JP2010520751A - 乾癬のブタモデル - Google Patents
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Abstract
fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタも開示される。本発明はさらに、改変ブタの製造方法、乾癬の治療的処置における応答の評価方法、医薬品組成物の有効性のスクリーニング方法、並びに乾癬に罹患しているヒトの治療方法が開示される。
Description
raised areas)を特徴とする慢性的な皮膚の状態である。鱗屑形成は、皮膚の外層中の細胞が正常より速く再生し、皮膚表面に積み重なる場合に起こる。その結果として、皮膚は3日〜4日毎に剥げ落ちる。最もしばしば、肘、膝、頭皮、又は生殖器領域の皮膚が、乾癬に侵される。さらに、爪の変化は一般的であり、真菌感染に似た点食(pitting)及び黄色っぽい変色を含む。乾癬は、抜け毛を引き起こす場合もある。
L, Florin L, Hummerich L, Mehic D, Scheuch H, Angel P, Tschachler E, Wagner E.
Psoriasis-like skin disease and arthritis caused by inducible epidermal
deletion of Jun proteins. Nature. 2005; 437 (7057): 369-75)。
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタに関する。
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚盤胞;及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胚盤胞
に関する。
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚;及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胚に関する。
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胎仔;及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胎仔に関する。
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核;及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核に関する。
i)修飾透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程:
ii)卵母細胞を少なくとも2つの部分に分離し、核を有する卵母細胞及び少なくとも1つの細胞質体を得る工程、
iii)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、
iv)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核(membrane surrounded cell nucleus)と融合する工程、
v)再構築胚(reconstructed embryo)を得る工程、
vi)胚を形成するように再構築胚を活性化し、上記胚を培養する工程、及び
vii)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程
を含む核移植により得られる上記の遺伝子改変ブタモデル、ブタ胚盤胞、胚、胎仔及び/又はドナー細胞に関し、
この場合、核移植により得られる上記遺伝子改変胚は工程i)〜工程v)及び/又は工程vi)を含み、核移植により得られる上記遺伝子改変胚盤胞は工程i)〜工程vi)及び/又は工程vii)を含み、核移植により得られる上記遺伝子改変胎仔は工程i)〜工程vii)を含む。
i)少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、
ii)卵母細胞を少なくとも3つの部分に分離し、少なくとも1つの細胞質体を得る工程、
iii)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、
iv)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、
v)再構築胚を得る工程、
vi)胚を形成するように再構築胚を活性化し、上記胚を培養する工程、及び
vii)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程
を含む、乾癬のモデルとしてのトランスジェニックブタ、ブタ胚盤胞、胚、胎仔及び/又はドナー細胞を製造する方法に関し、
この場合、上記トランスジェニック胚は工程i)〜工程v)及び/又は工程vi)を含み、上記トランスジェニック胚盤胞は工程i)〜工程vi)及び/又は工程vii)を含み、上記トランスジェニック胎仔は工程i)〜工程vii)を含む。
domesticus種であって、ランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズ メイシャン、バークシャー及びピエトラン、並びにその任意の組合せから成る群から選択されるブタに関する。
i)本発明のブタモデルを用意する工程、
ii)上記表現型に効果を発揮する医薬品組成物で上記ブタモデルを処置する工程、及び
iii)観察された効果を評価する工程を含む方法に関する。
i)本発明のブタモデルを用意する工程、
ii)上記遺伝的決定因子を上記ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、
iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を上記ブタモデルに投与する工程、及び
iv)ブタモデルにおいて遺伝的決定因子を発現することにより発揮される表現型に及ぼす医薬品組成物の効果(もしあれば)を評価する工程
を含む方法に関する。
i)本発明のブタモデルを用意する工程、
ii)上記遺伝的決定因子を上記ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、
iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を上記ブタモデルに投与する工程、
iv)観察された効果を評価する工程、並びに
v)ブタモデルで観察された効果に基づいて乾癬に罹患している上記ヒトを治療する工程
を含む方法に関する。
「トランスジェニック」ブタ及び「遺伝子改変」ブタという用語は、本明細書中では同一の意味で用いられる。
メイシャン、バークシャー及びピエトランから成る群、例えばランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー及びデュロックから成る群、例えばランドレース、デュロック及びチャイニーズ
メイシャンから成る群、例えばバークシャー、ピエトラン、ランドレース及びチャイニーズ メイシャンから成る群、例えばランドレース及びチャイニーズ メイシャンから成る群から選択され得る。一実施形態では、ブタはミニブタではない。別の実施形態では、本発明のブタは近交系ブタである。
改変は、細胞核移植前に体細胞に導入される。しかしながら、別の実施形態では、例えばハンドメイドクローニング(HMC)手法の異なる工程でのトランスジーンの付加により(これはその後、胚のゲノムにたどり着く)、改変は細胞核移植過程中にも導入され得る。
fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1に関する。
et al J Cell biol 1996、Kaiser et al J Invest Dermatol
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al Derm Symp Proc 2005、Li et al EMBO 2004)、CD18ハイポ(Bullard et al PNAS 1996、Barlow et al Am J pathol 2003)、K14-Cre-IIKK2
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機能的等価物及びバリアントは、本明細書中では互換的に用いられる。本発明の好ましい一実施形態では、本明細書中に記載されるヒト及び/又はブタのPPARδ遺伝子及び/又はIκB-α遺伝子のバリアント並びにその断片のバリアント、及び/又は任意のその他のトランスジーンも提供される。ポリペプチドである場合、バリアントは、予定アミノ酸配列(predetermined amino acid sequence)(即ち配列番号4及び/又は配列番号6)とそれらとの同一性若しくは相同性の程度に基づいて決定され、又はバリアントが断片である場合は、それぞれ上記アミノ酸配列のいずれかの断片である。
fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1は、本発明の範囲内である。
(1981) Adv. Appl. Math. 2: 482の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman
and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444の類似性検索メソッドにより、以下のアルゴリズムのコンピューターによる実行により(GAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA;
Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.によるWisconsin Genetics Software Package Release 7.0に含まれる)、又は精査により実行され得るし、種々の方法により生成される最良のアラインメント(すなわち、比較ウインドウ内での相同性の百分率が最高であるもの)が選択される。
乾癬に関連した表現型は、多数存在する。本発明のブタモデルは乾癬に関連した少なくとも1種類の表現型、例えば乾癬に関連した3種類、例えば4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類又は20種類の表現型を発現する、と理解される。
fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIGのうちの1つ又は複数を過剰発現するブタは、JunB/c-Jun、IL-1Ra、ILK-1Ra、CD18、及び/又はLIG2のようなトランスジーンの少なくとも1つの欠失、突然変異及び/又は抑制を保有するブタと交雑され得る。
本発明の改変ブタ胚、胚盤胞、胎仔、ドナー細胞及び/又は細胞核は、改変した遺伝物質、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部がドナー細胞から例えば除核卵母細胞のような宿主細胞に移されるいずれかの技法を使用して、製造され得る。例えばマイクロインジェクションにより、又は核移植により、遺伝子改変体細胞から除核卵母細胞に遺伝物質を導入するといったような多数の技法が存在する。本発明は、或る細胞からの核DNA全てを除核細胞に導入することを指す核移植によりブタをクローニングするための改良型手法を提供する。
この場合、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚は工程a)〜工程e)及び/又は工程f)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚盤胞は工程a)〜工程e)及び/又は工程f)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胎仔は工程a)〜工程g)を含む。
この場合、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚は工程a)〜工程e)及び/又は工程f)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚盤胞は工程a)〜工程e)及び/又は工程f)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胎仔は工程a)〜工程g)を含む。
本発明による「卵母細胞」という用語は、未成熟雌生殖細胞、すなわち、卵子(配偶子)を形成するための成熟過程を完了していないものを意味する。本発明において、除核卵母細胞は、核移植過程におけるレシピエント細胞である。
本発明によれば、再構築胚(すなわち単細胞胚)は、ドナー細胞の遺伝物質を含有する。その後、再構築胚は、有糸分裂の開始後、進行的に多細胞胚に分裂する。インビトロでは、有糸分裂の開始は本明細書中に記載されるような活性化により誘導されるのが典型的である。
cavity)が形成される。この段階で、胚は「胚盤胞」と呼ばれる。移植するのが容易である時点である発生段階の「受精」卵母細胞は、桑実胚から形成され、内部細胞塊、内部空洞、及び栄養外胚葉細胞と呼ばれる細胞の外層から成る。
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-1IKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタに関する。
核が除去された卵母細胞又は卵母細胞の一部。
本発明の「ドナー細胞」という用語は、体細胞、及び/又は生殖系由来の細胞を意味する。
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核に関する。改変ドナー細胞は本明細書中の他の箇所に記載される任意の型の組織であり得るが、好ましいドナー細胞はブタ線維芽細胞である、と理解される。
ドナー細胞は、当業者に既知の標準的な方法のいずれかにより遺伝的に改変され得る。遺伝子改変は、欠失、挿入、重複及び/又はその他の形態の突然変異、例えば点突然変異によるゲノムDNAの改変であり得る。改変は、コード配列及び/又は非コード配列中になされ得る。挿入のためのDNAコンストラクトは、対象の遺伝子及び/又は調節配列、例えばプロモーター、インシュレーター、エンハンサー、リプレッサー又はリボソーム進入部位を保有し得る。
et al. (2002) Gene Ther. 9: 118及びSorensen et al. (2005)
J. Mol. Med. 83: 39に記載されている。
a)哺乳動物細胞を用意する工程、b)トランスポゼースを発現するプラスミドと、DNAトランスポゾンコンストラクト並びに(i)FRT組換え部位、及び(ii)IRESで駆動される選択遺伝子を含むバイシストロン性遺伝子カセットから成る組換え標的ベクターとで、a)の細胞をトランスフェクションする工程、c)SBタグをつけた細胞を選択する工程。
卵母細胞の除核方法は、吸引、物理的除去、DNA特異的蛍光色素の使用、紫外線への曝露、及び/又は化学的に促進される除核から成る方法の群から選択され得る。一実施形態では、本発明はDNA特異的蛍光色素の使用に関する。
透明帯は、卵母細胞を取り囲む均一の厚い透明な非細胞層又は外被である。
「再構築胚」という用語は、除核卵母細胞中へのドナー細胞又はドナー細胞の核の挿入により形成される細胞を意味し、正常受精における受精卵に対応するものである。しかしながら「再構築胚」という用語は、「再構成細胞」とも呼ばれる。本発明において、ドナー細胞は体細胞である。しかしながらドナー細胞は生殖系細胞由来でもあり得る。
ドナー細胞から少なくとも細胞質体へのドナー細胞又は膜包囲核の移入は、本発明によれば、融合により実施される。下記の筋書きでは、「ドナー細胞」という用語は、ドナー細胞由来の膜包囲核も指す。融合は、いくつかの方法により達成され得る。
好ましい一実施形態では、ドナー細胞の核にそのゲノムをリセットさせ、そして除核細胞質体中の新規の周囲環境における分化全能性を獲得させるため、再構築胚は、活性化の前の或る期間、静止させられ得る。再構築胚は、例えば活性化前に1時間静止し得る。
本発明の一側面は、胚のインビトロ培養方法に関し、これにより胚盤胞率は25.3%に増大した。したがって再構築胚の培養方法であって、a)透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、b)卵母細胞を少なくとも2つの部分に分離し、核を含む卵母細胞及び少なくとも1つの細胞質体を得る工程、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、d)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、e)再構築胚を得る工程、f)胚を形成するように再構築胚を活性化する工程、並びにe)上記胚を培養する工程を包含する、再構築胚の培養方法は、本発明の範囲内である。
一実施形態では、本発明の動物はヒト又は他の動物、同一種の動物又は他の種の動物のいずれかの器官又は組織提供のための供給源として用いられ得る。種間の移植は、通常は異種移植と呼ばれる。移植され得る全体器官としては、心臓、腎臓、肝臓、膵臓又は肺が挙げられる。代替的には、器官の一部、例えば特定器官組織が、ヒト又は他の動物に移植又は移入され得る。さらなる一実施形態では、本発明の動物由来の個々の細胞又は個々の細胞の集団が、治療目的のためにヒト又は別の動物に移入され得る。
「凍結保存」という用語は、本明細書中で用いる場合、本発明の卵母細胞、細胞質体、細胞、胚又はブタのガラス化(vitrification)を指し得る。凍結保存に用いられる温度は、好ましくは-80℃より低い温度、さらに好ましくは-196℃より低い温度である。本発明の卵母細胞、細胞及び胚は、不定量の時間、凍結保存され得る。生物学的材料は50年より長い間、凍結保存され得る、ということが知られている。
本発明により獲得可能な遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び/又は非ヒト胚の組織の細胞は、異なる母系起源のミトコンドリアを保有し得る。好ましい一実施形態では、非ヒト哺乳動物及び/又は非ヒト胚は、1つだけの母系起源からのミトコンドリアを保有し得る。しかしながら別の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物及び/又は非ヒト胚は、少なくとも2つの母系起源、例えば3つの母系起源、例えば4つの母系起源、例えば5つの母系起源、例えば6つの母系起源、例えば7つの母系起源、例えば8つの母系起源、例えば9つの母系起源、例えば10個の母系起源からのミトコンドリアを保有し得る。特定数の母系起源を有するという可能性は、観察されるミトコンドリアの型に基づいて算定され得る。
乾癬に罹患している患者に施される治療は様々であるが、これは或る型の治療の有効性が患者によって異なるという事実のためである。施される治療は、乾癬の型、位置、程度及び重症度によって変わる。
異常表皮増殖及び分化は、炎症性皮膚疾患である乾癬の特徴である。乾癬性ヒト表皮は、調節遺伝子PPAR-δ及びNFκBに関して均衡が失われている。IκB-αのドミナントネガティブバリアントの発現によるNFκBの下向き調節、及びPPAR-δの上向き調節は、本明細書中の他の箇所に記載されるような組込み部位を含む、タグをつけた線維芽細胞中への上記遺伝子の組込みにより得られる。したがって乾癬様調節不全を有するブタ表皮組織は、本発明のブタモデルで試験され得る。
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SB転位(4〜8)及びFlp組換え(9、10)についての十分に説明されたメカニズムに基づいて、本発明は、ゲノム中への部位特異的組込みのための新規の標的ベクターを開示する。このベクターは、SBトランスポゾンベクターのコンテクスト内で、(i)eGFPのコード配列中に埋め込まれるFRT組換え部位、及び(ii)IRESで駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含有するバイシストロン性遺伝子カセットを保有する。SBタグをつけたゲノム遺伝子座中への効率的な選択的プラスミド挿入を、本発明者らは実証する。これらのベクターの性能をさらに改善するための一つの試みにおいて、SBベクターのコンテクスト内で、転写的サイレンシングに対して挿入外来遺伝子を保護すると考えられるインシュレーターエレメントの作用を、本発明者らは分析した。FRT遺伝子発現カセットの側面に位置するインシュレーターは、Flp挿入トランスジーンの遺伝子発現を維持及び安定化するのに役立ち得る、ということを本発明者らの研究は示す。
この試験に用いられるSBトランスポゾンベースのベクターは、pSBT/SV40-GFIP.loxPベクターから得られた。このベクターは、SBトランスポゾンのコンテクスト内で、上流はATG開始コドンにより、そして下流はポリA配列により挟まれたバイシストロン性FRTeGFP-IRES-puro(GFIP)カセットを含有する。さらに、ベクターの上方逆方向反復(inverted repeat)とFRTeGFP-IRES-puroカセットの発現を駆動するSV40プロモーターとの間に位置するCreリコンビネース(loxP)認識部位を、該ベクターは含有する。
pSBT/RSV-GFIPベクターは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)由来のプロモーターにより駆動されるFRT-GFP.IRES.puroバイシストロン性遺伝子カセット、及びそれを挟むSB DNAトランスポゾンの末端逆方向反復を含有する。eGEP配列は、48bpのFRT配列を含有する順方向プライマーを用いてpeGFP.N1(Clontech)から増幅された。FRT-GFPの機能性を分析するために、FRT-eGFP融合物を、SV40プロモーターを含有する発現ベクター中に挿入した。FRTタグをつけたeGFP融合遺伝子を含有するPCR断片をMluI及びXmaIで消化し、MluI/XmaI消化pSBT/RSV-hAAT(参考文献(8)におけるpT/hAAT、Mark
Kay, Stanford University, USAから入手)中に挿入して、RSVに駆動されるeGFP発現を伴うトランスポゾンベクターを生じた(pSBT/RSV-eGFP)。IRES-puroカセットをpecoenv-IRES-puro(Finn Skou Pedersen, University of Aarhus, Denmarkにより提供された)からPCR増幅し、XmaIで消化し、XmaI消化pSBT/RSV-eGFP中に挿入して、pSBT/RSV-GFIPを生じた(図2参照)。SV40プロモーター(pSBT/SV40-GFIP)及びヒトユビキチン遺伝子由来のプロモーター(pSBT/Ubi-GFIP)を含有するこのベクターの代替的バージョンを生成した。さらに、トランスポゾンの左逆方向反復とpSBT/SV40-GFIPのSV40プロモーターとの間に位置するMluI部位にCre組換え標的部位(loxP)を挿入することにより、ベクターpSBT/SV40-GFIP.loxPを作製した。開始コドンを伴わないFRT-hygro融合遺伝子を含有するドナープラスミドpcDNA5/FRTは、Invitrogenから入手した。FlpコードプラスミドであるpCMV-Flpは、A. Francis Stewart (University of California San Francisco, USA)から入手した。このプラスミドは、Flpx9と呼ばれる強化Flpバリアントをコード化する(11)。ニワトリ1.2kbデオキシリボヌクレアーゼ高感受性部位4(cHS4)由来インシュレーターエレメント(12、13)の2つのコピーを含有するSBベクターは、PCR増幅cHS4配列及び介在リンカーをNotI/SpeI消化pSBT/PGK-puro(Mark Kay(米国スタンフォード大学)から入手)中に挿入することにより、生成した。リンカー中に位置する制限部位を用いることによりPGK-puroカセットをコンストラクト中にクローン化し戻して、pSBT/cHS4.PGK-puro.cHS4を生成した。
1.5μgのpSBT/lox.RSV-GFIP.loxP257(又はpSBT/PGK-puro)を1.5μgのpCMV-SB(又はネガティブコントロールとしての1.5μgのpCMV-mSB)と同時導入する(Roche製Fugene-6を用いる)ことにより、SBトランスポゾンベクター(SBT/PGK-puro又は標的トランスポゾンSBT/loxP.RSV-GFIP.loxP257のいずれか)をブタ線維芽細胞のゲノム中に挿入した。pCMV-SB(権利は、Perry Hackett, University of Minnesota, Minnesota, USAが保持)は、サケ科魚類の化石DNA転位因子から再構築されたスリーピングビューティートランスポゼースをコード化する。pCMV-SB、pCMV-mSB及び機能亢進性バリアントpCMV-HSB3は、Mark Kay(米国スタンフォード大学)から入手した。SBタグをつけた細胞クローンは、ピューロマイシン(0.5μg/ml)によりトランスフェクトした細胞を選択する結果として出現した。コロニーを固定し、メタノール中のメチレンブルーで染色して、その後、計数した。
SBは、ほとんどの哺乳動物細胞において効率的に転位するが、ヒト細胞においては、マウス細胞よりも高い有効性を有する。SBベクターの転位はブタ細胞では分析されていなかったので、したがって、ブタ一次線維芽細胞における活性を本発明者らが最初に試験した。ピューロマイシン耐性遺伝子をコード化する標準トランスポゾン(SBT/PGK-puro)を利用したところ、適切なレベルの転位が見出され、pSBT/PGK-puro及びpCMV-SBで同時導入された線維芽細胞の培養液中に約75個の薬剤耐性コロニーが生じた(図3)。pSBT/PGK-puro及びpCMV-mSB(後者はトランスポゼースの不活性バージョンをコード化する)でのトランスフェクション後には3個未満のコロニーしか出現しなかった。興味深いことに、機能亢進性トランスポゼースバリアントHSB3を用いるとほぼ140個にも及ぶ平均コロニー数が得られ、これは、HSB3が、ブタ細胞においても、元のSBトランスポゼースと比較してより高レベルの転位を媒介するということを示す。
部位特異的遺伝子挿入のためのFlp組換え標的部位を含有するSBタグをつけた細胞クローンを生成するために、pSBT/loxP.SV40-lopP257プラスミドと共にpCMV-mSB、pCMV-SB及びpCMV-HSB3をそれぞれ同時導入した。HSB3は再び最高活性を示し、3×104個の線維芽細胞のトランスフェクション後に約30個の薬剤耐性コロニーを生じた(図4)。
組織培養液におけるブタ一次線維芽細胞の長期的成長の制限のため、ブタ線維芽細胞におけるFRTタグをつけたSBベクターへのFlpベースの遺伝子挿入を実証することができなかった。したがって、本発明者らは、HEK-293細胞中で実行される標準的な一連の組換え実験によりFRT含有ベクターの機能性を試験することを選択した。本発明者らは、転位されたSBT/loxP.SV40-GFIP.loxP257ベクターを含有するHEK-293細胞のクローンを生成した。(i)FRT-hygo融合遺伝子及び赤色蛍光タンパク質(RFP)発現カセットを含有するpcDNA5/FRT由来基質プラスミド、並びに(ii)Flpリコンビネースをコード化するプラスミド(pCMV-Flpx9)によるこのような細胞クローンへの同時トランスフェクションにより、本発明者らはハイグロマイシンB耐性クローンをその後同定した。蛍光顕微鏡により、部位特異的に工学処理されたクローンが、予測どおり、eGFP発現を止め、そしてRFP発現を作動する、ということを本発明者らは観察した(データは示されていない)。この「緑色から赤色への」表現型変化は、組込まれたSB由来標的ベクターがFlpベースの組換えのためのアクセプター部位として役立つ、ということを示す。
別記する場合を除いて、化学物質は全て、Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)から入手した。
卵丘-卵母細胞複合体(COC)は、食肉処理場から得られた成熟雌ブタ又は若い雌ブタ卵巣からの2mm〜6mmの卵胞から吸引した。加湿空気中で5%CO2で、41時間〜44時間、「サブマリンインキュベーション系(Submarine Incubation System)」(SIS、Vajta, et al. 1997)において、38.5℃で、10%(v/v)ウシ血清(CS)、10%(v/v)ブタ卵胞液、10IU/mlのeCG、5IU/mlのhCG(Suigonan Vet; Skovlunde, Denmark)を添加した重炭酸塩緩衝TCM-199(GIBCO BRL)400μl中で50個の群において成熟させた。
IVF実験は3回の同一反復実験で、インビトロ成熟卵母細胞を用いて実施した。成熟後、2mMのカフェインを含有するmTBM(mTBMfert)でCOCを2回洗浄し、50個の群で400μlのmTBMfertに移した。新たに射出された精液を、前に記載されたように処理した(Booth, et al.、近刊)。38.5℃で、加湿空気中の5%CO2中で2時間受精能獲得後、1×105個の精子/mlという調整最終濃度で精子を卵母細胞に付加した。SISで加湿空気中の5%CO2中で3時間、38.5℃で受精を実施した。精液注入後、予定接合子をmTBMfert中でボルテックスして卵丘細胞を除去した後、IVC培地中で洗浄し、培養皿中に入れた(「胚培養及び評価」参照)。
適用されたHMC法は、ウシ及びブタにおける本発明者らの以前の研究を基礎にした(Kragh, et al., 2004、Peura and Vajta, 2003、Vajta, et al., 2003)が、有意の変法も加えられた。簡約すると、成熟の開始後41時間で、Hepes緩衝TCM199中の1mg/mlヒアルロニダーゼ中で反復ピペッティングすることにより、COCの卵丘外被を除去した。この時点から(別記する場合を除いて)、39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施し、そして卵母細胞を取り扱うために用いられる滴量は全て、ミネラルオイルで被覆された20μl容量であった。T33(TはHepes緩衝TCM199培地を意味し、数字はCSサプリメントの百分率(v/v)を意味する、ここでは33%)中に溶解した3.3mg/mlのプロナーゼ中で短時間(5秒間)、卵母細胞をインキュベートした。卵母細胞がプロナーゼ溶液中で形を崩し始める前に、それらを摘み出し、T2滴及びT20滴中で迅速に洗浄した。一部消化されているが、依然として目に見える帯を有する卵母細胞を、3mg/mlのポリビニルアルコール(TPVA)及び2.5μg/mlのサイトカラシンBを添加したT2の滴中に整列させた。ウルトラ・シャープ・スプリッティング・ブレード(AB
Technology, Pullman, WA, USA、図6a)を用いて、立体顕微鏡制御下で、手動で二分割の代わりに三分割した。三分割卵母細胞の断片を収集し、TPVA滴中の5μg/mlHoechst33342蛍光色素で5分間染色し、次に、オイルで被覆した60mmのFalconペトリ皿の底の1μl滴のTPVA培地中に入れた(3〜4断片/滴)。倒立顕微鏡及びUV光を用いて、クロマチン染色なしの断片(細胞質体)の位置を登録し、その後、融合の開始まで、T10滴中で立体顕微鏡下で収集した。
単為生殖的活性化卵母細胞は、HMCと別々に、又は平行して、産生された。透明帯を完全に除去させるためにプロナーゼ中でのインキュベーションがより長時間であったということを除いて、上記と同様にして卵母細胞を裸出した。次に無帯(zona free: ZF)卵母細胞を、活性化培地(0.3Mのマンニトール、0.1mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2及び0.01%PVA)中で10秒間平衡させて、融合チャンバー(BTXマイクロスライド0.5mm融合チャンバー、モデル450、BTX, SanDiego, CA, USA)に移した。0.85KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを、BLS CF-150/B細胞融合機(BLS, Budapest, Hungary)で生成し、ZF卵母細胞に印加した。無傷帯(zona intact: ZI)卵母細胞に関しては、1.25KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを用いた(本発明者らの未発表予備実験によれば、これらのパラメーターは、ZI卵母細胞及びZF卵母細胞それぞれに関して最高の活性化、及びその後のインビトロ発生を与えた)。電気パルス後の手順は、HMC再構築胚に関するものと同一であった。
上記の処理により産生されるブタ胚は全て、4mg/mlのBSAを含有する改変NCSU37培地(Kikuchi, et al., 2002)中で、5%O2、5%CO2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で培養した。0日目(受精及び活性化の当日)から2日目までは0.17mMのピルビン酸ナトリウム及び2.73mMの乳酸ナトリウムを、次に2日目から7日目までは乳酸ナトリウム及びピルビン酸ナトリウムを5.5mMのグルコースに取り替えて、培地に補充した。ZF胚は全て、上記で用いたものと同一培養培地及びガス混合物中で、WOW系(Vajta, et al., 2000)で培養し、WOWから胚を取り出すことなく2日目に注意深く培地を変えた。胚盤胞率を、7日目に登録した。総細胞数を確定するために、胚盤胞を固定し、20μg/μlのHoechst33342蛍光色素を含有するグリセロール中で顕微鏡スライドガラス上に載せた。24時間染色後、エピフルオレッセンスアタッチメント及びUV-2Aフィルターを備えたDiaphot200倒立顕微鏡(株式会社ニコン、日本、東京)下で、胚を観察した。
成熟雌ブタ(2.5歳、体重170Kg)由来の卵母細胞及び若い雌ブタ(5.5月齢〜6月齢、体重75Kg)由来の卵母細胞間の発生コンピテンスの差を、44時間インビトロ成熟後にZF及びZIのPAにより調べた。4つの併合群を、3回の同一反復実験で調べた:(1)成熟雌ブタからのZF卵母細胞、(2)成熟雌ブタからのZI卵母細胞、(3)若い雌ブタからのZF卵母細胞、(4)若い雌ブタからのZI卵母細胞。ZF卵母細胞活性化には0.85KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを印加したが、ZI卵母細胞活性化には1.25KV/cmの単一のパルスを用いた。上記のように7日培養後、活性化胚当たりの胚盤胞の百分率を確定した。
改変ブタHMCの実現可能性を、6回の同一反復実験で、IVFを用いて、平行して対照としてZFのPAを用いて調べた。より適格性の成熟雌ブタ卵母細胞(実施例1に記載)を、実施例2で用いた。再構築及び/又は活性化後7日目に、再構築胚当たりの胚盤胞数、並びに無作為選択胚盤胞の総細胞数を確定した。
SPSS11.0を用いて、ANOVA分析を実施した。P<0.05の確率は、統計学的に有意であるとみなされた。
脂肪分離インビトロ成熟卵母細胞から産生されるハンドメイドクローン化ブタ胚盤胞のガラス化
近年、遠心分離を用いるが、その後の顕微操作を伴わないブタ胚の脂肪分離に関する、非侵襲的手法が発表された(Esaki et al. 2004 Biol Reprod. 71, 432-6)。
Online、近刊)を用いて38.5℃で加温した。10%CSを添加した培養培地中での24時間回復後の再増殖率により、ガラス化胚盤胞の生存率を確定した。両群からの再増殖胚盤胞の細胞数を、Hoechst染色後に確定した。結果を、ANOVA分析により比較した。帯の部分的消化及び遠心分離は、173/192(90%)の卵母細胞における上首尾の脂肪分離を生じた。胚盤胞の発生は、脂肪分離卵母細胞と無傷卵母細胞との間で異ならなかった(それぞれ28±7%対28±5%、P>0.05)。しかしながら、脂肪分離卵母細胞由来の胚盤胞の生存率は、無傷卵母細胞から発生した胚盤胞の生存率より有意に高かった(それぞれ85±6%対32±7%、P<0.01)。脂肪分離卵母細胞又は無傷卵母細胞由来の再増殖胚盤胞の平均細胞数において差は認められなかった(それぞれ36±7対38±9、P>0.05)。これらの結果は、簡便な脂肪分離技法は活性化ブタ卵母細胞のインビトロ発生コンピテンスを妨げず、そして細胞数の有意の損失を伴わずに、得られた胚盤胞の凍結生存率を改良する、ということを示す。
脂肪分離卵母細胞を、5回の反復実験でHMCのために用いた。非脂肪分離卵母細胞を用いたHMCの4回の同一反復実験を、対照系として用いた。再構築後7日目に、両群から産生された胚盤胞をクライオトップでガラス化した。再増殖胚盤胞の生存率及び細胞数を、PAにより産生された胚盤胞に関する上記のように確定した。
Technology, Pullman, WA, USA)を用いて、立体顕微鏡制御下で、二分割を手動で実施した(図7c)。半分片を収集し、T2滴中の5μg/mlのHoechst33342蛍光色素で5分間染色し、次に、オイルで被覆した60mmのFalconペトリ皿の底の1μl滴のT2培地中に入れた(3〜4個の半分片/滴)。倒立顕微鏡及びUV光を用いて、クロマチン染色なしの半分片(細胞質体)の位置を登録した。その後、細胞質体を立体顕微鏡下で収集し、T10滴中に保存した。
化学的に促進されるハンドメイド除核(CAHE)及び現行方法との比較
41時間〜42時間インビトロ成熟後、0.4μg/mlデメコルチンを添加した同一溶液中で45分間、COCをさらに培養した。次に、Hepes緩衝TCM199中に溶解した1mg/mlヒアルロニダーゼ中でピペッティングすることにより、卵丘細胞を除去した。この時点から(別記する場合を除いて)、39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施した。卵母細胞を取り扱うために用いられる滴量は全て、20μl容量であり、ミネラルオイルで被覆された。
工程は全て前に記載された手順と同様であったが、デメコルチン予備インキュベーションを適用しなかった。
デメコルチン予備インキュベーションを、同様にこの群の前処理から省いた。卵丘細胞の除去後、透明帯を上記のようにプロナーゼにより部分消化した。無作為ハンドメイド二等分割を、2.5μg/mlのCBを添加したT2の滴で適用した。全ての半卵母細胞を選択し、T2滴中の10μg/mlのHoechst33342で10分間染色して、次に、ミネラルオイルで被覆されたT2培地の1μl滴中に入れた(各滴中に3つの半卵母細胞)。倒立顕微鏡及びUV光を用いて、無クロマチン半卵母細胞、すなわち細胞質体の位置を登録した。その後、これらの細胞質体を立体顕微鏡下で収集し、さらなる操作の前にT2滴中に保存した。
ブタ胎仔線維芽細胞を、前に記載されたように調製した(Kragh, et al., 2005、Du, et al., 2005)。融合を二段階で実施したが、この場合、第2の工程は活性化の開始を同様に包含した。第一の工程に関しては、細く伸ばして、火仕上げしたガラスピペットを用いて、約100個の体細胞をT2滴中に入れ、そして20〜30個の細胞質体をT10滴中に入れた。短時間平衡後、3つの細胞質体の群を、1mg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA)に2秒〜3秒間移して、次に、各々を単一体細胞上に迅速に滴下した。付着後、細胞質体-体細胞対を再び摘み出し、融合培地(0.01%(w/v)のPVAを添加した0.3Mのマンニトール)に移した。0.6KV/cm及び700KHzの交流(AC)を用いて、体細胞が導線から最も離れて位置するように、融合チャンバー(BTXマイクロスライド0.5mm融合チャンバー、モデル450、BTX, San Diego, CA)の一導線に沿って平衡後の対を一列に並べ、次に、2.0KV/cmの直流(DC)インパルスで9μ秒間、融合した。次に、対を注意深く導線からT10滴に取り出し、融合が起きていたか否かを観察するためにインキュベートした。
前に記載されたように(Chen et al., 1999、Zhang et al., 2005)、Diaphot200倒立顕微鏡(株式会社ニコン、日本、東京)を用いて、顕微操作を実行した。要するに、42時間〜44時間インビトロ成熟後、上記と同様に卵丘細胞を除去した。39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施した。単一50μLの顕微操作溶液滴を、60mm培養皿の蓋上の中央域に作り、ミネラルオイルで被覆した。20〜30個の卵母細胞及び胎仔線維芽細胞の群を、同一滴中に入れた。15分〜30分間のインキュベーション後、卵母細胞をホールディングピペット(内径=25μm〜35μm及び外径=80μm〜100μm)で確保した。5時〜6時の位置に配置後、第一極体及び隣接細胞質体(卵母細胞の総容量の約10%)(おそらくは分裂中期板を含有)を斜端インジェクションピペット(内径=20μm)を用いて吸引し取り除いた。次に胎仔線維芽細胞を、同一スリットを通して空隙中に注入した。核移植(NT)後、再構築カプレットを、融合及び活性化が実行されるまで、1時間〜1.5時間、回復のためにミネラルオイルで被覆された培地の滴中に移した。回復培地は、4mg/mLのBSA及び7.5μg/mLのCBを添加したNCSU-23であった。再構築カプレットを、融合培地中で4分間インキュベートした。細く伸ばして、火仕上げしたガラスキャピラリを用いてカプレットを手動で整列させて、接触面を電極と平行にした。次に、20kV/cmの30μ秒、単一直流パルスを印加した。7.5μg/mLのCBを添加したIVC0-2(「胚培養及び評価」に明記)の滴中で30分〜60分間培養後、融合結果を立体顕微鏡下で検査した。融合カプレットに、活性化溶液中で二次パルスを施した。T10中での30分インキュベーション後、それらをIVC0-2に移して、インビトロ発生を評価した。
活性化インパルス後、5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で、5μg/mlのCB及び10μg/mlのシクロヘキシミドを添加したIVC0-2中で、全ての再構築胚をインキュベートした。
4時間後、全ての再構築及び活性化胚を、Nunc4ウェル皿中で、ミネラルオイルで被覆した400μlのIVC0-2中で、5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で、洗浄及び培養した。IVC0-2は、0日目(活性化の当日)から2日目まで用いられ、4mg/mlのBSA、0.17mMのピルビン酸ナトリウム及び2.73mMの乳酸ナトリウムを含有する、変法NCSU37培地(Kikuchi, et al., 1999)であった。2日目から7日目までは、ピルビン酸ナトリウム及び乳酸ナトリウムを5.5mMのグルコースに取り替えた(IVC2-7)。無帯胚は全て、上記で用いたものと同一培養培地及びガス混合物中で、the Well of the Well(WOW)系(Vajta, et al.,
2000)で培養し、WOWから胚を取り出すことなく2日目に注意深く培地を変えた。同一培地量及び組成を用いて4ウェル皿のウェル中での15〜30個の群で、TC胚を培養した。卵割及び胚盤胞率を、それぞれ2日目及び7日目に登録した。総細胞数を確定するために、胚盤胞を固定し、10μg/mlのHoechst33342を含有する少量(2μl未満)のグリセロール中で顕微鏡スライドガラス上に載せた。室温で数時間染色後、エピフルオレッセンスアタッチメント及びUV-2Aフィルターを備えたDiaphot200倒立顕微鏡(株式会社ニコン、日本、東京)下で、胚を観察した。
合計620個の卵母細胞を用いて、12回の同一反復実験で、CAHEの効率及び信頼度を試験した。41時間〜42時間成熟後、卵母細胞をデメコルチンインキュベーションに付した。突出錐体及び/又は強度付着PBが部分的プロナーゼ消化後に検出された卵母細胞では、配向二分割を実施した。二分割卵母細胞対全体卵母細胞、及び生存卵母細胞対二分割卵母細胞の百分率を登録した。その後、推定細胞質体及び核体両方を別々に収集し、Hoechst33342で染色した(T2中10μg/ml、10分間)。クロマチンの有無を、倒立蛍光顕微鏡下で検出した(図9)。
8回の反復実験で、合計468個のインビトロ成熟卵母細胞を無作為に配分して、3つの上記の除核手順に付した。細胞質体及びドナー線維芽細胞間の融合率を登録した。再構築胚を、上記と同様に活性化及び培養した。卵割及び胚盤胞率を、それぞれ2日目及び7日目に確定した。発生胚盤胞の立体顕微鏡下の特徴を、群間で比較した。
マイクロソフトXPエクセルソフトウエアによりAVEDEVを実施し、そしてSASシステムによりANOVAを実施した。P<0.05という確率は、統計学的に有意であるとみなされた。
実施例1、実施例2、実施例3、実施例4及び実施例5に関するハンドメイドクローニング(HMC)及び妊娠の確立
トランスジェニックのクローニング及び分娩のために、線維芽細胞をHMCに用いる。レシピエント成熟雌ブタに、60〜70個の総量の5日目及び/又は6日目の胚盤胞の混合物を投与する。
卵丘-卵母細胞複合体(COC)は、食肉解体処理場から得られた成熟雌ブタ卵巣からの2mm〜6mmの卵胞から吸引し、加湿空気中で5%CO2で、41時間〜44時間、「サブマリンインキュベーション系」(SIS、Vajta, et al. 1997)において、38.5℃で、10%(v/v)ウシ血清(CS)、10%(v/v)ブタ卵胞液、10IU/mlのeCG、5IU/mlのhCG(Suigonan
Vet; Skovlunde, Denmark)を添加した重炭酸塩緩衝TCM-199(GIBCO BRL)から成るIVM培地400μl中で50個の群において成熟させた。
胚を、the
Well of the Well系(WOW、Vajta, et
al., 2000)で、PZM-3培地中で、5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で培養する。明瞭に目に見える内部細胞塊を有する5日目及び6日目胚盤胞を、離乳後4日目又は5日目のデンマークランドレース成熟雌ブタに外科的に移入する。21日目に超音波診断により妊娠を診断し、2週間毎に確認する。114日目に、プロスタグランジンF2による処理の24時間後に、帝王切開により仔ブタを分娩させる。
仔ブタ産生
ハンドメイドクローニング(HMC)
インビトロ成熟開始の41時間後、Hepes緩衝TCM199中の1mg/mlヒアルロニダーゼ中で反復ピペッティングすることにより、COCの卵丘外被を除去した。この時点から(別記する場合を除いて)、39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施し、そして卵母細胞を取り扱うために用いられる滴量は全て、ミネラルオイルで被覆された20μl容量であった。T33(TはHepes緩衝TCM199培地を意味し、数字は仔ウシ血清(CS)サプリメントの百分率(v/v)を意味する、ここでは33%)中に溶解した3.3mg/mlのプロナーゼ中で短時間(20秒間)、卵母細胞をインキュベートし、次に、T2滴及びT20滴中で迅速に洗浄した。一部消化されているが、依然として目に見える帯を有する卵母細胞を、2.5μg/mlのサイトカラシンB(CB)を添加したT2の滴中に整列させた。細く伸ばし、火仕上げしたガラスピペットを用いて、表面に極体(PB)が見られるように、卵母細胞を回転し、マイクロブレード(AB Technology, Pullman, WA, USA)を用いて、立体顕微鏡制御下で手動で、配向二分割を実施した。したがって、(突出又はPB近くの)卵母細胞細胞質体の半分未満を残りの推定細胞質体から除去した。細胞質体をT2滴中で2回洗浄し、T10滴中に収集した。
Diaphot200倒立顕微鏡(株式会社ニコン、日本、東京)を用いて、顕微操作を実行した。42時間〜44時間成熟後、上記と同様に卵丘細胞を除去した。39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施した。単一50μL滴の顕微操作溶液(4mg/mLのBSA及び7.5μg/mLのCBを添加したNCSU-23)を、60mm培養皿の蓋上の中央域に作り、ミネラルオイルで被覆した。20〜30個の卵母細胞及び胎仔線維芽細胞の群を、同一滴中に入れた。15分〜30分間のインキュベーション後、1つの卵母細胞をホールディングピペット(内径=25μm〜35μm及び外径=80μm〜100μm)で確保した。5時〜6時の位置に配置後、第一極体及び隣接細胞質体(卵母細胞の総容量の約10%)(おそらくは分裂中期板を含有)を斜端インジェクションピペット(内径=20μm)を用いて吸引し取り除いた。次に単一の胎仔線維芽細胞を、同一スロットを通して空隙中に注入した。核移植(NT)後、再構築カプレットを、融合及び活性化が実行されるまで、1時間〜1.5時間、回復のためにミネラルオイルで被覆された培地の滴中に移した。再構築カプレットを、融合培地中で4分間インキュベートした。細く伸ばして、火仕上げしたガラスキャピラリを用いてカプレットを手動で整列させて、接触面を電極と平行にした。次に、2.0kV/cmの30μ秒、単一直流パルスを印加した。7.5μg/mLのCBを添加したPZM-3培地の滴中で30分〜60分間培養後、融合結果を立体顕微鏡下で検査した。融合カプレットに、活性化溶液中で二次パルスを施した。T10中での30分インキュベーション後、それらをPZM-3培地に移して、インビトロ発生を評価した。
4mg/mlのBSAを添加したPZM-3培地(Dobrinsky,
J.T. et al. Biol Reprod 55, 1069-1074 (1996))中で、再構築胚を培養した。HMCから産生された無帯胚は、変法WOW系(Feltrin, C. Et al. Reprod Fertil Dev 18, 126 (2006))で培養した。2つの異なる細胞株(HMCのためのLW1-2、TCのためのLW2)を、HMC及びTCのための核ドナー細胞として用いて、2つの手順からの子孫の同定を可能にした。LW1-2及びLW2は、それぞれ(デュロック種との)交雑及び純系デンマークランドレースからの胎仔に由来する。
10個の異なるブタマイクロサテライトマーカーを用いた親分析によって、クローン化仔ブタ及び核移植のために用いたドナー細胞の同一遺伝子型が確認された。新生仔ブタ、代理成熟雌ブタ、並びにそれぞれデンマークランドレース及びデュロック種を代表する2匹の胎仔に由来するドナー皮膚線維芽細胞LW1-2及びLW2の各々からの、ゲノムDNAのマイクロサテライト分析により、同定を実行した。異なるブタ染色体上に位置する10個の多型性マイクロサテライト遺伝子座(SW886、SW58、SW2116、SW1989、SW152、SW378、KS139、SO167、SW1987、SW957)を、3色多重PCRにより増幅し、そして生成物を、プログラムGene Mapper3.7を用いて、遺伝子分析機3130X1(Applied
Biosystems)で分析した。
SPSS
11.5による独立試料t検定を用いて、実験群の差を評価した。P<0.05は、有意であるとみなされた。
Claims (51)
- 乾癬を研究するためのモデルとしての遺伝子改変ブタであって、上記疾患に関連した少なくとも1種類の表現型を発現するブタモデル、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタに関する。 - ブタがミニブタである、請求項1に記載の遺伝子改変ブタ。
- ミニブタがゲッティンゲン、ユカタン、バマ・シャン・チュー(Bama Xiang Zhu)、ウージーシャン(Wuzhishan)及びシーサンバンナ(Xi Shuang Banna)並びにその任意の組合せから成る群から選択される、請求項2に記載の遺伝子改変ブタ。
- ブタがミニブタではない、請求項1に記載の遺伝子改変ブタ。
- ブタがS.domesticus種に属する、請求項1に記載の遺伝子改変ブタ。
- ブタがランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズ
メイシャン(Chinese Meishan)、バークシャー及びピエトラン並びにその任意の組合せから成る群から選択される、請求項5に記載の遺伝子改変ブタ。 - ブタが近交系ブタである、請求項1に記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記のヒト、マウス及び/又はブタPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部が異種性(heterologous)のプロモーターにより発現される、請求項1〜7のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記の異種性プロモーターが、K1、K5、K10、K14及びインボルクリン(involucrine)から成る群から選択される、請求項8に記載される遺伝子改変ブタ。
- 上記動物が少なくとも1つのブタPPARδ遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜9のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記動物が少なくとも1つのヒトIκB-α遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜10のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記動物が少なくとも1つのブタPPARδ遺伝子又はその一部及びヒトIκB-α遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜11のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記動物が少なくとも1つのブタIκB-αcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜12のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記動物が少なくとも1つのブタPPARδcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜13のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記動物が少なくとも1つのヒトIκB-αcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜14のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記動物が少なくとも1つのブタPPARδcDNA又はその一部及びヒトIκB-αcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜15のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記動物が少なくとも1つのブタIκB-αcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜16のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、乾癬に関連していると知られる任意の表現型を含む、請求項1〜17のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、尋常性乾癬、滴状乾癬、屈側性(flexural)乾癬、乾癬性紅皮症、膿疱性乾癬及び乾癬性関節炎からなる群から選択される、請求項1〜18のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、白色鱗屑、皮膚炎症、隆起皮膚、赤色皮膚、皮膚の剥脱、爪の変化、爪の黄変、及び抜け毛からなる群から選択される、請求項1〜19のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、皮膚の剥脱である、請求項1〜20のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、体幹、腕、足、膝、肘、生殖器及び頭皮の赤色隆起皮膚斑である、請求項1〜21のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、赤色皮膚、隆起皮膚の小斑、及び身体の広い領域全体に出現する多数の小卵円形スポットから成る群から選択される、請求項1〜22のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、皮膚襞中に、例えば腋窩に、乳房下に、特に生殖器周囲に生じる皮膚の平滑炎症斑からなる群から選択される、請求項1〜23のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、身体表面のほとんどに亘る皮膚の広範な炎症及び剥離、そう痒感、膨潤及び疼痛、身体が温度を調節する能力の障害並びに死から成る群から選択される、請求項1〜24のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、身体全体に亘る、又は掌、足裏及びその他の小領域上だけに現れる小膿疱である、請求項1〜25のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 上記少なくとも1種類の表現型が、臨床的観察及び/又は(例えば生検の形態における)皮膚組織の顕微鏡検査に基づいて検出される、請求項1〜26のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
- 請求項1に規定される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胚盤胞、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚盤胞、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胚盤胞。 - 請求項1に規定される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胚、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胚。 - 請求項1に規定される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胎仔、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胎仔、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胎仔。 - 請求項1に規定される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核。 - i)修飾透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、ii)卵母細胞を少なくとも2つの部分に分離し、核を有する卵母細胞及び少なくとも1つの細胞質体を得る工程、iii)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、iv)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核(membrane surrounded
cell nucleus)と融合する工程、v)再構築胚(reconstructed
embryo)を得る工程、vi)胚を形成するように再構築胚を活性化し、上記胚を培養する工程、及びvii)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程から成る核移植により得られることができる、請求項1〜31のいずれかに記載の遺伝子改変ブタモデル、ブタ胚盤胞、胚、胎仔及び/又はドナー細胞。この場合、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚は工程i)〜工程v)及び/又は工程vi)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚盤胞は工程i)〜工程vi)及び/又は工程vii)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胎仔は工程i)〜工程vii)を含む。 - i)少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、ii)卵母細胞を少なくとも3つの部分に分離し、少なくとも1つの細胞質体を得る工程、iii)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、iv)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、v)再構築胚を得る工程、vi)胚を形成するように再構築胚を活性化し、上記胚を培養する工程、及びvii)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程から成る、乾癬のモデルとしてのトランスジェニックブタ、ブタ胚盤胞、胚、胎仔及び/又はドナー細胞の製造方法。この場合、上記トランスジェニック胚は工程i)〜工程v)及び/又は工程vi)を含み、上記トランスジェニック胚盤胞は工程i)〜工程vi)及び/又は工程vii)を含み、上記トランスジェニック胎仔は工程i)〜工程vii)を含む。
- 請求項1〜33のいずれかに規定される1つまたは複数の特徴を含む、請求項28〜33のいずれかに記載の方法であって、再構築胚の活性化のための方法が、電気パルス、化学誘導性ショック、二価カチオンの細胞内レベルの増大及びリン酸化の低減から成る方法の群から選択される方法。
- 請求項1〜34のいずれかに規定される1つまたは複数の特徴を含む、請求項28〜33のいずれかに記載の方法であって、工程iv)及び工程vi)が順番に又は同時に実施される方法。
- 請求項1〜35のいずれかに規定される1つまたは複数の特徴を含む、請求項28〜33のいずれかに記載の方法であって、胚がインビトロで培養される方法。
- 請求項36に記載の方法であって、胚が順次培養(sequential culture)によって培養される方法。
- 請求項1〜37のいずれかに規定される1つまたは複数の特徴を含む、請求項28〜33のいずれかに記載の方法であって、胚が宿主哺乳動物に移される前に凍結保存される方法。
- 胚が胚盤胞期である、請求項38に記載の方法。
- ブタがミニブタではない、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
- ブタがS.domesticus種に属する、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
- ブタがランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズ
メイシャン、バークシャー及びピエトラン並びにその任意の組合せから成る群から選択される、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。 - ブタが近交系ブタである、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
- ブタがミニブタである、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
- ミニブタがゲッティンゲン、ユカタン、バマ・シャン・チュー、ウージーシャン及びシーサンバンナ並びにその任意の組合せから成る群から選択される、請求項44に記載の方法。
- 乾癬の治療的処置の効果を評価する方法であって、i)請求項1〜27のいずれかに記載のブタモデルを用意する工程、ii)上記表現型に効果を発揮する医薬品組成物で上記ブタモデルを処置する工程、及びiii)観察された効果を評価する工程を含む方法。
- 前述の観察された効果に基づき医学的処置について勧告をする工程を更に含む、請求項46に記載の方法。
- 医薬品組成物の有効性をスクリーニングする方法であって、i)請求項1〜27のいずれかに記載のブタモデルを用意する工程、ii)上記遺伝的決定因子を上記ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を上記ブタモデルに投与する工程、及びiv)ブタモデルにおいて遺伝的決定因子を発現することにより発揮される表現型に及ぼす医薬品組成物の効果(もしあれば)を評価する工程を含む方法である。
- 乾癬に罹患しているヒトの治療方法であって、以下の初期工程:i)請求項1〜27のいずれかに記載のブタモデルを用意する工程、ii)上記遺伝的決定因子を上記ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を上記ブタモデルに投与する工程、及びiv)観察された効果を評価する工程、並びにv)ブタモデルで観察された効果に基づいて乾癬に罹患している上記ヒトを治療する工程を含む方法である。
- 上記遺伝的決定因子が請求項8〜17のいずれかに規定されたものである、請求項46〜49のいずれかに記載の方法。
- 上記表現型が請求項18〜27のいずれかに規定されたものである、請求項46〜50のいずれかに記載の方法。
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