JP6436284B2 - 卵子活性化方法及びその用途 - Google Patents
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Description
[1]以下のステップ(1)を含む、卵子活性化方法:
(1)脂肪組織由来幹細胞と卵子とを共培養するステップ。
[2]前記細胞と前記卵子が接触した状態で共培養される、[1]に記載の方法。
[3]ステップ(1)において、前記細胞が細胞層を形成しており、該細胞層の上で前記卵子が培養される、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]ステップ(1)が以下の二つのステップを含む、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法:
(1−1)性腺刺激ホルモンの存在下での培養ステップ;
(1−2)性腺刺激ホルモンの非存在下での培養ステップ。
[5]ステップ(1−1)が、性腺刺激ホルモン及びジブチリルサイクリックAMPの存在下で行われる、[4]に記載の方法。
[6]以下のステップ(2)を更に含む、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法:
(2)共培養後の卵子を回収するステップ。
[7]ステップ(2)において、共培養後の卵子が共培養後の前記細胞から分離した状態で回収される、[6]に記載の方法。
[8]前記細胞の生物種と前記卵子の生物種が同一である、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9]前記卵子がヒト卵子である、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]前記卵子が非ヒト哺乳動物卵子である、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[11]前記非ヒト哺乳動物がブタ、ウシ、ウマ、ヤギ又はヒツジである、[10]に記載の方法。
[12][1]〜[11]のいずれか一項に記載の方法で活性化した卵子。
[13][12]に記載の卵子を含有する、受精卵移植用卵子組成物。
[14]脂肪組織由来幹細胞を含有する卵子活性化剤。
(1)代表的な共培養用細胞(フィーダー細胞)
初代培養細胞の卵管上皮細胞、卵丘細胞、顆粒層細胞、子宮上皮細胞などが用いられている。株化細胞(例えばBRL (Buffalo Rat Liver)細胞)も用いられる。
(2)フィーダー細胞の機能
フィーダー細胞の機能として、(i)胚刺激因子 (Embryotrophic factor)の培地中への放出、(ii)培地成分中や胚由来の阻害因子、毒性因子の除去、(iii)胚ゲノムの活性化や正常な胚発生に必須の成長因子を放出して、胚の発生停止を克服させること、(iv)活性酸素の毒性から胚を守ること、等が挙げられる。
(3)フィーダー細胞用培地
TCM199、MenezoB2、Ham’s F10などが用いられている。必要に応じて、蛋白源として血清やBSA等、エネルギー源としてグルコース、ピルビン酸、乳酸などが添加される。
(4)条件付け培地
フィーダー細胞を一定期間培養した培地中には、細胞より放出された様々な有効成分が含まれている。この培地を利用して胚を培養する試みがある。利点としては、細胞との接触による影響がない。
本発明の第1の局面は卵子活性化方法(以下、「本発明の方法」とも呼ぶ)に関する。本発明の方法によれば活性化された成熟卵子が得られる。従って、本発明の方法は、活性化成熟卵子の生産ないし取得方法ともいえる。
本発明において「脂肪組織由来幹細胞(ASC)」とは、脂肪組織に含まれる体性幹細胞のことをいうが、多能性を維持している限りにおいて、当該体性幹細胞の培養(継代培養を含む)により得られる細胞も「脂肪組織由来幹細胞(ASC)」に該当するものとする。通常、ASCは、生体から分離された脂肪組織を出発材料とし、細胞集団(脂肪組織に由来する、ASC以外の細胞を含む)を構成する細胞として「単離された状態」に調製される。ここでの「単離された状態」とは、その本来の環境(即ち生体の一部を構成した状態)から取り出された状態、即ち人為的操作によって本来の存在状態と異なる状態で存在していることを意味する。尚、脂肪組織由来幹細胞はADRC(Adipose-derived regeneration cells)、AT-MSC(Adipose-derived mesenchymal stem cells)、AD-MSC(Adipose-derived mesenchymal stem cells)等とも呼ばれる。本明細書では以下の用語、即ち、脂肪組織由来幹細胞、ASC、ADRC、AT-MSC、AD-MSC、を相互に置換可能に使用する。
脂肪組織は動物から切除、吸引などの手段で採取される。ここでの用語「動物」はヒト、及びヒト以外の哺乳動物(ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばサル、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等)を含む。本発明の方法で得られた活性化卵子を治療目的で使用する場合には、免疫拒絶の問題を回避するため、活性化卵子を適用する対象(レシピエント)と同一の個体から脂肪組織(自己脂肪組織)を採取することが好ましい。但し、同種の動物の脂肪組織(他家)又は異種動物の脂肪組織の使用を妨げるものではない。
細胞集団は続いて遠心処理に供される。遠心処理による沈渣を沈降細胞集団(本明細書では「SVF画分」ともいう)として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば1〜10分間、800〜1500rpmである。尚、遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団をろ過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことが好ましい。
SVF画分にはASCの他、他の細胞成分(内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、これらの前駆細胞等)が含まれる。そこで本発明の一態様では以下の選択培養を行い、SVF画分から不要な細胞成分を除去する。そして、その結果得られた細胞をASCとして本発明に用いる。
本発明の一態様では、上記(3)の操作の代わりに又は上記(3)の操作の後に以下の低血清培養を行う。そして、その結果得られた細胞をASCとして本発明に用いる。
本発明の第2の局面は、本発明の方法で得られた活性化卵子の用途に関する。活性化卵子は、卵子の機能低下に起因する不妊症の治療に有用である。また、家畜の交配・繁殖(受精卵移植の成功率や効率の向上)、育種・種の維持(例えば絶滅危惧種の維持、ペットの系統の維持又は交雑)等にも利用され得る。
前述の通り、本発明者らの検討の結果、脂肪組織由来幹細胞との共培養(特に接触した状態での共培養)によって卵子が活性化することが明らかとなった。当該知見に基づき、本発明は更に、脂肪組織由来幹細胞を有効成分として含有する卵子活性化剤を提供する。本発明の卵子活性化剤は、上記の活性化卵子組成物と同様に、卵子の機能低下に起因する不妊症の治療、受精卵移植、家畜の繁殖、育種・種の維持等に利用され得る。活性化卵子組成物の場合と同様に、各種任意成分(細胞の保護剤、抗生物質、ビタミン、サイトカイン、成長因子、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など)を含有させてもよい。尚、特に言及しない点(各細胞の動物種、卵子の動物種など)については、本発明の第2の局面の場合と同様であり、対応する説明を援用する。
(1)目的
体外で成熟培養したブタ卵子においては、核成熟は高率に見られるものの細胞質成熟が不完全であることにより、多精侵入等の異常受精が起こり発生率の低下することが知られている。これまでの研究の成果として、ブタ脂肪組織由来幹細胞(ASC)との共培養がブタ精子を活性化し、直進運動を促進することを突き止めた(特願2013−222630号)。このことからASCが精子に対し、何らかの機構の引き金を引くことが考えられた。そこで、本実験では、ブタASCが精子への作用と類似した活性化作用を卵子へ及ぼすか否かを検討する目的の下、ブタ卵子をブタASC(シート状)の上で体外成熟培養することがその後の受精へ及ぼす影響を調べた。
(a)シート状ブタASC上における卵子の成熟培養
(a−1)ブタASC
卵子の成熟培養1日目においては、24ウェルプレートのウェル内でシート状になるように培養したブタASCを、各ウェル当たり200μlの修正したNCSU37培養液(mNCSU37培養液;0.6 mM システイン、1 mM ジブチリルサイクリックAMP(dibutyryl cAMP)、10 iu/ml eCG、10 iu/ml hCG、ペンシリンナトリウム60μg/ml、硫酸ストレプトマイシン100μg/ml及び10% ブタ卵胞液を添加)で2回洗浄後、卵子の成熟培養に供した。2日目には、dibutyryl cAMP、eCG及びhCGを含まないmNCSU37培養液(200μl/ウェル)を用い、別のウェルでシート状になったブタASCを2回洗浄した後、卵子の成熟培養に供した。細胞を添加しないで同じ培養液のみ入れたウェルをコントロールとした。
と場にて未成熟雌ブタより卵巣を採取し、ペニシリンナトリウム60μg/ml及び硫酸ストレプトマイシン100μg/mlを添加した滅菌生理食塩水(35℃)に入れ、実験室まで持ち帰った。同様の滅菌生理食塩水で卵巣を洗浄後、卵巣表面の直径3〜6 mmの卵胞より卵子を吸引採取した。採取した卵胞を10% ウシ胎子血清(FCS)を添加した20 mM Hepes緩衝 M199培養液(ペニシリンナトリウム60 μg/ml及び硫酸ストレプトマイシン100 μg/ml添加)で4回洗浄した後、mNCSU37培養液で4回洗浄した。洗浄後、シート状ブタASCの入ったウェルあるいは入っていないウェルの同培養液中にて卵子を38.5℃、5%CO2/95%空気の気相下で20〜23時間培養した。成熟培養2日目には、dibutyryl cAMP、eCG及びhCGを含まないmNCSU37培養液で卵子を4回洗浄後、前述のとおり洗浄したシート状のASCの接着したウェルあるいは細胞を含まないウェル(コントロール)の中に卵子を入れ、同培養液中でさらに24時間培養した。
用手法にて採取した大ヨークシャー種雄豚の濃厚部精液をBTS希釈液(50μg/ml硫酸カナマイシン添加)で希釈後、17℃にて実験室まで運搬した。17℃にて使用まで約24時間保存後、2.5 mlの希釈精液をとり、室温にて10分間放置することにより細胞塊を沈殿させた。上清1.5 mlを0.1% PVA添加スクロース培地に重層し、120 g、5分間、続いて270 g、7分間遠心した後、上清を除去した。精子前培養用培地、すなわち修正M199培養液(M199に10%FCS、2.92 mM 乳酸カルシウム、0.91 mM ピルビン酸ナトリウム、3.05 mM グルコース、ペニシリンナトリウム60μg/ml、硫酸ストレプトマイシン100μg/mlを添加。pH 7.8)で洗浄後、同培養液に1×107精子/mlとなるように再浮遊し、38.5℃、5%CO2/95%空気の気相下で1.5時間(第1回実験)あるいは3時間(第2回実験)前培養した。
培養終了後卵子をKikuchiらの培養液(Kikuchi et al., Biol Reprod 66, 1033-1041(2002))を修正した培養液(8 mM CaCl2を4 mM 乳酸カルシウム・5H2O に置換し、2 mM カフェインおよび10 mg/mlのBSAを添加)で4回洗浄した。洗浄後、卵子を同培養液と共に40μlとなるように取り、マイクロドロップ内(50μl)に入れた(合計90μl)。前培養終了後の精子を優しく撹拌後に10μl取り、90μlの卵子の入った培養液へ授精した(最終精子濃度は1×106/ml)。8.5〜9.5 時間(第1回実験)あるいは13〜14時間(第2回実験)38.5℃、5%CO2/95%空気の気相下で培養後、酢酸エタノール(1:3)で卵子を固定した。72時間(第1回実験)あるいは120時間(第2回実験)固定後、アセトオルセイン染色を行い、精子の侵入と核相の判定を以下のとおり行った。
(i)精子の侵入率
精子が1つ以上侵入した卵子の割合
(ii)多精子受精率
精子が2つ以上侵入した卵子の割合
(iii)平均侵入精子数
受精卵当たり侵入した精子の平均値
(iv)前核形成率
雄性および雌性前核のいずれか一方あるいは両者の形成が認められた卵子の割合
(v)正常受精率
多精子侵入ではない正常に受精した卵子の割合(雌性前核と侵入精子、雌雄両前核形成)
第1回実験(図1上)では、シート状ブタASCの上で体外成熟培養したブタ卵子に精子を授精した場合(ブタASC)、ASC不在下で成熟培養した卵子(コントロール)に比べ精子侵入率、多精子受精率、平均侵入精子数および前核形成率が高い傾向にあり、特に、前核形成率では顕著な差が見られた。第2回実験(図1下)でも類似の傾向が見られ、雌性前核のみ形成した侵入卵がブタASC存在下の方が不在下よりも少なく、逆に雌雄両前核形成率はASC存在下の方が高かった。尚、シート状ブタASCの上で体外成熟培養したブタ卵子に精子を授精して得られた受精卵(典型例)を図2右に示す。二つの前核(PN)および二つの極体(PB)が見える。卵子由来・精子由来が各1個存在し、前核形成状態であることがわかる。図2左はコントロール(ASC不在下で成熟培養した卵子を使用した場合)の受精卵である。前核未形成状態(精子侵入が認められるが前核形成は行われていない)である。
卵の成熟は核・細胞質・膜の3つの成熟からなり、これら全てが良好に達成されたときにのみ、発生へと至る。正常な発生過程では、胚(受精卵)は卵管内で分割を繰り返し、約10時間後に前核と呼ばれる空胞のような構造が細胞内に出現する。通常、二つの前核(卵子由来と精子由来が各1個)が形成される。前核形成が起こらない場合あるいは多精子受精の場合には前核が三つ認められ、この受精卵は正常に発育しない。前核形成率が高いことは多精子受精を防ぐ卵成熟、卵活性を高める。このような評価方法に関して、卵管上皮とその培養液によって前核形成が促進されるとの報告(Bureau M, Bailey JL, Sirard MA.Zygote. Influence of oviductal cells and conditioned medium on porcine gametes. 2000 May;8(2):139-44.)がある。今回の実験では、卵子の体外成熟培養をシート状ASCの上で行うことにより、精子が受精する可能性が高まった。また、ASC上での成熟培養によって雌性又は雄性の前核形成率(第1回実験)あるいは雌雄両前核形成率(第2回実験)が高まっていたことは、ASCとの共培養によって、精子侵入後における受精卵の発生過程が早まることを示唆している。即ち、ASCによって卵子の成熟へ何らかの促進効果がもたらされたと考えられた。
上記実験の結果、ASCが卵子の活性を高め、雌雄両前核形成率を高めることが明らかとなった。本実験では体外受精後の発生状態を観察し、ASCが発生率に及ぼす影響を評価することにした。卵子の成熟培養及び精子の前培養は上記実験と同様の条件及び操作で行った。体外受精については以下の方法で行った。
培養終了後卵子をKikuchiらの培養液(Kikuchi et al., Biol Reprod 66, 1033-1041(2002))を修正した培養液(8 mM CaCl2を4 mM 乳酸カルシウム・5H2O に置換し、2 mM カフェインおよび10 mg/mlのBSAを添加)で4回洗浄した。洗浄後、卵子を同培養液と共に40μlとなるように取り、マイクロドロップ内(50μl)に入れた(合計90μl)。前培養終了後の精子を優しく撹拌後に10μl取り、90μlの卵子の入った培養液へ授精した(最終精子濃度は1×106/ml)。8 時間38.5℃、5%CO2/95%空気の気相下で培養後、発生用培養液(NCSU23培養液のグルコースを除き、0.17 mM ピルビン酸ナトリウム、2.73 mM 乳酸ナトリウムおよび 1% MEM non-essential amino acids (Gibco)を添加したNCSU-23培養液(Petters, R. M.,In Vitro Culture of Early Stage Embryos from Livestock, Tiss. Cult. Res. Commun. 11: 305-313, 1992; mNCSU23-1 培養液とする)で受精卵を4回洗浄後、同じ培養液で48時間、同じ気相条件下で培養した。次いで、ピルビン酸ナトリウムと乳酸ナトリウムを除き5.55 mMグルコースを添加したNCSU23培養液(mNCSU-23-2培養液とする)で4回洗浄後、同じ培養液で133時間まで培養した。培養後、実体顕微鏡および倒立顕微鏡下で受精卵を観察し、胚盤胞(初期胚盤胞、中期胚盤胞あるいは拡張胚盤胞)まで発育した受精卵の、培養した全受精卵に対する割合(発生率)を求めた。
コントロールでは、培養総数38個中1個(2.63%)が胚盤胞(初期胚盤胞)まで発生が進んだ(図3)。シート状ASCの上で体外成熟させた後、授精および初期発生させた受精卵では、総数48個のうち3個(6.25%)が胚盤胞(中期〜拡張胚盤胞が2個、拡張胚盤胞が1個)となり(図4)、コントロールに比べて発生の段階が進んでおり、即ち発生率が高い傾向にあった。
ASCが卵子の成熟過程で促進的に作用し(特に細胞質成熟に対して)、体外受精後の発生率が高まったものと推察された。このことは、ASCのシート上で成熟培養した卵子の方が体外受精後の前核形成率が高かったこと(先の実験の結果)からも伺えた。
Claims (14)
- 以下のステップ(1)を含む、卵子活性化方法:
(1)脂肪組織由来幹細胞と卵子とを共培養するステップ。 - 前記細胞と前記卵子が接触した状態で共培養される、請求項1に記載の方法。
- ステップ(1)において、前記細胞が細胞層を形成しており、該細胞層の上で前記卵子が培養される、請求項1又は2に記載の方法。
- ステップ(1)が以下の二つのステップを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法:
(1−1)性腺刺激ホルモンの存在下での培養ステップ;
(1−2)性腺刺激ホルモンの非存在下での培養ステップ。 - ステップ(1−1)が、性腺刺激ホルモン及びジブチリルサイクリックAMPの存在下で行われる、請求項4に記載の方法。
- 以下のステップ(2)を更に含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法:
(2)共培養後の卵子を回収するステップ。 - ステップ(2)において、共培養後の卵子が共培養後の前記細胞から分離した状態で回収される、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞の生物種と前記卵子の生物種が同一である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記卵子がヒト卵子である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記卵子が非ヒト哺乳動物卵子である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物がブタ、ウシ、ウマ、ヤギ又はヒツジである、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法で活性化した卵子であって、脂肪組織由来幹細胞と培養していな卵子と比較して前核形成率が高い卵子。
- 請求項12に記載の卵子を含有する、受精卵移植用卵子組成物。
- 脂肪組織由来幹細胞を含有する卵子活性化剤。
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