각내었다. 상기 조각낸 피부조직을 1mM EDTA가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지(DMEM Life Technologies, Rockville, MD)에 넣고 300 x g로 2분간 원심분리한 후 60mm 플라스틱 배양용 접시(Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)에서 배양하였다.
그 다음 상기 세포를 10%(v/v) FBS, 1mM 글루타민, 25mM NaHCO3 및 1%(v/v) 최소 필수 배지(MEM) 비필수 아미노산 용액(Invitrogen, CA)이 첨가된 DMEM 배지에서 39℃, 5% CO2 및 95% 공기로 가습된 조건으로 3~4일간 배양하였다.
세포가 컨플루언시(confluency)가 될 때까지 배양한 후, 체세포가 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 나머지 세포는 0.1% 트립신 및 0.02% EDTA가 포함된 배지 내에서 1분간 트립신 처리하고 추가 계대를 위해 3개의 새로운 배양접시로 옮기어 4 내지 6일 간격으로 계대배양하였다. 그 다음 80%(v/v) DMEM, 10%(v/v) DMSO 및 10%(v/v) FBS로 이루어진 동결 배지에 넣고 -196℃의 액체 질소에 보관하였다.
체세포 핵 이식을 하기에 앞서, 세포들을 해동하고, 15 uM의 로스코비틴이 첨가된 배양 배지(즉, DMEM + 10% FBS + 15 uM 로스코비틴) 에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 체세포 핵이식시 약 2분 동안 트립신 처리하여 단일층으로부터 세포를 회수하였다.
실시예 4 :체세포 핵이식
상기 실시예 2에서 제조한 탈핵 난자에 상기 실시예 3에서 제조한 공여 핵 세포를 미세주입하였다. 공여 핵 세포는 탈핵 난자의 주란강(perivitellin) 공간으로 다음과 같은 방법으로 미세주입하였다. 미세주입시 정치된 탈핵 난자를 100/mL 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)이 함유된 표1의 배지에 처리하고, 탈핵 난자의 절개창을 고정용 피펫으로 고정한 다음 이식용 피펫을 절개창으로 삽입하여 실시예 3에서 단일세포로 분리된 섬유아세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입하였다.
그 다음 상기 공여 핵 세포-난자 결합체(couplets)를 융합 배지(0.26M 만니톨, 0.1mM MgSO4, 0.5mM 헤페스(HEPES) 및 0.05% BSA)에 넣고, 미세조작장치(Nikon-Narishige, Japan)에 부착되어 있는 평행한 2개의 전극사이에 놓고 전기-세포 융합 장치(Electro-Cell Fusion apparatus) (NEPA GENE Co., Chiba, Japan)로, 전압 4kV/cm 조건으로 15㎲ 동안 2회간 전기적 자극을 가하였다.
전기자극 1시간 후에 공여 핵 세포와 난자 세포질체의 융합을 입체현미경 하(stereomicroscope)에서 관찰하였다. 융합된 수정란을 선별하였고 이를 10%(v/v) FBS가 첨가된 TCM-199(표 2)에서 1.5~4시간 동안 배양하였다.
실시예 5: 핵 이식란의 활성화
상기 실시예 4에서 수득한 핵 이식란을 10μM 아이오노포어(Sigma)가 함유된 mSOF에 넣고 39에서 4분간 배양하여 핵 이식란의 활성화를 유도하였다. 그 다음 상기 핵 이식란을 세척하고 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 mSOF(표 3)에서 4시간 동안 추가로 배양하였다.
상기 핵 이식란은 대리모에 이식하기 전까지 미네랄 오일이 덮여진 mSOF 25 미세유적(microdrop)에서 배양하였다.
mSOF의 조성
성분 농도 부피
NaCl(54.44) 2.900-3.100g/ml Kcl(74.55) 0.2669g KH2PO4 (136.1) 0.0810g Sod Lactate 0.28ml Kanamycin 0.0375g Phenel-Red 0.0050g stock-T 107.7mM(3.14g) 2ml
7.2mM
1.2mM
3.3mM
NaHCO3(84.01) 1.0531g/50ml 0.42124g/20ml Stock-B 25.1mM 2ml
Sod.Pyruvate(110.0) 0.0182g/5ml Stock-C 0.3mM 200㎕
MgCl26H2O(147.0) 0.0996g/10ml Stock-M 0.5mM 200㎕
CaCl22H2O(203.3) 0.2514g/10ml Stock-D 1.71mM 200㎕
Glucose(180) 0.27024g/10ml 1.5mM 200㎕
Glutamine(146.1) 0.14618g/10ml 1mM 200㎕
Citri Acid(192) 0.096g/10ml Stock-CA 0.5mM 200㎕
HEPES(238.3) 0.5958g/10ml Stock-E 2.5mM 200㎕
EAA(Gibco 11051-018) 400㎕
NEAA(Gibco 11140-019) 200㎕
ITS(I-3146) 100㎕
BSA(fatty acid free) 0.1600g
Hyaluronic Acid 0.5mg/ml
1N NaOH
D.W. total 20ml
pH 7.2-7.4 / 삼투압 275-285 / EAA, NEAA는 빛에 민감하므로 주의
실시예 6: 대리모 이식 및 복제개의 생산
상기 실시예 5의 핵 이식란을 발정 동기화된 대리모의 난관에 외과적 수술방법을 사용하여 이식하였다. 이식은 상기에서 핵 이식란을 활성화한 후 4시간 이내에 수행하였다. 대리모로는 질병에 이환되지 않으며 정상적인 발정주기가 반복되며 자궁상태가 정상인 암캐를 사용하였다.
이를 위해 먼저 대리모에 0.1mg/kg 아세프로마진(acepromazine)과 6mg/kg 프로포폴(propofol)을 혈관주사하여 마취시켰고, 2% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입마취상태를 유지하였다. 마취된 개의 수술부위를 무균처리하고 난관을 노출시키기 위해 일반적인 개복수술법에 따라 등배쪽 부위를 절개하였다. 손으로 복강 내를 촉진하여 난소와 난관 및 자궁을 절개창으로 견인하였다. 견인된 난소의 난소간막을 조심스레 다루어 난관의 개구부를 인지하고 1.0ml 튜버큘린(tuberculin) 주사기(Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417)가 장착된 3.5F 톰 캣 카테터(Tom cat catheter, Sherwood, St. Louis, MO)를 난관 내로 넣어 카테터 전방에 충분한 공간을 확보하고 핵 이식란을 주입하였다. 핵 이식란의 주입여부는 현미경을 검경하였다. 복부의 봉합은 흡수성 봉합사를 이용하였고 이후 피부봉합을 실시하였다. 수술 후 감염을 방지하기 위하여 광범위 항생제를 3일간 투여하였다.
임신여부는 대리모에 핵 이식란을 이식한 후 23일째에 7.0 MHZ 리니어-어레이 프로브(linear-array probe)가 장착된 SONOACE 9900 초음파 스캐너(Medison Co. LTD, Korea)를 이용하여 검사하였다. 임신상태는 초기에 임신을 확인한 후 2주마다 초음파로 모니터링하였다. 그 결과, 개에게서 임신 사실을 확인하였고 자연분만을 유도하거나 제왕절개 수술로 복제개를 생산하였다. 생산된 복제개를 도 3 및 도4에 나타내었다.
실험예 1 : 로스코비틴 처리군과 대조군의 비교
로스코비틴을 처리하지 않은 대조군과 로스코비틴을 24시간 처리한 처리구간에, 탈핵된 난자에 미세주입방법을 이용하여 개의 체세포 이식을 실시한 후, 핵의 형성 및 변화에 있어서 차이점을 조사하였다.
그 결과 로스코비틴 처리구가 대조군에 비하여 더 높은 비율로 조숙 염색체 응축(premature chromosome condensation, PCC)가 일어나며, 융합란의 활성화 후에도 계속적인 핵의 팽윤과 재응축이 대조군과 상이하게 차이를 보이며 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과들은 개 난자의 미세주입법을 이용한 핵치환 이후에도 개의 재구축된 복제수정란이 정상적으로 리모델링(remodeling) 될 수 있음을 보여주고 있으며, 대조군에 비하여 처리군이 더 우수하게 발달하는 것을 보여주고 있다. 실제 이러한 핵 리모델링으로 인한 핵의 다양한 형태학적 양상을 표 4 및 도 1에 나타내었다.
하기 표 4는 로스코비틴을 처리한 처리군과 대조군 간의 탈핵된 난자에 체세포를 이식한 후 재구축된 난자의 핵 리모델링을 관찰한 결과이다. PCC, NE, NS는 핵이 시간에 지남에 따라 정상적으로 발달하는데 겪게되는 현상들로, 시간의 흐름에 따라서 PCC → NE → NS 의 순서대로 과정을 겪게 되는데, 전기 융합후 1시간째, 대조군에 비하여 처리군에서 PCC가 유의하게 더 높은 비율로 일어나있는 것을 확인하였다. 그리고 융합란의 활성화 후 4시간째, 핵의 팽윤 (NS)이 처리군에서 더 많이 발생되는 것이 확인되었다.
시간 (hpf/hpa) 처리 핵이식란 수 재구축된난자 수 재구축된 난자에 대하여
IN (%) PCC (%) NE (%) NS (%)
1 hpf 대조군 32 27 24(88.8±7.9) 3(11.1±7.9) 0 0
실험군 39 34 11(32.3±7.0) 23(67.6±7.0) 0 0
4 hpa 대조군 36 30 0 2(6.6±3.7) 17(56.6±8.4) 11(36.6±8.5)
실험군 45 38 0 1(2.6±3.3) 9(23.6±7.5) 28(73.6±7.5)
(hpf = hour post fusion; hpa = hour post activation; IN = intact nucleus; PCC = premature chromosome condensation; NE = nuclear enlargement; NS = nuclear swelling. (P < 0.05))
다음으로, 본 발명의 방법에 따라 로스코비틴을 처리한 공여 핵 세포와 그에 대한 대조군으로 로스코비틴을 처리하지 않고 배양한 공여 핵 세포를 사용하여 체세포 핵이식을 실시한 후 각 그룹의 임신율을 조사하였다.
그 결과, 대조군에서는 체세포 핵이식한 478 개의 배아를 26 마리의 대리모에 이식하였으며, 그 중 4 마리가 임신이 되었다 (15.3%,임신 대리모수/총 대리모수). 로스코비틴 처리군에서는 체세포 핵이식 후 556 개의 배아를 29마리의 대리모에 이식하였으며, 그 중 11 마리가 임신에 성공하였다 (37.9%,임신 대리모수/총 대리모수).
이 결과로 볼 때, 로스코비틴 처리 후 체세포 이식한 경우에 임신율이 매우 유의미하게 향상되었음을 확인할 수 있었다.
세포의 처리 이식한 배아수 대리모수 임신수 임신율 (대리모 기준) 임신율 (이식한 배아 기준)
대조군 478 26 4 15.38% 1.040%
로스코비틴 처리군 556 29 11 39.93% 3.95%
도 1은 로스코비틴이 처리된 핵공여세포로 제작된 복제 수정란의 핵 리모델링을 나타내는 사진이며, 흰색 화살표가 다양한 단계의 핵 모양을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 복제 생산된 리트리버 7마리의 1개월령의 사진(a)과, 4개월령때의 사진(b), 그리고 체세포 핵 공여 견의 사진(C)이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 생산된 4마리의 암탐지견(a)과, 5마리의 복제된 피플 테리어(b)의 사진이다.

Claims (12)

  1. 탈핵난자를 제조하는 단계; 공여 핵 세포를 제조하는 단계; 상기 공여 핵세포의 미세주입 및 전기융합 단계; 및 융합된 난자의 활성화 단계를 포함하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법에 있어서,
    상기 공여핵 세포를 제조하는 단계는, 로스코비틴(Roscovitine), 사이클로헥사마이드(Cyclohesimide), 디엠에스오 (DMSO), 부티로락톤 I(Butyrolactone I), 아피디콜린(Aphidicolin), 디메콜신(Demecolcine), 미모신(Mimosine), 콜치신(colchicine) 및 훽스트 33342(Hoechst 33342)으로 구성된 군에서 선택되는 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 주기 동기화 유도물질은 로스코비틴인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 주기 동기화 유도물질은 5 ~ 30μM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 공정은 18 ~ 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 성체 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포 또는 난구세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법.
  7. 탈핵난자를 제조하는 단계; 공여 핵 세포를 제조하는 단계; 상기 공여 핵세포의 미세주입 및 전기융합 단계; 융합된 난자의 활성화 단계; 및 상기 융합된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 복제된 개과 동물의 생산방법에 있어서,
    상기 공여핵 세포를 제조하는 단계는, 로스코비틴(Roscovitine), 사이클로헥사마이드(Cyclohesimide), 디엠에스오 (DMSO), 부티로락톤 I(Butyrolactone I), 아피디콜린(Aphidicolin), 디메콜신(Demecolcine), 미모신(Mimosine), 콜치신(colchicine) 및 훽스트 33342(Hoechst 33342)으로 구성된 군에서 선택되는 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포 주기 동기화 유도물질은 로스코비틴인 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 세포 주기 동기화 유도물질은 5 ~ 30μM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 공정은 18 ~ 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 성체 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포 또는 난구세포인 것을 특징으로 하는 복제된 개과 동물의 생산방법.
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