KR101635671B1

KR101635671B1 - 개과 동물 복제시 태아 착상율 증진을 위한 핵 공여 세포 배양용 배지 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101635671B1
Application number: KR1020140052231A
Authority: KR
Inventors: 이병천; 오현주; 김민정; 김건아; 조영광
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2016-07-04
Also published as: KR20150125768A

Abstract

본 발명은 핵 이식 기술에 따른 개과 동물(Canidae)의 복제에 있어서의 효율적인 배양체계에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 개과 동물의 체세포 또는 줄기세포 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 특정 히스톤 아세틸레이션 저해제 물질을 이용함으로써 이식란의 in vivo 발달, 특히 이식란의 착상율을 현저히 높이는 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.

Description

개과 동물 복제시 태아 착상율 증진을 위한 핵 공여 세포 배양용 배지 및 이의 이용{A Medium for Culturing Donor Cells to Increase Implantation Rate on Canidae Cloning and The Use thereof}

생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 원하는 형질들로 조합한 다양한 재조합 생명체들의 여러가지 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들이 속속 보고되었다.

체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577).

복제 동물을 생산하는 기술은 상업적 유용성뿐 아니라, 생체의학과 생물학 연구에 있어서도 그 중요성은 압도적이다. 복제 동물 생산기술의 산업적 적용분야는 고품질의 축산식품 생산, 고부가가치의 약리활성물질 생산, 각종 병원균에 대한 생체저항력 향상동물 생산, 질환 모델 동물의 생산 및 유전자치료 분야에 이르기까지 매우 광범위하다.

복제 동물의 다양한 용도 중에서도, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어, 요즘 같은 산업화 및 정보화 시대를 거쳐오면서 개, 고양이 등의 애완 동물 및 반려 동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다.

이 중 특히 반려견에에 대한 심리적 의존도가 급격히 증가하고 있고, 개과 동물의 우수한 능력을 이용하는 검역견이나 마약탐지견과 같은 특수목적견의 필요성도 증가하고 있다. 또한, 인간의 난치질환 연구모델분야에서는 여러 한계가 있는 설치류를 대신하여 개과 동물이 선호되고 있는 추세이다. 개는 인간과 생리학적 특성이 비슷하고 사람과 동물의 유사한 질병 발생 패턴을 을 가지고 있어 병리학적, 생리학적으로도 유사하며, 실제로 인간 질병연구에 응용할 수 있는 유전 질병의 수가 65개의 돼지나 136개의 고양이와 비교해 개는 224개로 월등히 많아 (http://omia.angis.org.au/) 이러한 유전 형질을 이용하여 인간의 질병모델 복제개를 만들면 인간 질병연구에 큰 도움이 되는 중요한 의미가 있다.

그렇기 때문에 오랜 기간 개복제에 대한 시도가 이루어져왔으나, 현재까지 개 복제는 여전히 성공률이 극히 낮고, 성공하기 어려운 복제로 여겨지고 있으므로, 개과 동물의 복제 효율을 향상시키기 위한 다양한 방법이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 체세포 핵이식 방법에 의한 복제개의 향상된 생산방법을 연구하던 중, 특정 물질을 함유하는 배지에서 배양시킨 핵 공여 세포를 이용하여 제조한 이식란이 대리모의 난관에서 착상율이 현저하게 높은 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

Jang G, Kim M, Oh H, Hossein M, Fibrianto Y, Hong S, Park J, Kim J, Kim H, Kang S: Birth of viable female dogs produced by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology 2007, 67:941-947. Jang G, Hong S, Oh H, Kim M, Park J, Kim H, Kim DY, Lee BC: A cloned toy poodle produced from somatic cells derived from an aged female dog. Theriogenology 2008, 69:556-563. Hong SG, Jang G, Kim MK, Oh HJ, Park JE, Kang JT, Koo OJ, Kim DY, Lee BC: Dogs cloned from fetal fibroblasts by nuclear transfer. Anim Reprod Sci 2009, 115:334-9. Jang G, Hong S, Kang J, Park J, Oh H, Park C, Ha J, Kim D, Kim M, Lee B: Conservation of the Sapsaree (Canis familiaris), a Korean Natural Monument, using somatic cell nuclear transfer. J Vet Med Sci 2009, 71:1217-20. Oh H, Hong S, Park J, Kang J, Kim M, Kim M, Kang S, Kim D, Jang G, Lee B: Improved efficiency of canine nucleus transfer using roscovitine-treated canine fibroblasts. Theriogenology 2009, 72:461-470. Park J, Oh H, Hong S, Kim M, Kim G, Koo O, Kang S, Jang G, Lee B: Effective donor cell fusion conditions for production of cloned dogs by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology 2011, 75:777-82. Lee BC, Kim MK, Jang G, Oh HJ, Yuda F, Kim HJ, Shamim MH, Kim JJ, Kang SK, Schatten G, Hwang WS: Dogs cloned from adult somatic cells. Nature 2005, 436:641. Kim MJ, Oh HJ, Park JE, Kim GA, Park EJ, Jang G, Lee BC: Effects of mineral supplements on ovulation and maturation of dog oocytes. Theriogenology 2012, 78:110-5. Kim MJ, Oh HJ, Park JE, Hong SG, Kang JT, Koo OJ, Kang SK, Jang G, Lee BC: Influence of oocyte donor and embryo recipient conditions on cloning efficiency in dogs. Theriogenology 2010, 74:473-478.

본 발명의 주요 목적은 개과 동물의 세포 핵 이식에 사용되는, 이식란의 착상율을 높이는 핵 공여 세포의 배양방법 및 이에 사용되는 배지를 제공하고자 하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법 및 배지를 이용하여 개과 동물의 핵 이식란 착상율 및 복제 산자 생산의 효율을 높이는 방법을 제공하고자 하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은

기본 배지로서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 5~15% FBS(fetal bovine serum) 및 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 핵 이식란의 착상율을 향상시키는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지 및 이의 이용을 제공한다.

상기 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체는 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid), N-히드록시-3-[3-(히드록시아미노)-3-옥소-l-프로페닐]-벤즈아미드 (CBHA) 및 트리코스타틴(TSA)으로 구성된 군에서 선택될 수 있는데,

바람직하게는 하기 화학식 1의 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)인 것을 사용한다:

[화학식 1]

이 때, 상기 개과 동물 복제용 핵 공여 세포는 3~6 계대의 세포를 사용하는 것이 바람직하고, 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)은 1~50μM 농도, 바람직하게는 1~10μM 농도로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에서는, 10%(v/v) FBS 및 1μM수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)을 함유하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)를 함유하는 배지를 사용하였다.

한편, 상기 핵 공여 세포는 개과 동물 체세포 또는 줄기세포 유래인 것을 사용할 수 있는데, 이 때, 상기 체세포는 유사분열 G0/G1단계의 것이 바람직하다.

체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 성체 유래 세포, 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 섬유아세포 또는 줄기세포를, 가장 바람직하게는 섬유아세포를 사용한다.

또한, 상기 줄기세포는 배아 또는 성체 유래인 것을 사용할 수 있으나, 윤리적인 문제 등을 고려하여 성체 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 성체 유래 줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 지방, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택된 조직으로부터 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵 이식란의 착상율을 향상시키는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지를 이용하여 배양한 핵 공여 세포를 탈핵된 난모 세포에 이식 한 다음 이를 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및

상기 제조된 핵 이식란을 즉시 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는, 핵 이식란의 착상율이 향상된 복제된 개과 동물의 생산방법을 제공한다.

이 때, 핵 공여 세포를 배양할 때, FBS를 함유하는 DMEM 기본배지에서 핵 공여세포를 약 3~6 계대까지 배양한 후 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체를 첨가하는 것이 바람직하다.

그리고, 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체를 첨가한 후 세포가 60~70% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양한 다음, 히드록삼산 유도체를 추가로 첨가하여 배양할 수 있다.

히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체에 관한 설명은 앞서 설명한 바와 같다.

이처럼, 본 발명은 개과 동물의 체세포 또는 줄기세포 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 특정 히스톤 아세틸레이션 저해제 물질을 이용함으로써 이식란의 in vivo 발달, 특히 이식란의 착상율을 현저히 높이는 방법 및 이의 모든 용도를 포함한다.

본 발명은 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체인 SAHA 처리된 핵 공여세포를 이용하여 이식란의 착상율을 높임으로써 개과 동물의 복제에 있어서의 태아 형성율을 현저히 향상시킨다. 이를 통해 개과 동물을 고효율로 복제할 수 있게 함으로써 개과동물 우량 품종의 번식, 보존, 이종이식, 질환 모델동물 생산 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 SAHA 처리 유무에 따른 공여세포에 있어서 세포사멸(A), 염색질 리모델링(B, C) 관련 유전자들의 상대적인 발현 수준에 관한 그래프이다.
도 2는 SAHA 처리 시간(20hr 및 44hr)에 따른 공여세포에 있어서 세포사멸(A), 염색질 리모델링(B, C) 관련 유전자들의 상대적인 발현 수준에 관한 그래프이다.
도 3은 SAHA 처리 유무에 따른 공여세포에 있어서 H3K9 및 H4K5/K8/K12/16의 아세틸레이션 결과를 관찰한 사진이다.

본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"배양"은 생물체나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도 ·습도 ·빛 ·기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다.

"체외배양"이란 세포 등이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것이다.

'배지' 또는 '배지 조성물'은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 개과 동물의 세포 핵 이식에 사용되는, 이식란의 착상율을 높이는 핵 공여 세포의 배양에 사용되는 배지이다.

'핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.'핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.

'복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 개과 동물의 체세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. 본 발명은 핵 이식 기술을 이용하여 개과 동물을 복제하는 기술에 관한 것이다. 특히, 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.

'핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다. 본 발명에서 상기 핵 공여 세포로는 개과 동물의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있다.

'체세포(somatic cell)'란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포이며, 어떤 목적으로 특화하여 그 이외의 세포는 되지 않는 분화된 세포와, 몇종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 포함한다.

'줄기세포(stem cell)'란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능성 줄기세포(totipotent stem cell), 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 소스에 따라 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포로 분류할 수도 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 개과 동물의 성체 줄기세포를 사용할 수 있다.

'계대 배양(Subcultury)' 은 세포는 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양 접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양 접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시키는데 이때 세포를 동물에서 떼어내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양하는 방법 즉, 주기적으로 새로운 배지를 교환함으로써 세포주를 보존하는 방법을 말한다. 각 단계를 '계대(passage)'라고 일컫는다.

'융합'은 핵 공여 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여 세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.

'핵 재프로그래밍(nuclear reprogramming)'는 핵 이식 과정 중 수핵 난자와 공여 세포를 융합한 후 공여 세포주의 핵이 재구성 되어 핵 이식란(복제 수정란)의 정상적인 발생을 유도하는 과정을 말하는 것으로, 일정 시간을 항온 배양하는 것으로 달성할 수 있다.

'활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다.

'산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.

'개과 동물(canidae)'은 크게 개족(Tribe Canini)과 여우족(Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066). 본 발명에 있어서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.

'약'이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일반적으로 복제된 개과 동물의 생산방법은 예를 들어,

(a) 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;

(b) 개의 조직으로부터 분리한 체세포들에 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조단계;

(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계;및

(e) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 것으로 알려져 있고, 각 단계에 관한 통상적 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래의 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조방법 등을 참조하여 이해할 수 있다.

본 발명은 상기 방법의 수행 중 이용되는, 개과 동물의 체세포 핵 이식에 따른 이식란의 대리모 착상율을 높이는 효율적인 복제개 생산용 배양체계에 관한 것으로서, 특히, 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체를 핵 공여 세포에 처리하여 배양함으로써 이후 형성된 이식란의 착상율을 현저히 개선시켜 태아 형성 효율을 높이는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체를 핵 공여 세포의 배양에 이용하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid), N-히드록시-3-[3-(히드록시아미노)-3-옥소-l-프로페닐]-벤즈아미드 (CBHA), 트리코스타틴(TSA) 등을 사용할 수 있다. 이하에서 별도의 설명이 없는 한, 상기 화합물들은, 동일유사한 효과를 가지는 화합물 그 자체, 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 및 프로드럭 등의 유사체들을 모두 포함하는 개념으로 사용된다

상기 물질들 중에서 가장 바람직한 구체예로서는, 하기 화학식 1의 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid) 물질을 들 수 있다. 이는 SAHA라는 약어로 본 명세서에서 혼용하여 기재하기도 한다.

[화학식 1]

히스톤은 진핵세포의 핵내 DNA와 결합하고 있는 염기성 단백질로서 히스톤의 각 분자 중 특정 위치의 라이신 잔기의 아미노기에 가역적인 아세틸화가 일어난다. 이러한 히스톤의 아세틸화 반응은 염색질(chromatin)의 고차구조 형성이나 세포분열주기 등과 관계가 있어서 유전자 정보의 발현조절에 관여하며, 히스톤 아세틸전이효소(acetyltransferases, HATs) 및 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase, HDACs)에 의해 안정하게 조절된다.상기 효소들은 히스톤의 아미노 말단에 존재하는 라이신 잔기(H4의 경우 4개)의 양전하를 아세틸화로 중화시켜 전사활성을 유도하거나, 탈아세틸화시켜 다시 전하를 부여하여 전사를 억제함으로써 히스톤의 아세틸화 수준의 평형을 유도하여 전사 수준에서 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.

HDAC는 저산소증, 저포도당, 세포 암화 등 열악한 환경조건에서 고-발현되어 세포증식 억제인자의 발현을 저해함으로써 세포증식을 촉진시키는 역할을 하는 것이 최근 밝혀지면서 세포의 암화 및 분화를 조절하는데 있어 중요한 인자로 인식되고 있다.최근 들어 염색질 리모델링을 이용한 항암제 연구가 시작되었고, SAHA 또는 아피시딘(apicidin)과 같은 HDAC 억제자를 처리할 경우 암세포의 증식이 억제되고 분화가 유도된다는 연구결과가 발표되면서 항암제의 개발이 더욱 활발히 진행되고 있다(Munster PN, et. al. Cancer research 61: 8492, 2001; Han JW, et. al. Cancer research 60: 6068, 2000).

그러나, HDAC 억제자를 포유 동물의 복제, 특히 개과 동물의 클로닝에 사용하여 복제 효율을 높이는 용도로 사용된 적은 전혀 없었다.

본 발명은 이러한 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제자, 특히 HDAC 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체, 바람직하게는 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)을 핵 공여 세포 배양 배지에 첨가하여 사용함으로써 핵 이식란의 착상율을 높이는 것을 특징으로 한다.

즉, 이러한 특정 물질의 사용에 의해 본 발명은 핵 이식란의 in vivo 발달, 특히, 체세포 핵이식에 따른 이식란의 대리모 난관에서의 착상율이 개선되어, 나아가 태아 형성율이 개선되는 효과를 가지는 것이다.

그러므로, 본 발명은 일 관점에서, 개과 동물의 복제에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 특히 효과적인 배지 조성물에 관한 것으로 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체, 바람직하게는 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid)을 포함하는 배지 및 이의 이용방법에 관한 것이다.

배지의 성분

바람직한 구체예로써, 사용되는 배지 조성물은 다음과 같을 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 기본 배지는, 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포를 인 비트로에서 배양하기 위한 배지로서, 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분만을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)일 수 있다. 즉, 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 기본 배지이다.

에너지 공급원으로서 다당류(polysaccharides), 단당류(monosaccharides), 유기산(organic acid), 아미노산(amino acid), 알콜(alcohol), 다환식 함유물(polycyclic compounds), 세루로오스(cellurose), 헤미셀루로오스(hemicellurose), 리그닌(lignin) 등의 여러가지 탄소원을 이용할 수 있다. 상기 다당류로는 덱스트린, 스타치 등을, 이당류로는 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 만니톨 등을, 단당류로는 글루코스, 만노스, 프록토오스, 갈락토오스 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), K-SFM (Keratinocyte-SFM;Keratinocyte serum free medium) 등이 있는데, 가장 바람직하게는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지를 사용한다.

또한 본 발명의 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지는 필수적으로 단백질 영양분, 예를 들어 FBS(fetal bovine serum), 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민 등을 포함한다. 상기 단백질 영양분 중에서 가장 바람직하게는 FBS(fetal bovine serum)을 사용하며 약 5~15% (v/v)의 함량으로 포함시키는 것이 좋다.

그리고, 본 발명의 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지의 주요한 특징적 성분으로서, 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체를 포함한다.

상기 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체로서는 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid), N-히드록시-3-[3-(히드록시아미노)-3-옥소-l-프로페닐]-벤즈아미드 (CBHA), 트리코스타틴(TSA) 등을 예로 들 수 있고, 가장 바람직하게는 화학식 1의 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA) 물질을 사용한다.

[화학식 1]

이 때, 상기 개과 동물 복제용 핵 공여 세포는 3~6 계대의 세포인 것이 바람직하고, 세포가 약 50~80, 바람직하게는 60~70% 컨플루언시에 도달할때까지 배양하한다.

바람직한 구체예로서, 상기 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA) 등의 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체는 FBS(fetal bovine serum) 등의 단백질 영양분을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등의 기본배지에서 핵 공여세포를 약 3~6 계대까지 배양한 후 첨가하는 것이 바람직하다.

상기 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA) 등의 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체는 1~50 μM 농도, 바람직하게는 1~10μM 농도로 25시간 이하, 바람직하게는 21시간 이하로 처리하는 것이 바람직하다.

더욱 바람직한 구체예로서, 약 1 μM 농도의 SAHA를 3~6 계대의 핵 공여세포 배양 배지에 첨가하여 20-21시간 동안 세포가 약 70% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양한다. 이후, SAHA를 추가로 더 첨가하여도 무방하다.

이와 같이, 본 발명인 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지 조성물은, 가장 바람직한 예로써, 기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium )(high glucose)를 사용하며, FBS(Fetal bovine serum), SAHA를 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는 10% FBS를 함유하는 DMEM(high glucose,Invitrogen) 기반 배지에서 1μM SAHA를 핵 공여 세포에 처리하여 배양하였다.

한편, 본 발명의 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지는 이하와 같은 구성성분을 추가로 더 포함할 수도 있다. 각 배지 구성 성분의 함유량은 당업자들이 적절히 조절할 수 있음은 자명할 것이다.

본 발명의 배지는 성장 인자를 더 함유함으로써, 핵 공여 세포의 증식을 한층 더 촉진시킬 수 있다. 성장 인자의 바람직한 예로서는 상피 성장 인자(EGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 트랜스포밍 성장 인자(TGF), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 간세포 증식 인자(HGF) 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 배지는 항산화제를 더 함유할 수도 있다. 항산화제는 비제한적으로, 천연 항산화제인 토코페놀(Tocopherol), 쎄사몰(Sesamol), 진저론(Gingeron), 캡사이신(Capsaicin), 퀘르세틴(Quercetin), 갈릭산(Garlic acid); 합성항산제인 BHA, BHT, TBHQ; 효과상승제인 구연산, 아스코르브산; 항산화성 생체 기능 분자인 수용성 항산화제 비타민 C, 지용성 항산화제 비타민 E, 유비퀴논 (CoQ), 카로테노이드 등을 선택하여 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 아스코르브산 또는 비타민 C를 사용한다.

이 외에도, 본 발명의 배지는 필요에 따라 하기 임의 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 체세포의 증식 또는 유지를 위한 배양에 사용할 수 있는 것 외에 배양하는 세포가 줄기세포인 경우에는 줄기세포의 분화 유도를 위해서 사용할 수도 있다. 줄기세포의 분화 유도에 사용하는 경우에는 분화 유도제가 더 첨가된다. 분화 유도제로서는 사이토카인(각종 인터류킨, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴 등), 콜로니 자극 인자(예를 들면, G-CSF 등), 스테로이드 호르몬(덱사메타손 등), 인돌(인도메타신 등), 티아졸리딘 유도체(로시글리타존 등) 등을 예시할 수 있다. 이들 중 1개 또는 복수종을 사용할 수 있다. 또한, 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 일반적인 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수도 있다. 또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent)를 포함할 수 있다.

이러한 임의 성분의 첨가는 당업계의 통상의 지식을 가진 자가 공지 기술 및 실험 설계의 내용에 따라 적절히 수행할 수 있을 것이다.

대상 세포

즉, 본 발명은 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제개의 생산에 사용되는 핵 이식란의 착상율을 개선시키기 위한 "핵 공여 세포"의 배양에 특이적인 것이다.

상기 핵 공여 세포의 일 구체예로서 개과 동물의 체세포를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.

핵 공여 세포로서 제공되는 상기 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 바람직하게는 유사분열 G0/G1단계의 체세포를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 핵 공여 세포로는 체세포 이외에도 개의 배아 유래 또는 성체 유래의 줄기세포를 사용할 수 있다.

성체 유래 줄기세포의 예를 들면, 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래된 조직으로부터 분리, 사용할 수 있다. 성체 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 원하는 방향으로 분화되지 않은 세포가 암을 유발할 가능성이 매우 희박하여 임상적으로 매우 중요한 장점을 갖고 있다. 개로부터 배아 줄기세포를 수득하거나 개의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

줄기세포를 사용할 경우, 줄기세포의 특성상 일반적으로 초기 배아 발달에 필수적이라 여겨지고 있는, 미분화 유전자들이 발현되고 있다는 점이 그 장점으로 부각될 수 있다.

이처럼, 본 발명에서의 핵 공여 세포로는 개로부터 유래된 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 체세포인 섬유아세포를 사용하였다.

배양 방법

한편, 본 발명은 다른 관점에서 상기 핵 공여 세포 배양용 배지를 이용하는 방법에 관한 것으로, 예를 들어, 핵 이식란의 착상율을 높이는 핵 공여 세포의 배양방법 및 이를 이용하여 개과 동물의 복제 산자 생산의 효율을 높이는 방법에 관한 것이다.

일 구체예를 간단히 설명한다.

개과 동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 상기 설명한 핵 공여 세포 배양용 배지에서 배양한다. 상기 배지에서 3-4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 핵 이식에 이용하기 위하여 계대 배양을 실시한다.

상기 3~6 계대 배양된 핵 공여 세포에 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA) 등의 히스톤 디아세틸라제 억제 활성을 갖는 히드록삼산 유도체를 처리하고, 각각 목적하는 %컨플루언스에 도달함에 따라 새로운 배지로 옮겨 배양한다. 그리고 배양된 세포에 대해 트립신 처리하여 단일세포로 제조하여 핵이식을 위한 최종 핵 공여 세포로 사용한다.

‘~% 컨플루언스’는 세포 배양에 있어서 단위 면적당 세포수(세포농도)를 상대적으로 나타내는, 당업자들이 실험에 있어서 자주 사용하는 단위이다.

본 발명의 방법에 있어서, 평균적 계대수는 3~6 계대이며, 가장 바람직하게는 약 5계대로 사용한다. 또한 각 계대에서 배양시 요구되는 컨플루언스 값은 70~90% 이상이다. 최종 공여 세포 수득시 요구되는 컨플루언스은 90% 이상에 해당된다.

상기 배양은 통상의 체외 배양용 용기, 예를 들어, CO₂ 인큐베이터, 디쉬, 바이오리액터 등을 이용하여 당업자가 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식에 의해 적절히 온도, 습도 등의 조건을 맞추어 수행할 수 있다.

이와 같은 본 발명에 따른 배지 및 이의 이용 방법은, 생물반응장치 시스템(bioreactor systems) 등을 이용한 체외 배양을 통해 복제개 생산을 위한 핵 공여 세포의 효과적인 생산에 적용시킬 수 있을 것이다.

특히, 지금까지 일반적으로 사용해왔던 방법에 비해, 본 발명의 SAHA 처리 방법을 이용하는 경우, 탈핵 난자에 이식되어 개과 동물의 핵 이식란을 형성한 후의 착상율을 현저히 높임으로써 태아 형성 효율을 현저히 향상시킨다.

본 발명의 일 실시예에서 SAHA 처리에 의해, DNA 메틸레이션에 관여하는 Dnmt1 유전자의 발현 감소 및 미분화된 세포의 전분화능(pluripotency)를 유지하는데 관여하는 Sox2 유전자 발현 증가 효과를 확인함으로써, 세포가 덜 미분화된 상태로 재프로그래밍이 이루어졌음을 확인하였고, 특히, 동일 농도의 SAHA 처리에 있어서는 약 20시간 처리군이 유의적으로 높은 재프로그래밍 효율을 나타냄을 확인하였다.

마찬가지로, 전사(transcription) 효율에 관여하는 히스톤 아세틸화 실험을 통해서도, H3, H4의 다양한 라이신 잔기의 아세틸레이션 패턴을 분석한 결과, SAHA 처리에 따른 H3K9과 H3K16 발현 증가를 확인함으로써 세포가 덜 미분화된 상태로 재프로그래밍이 이루어졌음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 특정 히스톤 아세틸레이션 저해제 물질 처리에 의해 핵 공여세포에서의 히스톤 아세틸레이션 억제활성 증가 및 리프로그래밍 능력이 향상된다. 그리고 이러한 기작에 의해 궁극적으로 착상율 및 태아 형성율 또한 현저히 개선되는 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 대조군과 비교하여 착상율 및 태아 형성율이 약 3배 이상 크게 개선되었음을 확인할 수 있었다.

이처럼, 본 발명은 핵 이식란의 착상율을 향상시킴으로써 복제개의 생산에 있어서 종래 극히 낮았던 태아 형성율 및 임신 성공률을 높이는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 방법은 복제 효율이 너무 낮아 실용화가 어려웠던 문제점을 개선하여 실질적으로 복제 개를 생산의 효율을 높이는데 적용될 수 있을 것이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료 및 방법

모든 동물 실험은 서울 대학교의 실험동물 관리 및 사용에 대한 평가 위원회 및 가이드라인의 표준 절차에 의해 수행하였고, 모든 화합물은 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다

1. 세포 배양 및 SAHA ( suberoylanilide hydroxamic acid ) 처리

마약 탐지견인 10년령 수컷 잉글리쉬 스프링어 스패니얼(English springer spaniel) 유래의 냉동 보관된 성인견 피부의 섬유아세포주를 농촌진흥청(Rural Development Administration)으로부터 준비하였다. 3~6 계대의 세포를 실험에 사용하였다

세포들을 해동시키고 39℃에서 5% CO₂ 및 95% 공기의 습한 대기 하 10% (v/v) FBS(fetal bovine serum, Invitrogen)가 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) (Invitrogen)에서 배양하였다.

다양한 농도의 SAHA (0, 1, 10, 50 μM)를 배양 배지에 첨가하여 20-21 hr 동안 세포가 70% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양하고, 농도 결정 후 44-45 hr의 SAHA를 처리하였다.

2. SAHA 처리 세포에서의 유전자 발현 분석

easy-spinTM Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology Inc., Kyunggi, Korea)를 이용하여 각 그룹의 펠렛으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 1㎍을 이용하여 Maxime RT PreMix Kit (Intron Biotechnology, Seoul, Korea)로 cDNA를 합성하였다. RT-PCR(Real-time polymerase chain reaction) 반응을 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) 상에서 Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 각 반응 혼합물은 200 ng cDNA, 10 μl SYBR, 7.2 μl 증류수 및 0.4 μl (10 pM/μl)의 정방향 및 역방향 프라이머들;

beta-actin, forward, 5’-GCTACGTCGCCCTGGACTTC-3’, reverse, 5’-GCCCGTCGGGTAGTTCGTAG-3’;

bax1, forward, 5’-ACTTTGCCAGCAAACTGGTG-3’, reverse, 5’-AGGAAGTCCAGTGTCCAGCC-3’;

bcl2, forward, 5’-TGAGTACCTGAACCGGCATC-3’, reverse, 5’-GTCAAACAGAGGCTGCATGG-3’;

Dnmt1, forward, 5’-CCCAGACCGCTTCTACTTCC-3’, reverse, 5’-ACTTGGCTCGCATGTTTGAG-3’;

Sox2, forward, 5’-CCCCCTTTATTTTCCGTAGTTGT-3’, reverse, 5’-TGGATTCTCGGCAGACTGATT-3’

을 포함하고 있다.

3. 공여세포에서의 히스톤 아세틸레이션 ( histone acetylation ) 수준의 측정

세포 배양 슬라이드(SPL life science, Gyeonggi-do, Korea) 상에서 배양된 세포들을 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, PBS (phosphate buffered saline) 에서 0.5% Triton X-100로 침투시켰다. 세포들을 PBS에서 1% BSA(bovine serum albumin)로 블로킹하고, 희석한 (1:200) 1차 항체들[anti-histone H3K9 antibody (Abcam, MA, USA) 및 anti-histone H4K5/K8/K12/K16 antibody (Millipore, MA, USA)]과 4℃에서 밤새 배양하였다. FITC-컨쥬게이트된 염소 항-래빗 IgG (Abcam) 및 Alexa 488 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG (The Jackson Laboratory)를 1:200로 희석하여 2차 항체들로 사용하였다. 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide) 염색 (1:200) 후에, 세포들을 공초점 현미경으로 관찰하였다.

4. 성숙된 난모세포의 수집

In vivo 성숙된 난모세포들을, 혈청 프로게스테론 농도에 의해 결정된 배란 후 약 72시간 쏟아낸 난관으로부터 수득하였다. 간략하게, 난모세포 공여 견의 난소를 일반적 개복술(laparotomy) 후 밖으로 내고 플러쉬 바늘(flushing needle)을 깔때기(infundibulum) 입구 내로 삽입하였다. 상기 바늘을 2-0 나일론사(Blue Nylon, Ailee, Busan, Korea)로 묶고 정맥 카테터(24 게이지)를 난관의 꼬리 부분 내로 삽입하였다. 배란된 난소들을, 10 mM HEPES, 2 mM NaHCO₃, 5 mg/mL BSA(Invitrogen) 및 12.9 μM 카나마이신이 보충된 TCM-199 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 씻어내었다. 완충된 TCM-199 내 0.1% (w/v) 히알루로니다아제에서 반복된 피펫팅에 의해 in vivo 난소들로부터 cumulus 세포들을 제거한 후, 오직 성숙된 난모세포와 제1극체, 25 μm보다 작은 난황주위간극(perivitelline space)을 체세포 핵이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT)을 위해 사용하였다.

5. 체세포 핵이식

5 μg/ml cytochalasin B 및 5 μg/ml bisbenzimide을 포함하는 HEPES 완충된 TCM-199 (Invitrogen) 드롭에 벗겨낸 난모세포(Denuded oocytes)를 두었다. Bisbenzimide로 염색된 핵물질을 유리 마이크로피펫으로 자궁 흡입법(aspiration)에 의해 제거하고, 공여 세포들을 체세포 핵이식 전 20-21 시간 동안 70% 컨플루언시에 도달하도록 하였다. 1 μM SAHA를 배양 배지에 첨가하고, SCNT를 위해 세포들을 3분 동안 트립신처리에 의해 회수하고 0.1% (v/v) FBS (fetal bovine serum) 보충된 PBS에 현탁하였다.

싱글 공여세포를 탈핵 난모세포의 난황 주위 간극 내로 주입하였다. 난모세포-체세포 커플렛을 0.26 M 만니톨, 0.1 mM MgSO₄, 0.5 mM HEPES 및 0.05% (w/v) BSA를 포함하는 융합 배지에 두고 Electro-Cell Fusion apparatus (NEPA GENE, Chiba, Japan)를 이용하여 2 펄스의 직류 (72 V for 15 μs)로 융합하였다. 융합된 배아를 4분 동안 10 μM 칼슘 이노포어에서 배양하고 추가로 1.9 mM 6-디메틸아미노퓨린에서 배양시킴으로써 활성화시켰다.

6. 클론화된 배아의 이식 및 임신 진단

클론화된 배아의 외과적 방법에 따른 이식을 수행하였다. 간략하게는, 배란 후 약 72시간 때 개복술(laparotomy)에 의해 수용견의 난관을 노출시키고 클론 배아를 포함하는 HEPES 완충된 TCM-199를 3.5 Fr Tom Cat Catheter (Sherwood, St. Louis, MO, USA)의 말단에 위치시켰다. 상기 카테터를 난관의 깔때기(infundibulum)입구 내에 삽입하고 배아를 난관의 꼬리 말단(caudal end)에 이식하였다. 임신진단은 배아 이식 후 최소한 29일 후 초음파를 이용하여 이루어졌다.

7. 통계학적 분석

데이터들을 Graph Prism software (GraphPad, San Diego, CA)을 이용하여 분석하였다. 상이한 농도 및 SAHA 처리 기간에 따른 상대적인 유전자 발현을 비교하기 위해 unpaired t test를 이용하였다. 형광 강도를 ImageJ software (US National Institutes of Health)로 측정하고 unpaired t test로 비교분석하였다. chi-square test를 이용하여 두 그룹에서의 착상율(implantation rate)을 비교분석하였다. p< 0.05를 유의미한 수준으로 결정하였다.

실시예 1 : 다양한 SAHA 농도 처리된 공여세포에서 세포사멸 및 재프로그래밍 관련 유전자들의 상대적인 발현 분석

도 1에 도시한 바와 같이, bax1/bcl2 비율은 대조군 및 1 μM SAHA 그룹 간 유사하게 나타났지만, 10 μM 및 50 μM 그룹에서는 현저히 증가하였다. 즉, 1μM SAHA 그룹의 세포 사멸율은 대조군과 유사한 정도로 낮게 나타났고, 10 μM 그룹은 bax1/bcl2 비율이 가장 높게 나타났다 (도 1, A).

세포사멸을 유도하는 bax 유전자와 세포사멸을 억제하는 bcl2 유전자의 비율이 높을수록 더 높은 세포사멸이 유도된다. 따라서, 이러한 결과를 통해 기본적으로 SAHA가 세포에 유해 효능을 가지는 바, 공여 세포 배양에 당업자가 용이하게 적용하기 어려울 것임을 예상할 수 있다.

그러나, 재프로그래밍 관련 유전자의 발현에 대해서는 SAHA 처리에 의해 재프로그래밍 효율이 현저히 개선되는 예상치 못한 결과를 보였다.

실험 결과, 모든 SAHA 처리 그룹은 용량 의존적으로 대조군과 비교하여 낮은 Dnmt1 수준을 보였고(도 1, B), SOX2의 발현은 용량 의존적으로 증가하였는데, 특히 10 μM 및 50 μM 그룹에서는 현저히 높았다.

Dnmt1 유전자는 유전자의 발현이나 기능을 조절하는 후성학(epigenetics)의 일종인 DNA methylation에 관여하는 유전자로, 미분화된 세포일수록 더 낮은 발현율을 보이는데, SAHA 처리에 의해 Dnmt1 유전자의 발현이 감소하는 결과를 통해 세포가 덜 미분화된 상태로 재프로그래밍이 이루어졌음이 확인되었다. 반대로 Sox2는 미분화된 세포의 전분화능(pluripotency)를 유지하는데 관여하는 유전자로, 미분화된 세포일수록 더 높은 발현율을 나타내므로 SAHA 처리에 따른 Sox2 발현의 증가 역시 세포가 덜 미분화된 상태로 재프로그래밍이 이루어졌음을 입증한다.

즉, 본 발명의 특정 히스톤 아세틸레이션 저해제 물질을 이용함으로써 재프로그래밍 효율이 향상됨을 확인하였다.

실시예 2 : 상이한 SAHA 처리 기간에 노출된 공여세포에서 세포사멸 및 재프로그래밍 관련 유전자들의 상대적인 발현 분석

공여세포에서 재프로그래밍 효율을 증가시키고 세포사멸을 감소시키기 위해, 1 μM SAHA 군을 선택하고, 상이한 노출 시간 (20hr 및 44hr) 을 비교하였다.

그 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, 세포 사멸율을 나타내는 Bax1/blc2 비율은 대조군과 비교하여 SAHA 노출 시간 증가에 영향을 받지 않았다 (도 2, A). 즉 세포 사멸 효과는 SAHA 처리 시간에는 큰 관계성을 가지지 않음을 알 수 있었다.

그러나, 재프로그래밍 유전자에 있어서는, 20 hr 처리 그룹에서는 Dnmt1 발현이 현저하게 감소하였고, 44 hr 처리군도 대조군보다는 감소했으나 20hr 처리굼보다는 그 정도가 덜하였다. 한편, Sox2 발현은 SAHA 처리군에서 증가하였는데, 20 hr 처리군이 44 hr 처리군보다 더 크게 증가하였다(도 2의 B 및 C).

따라서 약 20 hr 처리군이 대조군에 비하여 유의적으로 높은 재프로그래밍 효율을 나타낸 것으로 확인되었다.

실시예 3 : SAHA 처리된 공여세포에서 히스톤 아세틸레이션 수준의 변화

20시간 동안 1 μM SAHA 처리 후, H3 및 H4에서 라이신(lysine) 잔기에 의해 상이한 히스톤 아세틸레이션 결과들이 관찰되었다(도 3). SAHA 처리 후 H3K9 및 H4K16 발현은 현저히 증가하였지만 H4K5 발현은 현저히 감소하였다. H4K8 및 H4K12 발현에서는 큰 변화가 나타나지 않았다.

히스톤 아세틸화도 유전자의 전사과정에 대한 후성학(epigenetics)적 조절 기작의 일종으로서, 히스톤 단백질의 라이신 잔기의 아세틸화 수준이 높을수록 DNA가 구조적으로 느슨하게 풀어져 전사(transcription) 효율이 향상되는데, 배아세포 등의 미분화세포에서 높은 수준의 아세틸화를 나타내고, 분화가 된 세포일수록 아세틸화가 감소한다.

그러므로, 본 발명의 SAHA 처리를 통하여 핵심 히스톤 중 H3, H4의 다양한 라이신 잔기의 아세틸레이션 패턴을 분석한 결과, H3K9과 H3K16 발현 증가를 확인함으로써 세포가 덜 미분화된 상태로 재프로그래밍이 이루어졌음을 확인하였다.

실시예 4 : 체세포 핵이식에 의해 생성된 클론 배아의 in vivo 발달

SAHA 처리를 하지 않은 공여세포 및 SAHA 처리를 한 공여세포를 이용하여 SCNT에 의해 전체 57 및 64 클론 배아를 각각 생성하였다.

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 평균 융합율은 대조군 및 SAHA 그룹에서 각각 72.8% 및 84.8%으로 나타났다.

각 그룹에서 초음파로 한 마리의 개가 임신한 것으로 진단하였고, 대조군 및 SAHA 그룹에서 각각 1 및 3 마리의 태아가 관찰되었는데, 특히, 착상율이 각각 1.75% 및 4.69%으로, SAHA 처리된 공여세포를 이용하는 경우 착상율이 약 3배 정도 크게 개선됨을 확인하였다.

Claims

3~6 계대의 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배지를 배양하기 위한 기본 배지로서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 5~15% FBS(fetal bovine serum) 및 1μM이상 ~ 10μM미만 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)을 함유하는 것을 특징으로 하는, 핵 이식란의 착상율을 향상시키는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
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제1항에 있어서, 상기 핵 공여 세포는 개과 동물 체세포 또는 줄기세포 유래인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제7항에 있어서, 상기 체세포는 개과 동물의 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
제1항의 배지를 이용하여 배양한 핵 공여 세포를 탈핵된 난모 세포에 이식 한 다음 이를 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 핵 이식란을 즉시 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하고,
제1항의 배지를 이용하여 핵 공여 세포를 배양할 때, 상기 1μM이상 ~ 10μM미만 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)은 20~21 시간 처리하는 것을 특징으로 하는 핵 이식란의 착상율이 향상된 복제된 개과 동물의 생산방법.
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제9항에 있어서, 1μM이상 ~ 10μM미만 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)을 첨가한 후 세포가 60~70% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양한 후 1μM이상 ~ 10μM미만 수버로이라니라이드 히드록사민산(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)을 추가로 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 핵 이식란의 착상율이 향상된 복제된 개과 동물의 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 핵 공여 세포는 유사분열 G0/G1 단계인 개과 동물의 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 핵 이식란의 착상율이 향상된 복제된 개과 동물의 생산방법.
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