KR20100014504A - 분화된 세포를 리프로그래밍하고, 리프로그래밍된 세포로부터 동물 및 배아 줄기세포를 생성시키기 위한 고도로 효율적인 방법 - Google Patents

분화된 세포를 리프로그래밍하고, 리프로그래밍된 세포로부터 동물 및 배아 줄기세포를 생성시키기 위한 고도로 효율적인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전반적으로 체세포핵이식(SCNT) 분야 및 클로닝된 동물과 세포를 생성시키는 것에 관한 것이다. 본원의 기재내용은 포유류를 클로닝하거나, 배아 줄기세포와 같은 다능성 세포를 수득하거나, 난모세포 및 수정된 배아를 사용하여 포유류 세포를 리프로그래밍하는 방법에 관한 것이다.

Description

분화된 세포를 리프로그래밍하고, 리프로그래밍된 세포로부터 동물 및 배아 줄기세포를 생성시키기 위한 고도로 효율적인 방법 {HIGHLY EFFICIENT METHODS FOR REPROGRAMMING DIFFERENTIATED CELLS AND FOR GENERATING ANIMALS AND EMBRYONIC STEM CELLS FROM REPROGRAMMED CELLS}
발명의 분야
본 발명은 전반적으로 체세포핵이식(SCNT) 분야 및 동물과 세포를 생성시키는 것에 관한 것이다.
관련 출원
본원은 2007년 2월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 60/902,970, 2007년 3월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 60/918,543, 2007년 9월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 60/993,772 및 2007년 12월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 61/009,432를 우선권으로 주장하며, 이들 가출원의 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
발명의 배경
인간 배아 줄기세포("hES" 세포)의 시험관내 단리(isolation) 및 증식과 같은 줄기세포 기술의 진보는 중요한 신규 의료 연구 분야를 구성한다. hES 세포는 미분화된 상태로 증식된 다음 후속하여 복잡한 조직을 포함하는 인체의 임의의 그리고 모든 세포 유형으로 분화되도록 유도될 수 있는 입증된 잠재력을 지닌다. 이는 세포의 기능장애로부터 초래되는 많은 질병이 다양한 분화 유형을 지닌 hES 유래된 세포의 투여에 의해 치료될 수 있음을 시사하기에 이르렀다 (Thomson et al, Science 282:1 145-1147 (1998)). 핵이식 연구는 분화된 체세포를 다시 분화전능성(totipotent) 상태, 예를 들어 배아 줄기세포 ("ES") (Cibelli et al, Nature Biotech 16:642-646 (1998)) 또는 배아 유래된(embryo-derived, "ED") 세포의 상태로 변환시키는 것이 가능함을 입증하였다. 종종 체세포핵이식("SCNT")으로 일컬어지는, 체세포의 게놈을 핵제거된(enucleated) 난모세포로 이식하고 재구성된 배아를 후속 배양하여 ES 세포를 생성시킴에 의해 이루어지는 바와 같은, 체세포를 분화전능성 ES 세포 상태로 다시 리프로그래밍(reprogramming)하는 기술을 개발하는 것은 환자의 핵 유전자형을 지닌 ES 유래된 체세포를 이식하는 방법을 제공한다 (Lanza et al., Nature Medicine 5:975-977 (1999)). 이러한 세포 및 조직은 동종이계(allogeneic) 미토콘드리아의 존재에도 불구하고 거부되지 않을 것으로 예상된다 (Lanza et al, Nature Biotech 20:689-696, (2002)). 핵이식은 또한 초기 배아내의 텔로머라제 촉매 성분의 재활성화를 통해 세포에서 텔로미어 반복 길이를 재건(rebuilding)할 수 있게 해준다 (Lanza et al, Science 288:665-669, (2000)). 그럼에도 불구하고, 성공적이고 완전한 리프로그래밍의 빈도를 증가시키도록 동물 세포를 리프로그래밍하는 방법을 개선시킬 필요가 있는 실정이다. 또한, 인간 난모세포의 이용가능성에 대한 의존도를 감소시킬 필요성이 또한 존재한다.
체중 증가, 유즙(milk) 함량, 유즙 생산량, 수유 간격의 길이 및 질병 내성과 같은 특정한 요망되는 형질 또는 특질을 지닌 동물이 오랫동안 요망되어 왔다. 전통적인 육종 방법은 일부 요망되는 특정 형질을 지닌 동물을 생성시킬 수 있지만, 이러한 형질은 종종 다수의 요망되지 않는 특질을 수반하며, 종종 너무 시간이 소요되고, 비용이 많이 들고, 개발 여부를 신뢰할 수 없다. 더욱이, 이러한 방법은 특정 동물 계통이 유전자 산물, 예를 들어 당해 종의 유전자 총체(genetic complement)에는 어떤 식으로든 전혀 없는 바람직한 단백질 치료제 (즉, 인간 또는 인간화된 혈장 단백질 또는 우유 중의 다른 분자)를 생성시키는 것을 전혀 가능하게 할 수 없다.
유전자이식 동물을 생성시킬 수 있는 기술을 개발하는 것은 특정 형질을 지니도록 엔지니어링된(engineered) 동물 또는 치료적, 과학적 또는 상업적 가치가 있는 특정 단백질 또는 다른 분자 화합물을 발현하도록 설계된 동물을 생성시키는 데에 있어서 이례적인 정확성을 위한 수단을 제공한다. 즉, 유전자이식 동물은 초기 발달 단계(developmental stage)에서 기존의 체세포 및/또는 생식세포내로 의도적으로 도입된 관심있는 유전자(들)을 지닌 동물이다. 동물이 발달하고 성장함에 따라, 동물내로 엔지니어링된 단백질 산물 또는 특정 발달 변화가 뚜렷해지고, 이는 이러한 동물의 유전자 총체 및 이러한 동물의 자손의 유전자 총체에 존재한다.
기존의 체세포 기술과 관련된 또 다른 문제는 줄기세포를 수득하기 위해 진행된 인간 배아(advanced human embryo)를 사용하는 것에 대한 윤리적 고려이다. 따라서, 윤리적 우려에 한계를 두기 위해 클로닝된 배아를 초기 단계에서 이용가능하게 하는 것이 매우 유리할 것이다.
요약하면, 본 발명은 효율, 윤리적 딜레마 및 난모세포없이 배아를 클로닝하는 방법에 관한 문제와 관련된 숙원 문제를 해결해준다.
발명의 개요
본 발명은 전반적으로 수용자(recipient)로서 수정된 배아를 사용하여 체세포를 클로닝하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 난모세포는 최초 수용자이고, 수정된 배아는 2차 수용자이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 포유류를 클로닝하거나, 다능성(pluripotent) 세포를 수득하거나, 포유류 세포를 리프로그래밍하는 방법에 관한 것이다.
특정 일면에서, 본 발명은 분화된 세포, 동물의 핵제거된(enucleated) MII기 난자 및 동물의 핵제거된 2세포기 배아를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된(synchronized) 것인 단계; 상기 분화된 세포의 핵을 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계; 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계; 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자가 2세포기로 발달되게 하는 단계; 앞의 단계로부터의 상기 활성화된 2세포기 난자의 1개 이상의 핵 및 주위 세포질의 일부 또는 전부를 분리해내는 단계; 앞의 단계에서 분리된 상기 1개 이상의 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 상기 분화된 세포의 리프로그래밍된 핵을 함유하는 단일 세포를 생성시키는 단계로서, 상기 융합은 바람직하게는 상기 핵을 상기 2세포기 배아의 2개 세포 사이에 위치시킴으로써 이루어지는 단계를 포함하여 분화된 세포의 핵을 리프로그래밍하는 방법을 제공한다.
특정 일면에서, 본 발명은 분화된 세포, 동물의 핵제거된 MII기 난자 및 동물의 핵제거된 2세포기 배아를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된 것인 단계; 상기 분화된 세포의 핵을 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계; 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계; 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자가 2세포기로 발달되게 하는 단계; 앞의 단계로부터의 상기 2세포기 난자의 1개 이상의 핵 및 주위 세포질의 일부 또는 전부를 분리해내는 단계; 앞의 단계에서 분리된 상기 1개 이상의 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 단일 세포를 생성시키는 단계; 및 앞의 단계로부터의 상기 단일 세포를 배양하여 동물로 발달되게 하는 단계를 포함하여 동물을 생성시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 배양한다는 것은 상기 배양된 세포를 동물의 자궁내로 착상(implanting)시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 착상된 세포 및 이러한 세포가 착상된 동물은 동일한 종이다.
특정 일면에서, 본 발명은 분화된 세포, 동물의 핵제거된 MII기 난자 및 동물의 핵제거된 2세포기 배아를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된 것인 단계; 상기 분화된 세포의 핵을 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계; 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계; 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자가 2세포기로 발달되게 하는 단계; 앞의 단계로부터의 상기 2세포기 난자의 핵 및 주위 세포질을 분리해내는 단계; 앞의 단계에서 분리된 상기 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 단일 세포를 생성시키는 단계로서, 상기 융합은 상기 핵을 상기 2세포기 배아의 2개 세포 사이에 위치시킴으로써 이루어지는 단계; 및 앞의 단계로부터의 상기 단일 세포를 배아 줄기세포가 유래될 수 있는 발달 단계로 배양하는 단계를 포함하여 배아 줄기세포를 생성시키는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 상기 배아 줄기세포는 MHC 대립유전자에 대해 반접합성(hemizygous) 또는 동형접합성(homozygous)이고, 여기서 상기 분화된 세포는 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이거나, 상기 배아 줄기세포는 상동 재조합, 이형접합성의 상실 또는 둘 모두에 의해 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이 되도록 엔지니어링되고, 상기 동일한 종은 인간이다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 배아 줄기세포의 뱅크(bank)를 생성시키도록 여러 차례 반복되며, 상기 배아 줄기세포 각각은 상기 뱅크의 다른 배아 줄기세포와는 상이한 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이다.
특정 일면에서, 본 발명의 방법은 앞서의 방법으로부터 생성된 상기 단일 세포를 할구기(blastomere stage), 상실배기(morula stage) 또는 배반포기(blastocyst stage)로 성장시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 일면에서, 본 발명의 방법은 난모세포내로 연속 핵이식(serial nuclear transfer)하는 것을 추가로 포함한다. 특정 일면에서, 본 발명의 방법은 배아내로 연속 핵이식하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 난자는 시클로헥사미드, CsCl2, 칼슘 이오노포어(ionopore), 이오노마이신(ionomycin), 정자 인자(sperm factor), 정자 일부(sperm portion) 또는 정자 성분(sperm component), 6-DMAP, SrCl2, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 또는 이들의 임의의 조합물에 의해 활성화된다. 특정 구체예에서, 상기 난자는 이들 작용제의 조합물에 의해 활성화된다. 바람직한 구체예에서, 상기 난자는 이오노마이신과 6-DMAP의 조합물에 의해 활성화된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 난자는 칼슘 이오노포어와 6-DMAP의 조합물에 의해 활성화된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 난자는 SrCl2와 사이토칼라신 B의 조합물에 의해 활성화된다.
특정 구체예에서, 상기 융합 단계는 전기적으로 수행된다. 특정 구체예에서, 상기 전기적 융합은 상기 핵이 양극(positive pole)과 일렬로 정렬되고 전기 충격이 가해지는 첫 번째 단계 및 상기 배아와 상기 핵이 약 90도 회전되고 전기 충격이 가해지는 두 번째 단계의 두 단계로 수행된다. 특정 구체예에서, 배아와 핵은 충격이 가해지기 전에 회전하지 않는다. 특정 구체예에서, 상기 융합 단계는 센다이(Sendai) 바이러스를 사용하여 수행된다.
특정 구체예에서, 상기 MII기 난자는 인간 난자이다. 특정 구체예에서, 상기 핵제거된 2세포기 배아는 인간 배아이다. 특정 구체예에서, 상기 분화된 세포는 인간 세포이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 세포는 임의의 포유류로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 포유류는 마우스, 랫트, 고양이, 개, 토끼, 염소, 햄스터, 돼지, 양, 인간 이외의 영장류, 또는 영장류로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 상기 MII기 난자와 상기 핵제거된 2세포기 배아는 임의의 동물로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 상기 MII기 난자와 상기 핵제거된 2세포기 배아는 동일한 종으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 상기 분화된 세포와 상기 MII기 난자는 동일한 종으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 상기 분화된 세포와 상기 핵제거된 2세포기 배아는 동일한 종으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 상기 분화된 세포, 상기 MII기 난자 및 상기 핵제거된 2세포기 배아는 동일한 종으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 상기 동일한 종은 인간이다.
특정 일면에서, 본 발명은 포유류를 클로닝하거나, 다능성 세포를 수득하거나, 포유류 세포를 리프로그래밍하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 포유류 세포로부터 공여 핵을 수득하는 단계; (b) 포유류로부터 수정된 배아를 수득하는 단계; (c) 상기 공여 핵을 상기 수정된 배아의 1개의 세포내로 이식하는 단계; (d) 상기 수정된 배아의 본래의 핵을 제거하여, 상기 수정된 배아 내부에 공여 핵이 남게 하는 단계; 및 (e) 상기 수정된 배아를 배양하는 단계로 구성된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법의 핵제거 단계는 핵이식 단계후 3시간째 내지 6시간째, 핵이식 단계후 4시간째 내지 6시간째, 핵이식 단계후 5시간째 내지 6시간째, 핵이식 단계후 3시간째 내지 4시간째, 핵이식 단계후 3시간째 내지 5시간째, 또는 핵이식 단계후 4시간째 내지 5시간째에 수행된다. 특정 구체예에서, 핵제거 단계는 핵이식 단계후 3시간내에, 핵이식 단계후 2시간내에, 또는 핵이식 단계후 1시간내에 수행된다. 특정 구체예에서, 핵제거 단계는 핵이식 단계후 1시간째 내지 2시간째, 핵이식 단계후 1시간째 내지 3시간째에, 핵이식 단계후 1시간째 내지 4시간째에, 핵이식 단계후 1시간째 내지 5시간째에, 핵이식 단계후 1시간째 내지 6시간째, 핵이식 단계후 2시간째 내지 3시간째에, 핵이식 단계후 2시간째 내지 4시간째에, 핵이식 단계후 2시간째 내지 5시간째에, 또는 핵이식 단계후 2시간째 내지 6시간째에 수행된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 클로닝된 배아를 배양하면 세포의 배반포 또는 배반포 유사(blastocyst-like) 집합체가 생성된다. 특정 구체예에서, 배아 줄기세포는 이러한 세포의 배반포 또는 배반포 유사 집합체로부터 유래될 수 있다. 특정한 다른 구체예에서, 클로닝된 배아를 배양하면 4세포기 내지 8세포기 배아 또는 상실배기 배아가 생성된다. 특정 구체예에서, 배아 줄기세포는 이러한 초기 난할기(early cleavage stage) 또는 상실배기 배아의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 특정한 다른 구체예에서, 클로닝된 배아를 배양하면 2세포기를 넘어서 분열을 지속하는 배아로 발달된다. 특정 구체예에서, 배아 줄기세포주가 유도되고 확립된다.
본 발명의 특정 일면에서, 수정된 배아는 포유류 공여 세포와 동일한 종의 포유류로부터 유래된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 수정된 배아는 포유류 공여 세포와 밀접하게 관련된 종의 포유류로부터 유래된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 수정된 배아는 전핵 단계(pronuclear stage) 배아이다. 특정 구체예에서, 상기 수정된 배아는 2세포기 배아이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 포유류 공여 세포는 ES 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 포유류 세포는 분화된 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 분화된 포유류 세포는 난구세포이다. 특정 구체예에서, 상기 포유류 세포는 뮤린(murine) 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 포유류 세포는 소(bovine) 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 포유류 세포는 인간 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 말, 개, 돼지, 양을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 그 밖의 포유류 종으로부터 유래될 수 있거나, 랫트와 같은 설치류 종이 사용될 수 잇다. 특정 구체예에서, 수정된 배아는 동결 보존되어, 핵이식 단계 전에 해동되었다.
특정 구체예에서, 공여 핵은 표지된다. 특정 구체예에서, 상기 핵은 형광 이식유전자의 발현에 의해 표지된다.
특정 일면에서, 본 발명은 (a) 포유류 세포로부터 공여 핵을 수득하는 단계; 포유류로부터 제 1의 수정된 배아를 수득하는 단계; (c) 상기 공여 핵을 상기 제 1의 수정된 배아내로 이식하는 단계; (d) 상기 제 1의 수정된 배아의 본래의 핵을 제거하여, 상기 수정된 배아 내부에 공여 핵이 남게 하는 단계; e) 상기 수정된 배아를 배양하는 단계; (f) 제 2의 수정된 포유류 배아의 핵을 제거하는 단계; (g) 단계 (e)로부터의 제 1의 수정된 배아의 세포를 해리(dissociating)시키고, 1개 이상의 세포를 핵제거된 제 2의 수정된 배아내로 이식하는 단계; (h) 상기 이식된 세포를 상기 핵제거된 제 2의 수정된 배아의 세포에 융합시킴으로써 단일 세포 배아를 형성하는 단계; 및 (i) 상기 클로닝된 단일 세포 배아를 배양하는 단계를 포함하여 포유류 세포를 클로닝하는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 이전 사이클(cycle)의 단계 (i)로부터 산출되는 단계 (g)에서 수득된 수정된 배아를 가지고 단계 (f) 내지 (i)가 1회를 초과하여 사이클링된다. 특정 구체예에서, 단계 (h) (융합 단계)는 전기융합에 의해 달성된다. 특정 구체예에서, 단계 (g)는 단계 (e)로부터의 수정된 배아의 1개 이상의 핵을 핵제거된 제 2의 수정된 배아내로 이식하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 제 2의 수정된 배아는 제 1의 수정된 배아와 동일한 발달 단계에 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 제 2의 수정된 배아는 제 1의 수정된 배아와 유사한 발달 단계에 있다. 유사한 단계는 포배기(blastula stage)와 같은 동일한 일반 단계에 있는 배아 또는 유사한 세포수기(cell number stage) 발달 시점의 배아를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 제 2의 수정된 배아 및 상기 제 1의 수정된 배아는 2세포기에 있고, 2개의 세포 중 단지 1개가 이식된다.
특정 일면에서, 본 발명은 (a) 포유류 세포로부터 요망되는 공여 핵을 수득하는 단계; (b) 포유류로부터 적어도 2세포기의 1개 이상의 수정된 배아를 수득하는 단계; (c) 공여 핵을 수정된 배아의 세포의 전부는 아니지만 1개 이상내로 이식하는 단계로서, 1개의 공여 핵이 각각의 세포내로 이식되는 단계; (d) 공여 핵이 이식된 상기 배아의 세포 각각의 본래의 핵을 제거하여, 상기 세포에 공여 핵이 남게 하는 단계; 및 (e) 상기 수정된 배아(들)를 배양하는 단계를 포함하여, 포유류를 클로닝하거나, 다능성 세포를 수득하거나, 포유류 세포를 리프로그래밍하는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 수정된 배아는 2세포기 배아이고, 공여 핵은 상기 배아의 2개의 세포 중 단지 1개에 이식된다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 수정된 배아는 임의의 단계의 배아일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 활성화된 난모세포는 2세포기에 있는 핵이식 수용자이다. 특정 구체예에서, 난모세포는 임의의 단계에 있다. 특정 구체예에서, 난모세포와 배아는 동기화(synchrony)되어 있다.
특정 구체예에서, 공여 핵을 이식하는 단계는 핵제거 단계 바로 전에 수행된다.
특정 일면에서, 본 발명은 수정된 배아로부터 유래된 배반포에 관한 것이며, 여기서 상기 수정된 배아는 본 발명의 방법들 중 임의의 방법에 의해 생성된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 방법들 중 임의의 방법에 의해 생성된 포배(blastula)에 관한 것이다.
전술한 일면들 중 임의의 일면의 특정 구체예에서, 배아 줄기세포 또는 배아 줄기세포주는 클로닝된 배아의 일부 또는 전부를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 배아 줄기세포 또는 세포주는 배반포기 클로닝된 배아의 일부 또는 전부를 사용하거나 초기 난할기 또는 상실배기 배아의 전부 또는 일부를 사용하여 생성될 수 있다.
특정 일면에서, 본 발명은, (a) 분화된 세포, 동물의 핵제거된 MII기 난자 및 동물의 2세포기 배아를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된 것인 단계; (b) 상기 분화된 세포의 핵을 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계; (c) 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계; (d) 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자가 2세포기로 발달되게 하는 단계; (e) 단계 (d)로부터의 상기 2세포기 난자의 핵 및 주위 세포질을 분리해내는 단계; (f) 단계 (e)에서 분리된 상기 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 단일 세포를 생성시키는 단계로서, 상기 융합은 바람직하게는 상기 핵을 2세포기 배아의 2개 세포 사이에 위치시킴으로써 이루어지는 단계; 및 (g) 상기 단계 (f)로부터의 상기 단일 세포를 배양하여 배아 줄기세포가 유도될 수 있는 발달 단계로 배양하는 것을 포함하여 배아 줄기세포를 생성시키는 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 단계 (g)는 (i) 상기 단계 (f)로부터의 상기 단일 세포를 상실배기로 배양하여 상실배를 생성시키고, (ii) 상기 상실배로부터 할구를 단리하고, (iii) 상기 할구를 배양하여 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터(cluster)를 생성시키고, (iv) 2개 또는 그 초과의 할구의 배양된 클러스터를 직접적으로 또는 간접적으로 배아 또는 태아 세포와 접촉시키고; (v) ES 세포가 생성될 때까지 상기 (iv)의 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터를 배양하는 것을 포함한다.
특정 일면에서, 본 발명은 (a) 포유류 모체 배아(parental embryo)로부터 분리되거나 생검된 할구와 상기 모체 배아를 12시간 내지 18시간 동안 함께 배양하고; (b) 할구를, 라미닌을 추가로 포함하고 마우스 배아 섬유아세포(MEF)가 접종(seeding)된 배반포 배지로 옮기고; (c) 배아 줄기(ES) 세포가 생성될 때까지 상기 (b)의 할구를 배양하는 것을 포함하여, ES 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
특정 일면에서, 본 발명은 (a) 포유류 모체 배아로부터 분리되거나 생검된 할구와 상기 모체 배아를 함께 배양하고; (b) 할구를, 라미닌 또는 피브로넥틴을 추가로 포함하는 배반포 배지로 옮기고; (c) 배아 줄기(ES) 세포가 생성될 때까지 상기 (b)의 할구를 배양하는 것을 포함하여, ES 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
특정 일면에서, 본 발명은 (a) 동물의 핵제거된 MII기 난자, 분화된 세포 및 동물의 핵제거된 2세포기 난자를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된 것인 단계; (b) 상기 분화된 세포를 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계; (c) 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계; (d) 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자를 2세포기로 발달되게 하는 단계; (e) 상기 단계 (d)로부터의 상기 2세포기 난자의 핵 및 주위 세포질을 분리해내는 단계; (f) 상기 단계 (e)에서 분리된 상기 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 단일 세포를 생성시키는 단계로서, 상기 융합은 바람직하게는 상기 핵을 2세포기 배아의 2개 세포 사이에 위치시킴으로써 이루어지는 단계; (g) 상기 단계 (f)로부터의 상기 단일 세포를 배양하여 상실배를 생성시키는 단계; (h) 상기 상실배(예를 들어, 이러한 상실배는 모체 배아임)로부터 할구를 단리하는 단계; (i) 상기 할구 및 모체 배아를 12시간 내지 18시간 동안 함께 배양하는 단계; (j) 할구를, 라미닌 또는 피브로넥틴을 추가로 포함하고 마우스 배아 섬유아세포(MEF)가 접종된 배반포 배지로 옮기는 단계; 및 (k) ES 세포가 생성될 때까지 할구를 배양하는 단계를 포함하여 배아 줄기세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예에서, MEF는 유사분열 비활성화(mitotically inactivated)된다. 특정 구체예에서, 단계 (c)는 배아 소포 형성을 감소시키는 조건에서 배양하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 배반포 배지는 2.5 ㎍/ml의 라미닌을 포함한다. 특정 구체예에서, 배반포 배지는 10 ㎕/ml의 라미닌을 포함한다. 특정 구체예에서, 배반포 배지는 약 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 또는 20 ㎍g/ml의 라미닌을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 배지는 1-5, 1-10, 5-10, 10-20 또는 1-20 ㎍/ml의 라미닌으로 보충된다. 특정 구체예에서, 상기 배지는 적어도 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 또는 20 μg/ml의 라미닌으로 보충된다.
특정 구체예에서, 상기 방법들의 단계 (c)는 MEF 세포가 접종된 배반포 배지에서 5일간 배양하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, MEF 세포가 접종된 배반포 배지에서 배양하는 것은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일간 수행된다. 특정 구체예에서, 상기 방법들의 단계 (c)는 할구가 약 20개 세포의 세포 클럼프(clump)를 형성할 때까지 배양하고, 이러한 세포 클럼프를 ES 세포가 접종된 배지로 옮기는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 세포 클럼프는 약 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 세포이다. 특정 구체예에서, ES 세포는 마커를 발현하거나 표지된다. 특정 구체예에서, ES 세포는 GFP를 발현한다. 특정 구체예에서, 모체 배아는 배반포 배지로 옮겨져서 배반포로 발달하게 된다. 특정 구체예에서, 할구는 배아로부터 단리되는데, 이는 (a) 배아를 고정시키고; (b) 할구가 단리될 때까지 상기 고정된 배아를 탭핑(tapping)하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 1개를 초과하는 할구가 모체 배아로부터 분리되거나 생검된다. 예를 들어, 2개의 할구가 모체 배아로부터 생검되어 ES 세포를 유도시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 배아 줄기세포는 배아를 파괴할 필요가 없고/없거나 배아의 파괴를 초래하지 않는 방법을 이용하여 생성된다. 예를 들어, 배아 줄기세포가 상실배기 모체 배아의 단일 할구로부터 생성되는 경우, 상기 모체 배아의 잔존 부분은 후속하여 장기간 또는 영구적 저장을 위해 동결될 수 있거나 임신(pregnancy)을 일으키기 위해 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 포유류 모체 배아로부터 분리되거나 생검된 할구와 상기 포유류 모체 배아는 약 6 내지 12시간, 6 내지 18시간, 6 내지 24시간, 12 내지 18시간, 12 내지 24시간, 또는 18 내지 24시간 동안 함께 배양된다.
본원은 이러한 일면들 중 임의의 일면을 개별적으로 사용하거나 본 발명의 구체예 및 전술된 일면들 또는 후술되는 일면들 중 임의의 일면을 조합하여 사용하는 것을 고려한다.
도면의 간단한 설명
도 1A-1B는 연속 클로닝(serial cloning) 절차에 의해 클로닝된 마우스 배아를 도시한다. GFP 양성 ES 세포 핵을 수용자 배아내로 주입하였다. 배아는 명시야 현미경검사 (A) 및 형광 현미경검사 (B)하에 도시되어 있다.
도 2A-2C는 헬퍼 세포의 존재하에서 2개의 세포 클로닝된 배아의 발달을 도시한다. 주입된 GFP 양성 ES 세포 핵은 4세포기 (A), 8세포기 (B), 및 배반포기 (C)로 발달할 수 있는 모자이크 배아를 형성하였다.
도 3은 클로닝된 F2GFP 마우스를 도시한다. 10주령된 F2GFP 마우스가 UV 광하에서 녹색 형광을 방출하고 있다 (화살표).
도 4는 GFP 클로닝된 마우스 유전적 구성(genetic makeup)을 확인하는 도면이다.
도 5는 DBA2 클론 1 핑거프린팅(fingerprinting)을 도시한다.
도 6은 F2GFP 난구세포 클로닝된 배아에서의 H19 유전자 발현을 도시한다.
도 7은 F2GFP 난구세포 클로닝된 배아에서의 IGF-2 유전자 발현을 도시한다.
도 8은 F2GFP 난구세포 클로닝된 배아에서의 Oct-4 유전자 발현을 도시한다.
도 9A-9C는 ES 세포 마커 및 연속 클로닝된 배아로부터의 ES 세포의 기형종 형성을 도시한다. (A) ES 세포 마커. (B) 기형종. (C) 키메라 새끼(chimeric pup).
도 10은 핵이식 및 연속 핵이식 방법을 개략적으로 도시한다.
도 11A-11C는 배아 파괴없이 단일 할구로부터의 hESC 세포주의 유도 및 특성화를 도시한다. 패널 A: 단일 할구로부터 hES 세포의 유도 단계. (a) - 할구 생검, (b) - 생검된 할구 (화살표) 및 모체 배아가 서로 이웃하여 발달중에 있음, (c) MEF상에서의 단일 할구의 최초 아웃그로쓰(initial outgrowth), 6일째, 배율 x200, (d) - 단일 할구 유래된 hES 세포의 콜로니, 배율 x200. 패널 B: 생검된 모체 배아에 의해 형성된 배반포 (a) 및 단일 할구 유래된 hES 세포주에서의 다능성의 마커 (b-i); (b) 알칼리 포스파타제, (c) - Oct-4, (d) - Oct4 및 Nanog에 상응하는 DAPI, (e) - Nanog, (f) - SSEA-3, (g) - SSEA-4, (h) - TRA-1-60, (i) - TRA-1-81; 본래의 배율(original magnification): 패널 A(a), 40Ox, 패널 A(b-d) 및 B, 20Ox, 예외적으로 NED5 g & h, 10Ox. 패널 C: 생체내 (a-d) 및 시험관내 (e-g)에서의 단일 할구 유래된 hESC의 3배엽으로의 분화. (a) -- 모든 3배엽의 유도체를 보여주는 기형종. cre, 섬모 호흡 상피, 보다 높은 배율에서 섬모를 보여주는 인셋(inset)을 포함함; int, 장 상피; cart, 연골; ne, 망막 색소 상피(rpe)가 결합된 원주상 신경상피. (b-d), 다른 기형종으로부터의 예, (b) 세기관지 네스트(nest); (c) 평활근 액틴에 대해 염색된 근육; (d) cdx2에 대해 염색된 장 상피. (e-g) -- 시험관내에서 분화된 유도체의 예: (e) 조혈 및 내피 잠재력 둘 모두를 지닌 혈관아세포(hemangioblast) 콜로니. (f) 박동(beating) 심장 세포를 지닌 배상체 (g), 망막 색소 상피. 배율: a-f 20Ox, g 10Ox.
도 12A-12I는 단일 할구 유래된 hES 세포의 3배엽으로의 분화의 예 (a-c) 및 치료적 가치가 있는 세포 유형 (d-i)을 도시한다. 3배엽 마커에 대한 항체를 이용한 면역염색: 튜불린 β III (a), 평활근 액틴 (b), α-페토 단백질 (c). 분화된 유도체의 예: 조혈 및 내피 잠재력 둘 모두를 지닌 혈관아세포 콜로니 (d). KDR (e) 및 CD31 (f)에 대한 항체를 사용한 내피 세포의 면역염색; 박동 심장 세포를 지닌 배상체 (g), 망막 색소 상피 (h,i). RT-PCR은 RPE 마커 PEDF (레인 1, 300 bp) 및 RPE65 (레인 2, 285 bp), 양성 대조군 GAPDH (레인 3, 465 bp)를 보여준다. 배율: a-c, e,f- 2Ox; d,g - 10x, h - 40x.
도 13A-13B는 단일 할구 유래된 hES 세포의 마이크로새털라이트(microsatellite) 및 PCR 분석을 도시한다. A - 단일 할구 유래된 hES 세포에 GFP가 없음을 확인해주는 DNA PCR. 레인 1, 양성 대조군 WA01(H1) hES 세포주, 레인 2, 음성 대조군 (주형(template) 없음), 레인 3, NED1, 레인 4, NED 2, 레인 5, NED 3, 레인 6, NED4. B - 단일 할구 유래된 hES 세포주의 마이크로새털라이트 분석.
도 14는 단일 할구 유래된 hES 세포주의 핵형(karyotype)을 도시한다.
도 15A-15H는 단일 할구 발달 및 hES 세포에 대한 라미닌의 효과를 도시한다. (A-C) 라미닌의 부재하에서의 영양외배엽(trophectoderm) 유사 소포의 형성. (A) 호프만 모듈레이션 콘트라스트(Hoffman modulation contrast), (B) cdx2에 대한 면역염색, (C) 사이토케라틴 8(cytokeratin 8)에 대한 면역염색. (D-F) 라미닌의 존재하에서의 ICM 유사 아웃그로쓰의 형성. (D) 위상차, (E) Oct-4에 대한 면역염색, (F) 상응하는 DAPI 영상. (G-I) hESC상에서의 라미닌의 탈분극 효과. (G,H) 밀착 연접 마커 ZO-1 (녹색)과 다능성 마커 Oct-4 (적색)로 동시염색된(costained) 대조군 (G) 및 라미닌 (H)이 오버레이(overlay)된 hESC (WA07)의 공초점 현미경검사. 대조군 (좌측) 및 라미닌 (우측)이 오버레이된 hESC 콜로니 (WA09)의 횡단면의 초미세구조 분석 (준초박 절편(semithin section)). 대조 콜로니는 준중층(semistratified) 상피로 조직화된다. 첨단부 미세융모(apical microvilli) (mv) 및 밀착 연접 (데이터는 제시되지 않음)의 존재는 상피 유사 분극에 전형적인 구조적 특수화(structural specialization)를 나타낸다. 라미닌 오버레이는 세포 표면상의 미세융모의 결여 및 다중층 구조를 형성하는 세포의 파일링(piling)에 의해 나타나는 바와 같이 세포 탈분극을 유도하였다. 배율: (A-F) 20Ox, (G,H) 630X, (I) 400x
발명의 상세한 설명
정의
"배아 줄기세포" (ES 세포)라는 용어는 세포주로서 연속 계대된 배반포 또는 상실배의 내부 세포괴(cell mass)로부터 유래된 세포를 지칭한다. ES 세포는 정자 또는 DNA에 의한 난세포의 수정, 핵이식, 단성생식으로부터 유도되거나, MHC 영역에서 동형접합성을 지닌 hES 세포를 생성시키기 위한 수단에 의해 유도될 수 있다. "인간 배아 줄기세포" (hES 세포)라는 용어는 인간 ES 세포이다.
"다능성 줄기세포"라는 용어는 1개를 초과하는 분화된 세포 유형으로 분화될 수 있는 동물 세포를 지칭한다. 이러한 세포는 hES 세포, 인간 배아 유래된 세포(hEDC), 및 중간엽 줄기세포, 신경 줄기세포 및 골수 유래된 줄기세포를 포함하는 성체 유래된 세포를 포함한다. 다능성 줄기세포는 유전적으로 변형되거나 유전적으로 변형되지 않을 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 난자내에서 이의 확인이 용이하게 되도록 형광 단백질과 같은 마커를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "분화된 세포"라는 용어는 체세포 계통으로 분화되는 과정에 있거나 최종 분화된 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 배아 세포는 장 내벽에 존재하는 상피세포로 분화될 수 있다. 분화된 세포는 예를 들어 태아 또는 살아서 출생한 동물로부터 단리될 수 있다.
배아와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "착상시키는"이라는 용어는 암컷 동물에게 본 명세서에 기재된 배아를 주입하는 것을 지칭한다. 이러한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: Seidel and Elsden, 1997, Embryo Transfer in Dairy Cattle, W. D. Hoard & Sons, Co., Hoards Dairyman). 배아가 자궁에서 발달하게 될 수 있거나, 태아가 분만 전에 자궁 환경으로부터 분리될 수 있다.
발정 주기와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "동기화된(synchronized)" 또는 "동기(sychronous)"라는 용어는 당업자에게 널리 공지된 보조 생식 기술을 지칭한다. 이러한 기술은 이전 단락에서 인용된 참고문헌에 상세히 기재되어 있다. 전형적으로, 암컷 동물의 발정 주기를 배아의 발달 주기와 동기화시키기 위해 에스트로겐 및 프로게스테론 호르몬이 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 "발달 주기"라는 용어는 본 발명의 배아 및 배아내에서의 각 세포 분열 사이에 존재하는 시간 간격을 지칭한다. 이러한 시간 간격은 배아에 대해 예측할 수 있고, 수용 동물의 발정 주기와 동기화될 수 있다.
배아와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "배양하는"이라는 용어는 배아를 배지에 넣는 것을 포함하는 실험실 절차를 지칭한다. 배아는 이러한 배아가 정지 상태이지만 배지에서 기능할 수 있게 되거나 이러한 배아가 배지에서 성장할 수 있게 하기에 적절한 시간 동안 배지에 넣어질 수 있다. 배아를 배양하기에 적절한 배지는 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: 퍼스트(First) 등의 미국 특허 번호 5,213,979 (명칭: "In vitro Culture of Bovine Embryos," 허여일: 1993년 5월 25일) 및 로젠크란스 쥬니어(Rosenkrans, Jr.) 등의 미국 특허 번호 5,096,822 (명칭: "Bovine Embryo Medium," 허여일: 1992년 3월 17일), 상기 두 미국 특허는 모든 수치, 표 및 도면을 포함하는 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨).
본 명세서에서 사용되는 "적절한 배지"는 세포 증식을 가능하게 하는 임의의 배지를 지칭한다. 적절한 배지는 최대 증식을 촉진할 필요가 없고, 단지 측정가능한 세포 증식을 촉진한다.
본 명세서에서 사용되는 "클로닝된"이라는 용어는 또 다른 세포, 배아 세포, 태아 세포 및/또는 동물 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 유사하거나 동일한 핵 DNA 서열을 지닌 세포, 배아 세포, 태아 세포 및/또는 동물 세포를 지칭한다. "실질적으로 유사한" 및 "동일한"이라는 용어는 본 명세서에 설명되어 있다. 클로닝된 배아는 1회의 핵이식으로부터 생성될 수 있거나, 클로닝된 배아는 적어도 1회의 리클로닝(re-cloning) 단계를 포함하는 클로닝 방법으로부터 생성될 수 있다. 클로닝된 배아가 적어도 1회의 리클로닝 단계를 포함하는 클로닝 절차로부터 생성되는 경우, 클로닝된 배아는 분화전능성 무한증식 세포로부터 간접적으로 생성될 수 있는데, 이는 리클로닝 단계가 분화전능성 무한증식 세포로부터 생성되는 배아로부터 단리된 배아 세포를 사용할 수 있기 때문이다. 배아와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "분화전능성"이라는 용어는 살아서 출생하는 동물로 발달될 수 있는 배아를 지칭한다.
핵 DNA 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 유사한"이라는 용어는 거의 동일한 2개의 핵 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 2개의 서열은 핵 DNA의 복제 동안 정상적으로 일어나는 복사 오류(copy error) 차이만큼 상이할 수 있다. 실질적으로 유사한 DNA 서열은 바람직하게는 97% 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 98% 이상 동일하고, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일하다. 동일성은 2개의 서열내의 동일한 잔기수를 전체 잔기수로 나누고 그 결과에 100을 곱함으로써 측정된다. 따라서, 정확하게 동일한 서열을 지닌 2개의 복사체는 100% 동일성을 지니며, 덜 고도로 보존되고 결실, 첨가 또는 치환을 지닌 서열들은 보다 적은 동일성 정도를 지닌다. 당업자는 수 가지 컴퓨터 프로그램이 서열 비교를 수행하고 서열 동일성을 측정하기 위해 이용될 수 있음을 인식할 것이다.
"모체 배아"라는 용어는 단일 할구가 분리되거나 생검되는 배아를 지칭하기 위해 사용된다. 생검 후, 할구의 증식 촉진을 돕기 위해 잔존 모체 배아 (모체 배아에서 생검된 할구를 뺀 것)가 할구와 함께 배양될 수 있다. 생존가능한 잔존 모체 배아는 후속하여 장기간 또는 영구적 저장을 위해 또는 장래 사용을 위해 동결될 수 있다. 또한, 생존가능한 모체 배아는 임신을 일으키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 생존가능한 모체 배아는 파괴될 수 있다. 특정 구체예에서, 모체 배아는 본 발명의 연속 이식 방법에 의해 생성되는 클로닝된 배아이다. 다른 구체예에서, 모체 배아는 수정에 의해 생성되는 배아이다.
개관
기초 과학 및 치료적 용도 둘 모두를 위한 매우 큰 잠재력에도 불구하고, 체세포핵이식(SCNT)에 의한 포유류 클로닝의 효율은 낮은 상태이다. SCNT 후 살아있는 새끼의 출생률은 종, 공여 세포 유형, 프로토콜 또는 사용되는 기술과 무관하게 10% 미만이다. 유사하게는, 클로닝된 배아의 발달률은 정상적인 수정된 배아의 발달률 보다 낮아서, 배반포로의 발달이 불량해지고 배반포에서 세포수가 보다 적게 된다. 이러한 결손은 정상적인 배아가 사용되는 경우의 약 30% 성공률과 비교하여 마우스 종(strain) 또는 공유 세포 유형과 무관하게 약 5%인 클로닝된 마우스 배아로부터의 비교적 덜 성공적인 ES 세포주 확립에 또한 기여한다. 클로닝된 배아의 무능력(incompetence)은 주로 불완전한 핵 프로그래밍에 기인하며, 이는 초기 발달 단계 동안 수 개의 유전자의 비정상적 발현에 의해 입증된다.
SCNT의 저효율을 극복하기 위해, 수 가지 방법이 시도되어 왔다. 최근, 기시가미(Kishigami) 등 (2006)은 히스톤 데아세틸라제의 억제제인 트리코스타틴 A를 사용하여 재구성된 마우스 난자를 처리함으로써 비정상적 DNA 과메틸화를 감소시키는 개선된 마우스 클로닝 기술를 보고하였다. 또 다른 방법은 전핵(PN) 단계 접합체 또는 2세포기 생체내 수정된 배아를 2차 사이토플라스트(cytoplast) 수용자로서 사용하는 연속 클로닝이었다. PN 단계 마우스 체세포 클로닝된 배아가 핵제거된 생체내 수정된 PN 단계 접합체내로 리클로닝된 경우, 시험관내에서의 클로닝된 배아의 발생률 및 살아있는 새끼 비율이 어느 정도 개선되었다. 실제로, 유사한 방법이 최초의 돼지 체세포 클로닝에서 또한 성공적으로 사용되었다. 2세포기 생체내 수정된 배아가 성공적인 연속 클로닝을 위해 또한 사용되어 왔다. 2세포기 SCNT 배아가 2세포기 생체내 배아내로 리클로닝된 경우, 이들의 시험관내 발달은 개선되었고, 살아있는 새끼면에서는 최고조에 달했다. 그러나, 이들 연구 중 어느 것도 개선을 위한 분자적 기초를 조사하지 않았고, 핵 공여 세포는 ES 세포 또는 전처리된 체세포였다. 더욱이, 클로닝된 배아 발달에서의 개선은 현저하지 않았다. 공여 세포의 전처리는 다양한 방법을 이용하여 염색질 리모델링(chromatin remodeling) 및 핵 공여 세포와 수용 난모세포 간의 세포 주기 동기화를 다루어왔고, 이는 또 다시 다소 개선된 클로닝 효율을 초래하였다. 그러나, 적용된 방법들과 무관하게, 클로닝 효율이 여전히 너무 낮아서 기초 과학 연구, 특정 마우스 종의 실용적 증식, 치료적 클로닝 또는 줄기세포 유도를 위해 광범위하게 사용될 수 없었다. 또한, 본 발명자들은 배아 줄기세포가 유래될 수 있는 배반포 또는 배반포 유사 클러스터를 성공적으로 유도해내기 위해 연속 클로닝을 사용하거나 배아 줄기세포 또는 줄기세포주를 성공적으로 유도해내는 임의의 단체를 알지 못한다. 유사하게, 본 발명자들은 상실배기 배아 (NT 클러스터는 발달의 상실배기와 실질적으로 동등하고 이에 상응함)를 성공적으로 유도해내기 위해 연속 클로닝을 사용하는 임의의 단체를 알지 못한다. 이러한 상실배기 배아는 1개 이상의 할구가 분리되거나 생검되어 ES 세포를 생성시키기 위해 사용될 수 있는 모체 배아로서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 1개 이상의 할구가 분리되거나 생검되어 ES 세포를 생성시키기 위해 사용될 수 있는 배아를 사용한다.
핵이식 방법
본 발명의 목적은 보다 효율적으로 그리고 윤리적 우려를 초래함이 없이 체세포를 클로닝하는 수단을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 방법은 포유류를 클로닝하거나, 다능성 세포를 수득하거나, 포유류 세포를 리프로그래밍하기 위해 사용될 수 있다.
인간 또는 동물 세포, 바람직하게는 포유류 세포는 널리 공지된 방법에 의해 수득되고 배양될 수 있다. 본 발명에서 유용한 인간 및 동물 세포는 예로서 상피세포, 신경세포, 표피세포, 케라틴세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 림프구 (B 및 T 림프구), 다른 면역세포, 적혈구, 대식구, 멜라닌세포, 단핵구, 단핵세포, 섬유아세포, 심근세포, 난구세포 및 다른 근육세포 등을 포함한다. 더욱이, 핵이식을 위해 사용되는 인간 세포는 다양한 기관, 예를 들어 피부, 폐, 췌장, 간, 위, 장, 심장, 생식기관, 방광, 신장, 요도 및 다른 비뇨기관 등으로부터 수득될 수 있다. 이러한 것들은 단지 적절한 공여 세포의 예이다. 적절한 공여 세포, 즉, 본 발명에서 유용한 세포는 신체의 임의의 세포 또는 기관으로부터 수득될 수 있다. 이는 모든 체세포 또는 생식세포, 예를 들어 원시 생식세포, 정자세포를 포함한다. 바람직하게는, 공여 세포 또는 핵은 활발히 분열하는, 즉, 비휴지(non-quiescent) 세포일 수 있는데, 이는 이것이 클로닝 효율을 향상시키는 것으로 보고되었기 때문이다. 이러한 세포는 G1, G2 S 또는 M 세포 단계에 있는 것들을 포함한다. 또한, 휴지 세포가 사용될 수 있다. 또한, 바람직하게는 이러한 공여 세포는 G1 세포 주기에 있을 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 공여 및/또는 수용 세포는 2세포 블록(2-cell block)을 경험하지 않는다. 특정 구체예에서, 공여 세포 또는 핵은 핵이식 전에 전처리되지 않는다. 특정 구체예에서, 공여 세포 또는 핵은 핵이식 전에 스페르민(spermine), 프로타민(protamine) 또는 푸트레신(putrescine)으로 전처리되지 않는다.
특정 구체예에서, 본 발명의 수용자인 수정된 배아는 임의의 포유류 종으로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 동결보존된 수정된 배아가 수용 세포로서 사용된다. 특정 구체예에서, 이러한 배아는 인간이다. 동결보존 및 해동은 당업자에게 공지되어 있다 (참조: Tucker et al., Curr Opin Obstet Gynecol. 1995 Jun;7(3): 188-92).
특정 구체예에서, 공여 핵이 표지될 수 있다. 세포는 녹색 형광 단백질 (Yang, M., et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:1206-1211)과 같은 용이하게 가시화되는 단백질 또는 이의 유도체들 중 하나를 엔코딩하는 이식유전자를 사용하여 유전적으로 변형될 수 있거나, 반딧불이(Photinus pyralis) 루시퍼라제 유전자 (Flue) (Sweeney, TJ. , et al. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 12044-12049)로부터 구성된 이식유전자를 사용하여 유전적으로 변형될 수 있거나, 시이 팬지(Sea Pansey) (Renilla reniformis) 루시퍼라제 유전자 (Rluc) (Bhaumik, S., and Ghambhir, S.S., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:377-382)로부터 구성된 이식유전자를 사용하여 유전적으로 변형될 수 있다. 리포터 이식유전자는 이러한 리포터 유전자가 다수의 또는 모든 세포에서 고수준으로 발현되도록 "하우스-키핑 유전자(house-keeping gene)" 프로모터를 사용하여 항시적으로 발현될 수 있거나, 리포터 이식유전자는 특정 니취(niche)내에 위치하여 특정 조직 또는 세포 유형으로 발달되는 세포만이 가시화될 수 있도록 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 유전자 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 추가의 표지화 시약은 비제한적으로 형광 단백질 유사체 및 바이오센서를 포함하는 발광 표지된 거대분자, 녹색 형광 단백질과 이의 변이체로 형성된 것을 포함하는 발광 거대분자 키메라, 생리학적 반응에 관여하는 세포성 항원과 반응하는 발광 표지된 1차 또는 2차 항체, 발광 염색제, 염료, 및 다른 소분자를 포함한다. 클로닝된 개체군을 단리하기 위해 모자이크 배반포로부터의 표지된 세포가 예를 들어 유동세포측정에 의해 분류될 수 있다.
핵이식(nuclear transfer 또는 nuclear transplantation) 기술은 문헌에 공지되어 있다 (참조: Campbell et al, Theriogenology, 43: 181 (1995); Collas et al, MoI. Report Dev., 38:264-267 (1994); Keefer et al, Biol. Reprod., 50:935-939 (1994); Sims et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274, 및 WO 90/03432, 이들 문헌은 본원에 그 전문에 참조로 포함되어 있음). 또한, 미국 특허 번호 4,944,384 및 5,057,420에는 소 핵이식에 관한 방법이 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Cibelli et al, Science, Vol. 280:1256-1258 (1998)]이 참조된다.
공여 핵을 수용자인 수정된 배아내로 이식하는 것은 미세주입 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 최소량의 세포질이 핵과 함께 이식된다. 최소량의 세포질의 이식은 세포 융합 방법에 의한 이식과 대조적으로 핵이 미세주입을 이용하여 이식되는 경우 달성가능하다. 한 가지 구체예에서, 미세주입 장치는 피에조 유닛(piezo unit)을 포함한다. 전형적으로, 피에조 유닛은 니들(needle)에 진동을 부여하도록 니들에 작동적으로 결합되어 있다. 그러나, 니들에 진동을 부여할 수 있는 피에조 유닛의 임의의 구성은 본 발명의 범위내에 포함된다. 특정한 경우, 피에조 유닛은 대상(object)내로 전달하는 데에 있어서 니들을 보조할 수 있다. 특정한 구체예에서, 피에조 유닛은 핵과 함께 최소량의 세포질을 이식하기 위해 사용될 수 있다. 이를 위해 적절한 임의의 피에조 유닛이 사용될 수 있다. 특정한 구체예에서, 피에조 유닛은 피에조 마이크로매니퓰레이터 컨트롤러(Piezo micromanipulator controller) PMM150 (PrimeTech, Japan)이다.
핵제거는 공지된 방법에 의해 달성될 수 있는데, 그러한 방법의 예로는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 4,994,384에 기재된 방법이 있다. 예를 들어, 제2중기 난모세포는 즉각적 핵제거를 위해 밀리리터 당 7.5 마이크로그램의 사이토칼라신 B를 함유하거나 함유하지 않는 HECM에 넣어지거나, 적절한 배지, 예를 들어 CR1aa + 10% 발정 소혈청(estrus cow serum)에 넣어진 다음 나중에 핵제거될 수 있다.
핵제거는 극체 및 인접 세포질을 분리해내기 위해 마이크로피펫을 사용하여 미세수술적으로 달성될 수 있다. 그 후, 세포는 성공적으로 핵제거된 것들을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크리닝은 세포를 HECM 중에서 밀리리터 당 1 마이크로그램의 33342 훽스트(Hoechst) 염료로 염색한 후, 10초 미만 동안 자외선 조사하에서 세포를 관찰함으로써 달성될 수 있다. 그 후, 성공적으로 핵제거된 세포가 적절한 배지에 넣어질 수 있다.
포유류에서의 핵제거를 위한 비침입적 방법의 극소수의 보고가 있어 왔지만, 양서류의 경우 자외선에 의한 조사가 정례적 절차로서 사용되고 있다 (Gurdon Q. J. Microsc. Soc. 101 299-311 (1960)). 포유류에서 이러한 방법을 이용하는 것에 관한 상세한 보고는 없지만, DNA 특이적 형광색소의 사용 동안 마우스 난모세포가 30초 이상 동안 자외선에 노출된 경우 세포의 발달 잠재력이 감소하였다는 것이 주목되었다 (Tsunoda et al., J. Reprod. Fertil. 82 173 (1988)).
본 발명은 "유도된 핵제거"를 이용할 수 있는데, 이는 유사분열 방추의 미세소관의 탈안정화 (예를 들어, 탈중합)를 통해 유사분열 방추장치를 붕괴시킴에 의한 난모세포의 핵제거를 지칭한다 (참조: 미국 특허 출원 번호 20060015950). 미세소관의 탈안정화는 염색분체가 분리되지 못하게 하고 (예를 들어, 성공적인 핵분열을 억제함), 난모세포 게놈 (예를 들어, 핵 염색질)이 유사분열 성숙 동안 동등하지 않게 분리 (비대칭적이)되도록 유도하여, 난모세포의 본질적으로 모든 내인성 염색질이 제 2 극체에 모아지게 한다.
특정 구체예에서, 할구는 유리 피펫을 사용하여 해리될 수 있다. 일부 구체예에서, 해리는 0.25% 트립신의 존재하에서 일어날 수 있다 (Collas and Robl, 43 BIOL. REPROD. 877-84, 1992; Stice and Robl, 39 BIOL. REPROD. 657-664, 1988; Kanka et al., 43 MOL. REPROD. DEV. 135-44, 1996).
NT 유닛은 공지된 방법에 의해 활성화될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 본질적으로 NT 유닛에 차가운 또는 실제로 서늘한 온도 충격을 가함으로써 생리적 온도 이하에서 NT 유닛을 배양하는 것을 포함한다. 이는 NT 단위를, 배아가 정상적으로 노출되는 생리적 온도 조건에 비해 차가운, 실온에서 배양함으로써 가장 편리하게 수행될 수 있다.
또한, 활성화는 공지된 활성제를 가함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 수정 동안 정자가 난모세포에 침투하는 것은 융합전 난모세포를 활성화시켜서 핵이식 후에 보다 많은 수의 생존가능한 임신 및 다수의 유전적으로 동일한 송아지를 생성시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 전기적 및 화학적 충격 또는 시클로헥시미드 처리와 같은 처리가 융합후 NT 배아를 활성화시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 적절한 난모세포 활성화 방법은 본원에 참조로 포함되어 있는 수스코-패리쉬(Susko-Parrish) 등의 미국 특허 번호 5,496,720의 주제이다.
예를 들어, 난모세포 활성화는, 동시에 또는 순차적으로
(i) 난모세포에서 2가 양이온의 수준을 증가시키고,
(ii) 난모세포에서 세포 단백질의 인산화를 감소시킴으로써 달성될 수 있다.
이것은 2가 양이온, 예를 들어 마그네슘, 스트론튬, 바륨 또는 칼슘을 예를 들어 이오노포어(ionophore)의 형태로 난모세포 세포질내로 도입시킴으써 일반적으로 달성될 것이다. 2가 양이온 수준을 증가시키는 다른 방법은 전기 충격의 사용, 에탄올에 의한 처리 및 케이지드(caged) 킬레이터에 의한 처리를 포함한다.
인산화는 공지된 방법에 의해, 예를 들어 키나제 억제제, 예를 들어 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예를 들어 6-디메틸아미노퓨린, 스타우로스포린, 2-아미노퓨린 및 스핑고신을 첨가함으로써 감소될 수 있다.
또한, 세포 단백질의 인산화는 포스파타제, 예를 들어 포스파타제 2A 및 포스파타제 2B를 난모세포내로 도입시킴으로써 억제될 수 있다.
활성화 방법의 특정한 예들이 하기 기재된다.
1. 이오노마이신과 DMAP에 의한 활성화
1-- 난모세포를 이오노마이신 (5 uM)과 2 mM의 DMAP에 4분간 넣고;
2-- 난모세포를 4시간 동안 2 mM의 DMAP를 지닌 배양 배지로 이동시키고;
3-- 4회 세정하고, 배양한다.
2. 이오노마이신 DMAP 및 로스코비틴(Roscovitin)에 의한 활성화
1-- 난모세포를 이오노마이신 (5 uM)과 2 mM의 DMAP에 4분간 넣고;
2-- 난모세포를 3시간 동안 2 mM의 DMAP와 200 mcrioM의 로스코비틴을 지닌 배양 배지로 이동시키고;
3-- 4회 세정하고, 배양한다.
3. 이오노마이신 노출에 이은 사이토칼라신과 시클로헥시드 노출에 의한 활성화.
1-- 난모세포를 이오노마이신 (5 microM)에 4분간 넣고;
2-- 난모세포를 5시간 동안 5 ug/ml의 사이토칼라신 B와 5 .mu.g/ml의 시클로헥시미드를 함유하는 배지로 이동시키고;
3-- 4회 세정하고, 배양한다.
4. 전기 펄스에 의한 활성화
1-- 난자를 100 uM CaCl2를 함유하는 만니톨 배지에 넣고;
2-- 펄스 당 22분의 간격을 두고 20 usec 동안 1.0 kVcm-1의 펄스를 3회 전달하고;
3-- 난모세포를 3시간 동안 5 ug/ml의 사이토칼라신 B를 함유하는 배지로 이동시킨다.
5. 에탄올 노출에 이은 사이토칼라신과 시클로헥시미드 노출에 의한 활성화
1-- 난모세포를 7% 에탄올에 1분간 넣고;
2-- 난모세포를 5시간 동안 5 ug/ml의 사이토칼라신 B와 5 ug/ml의 시클로헥시미드를 함유하는 배지로 이동시키고;
3-- 4회 세정하고, 배양한다.
6. 아데노포스틴의 미세주입에 의한 활성화
1-- 10 uM의 아데노포스틴을 함유하는 10 내지 12 피코리터의 용액을 난모세포에 주입하고;
2-- 난모세포를 배양한다.
7. 정자 인자의 미세주입에 의한 활성화
1-- 예를 들어 영장류, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터로부터 단리된 10 내지 12 피코리터의 정자 인자를 난모세포에 주입하고;
2-- 난자를 배양한다.
8. 재조합 정자 인자의 미세주입에 의한 활성화.
9. DMAP 노출에 이은 시클로헥시미드와 사이토칼라신 B 노출에 의한 활성화
10. SrCl2와 사이토칼라신 B 노출에 의한 활성화.
특정 구체예에서, 난모세포 또는 NT 유닛은 전형적으로 성숙후 약 22시간 내지 28시간째에 약 1시간 동안 약 2 mM DMAP에 넣어진 후, 5 pg/ml의 사이토칼라신 B와 20 ug/ml 시클로헥시미드에서 약 2시간 내지 12시간 동안, 바람직하게는 약 8시간 동안 인큐베이션된다.
특정 구체예에서, 재구성된 난모세포의 활성화는 고도로 습윤된 5.5% CO2 인큐베이터내에서 10mM SrCl2와 5㎍/ml의 사이토칼라신 B를 함유하는 Ca++ 비함유 CZB에서 6시간 동안 수행된다
언급된 바와 같이, 활성화는 핵이식 전에, 핵이식과 동시에 또는 핵이식 후에 달성될 수 있다. 일반적으로, 활성화는 핵이식과 융합이 일어나기 약 40시간 전에서 핵이식과 융합이 일어난 지 약 40시간 후에 달성되거나, 더욱 바람직하게는 핵이식과 융합이 일어나기 약 24시간 전에서 핵이식과 융합이 일어난 지 약 24시간 후에 달성되거나, 가장 바람직하게는 핵이식과 융합이 일어나기 약 4시간 내지 9시간 전에서 핵이식과 융합이 일어난 지 약 4시간 내지 9시간 후에 달성될 것이다. 활성화는 바람직하게는 난모세포의 시험관내 또는 생체내 성숙 후에 또는 이러한 성숙에 근접한 시점, 예를 들어 성숙과 거의 동시에 또는 성숙이 일어난 지 약 40시간내에, 더욱 바람직하게는 성숙이 일어난 지 약 24시간내에 달성된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 단계는 클로닝된 핵을, 생식선 세포, 예를 들어 당 분야에 공지된 바와 같은 할구, 상실배 세포, 내부 세포괴 세포, hES 세포를 포함하는 ES 세포, EG 세포, EC 세포 (Do & Scholer, Stem Cells 22:941-949 (2004))의 핵제거된 사이토플라스트와 융합시키는 것이다. 사이토플라스트와 핵의 융합은 폴리에틸렌 글리콜 (참조: Pontecorvo "Polyethylene Glycol (PEG) in the Production of Mammalian Somatic Cell Hybrids" Cytogenet Cell Genet. 16(1- 5): 399-400 (1976)), 핵의 직접 주입, 센다이(Sendai) 바이러스 매개 융합 (참조: 미국 특허 번호 4,664,097 및 Graham Wistar Inst. Symp. Monogr. 9 19 (1969)) 또는 전기 융합과 같은 당 분야에 공지된 그 밖의 기술을 포함하는 당 분야에 공지된 다수의 기술을 이용하여 수행된다. 세포의 전기융합은 세포들을 매우 가깝게 함께 브릿징(bridging)하고 이들을 교류 전기장에 노출시키는 것을 포함한다. 적절한 조건하에서, 세포들이 서로를 밀게 되어 세포막의 융합이 일어난 후, 융합 세포 또는 하이브리드 세포가 형성된다. 세포의 전기융합 및 이를 수행하기 위한 장치는 예를 들어 미국 특허 번호 4,441,972, 4,578,168 및 5,283,194, 국제 특허 출원 번호 PCT/AU92/00473 [WO 93/05166], 폴(Pohl)의 문헌 ["Dielectrophoresis", Cambridge University Press, 1978] 및 짐머만(Zimmerman) 등의 문헌 [Biochimica et Bioplzysica Acta 641 : 160-165, 1981]에 기재되어 있다.
당 분야에 널리 공지된 바와 같은 물리적 기질에 부착된 hES 세포와 같은 생식선 세포의 무핵 세포질 수포와 클로닝된 핵의 융합 (Wright & Hayflick, Exp. Cell Res. 96:113-121, (1975); & Wright & Hayflick, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1812-1816, (1975))이 본 발명과 조합될 수 있다. 요약하면, 생식선 세포의 세포질 용적은 조작 전에 20시간 동안 1OμM 사이토칼라신 B를 첨가함으로써 증가되고, 트립신처리되고, 멸균 18 mm 커버슬립, 실린더 또는 부착을 촉진하는 물질로 코팅된 다른 물리적 기질상에 리플레이팅(replating)된다. 세포는, 37℃에서 밤새 인큐베이션되고 배지를 사용한 1회의 약한 세척 후에 세포가 커버슬립 또는 다른 기질의 표면적의 일부, 바람직하게는 약 90%를 덮게 되도록 하는 밀도로 플레이팅된다. 그 후, 기질은 8mL의 10% 피콜(Ficoll)-400 용액을 함유하는 원심분리 튜브에 넣어지는데, 이러한 기질은 원심분리가 사이토플라스트로부터 핵을 분리시키는 위치에 넣어지고, 36℃에서 20,000 g에서 60분간 원심분리된다. 그 후, 클로닝된 핵은 적어도 사이토플라스트의 밀도로, 바람직하게는 사이토플라스트의 밀도 보다 5배 이상인 밀도로 커버슬립 또는 기질상으로 스프레딩(spreading)된다. 사이토플라스트와 핵의 융합은 폴리에틸렌 글리콜 (참조: Pontecorvo "Polyethylene Glycol (PEG) in the Production of Mammalian Somatic Cell Hybrids" Cytogenet Cell Genet. 16(l-5):399-400 (1976))을 사용하여 수행된다. 요약하면, 배양 배지 중의 1 mL의 미리가온된 50% 폴리에틸렌 글리콜 1500 (Roche)이 1분간 커버슬립 또는 기질상에 놓여진다. 그 후, 20 mL의 배양 배지가 5분 기간에 걸쳐 적가되어 폴리에틸렌 글리콜을 서서히 분리시킨다. 그 후, 전체 배지가 흡인되고, 배양 배지가 교환된다. 바이브레이션(vibration) 또는 마이크로피펫을 사용한 핵의 물리적 분리와 같은 원심분리 이외의 기술이 또한 사용될 수 있다.
핵이식에 의해 유도된 배아가 정상적인 배아와는 상이하고, 때때로 배아가 일반적으로 배양되는 (적어도 생체내에서) 조건과 다른 생체내 배양 조건이 유리하거나 이러한 조건을 필요로 함이 시사되어 왔다. 그 이유는 알려져 있지 않다. 소 배아의 정례적 증식에서, 재구성된 배아 (이들 중 다수가 한번에)는 5일 내지 6일간 양(sheep) 난관에서 배양되었다 (참조: Willadsen, In Mammalian Egg Transfer (Adams, E. E., ed.) 185 CRC Press, Boca Raton, FIa. (1982)). 특정 구체예에서, 배아는 이식전에 한천과 같은 보호용 배지에 묻혀있은 다음, 임시 수용자로부터 회수된 후 한천으로부터 절개될 수 있다. 보호용 한천 또는 다른 배지의 기능은 2중적인데, 첫 번째는 투명대(zona pellucida)를 함께 고정시킴으로써 배아를 위한 구조적 보조물로서 작용하고, 두 번째는 수용 동물의 면역계의 세포에 대한 장벽으로서 작용한다. 이러한 방법이 배반포를 형성하는 배아의 비율을 증가시키지만, 다수의 배아가 손실될 수 있다는 단점이 존재한다.
활성화된 NT 유닛은 배아 또는 줄기 유사 세포 및 세포 콜로니가 생성될 때까지 적절한 시험관내 배양 배지에서 배양될 수 있다. 배아의 배양 및 성숙을 위해 적절한 배양 배지는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 소 배아 배양 및 유지를 위해 사용될 수 있는 공지된 배지의 예는 햄스(Ham's) F-10+10% 우태아혈청(FCS), 조직 배양 배지-199(TCM-199)+10% 우태아혈청, 타이로즈-알부민-락테이트-피루베이트(TALP), 둘베코스(Dulbecco's)의 포스페이트 완충 식염수(PBS), 이글스 배지(Eagle's media) 및 위튼스 배지(Whitten's media)를 포함한다. 난모세포의 수집 및 성숙을 위해 사용되는 가장 통상적인 배지 중의 하나는 TCM-199, 및 우태아혈청, 신생아 혈청, 발정 소혈청, 새끼양 혈청 또는 거세우(steer) 혈청을 포함하는 1 내지 20% 혈청 보충물이다. 바람직한 유지용 배지는 TCM-199를 얼 솔트(Earl salt), 10% 우태아혈청, 0.2 Ma 피루베이트 및 50 ug/ml 젠타마이신 설페이트와 함께 포함한다. 상기한 것들 중 어느 하나는 과립층 세포, 난관 세포, BRL 세포 및 자궁 세포 및 STO 세포와 같은 다양한 세포 유형과의 공동배양(co-culture)을 또한 포함할 수 있다.
특히, 자궁내막의 인간 상피세포는 착상전 및 착상 기간 동안 백혈병 억제 인자(LIF)를 분비한다. 따라서, 배양 배지에 LIF를 첨가하는 것은 재구성된 배아의 시험관내 발달을 향상시키는 데에 있어서 중요할 수 있다. 배아 또는 줄기 유사 세포 배양를 위한 LIF의 용도는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,712,156에 기재되어 있다.
또 다른 유지용 배지는 본원에 참조로 포함된 로젠크란스 쥬니어(Rosenkrans, Jr.) 등의 미국 특허 번호 5,096,822에 기재되어 있다. CR1이라 명명되는 이러한 배아 배지는 배아를 지속시키기에 필요한 영양 물질을 함유한다. CR1은 1.0 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 1.0 mM 내지 5.0 mM의 양의 헤미칼슘 L-락테이트를 함유한다. 헤미칼슘 L-락테이트는 헤미칼슘염이 결합되어 있는 L-락테이트이다..
또한, 배양 중의 인간 배아 세포를 유지시키기 위한 적절한 배양 배지는 문헌 [Thomson et al., Science, 282:1145-1 147 (1998)] 및 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7844-7848 (1995)]에 논의되어 있다.
그 후, 배양된 NT 유닛(들)은 바람직하게는 세척된 다음, 적절한 배지, 예를 들어 바람직하게는 약 10% FCS를 함유하는, CR1aa 배지, 햄스 F-10, 조직 배양 배지-199(TCM-199), 타이로즈-알부민-락테이트-피루베이트(TALP), 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(PBS), 이글스 배지 또는 위튼스 배지에 넣어진다. 이러한 배양은 바람직하게는 적절한 컨플루언트 영양세포층(confluent feeder layer)을 함유하는 웰 플레이트에서 달성될 것이다. 적절한 영양세포층은 예로서 섬유아세포 및 상피세포, 예를 들어 유제류(ungulate)로부터 유래된 섬유아세포 및 자궁 상피세포, 닭 섬유아세포, 뮤린 (예를 들어, 마우스 또는 랫트) 섬유아세포, STO 및 SI-m220 영양세포주, 및 BRL 세포를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 영양세포는 마우스 배아 섬유아세포를 포함할 것이다. 적절한 섬유아세포 영양세포층을 제조하는 수단은 하기 실시예에 기재되어 있고, 이는 당업자의 기술상식에 속한다.
배반포기 배아 (또는 이의 등가물)로부터 ES 세포를 유도해내는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 기술은 클로닝된 배아로부터 ES 세포를 유도해내기 위해 사용될 수 있다. 또한, ES 세포는 초기 발달 단계 동안 클로닝된 배아로부터 유도될 수 있다.
적용분야
특정 구체예에서, 생성된 본 발명의 배반포 또는 배반포 유사 클러스터는 배아 줄기세포주를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 세포주는, 예를 들어 문헌 [Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)] 및 문헌 [Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7544-7848 (1995)]에 보고된 배양 방법에 따라 수득될 수 있으며, 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
다능성 배아 줄기세포는 출생을 위한 배아의 정상적인 발달을 간섭하지 않으며 배아로부터 분리된 단일 할구로부터 또한 생성될 수 있다 (참조: 2004년 11월 4일에 출원된 미국 출원 번호 60/624,827; 2005년 3월 14일에 출원된 미국 출원 번호 60/662,489; 2005년 6월 3일에 출원된 미국 출원 번호 60/687,158; 2005년 10월 3일에 출원된 미국 출원 번호 60/723,066; 2005년 10월 14일에 출원된 미국 출원 번호 60/726,775; 2005년 11월 4일에 출원된 미국 출원 번호 11/267,555; 2005년 11월 4일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US05/39776, 이들 출원의 내용은 그 전문이 참조로 포함되어 있음; 추가 참조: Chung et al, Nature, Oct 16, 2005 (electronically published ahead of print) 및 Chung et al, Nature V. 439, pp. 216-219 (2006), 이들 문헌의 전체 내용은 그 전문이 참조로 포함되어 있음).
본 발명의 한 가지 일면에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 리프로그래밍된 세포로부터 유래된 세포를 연구 및 치료용으로 사용하는 것을 포함한다. 이러한 리프로그래밍된 다능성 또는 분화전능성 세포는 비제한적으로 피부, 연골, 뼈, 골격근, 심근, 신장, 간, 혈액 및 조혈, 혈관 전구체 및 혈관 내피, 췌장 베타, 뉴런, 신경교, 망막, 내이낭(inner ear follicle), 장, 폐, 세포를 포함하는 신체의 세포들 중 어느 세포로 분화될 수 있다.
특히, 리프로그래밍된 세포는 고도로 엘라스토제닉(elastogenic)하거나 흉터 형성을 초래함이 없이 재생될 수 있는 유전자 발현의 태아기 피부 패턴을 지닌 세포로 분화될 수 있다. 포유류 태아 피부의 피부 섬유아세포, 특히 관절을 둘러싸는 영역에서와 같이 외피(integument)가 고수준의 탄성으로부터 혜택을 받는 부위에 상응하는 피부 섬유아세포는 턴오버(turnover)없이 수 년 동안 기능하는 탄성 원섬유의 복잡한 구조를 새로 합성하는 것을 담당한다. 또한, 초기 배아 피부는 흉터 형성없이 재생될 수 있다. 본 발명의 리프로그래밍된 세포로부터 생성된 배아 발달의 이러한 시점으로부터의 세포는 정상적인 엘라스틴(elastin) 구조를 형성하는 것을 포함하는 피부의 흉터없는 재생을 촉진하는 데에 있어서 유용하다. 이것은 정상적인 인간 노화 과정의 징후를 치료하거나 피부의 처짐 및 주름형성을 포함하는 노화된 외관을 초래하는 피부의 심한 탄력섬유용해가 존재할 수 있는 광화학적(actinic) 피부 손상을 치료하는 데에 있어서 특히 유용하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 리프로그래밍된 세포는 하나 이상의 분화 유도물질에 노출되어 다른 치료적으로 유용한 세포, 예를 들어 망막 색소 상피, 조혈 전구체 및 혈관아세포 프로제니터(progenitor) 뿐만 아니라 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 다른 많은 유용한 세포 유형을 생성시킨다. 이러한 유도물질은 비제한적으로 사이토카인, 예를 들어 인터류킨-알파 A, 인터페론-알파 A/D, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 인터페론-감마-유도성 단백질-10, 인터류킨-1-17, 케라틴세포 성장인자, 렙틴(leptin), 백혈병 억제 인자, 대식구, 콜로니 자극 인자, 및 대식구 염증 단백질-1 알파, 1-베타, 2, 3 알파, 3 베타, 및 단핵구 화학주성 단백질 1-3, 6kine, 액티빈 A(activin A), 암피레귤린, 안지오제닌(angiogenin), B-내피 세포 성장인자, 베타 셀룰린(beta cellulin), 뇌 유래된 신경영양인자, C10, 카디오트로핀-1(cardiotrophin-1), 섬모 신경영양인자, 사이토카인 유도된 호중구 화학유인물질(chemoattractant)-1, 에오택신, 표피 성장인자, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, 에리트로포이에틴, 에스트로겐 수용체-알파, 에스트로겐 수용체-베타, 섬유아세포 성장인자 (산성 및 염기성), 헤파린, FLT-3/FLK-2 리간드, 신경교 세포주 유래된 신경영양인자, Gly-His-Lys, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구대식구 콜로니 자극 인자, GRO-알파/MGSA, GRO-베타, GRO-감마, HCC-1, 헤파린 결합성 표피 성장인자, 간세포 성장인자, 헤레귤린-알파, 인슐린, 인슐린 성장인자 결합성 단백질-1, 인슐린 유사 성장인자 결합성 단백질-1, 인슐린 유사 성장인자, 인슐린 유사 성장인자 II, 신경 성장인자, 뉴로트로핀(neurotophin)-3,4, 온코스타틴(oncostatin) M, 태반 성장인자, 플레이오트로핀(pleiotrophin), 란테스(rantes), 줄기세포 인자, 기질세포(stromal cell) 유래된 인자 1B, 트로모포이에틴(thromopoietin), 전환 성장인자-(알파, 베타1,2,3,4,5), 종양 괴사 인자 (알파 및 베타), 혈관 내피 성장인자, 및 골 형성 단백질, 호르몬 및 호르몬 길항제의 발현을 변경시키는 효소, 예를 들어 17B-에스트라디올, 부신피질자극 호르몬, 아드레노메듈린(adrenomedullin), 알파-멜라닌세포 자극 호르몬, 융모성 고나도트로핀, 코르티코스테로이드 결합성 글로불린, 코르티코스테론, 덱사메타손, 에스트리올(estriol), 난포 자극 호르몬, 가스트린 1, 글루카곤, 고나도트로핀, L-3,3',5'-트리요오도티로닌(triiodothyronine), 황체형성 호르몬, L-티록신(L-thyroxin), 멜라토닌, MZ-4, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, PEC-60, 뇌하수체 성장 호르몬, 프로게스테론, 프롤락틴, 세크레틴, 성 호르몬 결합성 글로불린, 갑상선 자극 호르몬, 티로트로핀(thyrotropin) 방출인자, 티록신 결합성 글로불린, 및 바소프레신, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어 프브로넥틴, 피브로넥틴의 단백분해 단편, 라미닌, 테나신(tenascin), 트롬보스폰딘, 및 프로테오글리칸, 예를 들어 아그레칸(aggrecan), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulphate proteoglycan), 콘트로이틴(chontroitin) 설페이트 프로테오글리칸, 및 신데칸(syndecan)을 포함한다. 다른 유도물질은 본 발명의 리프로그래밍된 세포로부터 유래되는 분화중인 세포에 대해 유도 신호를 제공하기 위해 사용되는 규정된 조직으로부터의 세포로부터 유래되는 세포 또는 성분을 포함한다. 이러한 유도 세포는 인간, 인간 이외의 포유류, 또는 조류, 예를 들어 특정 병원체 비함유 (SPF) 배아 또는 성체 세포로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 클로닝된 세포는 치료 유용성을 나타내기 위해 이들 세포가 정상적으로 존재하는 조직내로 도입된다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 유도된 세포의 클론형성성(clonogenic) 개체군이 조직내로 도입될 수 있다. 특정한 다른 구체예에서, 클로닝된 세포는 전신적으로 도입되거나 치료 유용성이 요망되는 부위로부터 멀리 떨어진 곳에 도입된다. 이러한 구체예에서, 클로닝된 세포는 원거리에서 작용할 수 있거나 요망되는 부위로 호밍(homing)될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 클로닝된 세포는 다른 다능성 줄기세포의 분화를 유도해내는 데에 사용된다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하며 시험관내에서 증식될 수 있는 세포의 단일 세포 유래된 개체군을 생성시키는 것은 다른 다능성 줄기세포의 분화를 유도해내는 데에 유용하다. 세포-세포 유도는 초기 배아에서 분화를 유도하기 위한 통상적인 수단이다. 척수 뉴런, 심장 세포, 췌장 베타 세포 및 확정적 조혈 세포를 포함하는 다수의 잠재적으로 의학상 유용한 세포 유형은 정상적인 배아 발달 동안 유도 신호에 의해 영향을 받는다. 유전자 발현의 배아 패턴을 유지하며 시험관내에서 증식될 수 있는 세포의 단일 세포 유래된 개체군은 요망되는 세포 또는 조직 유형이 되도록 다른 다능성 줄기세포의 분화를 유도하기 위해 다양한 시험관내, 난자내(in ovo) 또는 생체내 배양 조건에서 배양될 수 있다.
본 발명의 배아 또는 줄기 유사 세포는 임의의 요망되는 분화된 세포 유형을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분화된 인간 세포의 치료적 사용은 전대미문인 것이다. 예를 들어, 인간 조혈 줄기세포는 골수 이식을 필요로 하는 의학적 치료에서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 질병, 예를 들어 말기암, 예를 들어 난소암 및 백혈병 뿐만 아니라 면역계를 약화시키는 질병, 예를 들어 AIDS를 치료하기 위해 사용된다. 조혈 줄기세포는, 예를 들어 암 또는 AIDS 환자의 성체 체세포, 예를 들어 상피세포 또는 림프구를, 핵제거된 난모세포, 예를 들어 소 난모세포와 융합시키고, 상기 기재된 바와 같은 배아 또는 줄기 유사 세포를 수득하고, 이러한 세포를 조혈 줄기 세포가 수득될 때까지 분화에 유리한 조건하에서 배양함으로써 수득될 수 있다. 이러한 조혈 세포는 암 및 AIDS를 포함하는 질병을 치료하는 데에 사용될 수 있다.
또한, 신경학적 장애를 지닌 환자로부터의 성체 체세포는 핵제거된 동물 난모세포, 예를 들어 영장류 또는 소 난모세포, 이로부터 수득된 인간 배아 또는 줄기 유사 세포와 융합될 수 있고, 이러한 세포는 신경 세포주를 생성시키기 위한 분화 조건하에서 배양될 수 있다. 이러한 인간 신경 세포의 이식에 의해 치료될 수 있는 특정 질병은 예로서 특히 파킨슨병, 알츠하이머병, ALS 및 뇌성 마비를 포함한다. 특정한 파킨슨병 환자에서, 이식된 태아 뇌 신경 세포는 주위 세포와 적절히 연결되어 도파민을 생성시키는 것으로 입증되었다. 이것은 파킨슨병 증상의 장기적 반전을 초래할 수 있다.
분화된 세포의 특이적 선택을 가능하게 하기 위해, 공여 세포는 유도성 프로모터를 통해 발현되는 선택성 마커로 트랜스펙션되어, 분화가 유도되는 경우 특정 세포 계통의 선택 또는 고밀화(enrichment)를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, CD34-neo가 조혈 세포의 선택을 위해 사용되고, 근육 세포의 경우에는 Pwl-neo가 사용되고, 교감신경 뉴런의 경우 Mash-1-neo가 사용되고, 대뇌 피질의 회백질의 인간 CNS 뉴런의 경우 Mal-neo가 사용될 수 있다.
본 발명의 커다란 이점은 이식에 적절한 동형(isogenic) 또는 동계(synegenic) 인간 세포의 본질적으로 제한없는 공급을 제공한다는 것이다. 따라서, 이는 현재의 이식 방법과 관련된 중요한 문제, 즉, 숙주 대 이식편 또는 이식편 대 숙주 거부로 인해 일어날 수 있는 이식된 조직의 거부를 방지할 것이다. 통상적으로, 거부는 시클로스포린과 같은 거부 억제 약물의 투여에 의해 예방되거나 감소된다. 그러나, 이러한 약물은 현저한 유해 부작용, 예를 들어 면역억제, 발암 특성을 지닐 뿐만 아니라 매우 고가이다. 본 발명은 거부억제 약물, 예를 들어 시클로스포린, 이뮬란(imulan), FK-506, 글루코코르티코이드, 및 라파마이신, 및 이들의 유도체에 대한 필요를 제거하거나 적어도 크게 감소시킬 수 있다.
동형 세포 요법에 의해 치료될 수 있는 다른 질병 및 질환은 예로서 척수 손상, 다발성 경화증, 근이영양증, 당뇨병, 간 질환, 즉, 고콜레스테롤혈증, 심장병, 연골 교체(cartilage replacement), 화상(burn), 족부 궤양(foot ulcer), 위장관 질환, 혈관 질환, 신장 질환, 요관 질환, 및 노화 관련 질병과 질환을 포함한다.
클로닝된 배아로부터 포유류를 클로닝하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 포유류를 클로닝하기 위해 사용되는 2가지 주요 방법은 로슬린(Roslin) 방법과 호놀룰루(Honolulu) 방법이다. 이들 방법은 1996년에 스코틀랜드의 로슬린 인스티튜트(Roslin Institute)에서 돌리(Dolly)라는 양을 생성시키고 (Campbell, K.H. et al. (1996) Nature 380:64-66), 1998년에 호놀룰루에 있는 유니버시티 오브 하와이에서 커뮬리나(Cumulina)라는 마우스를 생성 (Wakayama, T. et al. (1998) Nature 394:369-374)시킨 후에 이름붙여진 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 모체 배아로서 사용될 수 있는 클로닝된 난할기 배아 또는 상실배기 배아를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 모체 배아는 ES 세포를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 할구 (1개, 2개, 3개, 4개 할구)가 이러한 모체 배아로부터 분리되거나 생검될 수 있고, 이러한 할구는 ES 세포를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
할구 배양
다능성 배아 줄기세포로 증식되도록 단리된 인간 할구를 유도하기 위한 종래의 시도는 실패하였다 (Geber S. et al., Hum. Reprod. 10:1492-1496 (1995)). 본 발명은 부분적으로는 본 발명의 신규한 방법을 이용하여 줄기세포가 배아의 생존성에 영향을 미치지 않으며 배아로부터 생성될 수 있다는 발견을 기초로 한다. 한 가지 구체예에서, 이러한 방법은 배아를 파괴하지 않거나 배아의 생존성을 달리 현저하게 변경시키지 않으며 배아로부터 단일 할구를 단리해내기 위해 착상전 유전자 진단 (PGD)에서 현재 사용되는 것들과 관련된 시험관내 기술을 이용한다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 다능성 인간 배아 줄기(hES) 세포 및 세포주는 출생을 위한 배아의 정상적인 발달을 간섭하지 않으며 배아로부터 분리된 단일 할구로부터 생성될 수 있다.
본 발명의 방법은 줄기세포 연구 및 발생 생물학 분야를 진보시킬 다수의 중요한 용도를 지닌다. ES 세포, ES 세포주, TS 세포 및 세포주, 및 이들로부터 분화된 세포는 기초 발생 생물학을 연구하기 위해 사용될 수 있고, 다수의 질병과 질환의 치료에서 치료적으로 사용될 수 있다. 또한, 이러한 세포는 이들의 성장, 분화, 생존 또는 이동을 조절하기 위해 사용될 수 있는 인자 및 조건을 확인하기 위해 스크리닝 검정에서 사용될 수 있다. 확인된 작용제는 시험관내 및 생체내 세포 행동을 조절하기 위해 사용될 수 있고, 세포 요법 또는 무세포 요법의 기초를 형성할 수 있다.
본원에 기재된 발명이 충분히 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 상세한 설명이 제시된다.
달리 규정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 지닌다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명에서 또는 본 발명의 시험에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료가 하기 설명된다. 재료, 방법 및 예는 단지 예시를 위한 것이며, 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 공개 특허와 특허 출원 및 다른 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "포함한다"라는 어구 또는 "포함하여" 또는 "포함하는"과 같은 변화형은 명시된 정수 또는 정수들의 군을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군이 배제되지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
단수 용어는 본 명세서에서 1개 또는 1개 초과 (즉, 1개 이상)의 대상을 의미하도록 사용된다. 예로서, "엘리먼트"는 1개의 엘리먼트 또는 1개 초과의 엘리먼트를 의미한다.
"할구"라는 용어는 본 명세서 전반에 걸쳐 배아로부터 수득된 1개 이상의 할구 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 등)를 지칭하도록 사용된다. "2개 이상의 할구의 클러스터"는 할구의 시험관내 배양 동안 생성된 세포를 지칭하기 위해 "할구 유래된 아웃그로쓰"와 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 할구가 배아로부터 수득되어 최초로 배양된 후, 이는 2개 이상의 할구의 클러스터 (할구 유래된 아웃그로쓰로서 또한 공지됨)를 생성시키기 위해 일반적으로 1회 이상 분열한다. 클러스터는 배아 또는 태아 세포와 함께 추가로 배양될 수 있다. 궁극적으로, 할구 유래된 아웃그로쓰는 계속 분열할 것이다. 이러한 체계로부터, ES 세포, TS 세포, 및 부분적으로 분화된 세포 유형은 배양 방법의 과정에 걸쳐 발달할 것이다.
상기 요약된 바와 같이, 본 발명은 배아를 반드시 파괴시키지 않으면서도 초기 단계 배아의 단일 할구로부터 ES 세포, ES 세포주 및 분화된 세포 유형을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 특징이 하기 상세히 기술된다. 상기 그리고 하기 상세히 설명되어 있는 본 발명의 다양한 일면 및 구체예의 모든 조합이 고려된다.
할구의 분리
할구는 착상 전에 다양한 발달 단계에서 배아로부터 분리될 수 있으며, 이러한 발달 단계는 상실배의 치밀화(compaction) 전, 상실배의 치밀화 동안, 상실배의 치밀화 직후, 포배강(blastocoel)의 형성 전 또는 배반포기 동안을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 할구 (1개의 할구, 2개의 할구, 또는 2개 초과의 할구)는 4-16세포기, 또는 4-10세포기, 또는 4-8세포기에서 배아로부터 분리된다.
한 가지 구체예에서, 본 발명은 배아 줄기세포를 생성시키는 배반포의 생검 방법을 제공하고, 배반포의 나머지는 착상되어 임신을 일으키고 나중에 살아서 출생한다. 이의 예에서, 투명대가 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 배반포로부터 분리된 후, 배반포가 생검된다.
또 다른 구체예에서, 단일 할구가 배아로부터 분리되는 착상전 유전자 진단 (PGD)에서 사용되는 기술과 유사한 기술을 사용함으로써 인간 ES 세포의 유도와 관련된 논란이 회피된다. 한 가지 구체에에서, 단일 할구는 상실배의 치밀화 전에 분리된다. 생검된 할구는 세포 분열하게 되도록 될 수 있고, 1개의 프로제니(progeny) 세포가 유전자 시험을 위해 사용되고 나머지 세포는 인간 줄기세포를 생성시키기 위해 사용된다. 또한, 생검된 배아는 배반포기에서 착상될 수 있거나 추후 착상을 위해 동결될 수 있다.
특정 구체예에서, 생검 (예를 들어, 배아로부터 할구를 분리하는 것)은 두 단계로 구성된다. 첫 번째는 배아를 둘러싸는 투명대에 구멍을 생성하거나 일부 경우 이러한 투명대를 완전히 분리해내는 것이다. 구멍이 생성된 경우, 세포 (바람직하게는 1개 또는 2개)가 인간 배아로부터 분리될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 투명대를 분리해내거나 투명대에 적출 구멍을 생성시키는 것을 포함하고, 이러한 방법은 물리적 조작, 화학적 처리 및 효소적 분해와 같은 하나 이상의 기술에 의해 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적 기술은 다음과 같은 것들을 포함한다:
부분적 구역 절개 (PZD:): 마이크로피펫을 사용한 투명대의 부분적 절개;
투명대 천공: 타이로드 산(Tyrode acid)에 의한 부분 분해를 통한 투명대 구역의 화학적 개방;
투명대 천공: 프로나제(pronase) 또는 다른 프로테아제에 의한 부분 분해를 통한 투명대 구역의 효소적 개방;
투명대 씨닝(thinning): 타이로드 산 또는 레이저에 의한 투명대의 씨닝;
레이저에 의한 투명대의 점-유사(point-like) 개방;
피에조 미세조작기에 의한 투명대의 점-유사 기계적 개방.
한 가지 구체예를 간단히 예시하자면, 방법은 8-10세포기 배아로 수행된다. 배아를 고정용 피펫으로 고정함으로써 배아가 광유(mineral oil)하에서 생검 배지의 드롭(drop)에 넣어진다. 보조 햇칭(hatching) 피펫을 통해 산성화된 타이로즈 용액(Tyrode's solution) (Sigma, St. Louis, Mo. 63178)을 방출시킴으로써 투명대가 국소적으로 분해된다. 구멍이 생성된 경우, 세포 (할구)가 구멍을 통해 흡인될 수 있다.
또 다른 구체예를 예시하자면, 배반포의 투명대는 1개 이상의 효소 또는 프로나제와 같은 효소들의 혼합물로 처리함으로써 적어도 부분적으로 분해될 수 있다. 무손상 투명대에 의한 배반포의 간단한 프로나제 (Sigma) 처리는 투명대의 분리를 초래한다. 프로나제와 동일하거나 유사한 프로테아제 활성을 지닌 다른 유형의 프로테아제가 또한 사용될 수 있다.
단일 할구는 Ca++/Mg++ 비함유 PBS에서 투명대 제거된(zona-denuded) 배아를 해체(disaggregation)시킴으로써 또한 수득될 수 있다.
또한, 본 발명은 단일 할구를 단리하는 신규하고 보다 효율적인 방법을 제공한다. 배아가 고정된 후, 고정된 배아는 단일 할구가 배반포로부터 방출될 때까지 탭핑된다. 이러한 방법은 인간 배아에 제한되지 않고, 비제한적으로 인간 이외의 배아, 예를 들어 인간 이외의 포유류, 마우스, 토끼, 돼지, 소, 양, 개 및 영장류를 포함하는 다른 종의 배아로 수행될 수 있다.
배아는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 고정될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 배아는 마이크로피펫을 사용하여 고정되고, 이러한 마이크로피펫 홀더는 할구를 단리해내도록 탭핑된다. 또 다른 구체예에서, 배아는 칼슘과 마그네슘이 비함유된 배지에서 배양된다. 배아는 2세포기 내지 16세포기일 수 있다. 한 가지 구체예에서, 배아는 4세포기 내지 10세포기이다. 또 다른 구체예에서, 배아는 6-8세포기 배아이다. 또 다른 구체예에서, 배아는 8-10세포기 배아이다. 특정 구체예에서, 탭핑은 배아의 나머지의 생존성을 실질적으로 감소시키지 않으며 1개 이상의 할구를 분리하기에 충분한 힘의 양을 발생시키는 것을 포함한다. 생존성의 유지는, 예를 들어 잔존 배아를 1일 이상 동안 배양하고 잔존 배아가 배양시 계속 분열할 수 있음을 확인함으로써 밝혀질 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나가 사용되어 배아로부터 할구 (1개의 할구 또는 1개 초과의 할구)를 수득할 수 있다. 특정 방법은 할구의 분리를 촉진하기 위해 단독으로 사용되거나 또 다른 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 배아는 포유류 배아이다. 특정 구체예에서, 포유류 배아는 인간 배아이다. 예시적인 포유류는 비제한적으로 마우스, 랫트, 토끼, 소, 개, 고양이, 양, 햄스터, 돼지, 인간 이외의 영장류, 및 인간을 포함한다.
전술한 것들 중 어느 하나의 특정 구체예에서, 할구는 배아의 나머지를 파괴하지 않으며 배아로부터 분리된다. 잔존 배아 (배아에서 분리된 할구를 뺀 것)는 배양되고/거나 동결보존될 수 있다. 특정 구체예에서, 잔존 배아는 잔존 배아가 계속 분열할 수 있는 지 (예를 들어, 여전히 생존가능한 지)의 여부를 확인하기에 충분한 시간 동안 배양된 후, 생존성이 확인된 경우 잔존 배아가 동결보존된다. 특정한 다른 구체예에서, 잔존 배아는 즉시 동결보존된다.
특정한 다른 구체예에서, 다수의 할구가 단일 배아로부터 분리되고, 이러한 배아는 다수의 할구가 분리되는 동안 또는 분리된 후에 파괴된다. 다수의 할구는, 예를 들어 최초 할구 배양 동안 다수의 할구를 응집시킴으로써 하나의 실험에서 함께 사용될 수 있다. 또한, 단일 배아로부터 생성될 수 있는 경우 보다 세포주 또는 세포 유형의 수를 최대화시키기 위해 다수의 할구가 별개의 실험에서 사용될 수 있다.
할구가 수득되는 배아는 유성적 또는 무성적 방법에 의해 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 배아는 정자에 의한 난자의 수정에 의해 생성된다. 특정한 다른 구체예에서, 배아는 체세포핵이식, 단성생식, 동정생식(androgenesis), 또는 다른 무성 기술에 의해 생성된다. 무성 기술로부터 유래된 배아는 수정에 의해 생성된 배아와 동일하게 보이지 않을 수 있음이 주목된다. 그러나, 외관상의 임의의 차이에도 불구하고, 배아라는 용어는 무성생식의 산물 및 수정 또는 다른 유성생식 수단의 산물을 포함하는 것으로 의도된다.
할구의 배양 및 ES 세포의 생성
배아로부터 분리된 경우, 단리된 할구(들)은 임의의 유형의 배지, 예를 들어 퀸즈 난할 배지(Quinn's cleavage medium) (Cooper Surgical Inc. Cat #ART1529)와 같은 배아 배지에서 최초 배양될 수 있다. 비제한적으로 임의의 시판 포뮬레이션(formulation)을 포함하는, 배아의 성장을 지속시키는 임의의 배지가 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "배아 배지"라는 용어는 배양시 할구 (특히, 인간 할구)의 생존을 촉진시키는 배지를 지칭하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 배아 배지는 5 mM 미만의 글루코스를 함유하는 배지이다. 특정 구체예에서, 배아 배지는 310 mosm 미만의 삼투몰농도를 지닌 배지이다. 특정한 다른 구체예에서, 배아 배지는 5 mM 미만의 글루코스를 함유하며 310 mosm 미만의 삼투몰농도를 지니는 배지이다. 특정 구체예에서, 할구를 최초로 배양하기 위해 사용되는 배지는 300 mosm 미만, 280 mosm 미만, 또는 260 mosm 미만의 삼투몰농도를 지니며 임의로 5 mM 미만의 글루코스를 함유한다. 특정 구체예에서, 할구를 최초로 배양하기 위해 사용되는 배지는 약 260 내지 280 mosm의 삼투몰농도를 지니며, 임의로 5 mM 미만의 글루코스를 함유한다. 할구를 최초로 배양하기 위해 사용되는 배지의 삼투몰농도 및 글루코스의 특정 농도에 관계없이, 배지가 항생제, 미네랄, 아미노산, 및 시판되는 배지 포뮬레이션에서 통상적으로 발견되는 다른 인자들로 또한 보충될 수 있다는 것이 주목된다.
할구는 처음에는 표준 ES 세포 배지에서 잘 성장하지 않을 수 있다. 그러나, 본 명세서에 상세히 설명되어 있는 바와 같이, 할구가 특정 배아 또는 태아 세포의 존재하에서 배양되었고/되었거나 1회 또는 그 초과 횟수 만큼 분열하게 된 경우, 할구의 클러스터는 임의로 ES 세포 배지에서 배양될 수 있거나, 배지를 점진적으로 교환함으로써 배아 배지로부터 ES 세포 배지로 서서히 옮겨질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "ES 세포 배지"라는 용어는 배양시 ES 세포의 유지를 촉진시키는 배지를 지칭하기 위해 사용되고, 할구의 클러스터를 배양하기 위해 사용될 수 있는데, 이는 이러한 할구의 클러스터가 계속 분열하여 ES 세포, ED 세포 등을 생성시키기 때문이다. 이러한 배지는 ES 세포를 위해 적어도 어느 정도는 최적화된다. 특정 구체예에서, ES 세포 배지는 5 mM 이상의 글루코스 (비교적 고농도의 글루코스)를 함유한다. 특정한 다른 구체예에서, ES 세포 배지는 310 mosm 이상의 삼투몰농도를 지닌다. 특정한 다른 구체예에서, 배지는 5 mM 이상의 글루코스를 함유하며, 310 mosm 이상의 삼투몰농도를 지닌다. 특정 구체예에서, 이러한 배지는 320 mosm 이상 또는 330 mosm 이상의 삼투몰농도를 지니며, 임의로 5 mM 이상의 글루코스를 함유한다. 특정 구체예에서, 이러한 배지는 약 310 내지 340 mosm의 삼투몰농도를 지니며, 임의로 5 mM 이상의 글루코스를 함유한다. ES 세포 배지는 ES 세포의 성장을 촉진하는 것으로 당 분야에 공지된 인자들로 또한 보충될 수 있고, 이러한 배지는 항생제, 미네랄, 아미노산, 및 시판되는 배지 포뮬레이션에서 전형적으로 발견되는 다른 인자들을 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 전핵 단계 인간 배아는 퀸즈 난할 배지 (Cooper Surgical)에서 배양된다.
특정 구체예에서, 전핵 단계 인간 배아는 8세포기까지 배양된다. 특정 구체예에서, 전핵 단계 배아는 약 2세포기, 4세포기 또는 16세포기까지 배양될 수 있다. 특정 구체예에서, 전핵 단계 배아는 2세포기 내지 4세포기, 2세포기 내지 8세포기, 2세포기 내지 16세포기, 4세포기 내지 8세포기, 4세포기 내지 16세포기, 또는 8세포기 내지 16세포기까지 배양될 수 있다. 특정 구체예에서, 배아는 0.05% PVA로 보충된 Ca++ 및 Mg++ 비함유 포스페이트 완충 식염수에서 예비 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 배아는 실온에서 약 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 5-10분, 5-15분, 5-30분, 10-15분, 10-30분, 또는 15-30분간 예비 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 배아는 조작을 위해 퀸즈 hepes 배지(Quinn's hepes medium)로 옮겨진다.
특정 구체예에서, 개개의 할구는 PIEZO를 사용하여 배아로부터 단리된다. 특정 구체예에서, 생검 피펫을 삽입하기 전에, 투명대에 구멍 (500㎛ 직경)이 생성된다. 특정 구체예에서, 구멍은 PIEZO의 수 회의 펄스를 가함으로써 작은 (20 ㎛) 피펫을 사용하여 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 약한 부압을 가하여 할구를 붙잡기 위해 생검 피펫 (500 ㎛)이 구멍을 통해 삽입된다. 특정 구체예에서, 할구는 할구의 2/3가 피펫의 내부에 존재하는 경우 당겨서 빼내어진다. 특정 구체예에서, 할구의 1/3, 1/2 또는 3/4가 피펫의 내부에 존재한다. 특정 구체예에서, 할구의 1/3 내지 1/2, 1/3 내지 2/3, 1/3 내지 3/4, 1/2 내지 2/3, 1/2 내지 3/4, 또는 2/3 내지 3/4이 피펫의 내부에 존재한다.
특정 구체예에서, 생검 후, 모체 배아와 할구는 본래의 배양 드롭(culture drop) (Quinn's cleavage medium)으로 복귀되어, 12시간 내지 18시간 동안 함께 배양될 수 있다. 특정 구체예에서, 생검 후, 모체 배아와 할구는 본래의 배양 드롭 (Quinn's cleavage medium)으로 복귀되어, 약 6 내지 12시간, 6 내지 18시간, 6 내지 24시간, 12 내지 18시간, 12 내지 24시간, 또는 18 내지 24시간 동안 함께 배양될 수 있다. 특정 구체예에서, 모체 배아는 배반포 배지 (퀸즈 배반포 배지(Quinn's blastocyst medium))로 옮겨진다. 특정 구체예에서, 할구는 MEF를 함유하는 소량의 배양 드롭 (50㎕)로 옮겨진다. 특정 구체예에서, 할구 배지는 라미닌, 피브로넥틴 또는 매트리겔(Matrigel)로 보충될 수 있다. 특정 구체예에서, 할구는 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일간 배양된다. 특정 구체에에서, 할구는 이들이 동일한 배지에서 약 20개의 세포로 구성된 세포 클럼프를 형성할 때까지 배양된다. 특정 구체예에서, GFP ES 세포 배양 드롭은 할구 배양 드롭과 합쳐져서 2개의 배지가 함께 혼합되게 할 수 있다. 특정 구체예에서, 할구 클럼프의 일부 또는 전부가 분리되어, 약 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 후에 동일한 배양 드롭에 플레이팅될 수 있다.
특정 구체예에서, 할구는 인간 또는 다른 포유류 배아로부터 수득되어 배아 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 할구는 1일 이상 동안 또는 할구가 1회 이상 분열할 때까지 배아 배지에서 배양된다. 그러나, 할구는 1일을 초과한 기간 (2일, 3일, 4일 이상 등) 동안 배아 배지에서 배양될 수 있고/있거나 할구는 분열하여 할구의 클러스터를 생성시키기 전에 배아 또는 태아 세포와 접촉된 상태로 배양될 수 있다. 배아 배지에서 배양된 경우, 할구는 1회 또는 그 초과 횟수로 분열하거나 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터를 생성시킬 수 있다. 할구의 클러스터를 추가로 배양하는 것은 할구를 이의 프로제니와 함께 배양하는 것을 포함한다. 특정 구체에에서, 할구는 분열하고, 프로제니는 응집체로서 배양된다.
한 가지 구체예에서, 할구는 마이크로드롭(microdrop)에서 배양될 수 있다. 각각의 마이크로드롭은 단일 할구 또는 다수의 할구를 함유할 수 있다. 약 1일 이상, 2 내지 3일 이상, 또는 4일 이상 후, 배양된 할구는 분열하여 소포 또는 응집체를 형성할 수 있다. 배아 세포와의 직접적 또는 간접적 접촉 전에 할구를 배양하는 것의 이점은 배아 세포가 할구 보다 커지지 않게 한다는 것이다.
2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터를 생성시키기 위해 할구가 최초로 배양된 후, 2개 또는 그 초과의 할구의 배양된 클러스터는 배아 또는 태아 세포와 직접적으로 또는 간접적으로 접촉하거나, 배아 또는 태아 세포의 부재하에서 할구의 추가 성숙을 촉진시키는 배지와 접촉한다. 이러한 배지는 배아 또는 태아 세포로 컨디셔닝(conditioning)된 배지 (컨디셔닝된 배지), 또는 할구의 성숙을 촉진시키는 성장 인자 또는 사이토카인으로 보충된 배지를 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 ACTH (부신피질자극 호르몬)로 보충된다.
배아 또는 태아 세포와의 직접적 또는 간접적 배양이 사용되는 구체예의 경우, 배아 또는 태아 세포는 예를 들어 포유류로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 배아 또는 태아 세포는 마우스 또는 인간 세포이다. 예시적인 배아 또는 태아 세포는 비제한적으로 배아 줄기(ES) 세포 (배반포 또는 할구로부터 유래되거나 다른 방법에 의해 유래된 것이든지, 체세포핵이식 또는 다른 무성생식을 이용하여 유래된 것이든지 간에), 배아 생식세포, 배아 암종세포, 태반세포, 영양막/영양외배엽 세포, 영양막 줄기세포, 원시 생식세포 배아 생식세포, 양수세포, 양막 줄기세포, 태반세포, 태반 줄기세포, 및 제대혈세포를 포함한다. 할구가 배아 또는 태아 세포와 직접적으로 또는 간접적으로 접촉하는 특정 구체예에서, 할구가 배양되는 배지는 ACTH 또는 할구의 성숙을 촉진시키는 다른 성장 인자 또는 사이토카인으로 추가로 보충된다.
사용되는 경우, 배아 또는 태아 세포는 영양세포층의 존재 또는 부재하에서 성장될 수 있다. 영양세포는 배아 또는 태아 세포를 유지시키는 것을 보조하고 이의 분화를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 사용되는 특정 배아 또는 태아 세포를 기초로 하여 특정 영양세포가 선택될 수 있다. 예시적인 영양세포는 비제한적으로 섬유아세포 영양세포를 포함한다. 이러한 섬유아세포 영양세포는 배아 또는 태아 세포와 동일한 종으로부터 유래될 수 있거나, 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 유사하게는, 영양세포 및 배아 또는 태아 세포는 할구와 동일한 종으로부터 유래되거나 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 영양세포는 배아 또는 태아 세포 보다 커지지 않게 되도록 조사(irradiation)되거나 다른 방식으로 처리된다. 예시적인 영양세포는 비제한적으로 마우스 배아 섬유아세포 (MEF 세포), 인간 배아 섬유아세포, 인간 포피 섬유아세포, 인간 피부 섬유아세포, 인간 자궁내막 섬유아세포, 인간 난관 섬유아세포 및 태반 세포를 포함한다. 다른 동물 (포유류, 닭 등)로부터 유래된 유사한 세포 유형이 또한 고려된다.
한 가지 구체예에서, 영양세포 및/또는 배아 세포는 할구와 동일한 배아로부터 유래되는 자가 세포인 인간 세포이다.
배아 또는 태아 세포는 ES 세포 배지 또는 배아 또는 태아 세포의 성장을 지속시키는 임의의 배지, 예를 들어 녹아웃(Knockout) DMEM (Invitrogen Cat # 10829-018)에서 성장된다. 예시적인 배아 또는 태아 세포는 비제한적으로 배아 줄기세포, 예를 들어 이미 확립된 세포주로부터의 배아 줄기세포, 배아 암종세포, 뮤린 배아 섬유아세포, 다른 배아 유사 세포, 배아 기원 세포 또는 배아로부터 유래된 세포를 포함하는데, 이들 중 많은 세포는 당 분야에 공지되어 있고 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110- 2209, USA) 및 기타 공급원으로부터 이용가능하다.
배아 또는 태아 세포는 배양된 할구에 직접 첨가될 수 있거나, 배양된 할구(들)과 매우 근접해 있지만 직접 접촉되지 않은 상태로 성장될 수 있다. 배양된 할구에 배아 또는 태아 세포로부터의 인자 또는 신호를 제공하는 것을 촉진시키는, 다양한 직접적 및 간접적 공동배양 시스템이 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 "2개 또는 그 초과의 할구의 배양된 클러스터를 접촉시키는"이란 직접적으로 또는 간접적으로 접촉시키거나 공동배양하는 임의의 방법을 지칭한다.
특정 구체예에서, 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터를 접촉시키는 것은 할구 클러스터를 배아 또는 태아 세포와 응집시키는 것을 포함한다. 특정한 다른 구체예에서, 접촉시키는 것은 세포가 배아 또는 태아 세포와 직접 접촉하지만 이들에 응집되지 않도록 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터를 공동배양하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 접촉시키는 것은, 동일한 배양 용기에서 유지되지만 세포와 직접 접촉하지 않거나 연속 마이크로드롭으로서 유지되는 것과 같이 세포가 간접 접촉 상태로 존재하도록, 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터를 배아 또는 태아 세포와 공동배양하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 2개 또는 그 초과의 할구(들)의 배양된 클러스터를 배아 또는 태아 세포와 직접적으로 또는 간접적으로 접촉시키는 단계를 포함하는데, 단, 상기 접촉은 문헌 [Chung et al., Nature (2006) 439:216-9]에 ㅣ재된 바와 같이 배양된 할구를 배아 세포와 응집시킴으로써 수행되지 않는다. 또한, 할구(들)의 배양 및 배아 또는 태아 세포의 배양은 간접적으로 연결되거나 합쳐진다. 이는 경광유, 예를 들어 쿠퍼 서지컬(Cooper Surgical) ACT# ART4008, 파라핀 오일 또는 스퀴브스 오일(Squibb's oil)하에서 2개의 드롭 사이에서 조작 피펫을 드래깅(dragging)하는 것을 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 연결은 유리 모세관 또는 유사한 장치를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 배양된 할구와 배아 세포 간의 이러한 간접 연결은 배아 배지 (여기서 할구가 배양됨)와 ES 세포 배지 (여기서 인간 배아 세포가 성장됨)의 점진적 혼합을 가능하게 한다. 또 다른 구체예에서, 할구(들)은 잔존 배아와 공동배양될 수 있다. 예를 들어, 할구는 미세소적 배양 시스템 또는 당 분야에 공지된 다른 배양 시스템에서 잔존 배아와 공동배양되는데, 이는 세포-세포 접촉을 허용하지 않지만 세포 분비된 인자 및/또는 세포-매트릭스 접촉은 허용할 수 있다. 마이크로드롭의 용적은 신호를 증강시키기 위해 예를 들어 50 마이크로리터에서 약 5 마이크로리터로 감소될 수 있다. 또 다른 구체에에서, 배아 세포는 인간이 아닌 종, 예를 들어 인간 이외의 영장류 또는 마우스로부터 유래될 수 있다.
특정 구체예에서, 할구, 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터 및 배아 또는 태아 세포를 배양하기 위해 사용되는 특정 배지 포뮬레이션은 종에 따라 약간 달라질 수 있다. 추가로, 최초 할구 배양이 할구의 클러스터 또는 배아 세포를 배양하기 위해 사용되는 배지 포뮬레이션과 상이한 배지 포뮬레이션로부터 혜택을 받는 지의 여부는 또한 종에 따라 약간 달라질 수 있다.
특정 구체예에서, 할구를 개별적으로 배양하기 위해 사용되는 배지와 배아 또는 태아 세포를 배양하기 위해 사용되는 배지가 반드시 동일한 것은 아니다. 배지가 상이한 구체예에서, 할구가 최초로 배양되는 배지와 상이한 배지에 할구 또는 할구의 클러스터가 최초로 노출되고 있는 기간이 존재할 수 있다 (예를 들어, 세포는 배아 또는 태아 세포가 배양되는 배지에 서서히 노출될 것임). 이러한 구체예에서, 세포 및 세포 아웃그로쓰(outgrowth)의 클러스터를 초래하도록 수 회 분열이 일어난 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터는 점진적으로 ES 세포 배지의 특성을 지닌 배지로 옮겨져서 (예를 들어 배지의 교환에 의해), 이러한 배지에서 배양될 수 있다.
약 3 내지 4일 후, 할구(들)은 ES 세포의 특성을 나타낸다. 상세하게는, 세포 및 할구 프로제니 클러스터가 계속 분열함에 따라, 다양한 세포 유형이 출현하고 이들 세포 유형의 표현형이 확인될 수 있다. 출현하는 세포 유형으로는 영양외배엽 유사 세포, ES 세포, 및 부분 분화되거나 최종 분화된 ED 세포가 있다. 이와 같이, 이러한 방법들은 ES 세포, TS 또는 다른 영양외배엽 세포, 또는 ED 세포를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 배양된 할구는 아마도 배아 또는 태아 세포에 의해 분비되거나 세포외 매트릭스에 의해 분비된 인자들의 결과로써 수 일 또는 수 주의 기간에 걸쳐 ES 세포 성장을 나타내는 것으로 믿어진다. 또한, 분열 중인 할구 프로제니의 클러스터는 일부 일면에서 착상전 배반포의 발달 동안 관찰되는 변화와 유사점을 지닌다. 이와 같이, 이러한 배양물에서 출현하는 세포 유형은 어느 정도까지는 전배반포(whole blastocyst) 또는 ICM이 플레이팅된 경우 관찰되는 세포 유형의 발달 단계를 반복한다.
특정 구체예에서, 할구 배양 조건은 세포를 이러한 세포의 분화를 억제하거나 그렇지 않으면 이러한 세포의 분화를 강화시킬 수 있는 인자, 예를 들어 세포가 비-ES 세포, 영양외배엽 또는 다른 세포 유형으로 분화되지 못하게 할 수 있는 인자들과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 조건은 배양된 세포를 헤파린과 접촉시키거나, Oct-4를 세포내로 도입시키거나 (예를 들어 Oct-4를 배지에 포함시킴으로써), 세포에서 내인성 Oct-4를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, cdx-2의 발현은 비제한적으로 CDX-2 RNAi를 할구내로 도입시키는 것을 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 방지되며, 이로써 할구가 TS 세포로 분화하는 것을 억제한다.
특정 구체예에서, 할구 배양 배지는 비-ES 세포로의 분화를 억제하는 인자로 보충된다. 특정 구체예에서, 비-ES 세포로의 분화를 억제하기 위해 배양 배지에 라미닌이 첨가된다. 특정 구체예에서, 배지는 약 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 또는 20 ㎍/㎖의 라미닌으로 보충된다. 특정 구체예에서, 배지는 1-5, 1-10, 5-10, 10-20 또는 1-20 ㎍/㎖의 라미닌으로 보충된다.
특정 구체에에서, 배지는 밀착 연접을 붕괴시키는 인자들로 보충된다. 특정 구체예에서, 밀착 연접을 붕괴시키기 위해 배지에 라미닌이 첨가된다.
특정 구체예에서, 배지는 영양외배엽 분화 경로를 억제하는 인자들로 보충된다. 특정 구체에에서, 영양외배엽 경로를 억제하기 위해 배지에 라미닌이 첨가된다.
특정 구체예에서, 배지는 세포를 탈분극시키는 인자들로 보충된다. 특정 구체에에서, 세포를 탈분극시키기 위해 배지에 라미닌이 첨가된다. 특정 구체예에서, 탈분극은 세포 표면상의 미세융모의 결여에 의해 결정된다. 특정 구체예에서, 탈분극은 다중층 구조를 형성하는 세포의 파일링에 의해 결정된다.
상기 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명은 배아로부터 수득된 할구로부터 ES 세포, ED 세포 및 TS 세포를 생성시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 할구가 수득되는 배아를 반드시 파괴시키지 않으면서도 ES 세포, ED 세포 및 TS 세포 뿐만 아니라 세포주를 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
할구의 배양 및 ED 세포의 생성
과거에는, 배아 줄기세포주를 생성시키기 위해 내부 세포괴 세포의 장기간 배양이 사용되었다. 후속하여, 배아 줄기세포는 배양되고 조건적으로 유전적으로 변형되고, 치료용 세포를 생성시키기 위해 분화되도록 유도되었다. 본원에 그 전문이 참조로 포함된 미국 특허 출원 번호 11/025,893 (US 2005/0265976A1로서 공개됨)에는 배아 줄기세포주를 생성시키지 않으면서 분화를 직접 유도함으로써 내부 세포괴 세포 또는 상실배 유래된 세포로부터 분화된 프로제니터 세포를 생성시키는 방법 및 상기 분화된 세포, 조직 및 기관의 이식 요법용 용도가 기재되어 있다. 이러한 세포가 ES 세포주가 아닌 배아의 세포로부터 유래되므로, 본 발명자들은 이러한 세포를 배아 유래된(ED) 세포로 명명한다. 할구 유래된 ED 세포는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 생성된 인간 ES 세포 보다 광범위한 분화 잠재력을 지니는데, 이는 뮤린 ES 세포주를 생식선 세포로 분화시키는 방법을 사용하는 것과 같은 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 ED 세포가 생식선 세포로 용이하게 분화될 수 있기 때문이다. 대조적으로, 내부 세포괴 세포로부터 유래된 인간 ES 세포주는 생식선 세포로 분화될 수 있는 것으로 예측되지 않는다. 이러한 현상은 돼지, 소, 닭 및 랫트와 같은 동물에서 내부 세포괴 세포로부터 유래된 ES 세포에서 관찰되었고, 이는 생식선이 분화에서 분기되어 나오는 첫 번째 세포 계통 중 하나라는 사실에 기인하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 방법들 중 일부에서, 적어도 2개의 세포를 지니고 치밀화중인 상실배의 발달 단계로 진입하기 전의 배아로부터의 할구가, 분화된 프로제니터 세포로 직접 분화되도록 유도되며, 이러한 분화된 프로제니터 세포는 그 후 세포 요법을 위해 그리고 이식용 세포, 조직 및 기관의 생성을 위해 사용된다. 요망되는 경우, 유전적 변형이 예를 들어 상실배 또는 배반포를 생성시키기 위한 핵이식 전에 체세포내로 도입되거나, 체세포의 DNA를 상기 체세포를 리프로그래밍할 수 있는 인자들과 병치시킴으로써 상기 체세포를 미분화된 세포로 리프로그래밍하기 전에 상기 체세포내로 도입되거나, 이러한 방법들을 사용하여 생성되는 ES 세포주로 도입될 수 있다 (참조: US 2004199935로서 공개된 미국 특허 출원 번호 10/831,599, 2006년 8월 3일에 출원된 PCT/US06/30632, 및 미국 가특허 출원 번호 60/705,625, 60/729,173 및 60/818,813, 이들 특허 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있음). 따라서, 본 발명의 분화된 프로제니터 세포는 배아 줄기세포 또는 배아 생식세포의 다능성을 지니지 않으며, 본질적으로, 조직 특이적인 부분 분화되거나 완전 분화된 세포이다. 이러한 분화된 프로제니터 세포는 3가지 배아 배엽, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 중 어느 하나로부터 유래된 세포를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 분화된 프로제니터 세포는 뼈, 연골, 평활근, 유전자 발현의 태아기 패턴을 지니며 흉터없는 창상 복구를 촉진할 수 있는 진피, 및 조혈 또는 혈관아세포 (중배엽), 확정적 내배엽, 간, 원시장(primitive gut), 췌장 베타 세포, 및 호흡 상피 (내배엽); 또는 뉴런, 신경교세포, 모낭, 또는 망막 뉴런과 망막 색소 상피를 포함하는 눈 세포로 분화될 수 있다.
또한, 본 발명의 분화된 프로제니터 세포는 텔로머라제 (TERT)의 촉매 성분을 발현하여 무한증식성일 필요가 없거나, 상기 프로제니터 세포는 배아 줄기세포에서 발견되는 세포 표면 마커, 예를 들어 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 알칼리 포스파타제 활성에 대해 양성이고 SSEA-1에 대해 음성인, 영장류 배아 줄기세포에 특징적인 세포 표면 마커를 발현할 필요가 없다. 더욱이, 본 발명의 분화된 프로제니터 세포는 배상체와 구별되는데, 즉, 배상체는 배아 줄기세포로부터 유래되고 본 발명의 분화된 줄기세포는 할구로부터 유래된다.
바람직하게는, 본 발명의 분화된 세포는 배아 줄기세포의 부재하에서 할구 유래된 세포를 배양함으로써 생성된다. 미분화된 배아 줄기세포의 성장이 방지될 수 있는데, 이는 예를 들어 할구를 분화 유도제의 존재하에서 배양하거나, 배아 줄기세포의 성장이 방지되도록 유전적 변형을 세포내로 도입시킴으로써 이루어진다.
포유류 할구와 발달상 동등한 임의의 척추동물 배아가 할구원 또는 세포원으로서 사용될 수 있다. 특히, 인간 할구는 인간 세포 기반 요법을 만들어내는 데에 있어서 중요한 효용을 갖는다. 본래의 배아는 시험관내 수정에 의해 생성되거나, 정상적인 유성생식, 인공수정 또는 생식체 난관내 이식(GIFT)에 의한 생식관내에서의 수정에 의해 유도된 후 회수되거나, 체세포핵이식에 의해 유도될 수 있었다.
분화
할구를 단리하는 방법은 본 명세서에서 이미 설명되었다. 단리된 할구는, 당 분야에 공지되어 있거나 (예시적 분자의 목록에 대해서는 표 1이 참조됨), 그 기재내용이 본원에 참조로 포함되어 있는 계류중인 출원들, 즉, 2006년 4월 11일에 출원된 PCT/US2006/013573, 2006년 8월 3일에 출원된 미국 출원 번호 60/835,779, 2006년 4월 14일에 출원된 미국 출원 번호 60/792,224, 2006년 5월 19일에 출원된 미국 출원 번호 60/801,993, 2006년 4월 11일에 출원된 PCT/US2006/013519, 미국 출원 번호 11/025,893 (US 20050265976로서 공개됨), 2005년 8월 4일에 공개된 WO2005/070011, 및 2006년 8월 3일에 공개된 WO 2006/080952에 개시되어 있는 특정한 요망되는 분화된 세포 유형을 생성시키는 데에 있어서 유용한 성장 인자, 혈청, 호르몬, 세포외 매트릭스의 다양한 조합물을 포함하는 분화 유도 조건의 존재하에서 분화되도록 직접 유도되거나 ES 세포 또는 세포주를 통해 유도될 수 있다. 예를 들어, 할구 또는 ES 세포는 다양한 유도 세포 유형, 예를 들어 세포의 단일 세포 유래된 개체군으로서 단리된 세포 유형상에서 배양될 수 있거나, 특정 세포외 매트릭스 성분과 그 밖의 분화 유도 인자, 예를 들어 하기 표 1에 제시된 인자 또는 이들의 조합물상에서 배양될 수 있다.
표 1
배양 변수
EGF 리간드
1) 암피레귤린(Amphiregulin)
2) 베타셀룰린(Betacellulin)
3) EGF
4) 에피겐(Epigen)
5) 에피레귤린(Epiregulin)
6) HB-EGF
7) 뉴레귤린-3(Neuregulin-3)
8) NRGl 이소폼(isoform) GGF2
9) NRGl 이소폼 SMDF
10) NRG1-알파/HRGl-알파
11) TGF-알파
12) TMEFF1/토모레귤린-1(Tomoregulin-1)
13) TMEFF2
14) 푸울링된(pooled) EGF 리간드 (상기 1 내지 13)
EGF R/ErbB 수용체 패밀리
15) EGF 수용체
16) ErbB2
17) ErbB3
18) ErbB4
19) 푸울링된 EGF/ErbB 수용체 (상기 15 내지 18)
FGF 리간드
20) FGF 산성
21) FGF 염기성
22) FGF-3
23) FGF-4
24) FGF-5
25) FGF-6
26) KGF/FGF-7
27) FGF-8
28) FGF-9
29) FGF-10
3O) FGF-1l
31) FGF-12
32) FGF-13
33) FGF-14
34) FGF-15
35) FGF-16
36) FGF-17
37) FGF-18
38) FGF-19
39) FGF-20
40) FGF-21
41) FGF-22
42) FGF-23
43) 푸울링된 FGF 리간드 (상기 20 내지 38)
FGF 수용체
40) FGF Rl
41) FGF R2
42) FGF R3
43) FGF R4
44) FGF R5
45) 푸울링된 FGF 수용체 (상기 40 내지 44)
FGF 조절물질(Regulator)
46) FGF-BP
헤지호그(Hedgehog)
47) 데저트(Desert) 헤지호그
48) 소닉(Sonic) 헤지호그
49) 인디언(Indian) 헤지호그
50) 푸울링된 헤지호그 (상기 47 내지 49)
헤지호그 조절물질
51) Gas1
52) Hip
53) 푸울링된 헤지호그 조절물질 (상기 51 내지 52)
IGF 리간드
54) IGF-I
55) IGF-II
56) 푸울링된 IGF 리간드 (상기 54 내지 55)
IGF-I 수용체 (CD221)
57) IGF-I R
GF 결합성 단백질 (IGFBP) 패밀리
58) ALS
59 IGFBP-4
60) CTGF/CCN2
61) IGFBP-5
62) 엔도칸(Endocan)
63) IGFBP-6
64) IGFBP-1
65) IGFBP-rpl/IGFBP-7
66) IGFBP-2
67) NOV/CCN3
68) IGFBP-3
69) 푸울링된 GF 결합성 단백질 패밀리 (상기 58 내지 68)
수용체 티로신 키나제
70) Ax1
71) Clq Rl/CD93
72) DDRl
73) Flt-3
74) DDR2
75) HGF R
76) Dtk
77) IGF-II R
78) Eph
79) 인슐린 R/CD220
80) EphAl
81) M-CSF R
82) EphA2
83) Mer
84) EphA3
85) MSP R/Ron
86) EphA4
87) MuSK
88) EphA5
89) PDGF R 알파
90) EphA6
91) PDGF R 베타
92) EphA7
93) Ret
94) EphA8
95) RORl
96) EphBl
97) ROR2
98) EphB2
99) SCF R/c-kit
100) EphB3
101) Tie-l
102) EphB4
103) Tie-2
104) EphB6
105) TrkA
106) TrkB
107) TrkC
108) VEGF Rl/Flt-1
109) VEGF R2/Flt-1
110) VEGF R3/Flt-4
111) 푸울링된 수용체 티로신 키나제 (상기 70 내지 110)
프로테오글리칸
112) 아그레칸(Aggrecan)
113) 루미칸(Lumican)
114) 비글리칸(Biglycan)
115) 미메칸(Mimecan)
116) 데코린(Decorin)
117) NG2/MCSP
118) 엔도칸
119) 오스테오아드헤린(Osteoadherin)
120) 엔도레펠린(Endorepellin)
121) 신데칸-1(Syndecan-l)/CD138
122) 글리피칸 2(Glypican 2)
123) 신데칸-3
124) 글리피칸 3
125) 테스티칸 1(Testican l)/SPOCK1
126) 글리피칸 5
127) 테스티칸 2/SPOCK2
128) 글리피칸 6
129) 테스티칸 3/SPOCK3
130) 헤파란 설페이트 프로테오글리칸
131) 헤파린
132) 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸
133) 히알루론산
134) 더마탄(Dermatan) 설페이트 프로테오글리칸
프로테오글리칸 조절물질
135) 아릴설파타제 A(Arylsulfatase A)/ARSA
136) HAPLN1
137) 엑소스토신류 2(Exostosin-like 2)
138) HS6ST2
139) 엑소스토신류 3
140) IDS
141) 푸울링된 프로테오글리칸 조절물질 (상기 135 내지 140)
SCF, Flt-3 리간드 & M-CSF
142) Flt-3
143) M-CSF R
144) Flt-3 리간드
145) SCF
146) M-CSF
147) SCF R/c-kit
148) 푸울링된 인자 (상기 142 내지 147)
액티빈(Activin)
149) 액티빈 A
150) 액티빈 B
151) 액티빈 AB
152) 액티빈 C
153) 푸울링된 액티빈 (상기 149 내지 152)
BMP (골 형성 단백질)
154) BMP-2
155) BMP-3
156) BMP-3b/GDF-10
157) BMP-4
158) BMP-5
159) BMP-6
160) BMP-7
161) BMP-8
162) 데카펜타플레직(Decapentaplegic)
163) 푸울링된 BMP (상기 154 내지 162)
GDF (성장 분화 인자)
164) GDF-1
165) GDF-2
166) GDF-3
167) GDF-4
168) GDF-5
169) GDF-6
170) GDF-7
171) GDF-8
172) GDF-9
173) GDF-10
174) GDF-1l
175) GDF-12
176) GDF-13
177) GDF-14
178) GDF-15
179) 푸울링된 GDF (상기 164 내지 178)
GDNF 패밀리 리간드
180) 아르테민(Artemin)
181) 뉴르투린(Neurturin)
182) GDNF
183) 페르세핀(Persephin)
184) 푸울링된 GDNF 리간드 (상기 180 내지 183)
TGF-베타
185) TGF-베타
186) TGF-베타 1
187) TGF-베타 1.2
188) TGF-베타 2
189) TGF-베타 3
190) TGF-베타 4
191) TGF-베타 5
192) LAP (TGF-베타 1)
193) 잠복성(Latent) TGF-베타 1
194) 푸울링된 TGF-베타 (상기 185 내지 193)
그 밖의 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드
195) 레프티(Lefty)
196) 노달(Nodal)
197) MIS/ AMH
198) 푸울링된 그 밖의 TGF-베타 리간드 (상기 195 내지 197)
TGF-베타 수퍼패밀리 수용체
199) 액티빈 RIA/ALK-2
200) GFR 알파-1
201) 액티빈 RIB/ALK-4
202) GFR 알파-2
203) 액티빈 RIIA
204) GFR 알파-3
205) 액티빈 RIIB
206) GFR 알파-4
207) ALK-1
208) MIS RII
209) ALK-7
210) Ret
211) BMPR-IA/ALK-3
212) TGF-베타 RI/ALK-5
213) BMPR-IB/ALK-6
214) TGF-베타 RII
215) BMPR-II
216) TGF-베타 RIIb
217) 엔도글린(Endoglin)/CD105
218) TGF-베타 RIII
219) 푸울링된 TGF-베타 패밀리 수용체 (상기 199 내지 218)
TGF-베타 수퍼패밀리 조정물질(Modulator)
220) 암니온레스(Amnionless)
221) GASP-2/WFIKKN
222) BAMBI/NMA
223) 그레믈린(Gremlin)
224) 카론테(Caronte)
225) NCAM-1/CD56
226) 세르베루스 1(Cerberus 1)
227) 노긴(Noggin)
228) 코르딘(Chordin)
229) PRDC
230) 코르딘류 1(Chordin-Like 1)
231) 코르딘류 2
232) Smadl
233) Smad4
234) Smad5
235) Smad7
236) Smad8
237) CRIM1
238) 크립토(Cripto)
239) 크로스베인레스-2(Crossveinless-2)
240) 크립틱(Cryptic)
241) SOST
242) DAN
243) 잠복성 TGF-베타 bp1
244) TMEFF1/토모레귤린-1(Tomoregulin-l)
245) FLRG
246) TMEFF2
247) 폴리스타틴(Follistatin)
248) TSG
249) 폴리스타틴류 1(Follistatin-like 1)
250) 바소린(Vasorin)
251) GASP-1/WFIKKNRP
252) 푸울링된 TGF 조정물질 (상기 220 내지 251)
VEGF/PDGF 패밀리
253) 뉴로필린-1(Neuropilin-l)
254) PlGF
255) PlGF-2
256) 뉴로필린-2
257) PDGF
258) VEGF Rl/Flt-1
259) PDGF R 알파
260) VEGF R2/Flk-1
261) PDGF R 베타
262) VEGF R3/Flt-4
263) PDGF-A
264) VEGF
265) PDGF-B
266) VEGF-B
267) PDGF-C
268) VEGF-C
269) PDGF-D
270) VEGF-D
27I) PDGF-AB
272) 푸울링된 VEGF/PDGF 패밀리 (상기 253 내지 271)
딕콥프(Dickkopf) 단백질 & Wnt 억제물질
273) Dkk-l
274) Dkk-2
275) Dkk-3
276) Dkk-4
277) 소기-1(Soggy-1)
278) WIF-1
279) 푸울링된 인자 (상기 273 내지 278)
프리즐드(Frizzled) & 관련 단백질
280) 프리즐드-1
281) 프리즐드-2
282) 프리즐드-3
283) 프리즐드-4
284) 프리즐드-5
285) 프리즐드-6
286) 프리즐드-7
287) 프리즐드-8
288) 프리즐드-9
289) sFRP-1
290) sFRP-2
291) sFRP-3
292) sFRP-4
293) MFRP
294) 푸울링된 인자 (상기 280 내지 293)
Wnt 리간드
295) Wnt-1
296) Wnt-2
297) Wnt-3
298) Wnt-3a
299) Wnt-4
300) Wnt-5
301) Wnt-5a
302) Wnt-6
303) Wnt-7
304) Wnt-8
305) Wnt-8a
306) Wnt-9
307) Wnt-10a
308) Wnt-10b
309) Wnt-11
310) 푸울링된 Wnt 리간드 (상기 295 내지 309)
그 밖의 Wnt 관련 분자
311) 베타-카테닌
312) LRP-6
313) GSK-3
314) RORl
315) 크레멘-1(Kremen-l)
316) ROR2
317) 크레멘-2
318) WISP-1/CCN4
319) LRP-1
320) 푸울링된 인자 (상기 311 내지 319)
그 밖의 성장 인자
321) CTGF/CCN2
322) NOV/CCN3
323) EG-VEGF/PK1
324) 오스테오크린(Osteocrin)
325) 헤파소신(Hepassocin)
326) PD-ECGF
327) HGF
328) 프로그래뉼린(Progranulin)
329) 베타-NGF
330) 트롬보포이에틴(Thrombopoietin)
331) 푸울링된 인자 (상기 321 내지 330)
스테로이드 호르몬
332) 17베타-에스트라디올
333) 테스토스테론
334) 코르티손
335) 덱사메타손
세포외/막 단백질
336) 혈장 프브로넥틴
337) 조직 피브로넥틴
338) 피브로넥틴 단편
339) 콜라겐 타입 I (젤라틴)
340) 콜라겐 타입 II
341) 콜라겐 타입 III
342) 테나신(Tenascin)
343) 매트릭스 메탈로프로테이나제 1
344) 매트릭스 메탈로프로테이나제 2
345) 매트릭스 메탈로프로테이나제 3
346) 매트릭스 메탈로프로테이나제 4
347) 매트릭스 메탈로프로테이나제 5
348) 매트릭스 메탈로프로테이나제 6
349) 매트릭스 메탈로프로테이나제 7
350) 매트릭스 메탈로프로테이나제 8
351) 매트릭스 메탈로프로테이나제 9
352) 매트릭스 메탈로프로테이나제 10
353) 매트릭스 메탈로프로테이나제 11
354) 매트릭스 메탈로프로테이나제 12
355) 매트릭스 메탈로프로테이나제 13
356) ADAM-1
357) ADAM-2
358) ADAM-3
359) ADAM-4
360) ADAM-5
361) ADAM-6
362) ADAM-7
363) ADAM-8
364) ADAM-9
365) ADAM-10
366) ADAM-11
367) ADAM-12
368) ADAM-13
369) ADAM-14
370) ADAM-15
371) ADAM-16
372) ADAM-17
373) ADAM-18
374) ADAM-19
375) ADAM-20
376) ADAM-21
377) ADAM-22
378) ADAM-23
379) ADAM-24
380) ADAM-25
381) ADAM-26
382) ADAM-27
383) ADAM-28
384) ADAM-29
385) ADAM-30
386) ADAM-31
387) ADAM-32
388) ADAM-33
389) ADAMTS-1
390) ADAMTS-2
391) ADAMTS-3
392) ADAMTS-4
393) ADAMTS-5
394) ADAMTS-6
395) ADAMTS-7
396) ADAMTS-8
397) ADAMTS-9
398) ADAMTS-10
399) ADAMTS-11
400) ADAMTS-12
401) ADAMTS-13
402) ADAMTS-14
403) ADAMTS-15
404) ADAMTS-16
405) ADAMTS-17
406) ADAMTS-18
407) ADAMTS-19
408) ADAMTS-20
409) Arg-Gly-Asp
410) Arg-Gly-Asp-Ser
411) Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro
412) Arg-Gly-Glu-Ser
413) Arg-Phe-Asp-Ser
414) SPARC
415) Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg
416) Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Gln-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ser-Ala-Asp-Arg
417) 엘라스틴(Elastin)
418) 트로펠라스틴(Tropelastin)
419) Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys
420) Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro
421) 라미닌
422) Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly
423) Ser-Asp-Gly-Arg-Gly
424) 비트로넥틴(Vitronectin)
425) 수퍼피브로넥틴(Superfibronectin)
426) 트롬보스폰딘
427) TIMP-1
428) TIMP-2
429) TIMP-3
430) TIMP-4
431) 피브로모듈린(Fibromodulin)
432) 플라보리딘(Flavoridin)
433) 콜라겐 IV
434) 콜라겐 V
435) 콜라겐 VI
436) 콜라겐 VII
437) 콜라겐 VIII
438) 콜라겐 IX
439) 콜라겐 X
440) 콜라겐 XI
441) 콜라겐 XII
442) 엔탁틴(Entactin)
443) 피브릴린(Fibrillin)
444) 신데칸-1(Syndecan-1)
445) 케라탄(Keratan) 설페이트 프로테오글리칸
주위 산소(Ambient Oxygen)
446) 0.1-0.5% 산소
447) 0.5-1% 산소
448) 1-2% 산소
449) 2-5% 산소
450) 5-10% 산소
451) 10-20% 산소
동물 혈청
452) 0.1% 소 혈청
453) 0.5% 소 혈청
454) 1.0% 소 혈청
455) 5.0% 소 혈청
456) 10% 소 혈청
457) 20% 소 혈청
458) 10% 말 혈청
인터류킨
459) IL-1
460) IL-2
461) IL-3
462) IL-4
463) IL-5
464) IL-6
465) IL-7
466) IL-8
467) IL-9
468) IL-IO
469) IL-11
470) IL-12
471) IL-13
472) IL-14
473) IL-15
474) IL-16
475) IL-17
476) IL-18
프로테아제
477) MMP-1
478) MMP-2
479) MMP-3
480) MMP-4
481) MMP-5
482) MMP-6
483) MMP-7
484) MMP-8
485) MMP-9
486) MMP-10
487) MMP-11
488) MMP-12
489) MMP-13
490) MMP-14
491) MMP-15
492) MMP-16
493) MMP-17
494) MMP-18
495) MMP-19
496) MMP-20
497) MMP-21
498) MMP-22
499) MMP-23
500) MMP-24
501) 카텝신 B
501) 카텝신 C
503) 카텝신 D
504) 카텝신 G
505) 카텝신 H
506) 카텝신 L
507) 트립신
508) 펩신
509) 엘라스타제
510) 카르복시펩티다제 A
511) 카르복시펩티다제 B
512) 카르복시펩티다제 G
513) 카르복시펩티다제 P
514) 카르복시펩티다제 W
515) 카르복시펩티다제 Y
516) 키모트립신
517) 플라스미노겐
518) 플라스민
519) u형 플라스미노겐 활성제
520) t형 플라스미노겐 활성제
521) 플라스미노겐 활성제 억제제-1
522) 카르복시펩티다제 Z
아미노산
522) 알라닌
523) 아르기닌
524) 아스파라긴
525) 아스파르트산
526) 시스테인
527) 글루타민
528) 글루탐산
529) 글리신
530) 히스티딘
531) 이소류신
532) 류신
33) 리신
534) 메티오닌
535) 페닐알라닌
536) 프롤린
537) 세린
538) 트레오닌
539) 트립토판
540) 티로신
541) 발린
프로스타글란딘
542) 프로스타글란딘 A1
543) 프로스타글란딘 A2
544) 프로스타글란딘 Bl
545) 프로스타글란딘 B2
546) 프로스타글란딘 D2
547) 프로스타글란딘 El
548) 프로스타글란딘 E2
549) 프로스타글란딘 F1알파
550) 프로스타글란딘 F2알파
551) 프로스타글란딘 H
552) 프로스타글란딘 I2
553) 프로스타글란딘 J2
554) 6-케토-프로스타글란딘 F1a
555) 16,16-디메틸-프로스타글란딘 E2
556) 15d-프로스타글란딘 J2
557) 푸울링된 프로스타글란딘 (상기 542 내지 556)
레티노이드(Retinoid) 수용체 효능제/길항제
558) 메토프렌산(Methoprene Acid)
559) 올 트랜스(All trans) 레티노산
560) 9-시스 레티노산
561) 13-시스 레티노산
562) 푸울링된 레티노이드 효능제 (상기 558 내지 561)
563) 레티노이드 길항제
564) 레티노산 수용체 이소타입 RAR알파
565) 레티노산 수용체 이소타입 RAR베타
566) 레티노산 수용체 이소타입 RAR감마
567) 레티노익(Retinoic) X 수용체 이소타입 RXR알파
568) 레티노익 X 수용체 이소타입 RXR베타
569) 레티노익 X 수용체 이소타입 RAR감마
기타 유도물질
570) 식물 렉틴(lectin)
571) 세균 렉틴
572) 포르스콜린(forskolin)
573) 포르볼(Phorbol) 미리스테이트 아세테이트
574) 폴리-D-리신
575) 1,25-디히드록시비타민 D
576) 인히빈(Inhibin)
577) 헤레귤린(Heregulin)
578) 글리코겐
579) 프로게스테론
580) IL-1
581) 세로토닌
582) 피브로넥틴 - 45kDa 단편
583) 피브로넥틴 - 7OkDa 단편
584) 글루코스
585) 베타 메르캅토에탄올
586) 헤파리나제
587) 뇌하수체 추출물
588) 융모성 고나도트로핀
589) 부신피질자극 호르몬
590) 티록신
591) 봄베신(Bombesin)
592) 뉴로메딘 B(Neuromedin B)
593) 가스트린 방출 펩티드
594) 에피네프린
595) 이소프로테레놀(Isoproterenol)
596) 에탄올
597) DHEA
598) 니코틴산
599) NADH
600) 옥시토신
601) 바소프레신
602) 바소토신
603) 안지오텐신 I
604) 안지오텐신 II
605) 안지오텐신 I 전환 효소
606) 안지오텐신 I 전환 효소 억제제
607) 콘드로이티나제 AB(Chondroitinase AB)
608) 콘드로이티나제 C
609) 뇌 나트륨이뇨 펩티드(Brain natriuretic peptide)
610) 칼시토닌
611) 칼슘 이오노포어 I
612) 칼슘 이오노포어 II
613) 칼슘 이오노포어 III
614) 칼슘 이오노포어 IV
615) 브라디키닌(Bradykinin)
616) 알부민
617) 플라스모네이트(Plasmonate)
618) LIF
619) PARP 억제제
620) 리소포스파티드산(Lysophosphatidic acid)
621) (R)-메탄안다미드(METHANANDAMIDE)
622) 1,25-디히드록시비타민 D3
623) 1,2-디데카노일-글리세롤 (10:0)
624) 1,2-디옥타노일-SN-글리세롤
625) 1,2-디올레오일-글리세롤 (18:1)
626) 10-히드록시캄프토테신
627) 11,12-에폭시에이코사트리엔산
628) 12(R)-HETE
629) 12(S)-HETE
630) 12(S)-HPETE
631) 12-메톡시도데카노산
632) 13(S)-HODE
633) 13(S)-HPODE
634) 13,14-디히드로-PGE1
635) 13-케토옥타데카디엔산
636) 14,15-에폭시에이코사트리엔산
637) 1400W
638) 15(S)-HETE
639) 15(S)-HPETE
640) 15-케토에이코사테트라엔산
641) 17-알릴아미노-겔다나마이신(geldanamycin)
642) 17-옥타데시노산
643) 17-페닐-트리노르(TRINOR)-PGE2
644) 1-아실-PAF
645) 1-헥사데실-2-아라키도노일-522) 646) 글리세롤
647) 1-헥사데실-2-메틸글리세로-3 PC
648) 1-헥사데실-2-O-아세틸-글리세롤
649) 1-헥사데실-2-O-메틸-글리세롤
650) 1-옥타데실-2-메틸글리세로-3 PC
651) l-올레오일-2-아세틸-글리세롤
652) 1-스테아로일-2-리놀레오일-글리세롤
653) 1-스테아로일-2-아라키도노일-글리세롤
654) 2,5-디테르트부틸히드로퀴논(ditertbutylhydroquinone)
655) 24(S)-히드록시콜레스테롤
656) 24,25-디히드록시비타민 D3
657) 25-히드록시비타민 D3
658) 2-아라키도노일글리세롤
659) 2-플루오로팔미트산
660) 2-히드록시미리스트산
661) 2-메톡시안티마이신(methoxyantimycin) A3
662) 3,4-디클로로이소쿠마린
663) 그랜자임(granzyme) B 억제제
664) 4-아미노피리딘
665) 4-히드록시페닐레티나미드
666) 4-옥사테트라데카노산
667) 5(S)-HETE
668) 5(S)-HPETE
669) 5,6-에폭시에이코사트리엔산
670) 5,8,11,14-에이코사테트라이노산(EICOSATETRAYNOIC ACID)
671) 5,8,11-에이코사트리이노산
672) 5-히드록시데카노에이트
673) 5-요오도투베르시딘(iodotubercidin)
674) 5-케토에이코사테트라엔산
675) 5'-N-에틸카르복사미도아데노신 (NECA)
676) 6,7-ADTN HBr
677) 6-포르밀린돌로 [3,2-B] 카르바졸
678) 7,7-디메틸에이코사디엔산
679) 8,9-에폭시에이코사트리엔산
680) 8-메톡시메틸-IBMX
681) 9(S)-HODE
682) 9(S)-HPODE
683) 9,10-옥타데세노아미드
684) A-3
685) AA-861
686) 아세틸 (N)-s-파르네실(farnesyl)-1-시스테인
687) 아세틸-파르네실-시스테인
688) Ac-Leu-Leu-Nle-CHO
689) 아코니틴(ACONITINE)
690) 액티노마이신 D
691) 아드렌산(ADRENIC ACID) (22:4, n-6)
692) lmM
693) AG-1296
694) AG1478
695) AG213 (티르포스틴 47(Tyrphostin 47))
696) AG-370
697) AG-490
698) AG-879
699) AGC
700) AGGC
701) Ala-Ala-Phe-CMK
702) 알라메티신
703) 알레스타틴(Alrestatin)
704) AM 92016
704) AM-251
706) AM-580
707) 아만티딘(AMANTIDINE)
708) 아밀로리드(AMILORIDE)
709) 아미노-1,8-나프탈리미드 [4-아미노-1,8-522) 나프탈리미드]
710) 아미노벤즈아미드 (3-ABA) [3-522) 아미노벤즈아미드 (3-ABA)]
711) 아미오다론(AMIODARONE)
712) 아난다미드(ANANDAMIDE) (18:2,n-6)
713) 아난다미드 (20:3,n-6)
714) 아난다미드 (20:4, n-6)
715) 아난다미드 (22:4,n-6)
716) 이니소마이신(anisomycin)
717) 아피디콜린(aphidicolin)
718) 아라키돈아미드
719) 아라키돈산 (20:4, n-6)
720) 아라키도노일-PAF
721) 아리스톨로크산(aristolochic acid)
722) 아르바닐(Arvanil)
723) 아스코마이신(ascomycin) (FK-520)
724) B581
725) BADGE
726) 바필로마이신 A1(bafilomycin A1)
727) BAPTA-AM
728) BAY 11-7082
729) BAY K-8644
730) 벤자밀(BENZAMIL)
73I) 베프리딜(BEPRIDIL)
732) 베스타틴(Bestatin)
733) 베타-라파콘(beta-lapachone)
734) 베툴린산(Betulinic acid)
735) 베자피브레이트(bezafibrate)
736) 블레비스타틴(Blebbistatin)
737) BML-190
738) Boc-GVV-CHO
739) 봉크레크산(bongkrekic acid)
740) 브레펠딘 A(brefeldin A)
741) 브로모-7-니트로인다졸 [3-브로모-7-니트로인다졸]
742) 브로모-cAMP [8-브로모-cAMP]
743) 브로모-cGMP [8-브로모-cGMP]
744) 부메타니드(bumetanide)
745) BW-B 7OC
746) C16 세라미드(CERAMIDE)
747) C2 세라미드
748) C2 디히드로세라미드
749) C8 세라미드
750) C8 세라민
750) C8 디히드로세라미드
751) CA-074-Me
753) 칼펩틴(calpeptin)
754) 칼포스틴 C(calphostin C)
755) 칼리큘린 A(calyculin A)
756) 캄프토테신
757) 칸타리딘(cantharidin)
758) CAPE
759) 캅사신(E)(capsacin(E))
760) 캅사제핀(capsazepine)
761) 카르바시클린(CARBACYCLIN)
762) 카스타노스페르민(castanospermine)
763) CDC
764) 세룰레닌(Cerulenin)
765) CGP-37157
766) 켈레리트린(chelerythrine)
767) 시글리타존(CIGLITAZONE)
768) 시마테롤(CIMATEROL)
769) 신겔 2Me(CinnGEL 2Me)
770) 시라졸린(CIRAZOLINE)
77I) CITCO
772) 클로피브레이트(CLOFIBRATE)
773) 클로니딘(clonidine)
774) 클로프로스테놀 Na(CLOPROSTENOL Na)
775) 클로자핀(clozapine)
776) C-PAF
777) 쿠르쿠민(Curcumin)
778) 시클로 [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val]
779) 시클로헥시미드
780) 단백질 합성 억제제
781) 시클로헥시미드-N-에틸에타노에이트
782) 시클로파민(cyclopamine)
783) 시클로피아존산(CYCLOPIAZONIC ACID)
784) 시클로스포린 A
785) 시페르메트린(cypermethrin)
786) 사이토칼라신 B
787) 사이토칼라신 D
788) D12-프로스타글란딘 J2
789) D609
790) 담나캔탈(damnacanthal)
791) 단트롤렌(DANTROLENE)
792) 데코인닌(decoyinine)
793) 데실루비퀴논(Decylubiquinone)
794) 데옥시만노이리마이신(1)(deoxymannojirimycin(1))
795) 데옥시노리리마이신(1)(deoxynorjrimycin(1))
796) 데프레닐(Deprenyl)
797) 디아즈옥시드(DIAZOXIDE)
798) 디부티릴시클릭 AMP
799) 디부티릴시클릭 GMP
800) 디클로로벤즈아밀
801) 디호모-감마-리놀렌산(DIHOMO-GAMMA-LINOLENIC ACID)
802) 디히드로스핑고신
803) 디인돌릴메탄
804) 딜티아젬(DILTIAZEM)
805) 디페닐렌요오도늄 Cl(diphenyleneiodonium Cl)
806) 디피리다몰(dipyridamole)
807) DL-디히드로스핑고신
808) DL-PDMP
809) DL-PPMP
810) 도코사헥사엔산 (22:6 n-3)
811) 도코사펜타엔산
812) 도코사트리엔산 (22:3 n-3)
813) 독소루비신
814) DRB
815) E-4031
816) E6 베르바민(E6 berbamine)
817) E-64-d
818) 엡셀렌(Ebselen)
819) EHNA HCl
820) 에이코사-5,8-디엔산 (20:2 n-12)
821) 에이코사디엔산 (20:2 n-6)
822) 에이코사펜타엔산 (20:5 n-3)
823) 에이코사트리엔산 (20:3 n-3)
824) 에난티오-PAF C16
825) 에피바티딘(epibatidine) (+/-)
826) 에토포시드
827) 파르네실티오아세트산(FARNESYLTHIOACETIC ACID)
828) FCCP
829) 피프로닐(FIPRONIL)
830) FK-506
831) 플레카이니드(FLECAINIDE)
832) 플루페남산(FLUFENAMIC ACID)
833) 플루나리진(FLUNARIZINE)
834) 플루프로스테놀(FLUPROSTENOL)
835) 플루스피릴린(FLUSPIRILINE)
836) FPL-64176
837) 푸모니신 B1(Fumonisin Bl)
838) 푸록산(Furoxan)
839) 감마-리놀렌산 (18:3 n-6)
840) 겔다나마이신(geldanamycin)
841) 제니스테인(genistein)
842) GF-109203X
843) 진제롤(GINGEROL)
844) 글리오톡신(Gliotoxin)
845) 글리피지드(GLIPIZIDE)
846) 글리부리드(GLYBURIDE)
847) GM6001
848) Go6976
849) 그래야노톡신 III(GRAYANOTOXIN III)
850) GW-5074
851) GW-9662
852) H7]
853) H-89
854) H9
855) HA-1004
856) HA 1077
857) HA14-1
858) HBDDE
859) 헬레날린(Helenalin)
860) 히노키티올(Hinokitiol)
861) 히스타민
862) HNMPA-(AM)3
863) 훽스트(Hoechst) 33342 (세포투과성) (비스벤즈이미드)
864) 후페르진(Huperzine) A [(-)-후페르진 A]
865) IAA-94
866) IB-MECA
867) IBMX
868) ICRF-193
869) 이카루가마이인(Ikarugamyin)
870) 인디루빈(Indirubin)
871) 인디루빈-3'-모녹심(monoxime)
872) 인도메타신
873) 쥬글론(juglone)
874) K252A
875) 카바인(Kavain) (+/-)
876) KN-62
877) KT-5720
878) L-744,832
879) 라트룬큘린 B(Latrunculin B)
880) 라벤더스틴 A(Lavendustin A)
881) L-시스-딜티아젬
882) 류코톡신 A (9,10-EODE)
883) 류코톡신 B (12,13-EODE)
884) 류코트리엔 B4
885) 류코트리엔 C4
886) 류코트리엔 D4
887) 류코트리엔 E4
888) 류펩틴(Leupeptin)
889) LFM-A13
890) 리도카인(LIDOCAINE)
891) 리놀레아미드(LINOLEAMIDE)
892) 리놀레산(LINOLEIC ACID)
893) 리놀렌산 (18:3 n-3)
894) 리폭신 A4(LIPOXIN A4)
895) L-NAME
896) L-NASPA
897) 로페라미드(LOPERAMIDE)
898) LY-171883
899) LY-294002
900) LY-83583
901) 라이코린(Lycorine)
902) LYSO-PAF C16
903) 마노알리드(Manoalide)
904) 마뉴마이신 A(manumycin A)
905) MAPP, D-에리트로
906) MAPP, L-에리트로
907) 마스토파란(mastoparan)
908) MBCQ
909) MCI-186
910) MDL-28170
911) 메드산(MEAD ACID) (20:3 n-9)
912) 메드 에타올아미드
913) 메토트렉세이트
914) 메톡시 베라파밀(METHOXY VERAPAMIL)
915) 메비놀린(Mevinolin) (로바스타틴(lovastatin))
916) MG-132
917) 밀리논(Milrinone)
918) 미녹시딜(MINOXIDIL)
919) 미녹시딜 설페이트
920) 미소프로스톨(MISOPROSTOL), 유리산
921) 미토마이신 C
922) ML7
923) ML9
924) MnTBAP
925) 모나스트롤(Monastrol)
926) 모넨신(monensin)
927) MY-5445
928) 미코페놀산
929) N,N-디메틸스핑고신
930) N9-이소프로필올로무신(Isopropylolomoucine)
931) N-아세틸-류코트리엔 E4
932) NapSul-Ile-Trp-CHO
933) N-아라키도노일글리신
934) 니카르디핀(NICARDIPINE)
935) 니페디핀(NIFEDIPINE)
936) 니플룸산(NIFLUMIC ACID)
937) 니게리신(Nigericin)
938) 니글루디핀(NIGULDIPINE)
939) 니메술리드(Nimesulide)
940) 니모디핀(NIMODIPINE)
941) 니트렌디핀(NITRENDIPINE)
942) N-리놀레오일글리신
943) 노코다졸(nocodazole)
944) N-페닐안트라닐(PHENYLANTHRANILIC) (CL)
945) NPPB
946) NS-1619
947) NS-398
948) NSC-95397
949) OBAA
950) 오카다산(okadaic acid)
951) 올리고마이신 A
952) 올로무신(olomoucine)
953) 오우아바인(ouabain)
954) PAF C16
955) PAF C18
956) PAF C18:1
957) 팔미틸에탄올아미드
958) 파르테놀리드(Parthenolide)
959) 팍실린(PAXILLINE)
960) PCA 4248
961) PCO-400
962) PD 98059
963) 페니트렘 A(PENITREM A)
964) 펩스타틴(pepstatin)
965) 페나밀(PHENAMIL)
966) 페난트리디논(Phenanthridinone) [6(5H)-페난트리디논]
967) 페녹시벤즈아민
968) 펜톨아민(PHENTOLAMINE)
969) 페니토인(PHENYTOIN)
970) 포스파티드산, 디팔미토일
971) 피세아탄올(Piceatannol)
972) 피피트린(pifithrin)
973) 피모지드(PIMOZIDE)
974) 피나시딜(PINACIDIL)
975) 피록시캄(piroxicam)
976) PP1
977) PP2
978) 프라조신(prazocin)
979) 프레그네놀론 16알파 카르보니트릴(Pregnenolone 16alpha carbonitrile)
980) 프리마-1(PRIMA-1)
981) 프로카인아미드(PROCAINAMIDE)
982) 프로파페논(PROPAFENONE)
983) 프로피듐 요오다이드(propidium iodide)
984) 프로프라놀롤(propranolol) (S-)
985) 퓨로마이신(puromycin)
986) 퀘르세틴(quercetin)
987) 퀴니딘(QUINIDINE)
988) 퀴닌(QUININE)
989) QX-314
990) 라파마이신
991) 레스베라트롤(resveratrol)
992) 레티노산, 올 트랜스
993) REV-5901
994) RG-14620
995) RHC-80267
996) RK-682
997) Ro 20-1724
998) Ro 31-8220
999) 롤리프람(Rolipram)
1000) 로스코비틴(roscovitine)
1001) 로틀레린(Rottlerin)
1002) RWJ-60475-(AM)3
1003) 리야노딘(RYANODINE)
1004) SB 202190
1005) SB 203580
1006) SB-415286
1007) SB-431542
1008) SDZ-201106
1009) S-파르네실-L-시스테인 ME
1010) 쉬코닌(Shikonin)
1011) 시구아조단(siguazodan)
1012) SKF-96365
1013) SP-600125
1014) 스핑고신
1015) 스플리토마이신(Splitomycin)
1016) SQ22536
1017) SQ-29548
1018) 스타우로스포린(staurosporine)
1019) SU-4312
1020) 수라민(Suramin)
1021 스와인소닌(swainsonine)
1022) 타목시펜
1023) 탄쉬논 IIA(Tanshinone IIA)
1024) 택솔 = 파클리탁셀
1025) 테트라히드로칸나비놀-7-로 산(TETRAHYDROCANNABINOL-7-OIC ACID)
1026) 테트란드린(TETRANDRINE)
1027) 탈리도미드
1028) 탑시가르진(THAPSIGARGIN)
1029) 티오시트룰린(Thiocitrulline) [L-티오시트룰린 HCl]
1030) 티오르판(Thiorphan)
1031) TMB-8
1032) 톨라자미드(TOLAZAMIDE)
1033) 톨부타미드(TOLBUTAMIDE)
1034) 토실-Phe-CMK (TPCK)
1035) TPEN
1036) 트레퀸신(Trequinsin)
1037) 트리코스타틴-A(trichostatin-A)
1038) 트리플루오페라진(trifluoperazine)
1039) TRIM
1040) 트립톨리드(Triptolide)
1041) TTNPB
1042) 튜니카마이신(Tunicamycin)
1043) 티르포스틴 1(tyrphostin 1)
1044) 티르포스틴 9
1045) 티르포스틴 AG-126
1046) 티르포스틴 AG-370
1047) 티르포스틴 AG-825
1048) 티르포스틴-8
1049) U-0126
1050) U-37883A
1051) U-46619
1052) U-50488
1053) U73122
1054) U-74389G
1055) U-75302
1056) 발리노마이신(valinomycin)
1057) 발프로산
1058) 베라파밀(VERAPAMIL)
1059) 베라트리딘(VERATRIDINE)
1060) 빈블라스틴
1061) 빈포세틴(vinpocetine)
1062) W7
1063) WIN 55,212-2
1064) 위스코스타틴(Wiskostatin)
1065) 워르트만닌(Wortmannin)
1066) WY-14643
1067) 제스토스폰진 C(Xestospongin C)
1068) Y-27632
1069) YC-1
1070) 요힘빈
1071) 자프리내스트(Zaprinast)
1072) 자르다베린(Zardaverine)
1073) ZL3VS
1074) ZM226600
1075) ZM336372
1076) Z-프롤릴-프롤리날(Z-prolyl-prolinal)
1077) zVAD-FMK
1078) 아스코르베이트
1079) 5-아자시티딘
1080) 5-아자데옥시시티딘
1081) 헥사메틸렌 비스아세트아미드 (HMBA)
1082) 소듐 부티레이트
1083) 디메틸 설폭시드
1084) 구세코이드(Goosecoid)
1085) 글리코겐 합성효소 키나제-3
1086) 갈렉틴-1(Galectin-1)
1087) 갈렉틴-3
세포 부착 분자
1086) 카드헤린 1(Cadherin 1) (E-카드헤린)
1087) 카드헤린 2 (N-카드헤린)
1088) 카드헤린 3 (P-카드헤린)
1089) 카드헤린 4 (R-카드헤린)
1090) 카드헤린 5 (VE-카드헤린)
1091) 카드헤린 6 (K-카드헤린)
1092) 카드헤린 7
1093) 카드헤린 8
1094) 카드헤린 9
1095) 카드헤린 10
1096) 카드헤린 11 (OB-카드헤린)
1097) 카드헤린 12 (BR-카드헤린)
1098) 카드헤린 13 (H-카드헤린)
1099) 카드헤린 14 (카드헤린 18과 동일함)
1100) 카드헤린 15 (M-카드헤린)
1101) 카드헤린 16 (KSP-카드헤린)
1102) LI 카드헤린
상기 목록은 특정 발달 계통을 따라 ES 세포 또는 ED 세포의 분화를 촉진하는 데에 사용될 수 있는 인자 및 조건을 예시한다. 부분 분화되거나 최종 분화된 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 세포 유형은 발생 생물학과 줄기세포 생물학를 연구하거나 요법을 만들어내기 위해 스크리닝 검정에서 사용될 수 있다. 부분 분화되거나 최종 분화된 세포 유형은 임의로 실질적으로 정제되고, 약제 제제로 제형화되고/되거나 동결보존될 수 있다.
ES 세포의 다능성
본 발명의 방법들 중 어느 하나에 의해 생성된 인간 ES 세포 또는 세포주의 다능성은 인간 ES 세포 마커 단백질의 발현을 검출함으로써 측정될 수 있다. 이러한 단백질의 예는 비제한적으로 옥타머(octamer) 결합성 단백질 4 (Oct-4), 단계 특이적(stage-specific) 배아 항원(SSEA)-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 및 알칼리 포스파타제를 포함한다. 일부 구체예에서, 추정 ES 세포주는 13회, 20회, 30회, 40회, 50회, 60회, 70회, 80회, 90회 또는 100회 초과의 계대후 다능성을 유지한다. ES 세포는 정상적인 핵형을 유지하는 지에 관해 또한 검정될 수 있다. 다능성은 본 발명의 방법에 의해 생성된 ES 세포를 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 외배엽, 내배엽 및 중배엽 계통의 세포로 분화시킴으로써 또한 확인될 수 있다. 다능성은 ES 세포를 생체내에서, 예를 들어 면역결핍 마우스 (예를 들어, SCID 마우스)내로 이식하고, 기형종 형성을 평가함으로써 또한 시험될 수 있다.
특정 구체예에서, 할구로부터 생성된 ES 세포 또는 세포주는 1개 이상의 ES 세포 마커 단백질을 발현한다. 또한, 특정 구체예에서, 세포는 정상적인 핵형을 유지한다. 또한, 특정 구체예에서, 세포는 13회, 20회, 30회, 40회, 50회, 60회, 70회, 80회, 90회 또는 100회 초과의 계대후 다능성을 유지한다.
전술한 사항 중 어느 하나의 경우, 할구로부터 생성된 ES 세포 또는 세포주는 상기 세포 또는 세포주를 생성시키기 위해 사용되는 할구가 수득되는 배아를 파괴시키지 않으며 생성될 수 있다. 세포의 이러한 특징은 이러한 세포를, 반드시 근원이 되는 배아를 파괴시키는 방법을 사용하여 생성되는 현재 이용가능한 ES 세포 및 세포주와 구별시켜준다.
TS 세포의 생성
또한, 본 발명은 ES 세포주를 생성시키기 전에 그리고 ES 세포주를 생성시키지 않으며 단리된 할구로부터 세포 유형을 직접 분화시키는 방법을 제공한다. 한 가지 예에서, 인간 영양막 줄기("TS") 세포는, 형태학적으로 영양막 및/또는 배아외 내배엽과 유사하지만 ES 세포와 유사하지 않은 할구 아웃그로쓰를 FGF-4와 접촉시킴으로써 생성된다. 예를 들어, FGF-4는 아웃그로쓰의 배양 배지에 첨가된다. TS 세포는 당 분야의 표준 절차를 이용하여 cdx-2, fgfr2, PL-1 및 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)과 같은 단백질의 발현을 검정함으로써 검출될 수 있다. TS 세포 확인은 비제한적으로 Oct-4 및 α-페토 단백질과 같은 단백질의 발현의 부재에 의해 입증될 수 있다.
정제된 제제 및 세포주의 생성
특정 구체예에서, 세포주가 생성될 수 있다. 예로서, 특정 세포 유형이 2개 이상의 할구의 클러스터 (할구 유래된 아웃그로쓰)를 포함하는 배양물에서 확인된 경우, 그러한 세포는 장래 사용을 위해 배양물의 나머지와 분리될 수 있다. 분리된 경우, 요망되는 세포는 정제되거나 실질적으로 정제된 개체군으로서 증식될 수 있거나 세포주로서 유지될 수 있다.
특정 구체예에서, 배아로부터 수득된 할구를 배양하는 것으로부터 생성된 ES 세포는 할구 유래된 아웃그로쓰의 배양물로부터 분리되고, 배반포기 배아로부터의 ES 세포주의 확립시에 개발된 표준 기술을 이용하여 ES 세포주가 확립된다. 다른 구체예에서, 관심있는 부분 분화된 ED 세포는 예를 들어 형태학을 기초로 하여 선택될 수 있고, 그러한 세포는 배양물로부터 분리되어 정제되거나 그렇지 않으면 추가로 분석될 수 있다.
예시적인 세포주는 안정한 세포주를 포함한다. 이러한 방식으로 확립된 ES 세포주는 기존의 ES 세포주의 특성, 예를 들어 분화 잠재력, 단백질 발현, 핵형 등을 지닐 수 있다. 또한, 이러한 방식으로 확립된 ES 세포주는 하나 이상의 사항에서 기존의 ES 세포주와 상이할 수 있다.
ES 및 ED 세포의 치료적 용도
본 발명의 ES 또는 ED 세포는 ES 세포가 유용한 임의의 용도를 위해 적합하다. 본 발명은 장애를 지닌 피검체에 치료적 유효량의 본 발명의 ES 세포를 투여하는 것을 포함하여 세포 치료될 수 있는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 인간 배아의 착상전에 할구를 분리하기 위해 사용되는데, 할구가 분리된 후 이러한 할구는, 상기 인간 배아로부터 생겨난 아이가 예를 들어 장래에 질병 치료, 조직 복구, 이식, 세포 쇠약(cellular debilitation)의 치료 또는 세포 기능장애의 치료를 필요로 하는 경우 세포 치료를 이용하는 치료적 용도를 위해 인간 ES 세포를 유도해내거나 이를 저장하도록 상기 기재된 바와 같이 배양될 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배아 줄기세포주를 생성시키지 않으며 분화중인 세포 또는 분화된 세포를 생성시키도록, 할구, 치밀화전 상실배(precompaction morula), 치밀화중인 상실배 또는 분할된 배반포(sectioned blastocyst)가 시험관내 또는 생체내에서 직접 분화된다 (참조: 2005년 12월 1일에 공개된 미국 특허 출원 번호 20050265976 및 2001년 4월 26일에 공개된 국제 특허 공개 번호 WO0129206, 이들 문헌의 기재내용은 직접 분화 방법과 관련하여 본원에 참조로 포함됨). 본 발명의 세포는 의학적, 수의학적 및 생물학적 연구에서 유용하고, 세포 치료, 예를 들어 동종이계 세포 치료에 사용되는 세포를 제공함으로써 질병을 치료하는 데에 있어서 유용하다.
또 다른 구체예에서, ES 세포 또는 세포주는 할구로부터 유래되고, ES 세포 또는 세포주는 분화되어 하나 이상의 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 세포 유형을 생성시키도록 유도된다. 예시적인 세포 유형은 비제한적으로 RPE 세포, 조혈 줄기세포, 조혈 세포 유형 (예를 들어, RBC, 혈소판 등), 췌장 베타 세포, 피부 세포, 심근세포, 평활근세포, 내피세포, 간세포, 뉴런, 신경교, 골격근세포, 혈관세포 등을 포함한다. ES 세포가 그 자체로 질병 또는 장애의 치료에서 사용될 수 있지만, 본 발명은 치료적으로 사용될 수 있는 분화된 세포 유형을 생성시키는 것을 또한 고려한다.
본 발명의 방법은 할구로부터 줄기세포를 생성시키는 데에 사용될 수 있는데, 여기서 상기 줄기세포는 MHC 항원에 대해 반접합성 또는 동형접합성이다. 이러한 세포는 이식 및 세포 치료 동안 감소된 면역원성을 위해 유용하다. 이렇게 생성된 줄기세포는 MHC 유전자에서 감소된 복잡성을 지닌 뱅크로 어셈블링(assembling)될 수 있다. 본 발명의 할구는 MHC 항원에 대해 반접합성이거나 동형접합성인 배아로부터 유래될 수 있다. 이러한 배아는 MHC 항원에 대해 반접합성이거나 동형접합성인 것이 선택되거나, MHC 항원에 대해 반접합성이거나 동형접합성이 되도록 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 또한, 할구로부터 유래된 줄기세포는, 예를 들어 유전자 표적화에 의해, MHC 항원에 대해 반접합성 또는 동형접합성으로 될 수 있다 (참조: 2003년 3월 6일에 공개된 WO 03/018760 및 미국 가특허 출원 번호 60/729,173, 이들 문헌의 기재내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
상기 언급된 신규한 기술에 의해 생성된 ES 세포 및 인간 배아 유래된 세포는 세포 생물학, 약물 발견과 관련된 연구에서 그리고 세포 치료에서 사용되는데, 이의 예로는 혈액 장애, 혈관 장애, 심장 질환, 암, 및 창상 치유의 치료를 위한 조혈세포 및 혈관아세포, 당뇨병 치료에 유용한 췌장 베타 세포, 색소성망막염 및 황반변성과 같은 망막 질환의 치료에 유용한 신경 세포 및 망막 색소 상피 세포와 같은 망막 세포, 파킨슨병, 알츠하이머병, 만성 동통, 뇌졸중, 정신과적 장애 및 척수 손상의 치료에 유용한 뉴런, 심부전과 같은 심장 질환을 치료하는 데에 유용한 심근세포, 흉터없는 창상 복구를 위해 창상을 치료하고 화상을 치료하고 창상 복구를 촉진시키고 그리고 피부 노화를 치료하는 데에 유용한 피부 세포, 경변성 간 질환과 같은 간 질환을 치료하기 위한 간세포, 신부전과 같은 신장 질환의 치료를 위한 신장 세포, 관절염의 치료를 위한 연골, 폐 질환의 치료를 위한 폐세포, 및 골다공증과 같은 골 장애의 치료에 유용한 골 세포를 생성시키는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이러한 세포 치료 방법은 본 발명의 ES 세포를 증식 인자, 계통-결정(lineage-commitment) 인자, 또는 관심있는 유전자 또는 단백질과 함께 사용하는 것을 포함할 수 있다. 치료 방법은 조직이 생체내에서 재생되는 이식을 위해 직접적으로 줄기세포 또는 적절한 전구체 세포를 제공하거나, 시험관내에서 요망되는 조직을 다시 생성시킨 후 이러한 조직을 질병에 걸린 피검체에 제공하는 것을 포함할 수 있다.
약제 제제
본 발명은 ES 세포, ES 세포주, TS 세포, 및 다양한 부분 분화된 그리고 최종 분화된 세포 및 세포주를 생성시키는 방법을 제공한다. 이렇게 생성된 세포 및 세포주는 시험관내에서 그리고 생체내에서 연구될 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 세포의 연구는 기초 발생 생물학 및 줄기세포 생물학에 관한 정보를 제공한다. 특정한 다른 구체예에서, 이러한 세포 및/또는 이러한 세포의 증식, 분화 및 생존을 조작하는 데에 사용될 수 있는 인자의 연구는 다양한 질병 또는 질환 중 어느 하나를 치료하거나 개선시키는 줄기세포 기반 요법을 개발하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 이러한 방법에 의해 생성된 세포 및 세포주는 치료적으로 사용될 수 있는 작용제 및 조건을 확인하기 위해 스크리닝 검정에서 사용될 수 있다. 확인된 치료제는 세포 요법을 개발하기 위해 사용될 수 있거나 환자에게 전달되는 경우 그 자체로 유용할 수 있다.
특정 구체예에서, ES 세포, ES 세포주, TS 세포, TS 세포주, 또는 부분 분화되거나 최종 분화된 세포는 이러한 세포를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 배합시킴으로써 약제 제제로서 제형화될 수 있다. 특정 구체예에서, 약제 제제는 세포 치료제가 특정 용량의 세포를 전달하기 위해 투여될 수 있도록 담체의 단위 용적 당 특정한 세포 개수를 함유한다. 예를 들어, 약제 제제는 치료되는 질환 및 투여 경로에 대해 적절한 담체의 용적에서 예를 들어 1x105, 1x106, 2xlO6, 3xlO6, 4xlO6, 5xlO6, 1xIO7, 또는 1x1O7개 초과의 세포의 전달이 가능하도록 제형화될 수 있다.
연구를 수행하는 방법
상기 상세히 설명된 바와 같이, 배아 줄기세포 연구는 배아의 파괴에 대한 정치적 및 윤리적 반대에 의해 부분적으로 지장을 받아 왔다. 본 발명은 ES 세포 및 세포주를 포함하는 세포 및 세포주를 효율적으로 생성시키는 대안적 방법을 제공할 뿐만 아니라 ES 세포 유도 방법의 일부로서 새로운 배아가 파괴될 것을 필요로 하지 않는 방법을 제공한다. 잔존 배아는 동결보존되어, 추가의 장래 연구용으로 영구적으로 보존되거나 유지될 수 있다.
일부 경우, 새로운 배아를 반드시 파괴시키지 않으면서 ES 세포 및 세포주 (또는 ES 세포로부터 분화되거나 배아로부터 직접 분화되는, 부분 분화되거나 최종 분화된 세포 유형)를 유도할 수 있는 능력은 이러한 방법에 반영된 현저한 기술적 진보를 넘어서 실질적인 이점을 제공할 것이다. 이와 같이, 본 발명은 인간 배아를 파괴하지 않으며 배아 줄기세포 연구를 수행하는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 인간 배아를 파괴하지 않으며 그러한 인간 배아로부터 유래되는 인간 ES 세포 또는 ES 세포주를 수득하는 것을 수반한다. 상기 ES 세포 또는 세포주는 본 발명의 방법들 중 어느 하나를 사용하여 인간 배아로부터 수득되는 할구로부터 생성될 수 있다. ES 세포 또는 세포주가 유래된 경우, 본 발명의 방법은 그러한 인간 ES 세포 또는 ES 세포주를 사용하여 배아 줄기세포 연구를 수행하는 것을 수반한다. 본 발명의 방법은 새로운 배아를 파괴할 필요없이 ES 세포 연구를 수행하기 위한 수단을 제공한다.
특정 구체예에서, 배아 줄기세포 연구는 ES 세포 또는 세포주의 분화 잠재력을 조사하는 연구를 포함한다. 예를 들어, 상기 연구는 인간 ES 세포 또는 ES 세포주를 1개 이상의 인자와 접촉시키고, 이러한 ES 세포 또는 ES 세포주가 하나 이상의 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 세포 유형으로 분화되는 것을 촉진시키는 인자를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 배아 줄기세포 연구는 ES 세포 또는 이로부터 분화되는 세포의 가능한 치료적 용도를 연구하는 것을 포함한다.
특정 연구 용도와 무관하게, 이러한 방법은 세계 도처의 연구자들, 특히 배아 파괴를 규제하는 법률이 존재하는 국가에서 활동하는 연구자들과의 협력를 위한 기회를 확대시킬 수 있다.
달리 규정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 지닌다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
또한, 문맥상 달리 요망되지 않는 한, 단수 형태의 용어는 복수형을 포함할 수 있고, 복수 형태의 용어는 단수형을 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 발생 생물학, 세포 생물학과 관련하여 사용된 명칭 및 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다.
예시적인 방법 및 재료가 하기 기재되어 있지만, 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 공개 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함되어 있다.
본 명세서 및 청구의 범위 전반에 걸쳐, "포함한다" 또는 "포함하는" 또는 "포함하여"와 같은 이의 변화형은 명시된 정수 또는 정수들의 군을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군이 배제되지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
하기 실시예는 예시하고자 하는 것이며, 어떠한 방식으로든 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1. 전핵(PN) 단계 접합체에 대한 핵주입 및 핵제거 사이의 래깅 타임(lagging time)의 효과
핵주입을 64 PN 단계 배아상에서 수행하였다. GFP 양성 마우스 ES 세포 핵을 PN 단계 접합체내로 이식하였다. 그 후, 배아를 3시간, 6시간, 9시간 또는 12시간 배양한 후, 본래의 전핵(pronucleus)을 제거하였다. 그 다음, 클로닝된 배아를 배양하고, 이들의 발달을 관찰하였다. 대부분의 배아는 모든 시간점에서 2세포기에 도달하였지만, 핵이식후 3시간째에 핵제거된 배아만이 4세포기에 도달하였다 (표 2 참조).
표 2. PN 단계 마우스 접합체에 대한 핵주입 및 핵제거 사이의 래깅 타임의 효과
Figure 112009057861673-PCT00001
실시예 2. PN 단계 접합체와 2세포기 배아를 사용한 연속 클로닝.
클로닝된 배아의 추가 발달을 달성하기 위해, 연속 클로닝을 수행하였다. 실시예 1에 설명된 바와 같이 핵주입을 수행하였다. 그 후, 배아를 3시간 배양한 후, 본래의 전핵을 제거하였다. 그 다음, 클로닝된 배아를 2세포기까지 배양하였다.
해리된 개개의 클로닝된 배아 세포를 정상적인 수정된 2세포기 마우스 배아내로 이식하는 것을 최초 클로닝후 18시간째에 수행하였다. 핵이식 전에 수용자 배아의 핵을 제거하였다. 개개의 클로닝된 할구 세포를 핵제거된 2세포기 배아의 난황주위 공간(perivitellin space)내로 이식하였다. 150V DC의 단일 펄스를 15 마이크로세컨드(microsecond) 동안 가함으로써 이식된 할구와 핵제거된 배아의 전기융합을 수행하였다.
연속 클로닝된 배아를 KSOM 배지에서 배양하고, 추가의 발달에 대해 모니터링하였다. 6개의 배아 중 2개가 배반포로 발달하였다 (도 1A-1B). 대조군으로서, PN 단계 접합체에 마우스 ES 세포 핵 (GFP 양성)을 주입하고, 3시간 후 상기 접합체의 핵을 제거하고, 5% CO2 중에서 배양하였다. 이러한 배아 중 어느 것도 배반포로 발달하지 않았다.
표 3. 클로닝된 배아 발달에 대한 연속 클로닝의 효과.
Figure 112009057861673-PCT00002
실시예 3. 2세포기 마우스 배아를 사용한 체세포 클로닝.
모자이크 배아의 클로닝된 할구가 클로닝되지 않은 세포에 의해 추가 발달하도록 자극될 수 있는 것으로 가정되었다. 2세포기 마우스 배아의 2개의 할구 중 1개의 핵을 제거하고, 핵제거 직후 ES 세포 핵을 핵제거된 할구내로 주입하였다. 배아를 KSOM에서 임의의 추가 조작없이 배양하였다.
클로닝된 할구는 다음날 분열하였고, GFP 양성 세포를 보조하여 모자이크 배아를 형성하였다 (도 2A-2C). 이러한 배아가 8세포기로 발달한 경우, 3개 이상의 할구가 클로닝된 할구로부터 유래되었다 (도 2B). 이러한 클로닝된 배아 중 4개가 배반포로 발달하였다 (표 4 참조). GFP 양성 할구는 배반포의 일부내로 통합되었다.
표 4. 2세포기 클로닝된 배아중의 클로닝된 할구와 동일한 투명대의 내부에 있는 헬퍼 세포(helper cell)의 효과
Figure 112009057861673-PCT00003
실시예 4. 실시예 1 내지 3을 위한 재료 & 방법.
모든 실험을 CD-1 마우스 종를 사용하여 수행하였다. 사용된 핸들링 배지(handling media)는 CZB였다. 사용된 배양 배지는 KSOM였다. 모든 핵 공여 세포는 GFP 양성 마우스 ES 세포 (CD-1 X Svl29 Fl)였다. 핵 주입은 PIEZO 드릴(PIEZO drill)을 사용하여 수행하였다. 할구는 유리 피펫을 사용하여 해리시켰다. PN 단계 배아에서 극체와 인접 세포질을 분리하거나 2세포기 배아에서 가시적 핵을 분리하기 위해 미세피펫을 사용하여 미세수술적으로 핵제거를 수행하였다.
실시예 5. 클로닝된 배반포 발달.
발달률은 클로닝 방법에 의해 현저하게 영향을 받았다. 표 5 및 6에는 생체내 2세포기 배아를 사용한 단일 클로닝 대 연속 핵이식으로부터 유래된 F2GFP NT 배아의 착상전 발달이 기록되어 있다. 발달상 가장 현저한 차이점은 2세포에서 4세포로의 전이시에 발견되었는데, 단일 클로닝 대 연속 클로닝 각각에 대해 59% 대 97% 발달을 나타낸다. 동계교배종(inbred strain)에서 또한 감소가 관찰되었다. 더욱이, 거의 모든 F2GFP 난할된 연속 클론 배아가 최초 클로닝후 4일내에 확장(expanded) 또는 부화(hatched) 배반포기로 발달하였다. 이러한 발달률은 KSOM에서 배양된 생체내 수정된 B6D2 F1 배아 (95%)와 동일하였다. 동계교배종인 DBA2 및 C57BL/6로부터 유래된 클론은 F2 GFP와 비교하여 덜 효율적인 발달을 나타내었지만, 배반포 발달률은 단일 NT 군에 비해 현저히 증가하였다 (P<0.001).
표 5. F2GFP 연속 클로닝된 배아의 발달.
Figure 112009057861673-PCT00004
표 6. 연속 클로닝후 동계교배 마우스 클로닝된 배아의 발달
Figure 112009057861673-PCT00005
실시예 6. 살아있는 새끼(Live pup) 발달.
출산예정일까지 발달하는 능력을 평가하기 위해, F2 GFP 난구세포 핵을 사용한 연속 핵이식에 의해 구성된 전체 35개의 2세포기 배아를 4마리의 가임신 (pseudo pregnant) 암컷 (0.5 d.p.c)내로 이식하였다. 전체 6마리의 살아있는 새끼를 임신 19.5일째에 제왕절개에 의해 회수하였다. 모든 6마리의 새끼는 성공적으로 대리모에 의해 양육되었고, 정상적으로 성장하여 성숙하게 되었다 (도 3). 대조적으로, 동일한 F2 GFP 난구세포 핵을 사용한 단일 이식 기술로부터 클론이 생성된 경우 이식된 98개의 배아 중에서 단지 1마리의 새끼가 산출되었다 (표 7).
마우스의 동계교배종을 생성시키기 위해 동일한 기술이 적용될 수 있는 지의 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 DBA2 및 C57BL/6 동계교배 마우스를 사용하였다. 전체 2마리의 새끼 (1.6%)를 DBA2 연속 클론으로부터 임신 19.5일째에 제왕절개에 의해 회수하였지만, 사용된 클로닝 방법과 무관하게 C57BL/6 클론에서는 생존가능한 새끼가 발견되지 않았다. 2마리의 DBA2 새끼 중에서, 1마리는 회수후 수 분내에 호흡 결핍으로 치사하였다. 남아있는 새끼는 임의의 호흡 곤란 징후는 보이지 않았지만, 돌봄을 받지 못했고, 양육모(foster mother)에 전달된 지 수 시간후에 부분적으로 수유를 받았다 (표 7).
클로닝된 마우스가 F1GFP 및 DBA2 마우스의 난구세포로부터 유래되는 지의 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 이미 공지된 2개의 마우스 마이크로새털라이트 마커 D1MIT46의 존재를 입증하였고, Nd3 C9461T 다형을 미토콘드리아 DNA(19)에 대한 제한 단편 길이 다형(RFLP)에 의해 분석하였다 (도 4 & 5). 이러한 연구는 클로닝된 마우스가 난구세포가 준비되는 공여 마우스와 유전적으로 동일함을 입증해주었다. 클로닝된 마우스의 미토콘드리아 RFLP는 세포질 공여 B6D2F1 종의 미토콘드리아 RFLP와 매칭되었는데 (도 4 & 5), 이는 세포질 (수용자)의 기원에 대한 직접적인 증거를 제공한다. F2GFP 클론은 UV광하에서 녹색 형광을 방출하였는데, 이는 클론의 유전적 기원에 대한 추가의 증거를 제공한다 (도 3).
표 7. 클로닝된 배아 이식의 결과.
Figure 112009057861673-PCT00006
클로닝된 동물의 출생후 성장 및 행동 발달에서 총체적 비정상은 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, 핵 재이식을 사용하여 클로닝된 동물은 성체 클로닝된 마우스에서 기록된 바 있는 비만 표현형을 발현하지 않았다. 성체 클로닝된 마우스의 비만은 NT 및 배아 배양 동안의 유전자 발현 비정상 및 후성유전적(epigenetic) 변형에 기인하였고, 8주령 내지 10주령째에서 시작하는 거대 몸집 이외에 지방 조직의 증가를 반영한다. 핵 재이식을 사용하여 클로닝된 마우스의 평균 중량 (±SD)은 6개월째에서 34.9 ± 0.8 그램이었는데, 이는 정상적인 대조 동물 (33.6 ± 1.9)과 차이가 없었다 (P>0.1). 대조적으로, 통상적인 SCNT를 사용하여 클로닝된 동물은 3개월령 내지 6개월령째에서 54.8 ± 2.6 그램으로 칭량되었다 (표 8).
표 8. 통상적인 SCNT 대 핵 재이식을 사용하여 클로닝된 마우스의 중량
Figure 112009057861673-PCT00007
실시예 7. 클로닝된 배반포기 배아의 유전자 발현 프로파일.
다수의 연구는 재구성된 배아에서의 불완전한 후성유전적 리프로그래밍을 강력하게 나타내며, 이는 이식후 시험관내 배양 및 생체내 발달 둘 모두에서 상기 배아의 불량한 성능을 설명해줄 수 있다. 본 발명의 연속 클로닝이 부화 배반포기까지 클로닝된 배아 발달에서 극적인 증가를 초래하였기 때문에, 본 발명자들은 수 개의 유전자의 유전자 발현 패턴이 생체내 수정된 배아에서의 정상적인 유전자 발현 패턴과 유사할 수 있다고 가정하였다. 본 발명자들의 가설을 조사하기 위해, 본 발명자들은 4세포기, 8세포기 및 배반포기에서 2개의 각인 유전자(imprinted gene)인 H19 및 IGF2, 및 1개의 다능성 관련 유전자인 OCT-4의 발현을 분석하였다. 도 6 내지 8에 도시된 바와 같이, 단일 클로닝된 배아와 비교하여 연속 클로닝된 배아에서의 모든 3개의 유전자의 발현은 생체내 B6D2F1 대조 배아의 발현과 더욱 유사하였다. 특히, 연속 클로닝된 배반포에서의 H19 유전자 발현은 단일 클로닝된 대응하는 배반포와는 현저하게 상이하였고, B6D2F1 대조군의 H19 유전자 발현에 훨씬 더 가까웠다 (도 6). 연속 클로닝된 8세포기 배아는 단일 클로닝된 배아와 비교하여 IGF2 발현을 현저하게 상향 조절하였는데, 이는 B6D2 F1 대조군에서의 수준에 더 가까웠다 (도 7). 동일한 경향이 연구된 모든 발달 단계에서 OCT-4 발현의 경우 발견되었다 (도 8).
실시예 8. 배반포기 배아의 세포수 카운트(count).
배반포기 클론에서의 비정상적 유전자 발현 패턴은 정상적인 세포수의 절반 미만과 일치하며, 보다 많은 세포수는 개선된 클로닝 효율 및 OCT-4의 정확한 발현과 상호관련된다. 핵 재이식은 전체 세포수 뿐만 아니라 클로닝된 배반포의 내부 세포괴(ICM) 세포의 수를 현저하게 증가시켰다 (표 9). 통상적인 SCNT (n=14개 배아)는 정상적인 생체내 수정된 배아 (n=15, P<0.001)에 대한 67.4 ± 6.5개 세포 (28.7± 4.8개 ICM 세포)와 비교하여 배반포 당 32.3 ± 4.6개 세포 (8.3 ± 5.9 ICM 세포)를 산출하였다. 배반포는 핵 재이식 (n=15)을 통해 전체 49.8 ± 6.9개 세포 및 16.2 ± 7.1개 ICM 세포를 생성시켰는데, 이는 각각 약 1.5배 및 2배 개선을 나타낸다. 평균 ICM/영양외배엽(TE) 세포 비는 또한 0.33에서 0.48로 증가(45 %)하였다 (P<O.01) (표 9). 보다 높은 ICM/TE 비 및 세포수는 적어도 부분적으로 대리모내로 이식된 후 출생시까지 착상후 발달 및 생존에서의 현저한 증가를 설명할 수 있다.
표 9. 단일 또는 연속 핵 이식후 배반포의 내부 세포괴(ICM) 및 영양외배엽(TE) 세포의 차별적 염색에 의한 배반포 특성 분석
Figure 112009057861673-PCT00008
실시예 9. 클로닝된 배아로부터의 배아 줄기세포 유도 및 이의 특성화.
전체 35개의 단일 클로닝된 F2GFP 배반포 및 30개의 연속 클로닝된 배반포로부터 ES 세포를 단리하였다. 이들 중에서, 단일 클로닝된 배아로부터의 1개의 ES 세포주 (3%) 및 연속 클로닝된 배아로부터의 5개의 ES 세포주 (17%)가 확립되었다 (표 10). 확립된 모든 세포주는 알칼리 포스파타제, OCT-4 및 SSEA1에 대해 양성이었다 (표 9A). 또한, 이러한 모든 핵이식 ES 세포주는 시험관내에서 배상체를 형성하였고, 뒷다리내로 근내 주입된 경우 기형종을 형성하였다 (도 9B). 둘 모두의 샘플은 모든 3개의 배엽으로부터 유래되는 분화된 조직을 나타내었다. 또한, 이러한 ntES 세포가 8세포기 CD-1 배아내로 주입되어 대리용 암컷 (2.5 d.p.c)에 이식된 경우, 뚜렷한 반점이 있는 아구티 피막(agouti coat)을 지니며 UV 광이 조사된 경우 녹색 형광을 방출하는 수 마리의 키메라 마우스가 생성되었는데, 이는 F2GFP 유전자형을 나타낸다 (도 9C).
표 10. 클로닝된 배아로부터의 배아 줄기세포 유도 효율
Figure 112009057861673-PCT00009
실시예 10. 실시예 5 내지 9를 위한 재료 및 방법.
동물
암컷 DBA2, C57BL/6 및 F2 GFP 하이브리드 마우스를 핵 공여자로서 사용하였다. F2 GFP 마우스를 생성시키기 위해, 암컷 129/SV 마우스를 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 유전자를 함유하고 발현하는 129/ CD Fl 수컷 (129/Sv x CD-1)과 교배시켰다. 최초 클로닝 및 연속 클로닝을 위해, 핵제거된 BDFl (C57BL/6 x DBA/2) 난모세포 및 핵제거된 2세포기 BDFl 배아를 각각 수용자로서 사용하였다. 클로닝된 배아를 임신시키기 위해 CD-1 암컷을 대리모로서 사용하였다.
배지
난모세포 및 배아를 공기 중에 5% CO2를 지닌 고습도 인큐베이터에서 37℃에서 아미노산, 글루코스 및 1 mg/ml 소혈청알부민(BSA)을 함유하는 KSOM (Specialty Media, USA)에서 배양하였다. 난모세포 핵제거를 M2 배지 (Specialty Media, USA)에서 수행하였고, 최초 클로닝을 위해 세포 주입을 실온에서 Hepes 완충된 CZB 배지중에서 수행하였다. 재구성된 난모세포의 활성화를 극체 방출(extrusion)을 방지하기 위해 10 mM SrCl2 및 5 ug/ml의 사이토칼라신 B를 함유하는 Ca2+ 비함유 CZB에서 수행하였다. 미세조작을 용이하게 하기 위해 핵 재이식을 7.5 ug/ml의 사이토칼라신 B 및 0.4 ug/ml의 미세소관 중합효소 억제제인 노코다졸(Nocodazole)로 보충된 M2 배지 (Specialty Media, USA)중에서 37℃에서 수행하였다. 재구성된 배아는 0.27mM 만니톨, lOOμm MgSO4 및 50μm CaCl2로 구성되고, 0.3% 소혈청알부민으로 보충된 만니톨 기반 융합 배지중에서 펄싱하였다.
난구세포, 난모세포 및 2세포기 배아의 단리
8주령 내지 10주령된 성숙한 BDFl, DBA2, C57BL/6, 및 F2 GFP 암컷 마우스를 사용하여 과배란을 수행하였다. 마우스에 48시간 간격을 두고 말 융모성 고나도트로핀 (eCG) (5 IU)과 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG) (5 IU)을 주입하였다. hCG 주입후 13시간째에, 난구-난모세포 복합체를 난관으로부터 수집하고, 난구세포를 37℃에서 M2중에서 0.1 % (w/v) 소 고환 히알루로니다제 (150 USP 단위/ml)를 사용하여 5분간 처리함으로써 분산시켰다. 분산된 난구세포를 새로운 M2로 세척하고, 3% 폴리비닐피롤리돈 (PVP; Mr 360,000, ICN Biochemicals, USA)중에서 재현탁시키고, 사용할 때까지 냉장장치 (4℃)에 보관하였다. 난관을 27G 블런트 니들(blunt needle)에 부착된 1 ml 시린지(syringe)로 세척함으로써 M2 배지중에서의 플러그형성된(plugged) 암컷으로부터 hCG 주입후 36시간째에 2세포기 배아를 수집하였다.
클로닝 및 연속 클로닝
핵이식을 청(Chung) 등의 문헌 (29)에 보고된 방법에 따라 수행하였다. 핵제거는 나르시지(Narshige) 주입기 (Narshige, Japan)가 구비된 니콘 도립현미경 (TE300, Japan)을 사용하여 수행하였다. B2DF1 난모세포의 제2중기 방추체를, 피에조 마이크로매니퓰레이터 컨트롤러 PMM 150 (PrimeTech, Japan)를 사용하는 흡인에 의해 10-12 um 피펫을 사용하여 5ug/ml의 사이토칼라신 B를 함유하는 M2 배지의 드롭중에서 분리하였다. 핵제거된 난모세포를 CZB 배지중에서 철저히 세척하고, 사용할 때까지 인큐베이터에 보관하였다. 세포질을 소구경(small bore) 주입 피펫 (내경 7um)을 사용하여 3% PVP중에서 분리한 후, 난구세포의 핵을 개별적으로 주입하였다. 제거된 핵 주위에 단지 소량의 세포질이 남아있게 되도록 세포질의 분리를 수행하였다. 재구성된 난모세포의 활성화를, 고도로 습윤된 5.5% CO2 인큐베이터에서 1OmM SrCl2와 5㎍/ml의 사이토칼라신 B를 함유하는 Ca2+ 비함유 CZB중에서 6시간 동안 수행하였다. 활성화 후, 재구성된 난모세포를 KSOM 배지중에서 배양하였다.
연속 클로닝을 위한 절차는 도 4에 도시되어 있다. 두 번째 클로닝을 위해, 2세포기 클로닝된 배아의 1개의 핵을 최소량의 세포질과 함께 분리하여, 7.5 ug/ml의 사이토칼라신 B와 0.4 ㎍/ml의 노코다졸로 보충된 M2 배지중에서 핵제거된 2세포기 생체내 수정된 B6D2F1 배아로 이식하였다. 핵을 2세포기 사이토플라스트 사이에 두었다. 2세포기 사이토플라스트와 클로닝된 핵의 융합은, 상기 기재된 만니톨 기반 융합 배지중에서 15 usec간 2.4 kV/cm의 DC 펄스를 2회 가하는 BTX 2001 전기융합기를 사용하여 수행하였다. 첫 번째 펄스는, 이식된 핵이 네거티브 와이어(negative wire)를 향하고 2개의 할구 둘 모두가 포지티브 와이어(positive wire)를 향하도록 재구성된 난자가 정렬된 후에 가하였다. 첫 번째 펄스 후, 2개의 할구가 반대쪽 극(pole)을 향하도록 재구성된 난자를 5 볼트 AC의 정렬 펄스에 의해 90도 회전시키고, 두 번째 펄스를 가하였다. 펄싱된 재구성된 배아를 철저한 세척후 KSOM중에서 배양하고, 이들의 융합을 두 번째 펄스를 가한 지 30분후에 조사하였다. 본 발명자들은 전형적으로 첫 번째 펄스후 98%가 넘는 융합을 관찰하였다. 융합된 배아만을 추가 3일 동안 배양하였다.
클로닝된 자손의 생성
일부 클로닝된 배아가 2세포기로 발달한 경우, 이러한 배아를 가임신 CD-1 양육모 (0.5 교미후일수)의 난관에 이식하였는데, 이러한 양육모는 1일 전에 정관절제된 CD-1 수컷과 교미한 것이었다. 수용자 암컷을 19.5 교미후일수(d.p.c.)째에 안락사시키고, 태아 및 착상 부위의 존재에 대해 이들의 자궁을 조사하였다. 살아있는 새끼는 동일자에 새끼를 전달받은 양육모 (CD-1)에 의해 양육되었다.
배반포에서의 세포수 카운팅(counting)
이미 공지된 바와 같이 폴리누클레오티드 특이적 형광색소에 의한 차별적 염색 후 배반포의 전체 세포수, 및 TE 및 ICM 세포수를 카운팅하였다. 요약하면, 최초 클로닝후 4.5일째에 확장 배반포로 발달한 배아를 산성 타이로즈 용액(Tyrode's solution) (pH 2.1)에 노출시켜 투명대를 분리하였다. 투명대분리된 배반포를 M2 배지중에서 세척한 후, 4℃에서 10분간 M2중에서 트리니트로벤젠 설폰산 (TNBS; Sigma P-2297)으로 표지시켰다. 과량의 TNBS를 분리해낸 후, 배반포를 37℃에서 10분간 M2중에서 항-디니트로페놀에 노출시켰다. 그 후, 과량의 항체를 철저한 세척에 의해 분리해낸 후, M2 중에서 2ug/ml 프로피듐 요오다이드(PI)로 1:4로 희석된 기니피그 보체에 37℃에서 10분간 노출시켰다. 그 후, 배반포를 5 ug/ml 프로피듐 요오다이드로 보충된 단백질 비함유 Hepes CZB 배지중에서 신속히 세척한 후, 빙냉 무수 에탄올중에서 5분간 고정시켰다. 그 후, 배반포를 4℃에서 10분 이상 동안 에탄올중의 lOug/ml 훽스트 33258로 이동시켰다. 염색된 배반포를 100% 글리세롤중에서 마운팅하고, 형광현미경 (Nikon TE200, Japan)에 의해 평가하였다. 청색 핵을 내부 세포괴(ICM)로서 카운팅하였고, 적색 핵은 영양막(TE) 세포로서 간주되었다.
ntES 세포주의 확립
F2 GFP 클로닝된 배아가 배반포기로 발달한 경우, 이미 공지되어 있지만 경미하게 변형된 방법에 의해 이러한 배아를 사용하여 ntES 세포주를 확립하였다. 요약하면, 투명대를 분리해낸 후, 산성 타이로즈 용액에 짧게 노출시키고 격렬히 세척함으로써 플레이팅하였다. 3개 또는 4개의 투명대분리된 배반포의 군을, 2000 단위/ml의 백혈병 억제 인자 (Chemicon. USA)와 50 μM MEK-1 억제제 (Cell Signaling Tech, USA)로 보충된 500 ul 마우스 ES 세포 배양 배지를 지닌 4-웰 디쉬 (Nunclon, USA) 중 1개의 웰에서 성장시킨 미토마이신-C 처리된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 단일층상에 두었다. 내부 세포괴가 최초의 아웃그로쓰를 형성 (일반적으로 3일이내에)한 경우, 0.05% 트립신/EDTA로 처리하고 소구경 피펫으로 피펫팅함으로써 이러한 세포의 클럼프(clump)를 작은 조각으로 절개하였다. 동일한 배아로부터 유래되는 절개된 세포 클럼프와 분산된 세포를 조직 배양 광유로 덮어진 마우스 ES 세포 배양 배지의 50 ul 드롭중에서 성장시킨 새로운 MEF로 옮겼다. ES 세포 아웃그로쓰의 존재에 대해 배양 드롭을 매일 관찰하였다. 그 후, 아웃그로쓰를 새로운 MEF를 함유하는 4-웰 디쉬의 웰로 이동시켰다.
DNA 단리
제조업자 (QIAgen, USA)에 의해 권고된 바와 같이 디엔이지 티슈 키트(DNeasy Tissue Kit)를 사용하여, 양육모종 CD-1, 난모세포 공여종 B6D2F1, 핵 공여종 (F2GFP 및 DBA2), 및 체세포핵이식 유래된 동물 (F2GFP의 경우 클론 1-6이고, DBA2의 경우 클론 1임)의 꼬리 끝(tail tip)으로부터 DNA를 단리하였다. 나노드롭(Nanodrop) 분광광도계 (NanoDrop, USA)를 사용하여 DNA를 정량하였다.
미토콘드리아 DNA RELP 분석
Nd3 C9461T 다형을 앞서 설명된 바와 같이 (19) 제한 단편 길이 다형(RFLP)에 의해 확인하였다. 요약하면, 9461 부위를 함유하는 204 bp 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머에 의해 초래된 변이는 C9461 야생형 변형과 함께 BcII에 대한 인식 부위를 생성시킨다. 결과로써, T9461 다형의 존재는 제한 부위를 붕괴시킨다. 단편을 4% 아가로스 겔중에서 전기영동에 의해 분석하였다.
핵 GFP DNA PCR 분석
F2 GFP 클론으로부터의 게놈 DNA를 상기 기재된 바와 같이 꼬리 끝으로부터 단리하고, 반응 당 100 ng을 PCR에 의한 GFP 유전자 증폭을 위해 사용하였다. 본 발명자들은 95℃에서 9분간 (1회 사이클) 및 94℃에서 45초간, 59℃에서 1분간, 72℃에서 1.5분간의 37회 사이클의 반응 파라미터와 함께 GFP 유전자에 대한 정방향 (5'-ttgaattcgccaccatggtgagc-3') 및 역방향 (5'-ttgaattcttacttgtacagctcgtcc-3') 프라이머를 사용하였다. PCR 생성물을 1.5% 아가로오스 겔상에서 분리하고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화시켰다.
DNA 타이핑(Typing)
맵페어스(MapPairs) 검정 B219 정방향 및 역방향 비표지된 프라이머 (Invitrogen, USA)를 사용함으로써 DlMit46 단순 서열 반복(SSR) 다형을 사용하여 꼬리 끝 DNA로부터의 핵 DNA의 유전자형을 결정하였다. 반응 파라미터는 20 ng의 주형, 1X 패일세이프 프리믹스 K(FailSafe Premix K) (EpiCentre, USA), 0.2μM의 각각의 프라이머, 0.5 단위의 패일세이프 PCR 엔자임 믹스(FailSafe PCR Enzyme mix) (EpiCentre, USA), 및 96℃에서 2분간 (1회 사이클), 94℃에서 45초간, 55℃에서 45초간, 72℃에서 1분간의 30회 사이클의 사이클링 조건을 포함하였다. PCR 생성물을 4% 아가로스 겔상에서 분리하고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화시켰다. PCR을 30회 사이클 동안 수행하고, 생성물을 3% 아가로스 겔에 의해 분리하고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화시켰다.
각인 유전자 발현 분석
트리졸(TRIzol) 추출 및 퓨어링크(PureLink) 정제 컬럼 (Invitrogen, USA)을 사용하여 전체 RNA를 20개 내지 30개의 4세포기, 8세포기 및 부화 배반포기 배아로부터 단리하였다. 공급업자 (Applied Biosystems. USA)에 의해 권고된 바와 같이 cDNA 아키브 키트(archive kit)를 사용하여 전체 RNA를 역전사시키고, 이를 H19, IGF2, OCT-4 및 내인성 하우스키핑 유전자인 GAPDH에 대한 미리설계된 유전자 발현 검정인 TaqMan 케미스트리(chemistry)를 이용하고 공급업자 (Applied Biosystems. USA)에 의해 권고된 바와 같이 ABI SDS 7900HT 기기를 사용하는 정량적 실시간 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 이미 공지된 비교 역치 주기 방법을 이용하고 제조업자 (Applied Biosystems.USA)에 의해 권고된 바와 같이 RQ 매니저(Manager)와 엑셀을 사용하여 유전자 발현의 상대적 정량을 수행하였다.
통계 분석
연속성을 위해 보정된 카이-스퀘어 테스트(Chi-square test)를 이용하여 결과를 평가하였다.
실시예 11. 배아 파괴없이 생성된 인간 배아 줄기세포주.
임상용으로 IVF에 의해 생성시킨 나머지 배아를 사용하여 일련의 9회의 실험을 수행하였다. 배아를 완전 고지된 동의와 함께 수득하고, 이를 어드밴스드 셀 테크놀로지스 에틱스 어드바이저리 보오드(Advanced Cell Technology's Ethics Advisory Board) (EAB) 및 인스티튜셔널 리뷰 보오드(Institutional Review Board) (IRB)의 규정에 맞게 사용하였다. 전핵 단계 배아를 해동시키고, 6% CO2에서 퀸즈 난할 배지중에서 8세포기로 배양하였다. 배아를 표준 시스템을 사용하여 등급을 매기고, 전체 41개의 등급 I 또는 II 배아를 2개의 실험군에서 사용하였다 (표 11). PGD에서와 같이, 문헌 [Klimanskaya et al. Nature 2006; 444(7118):481-485]에 이미 공지된 생검 절차를 이용하여 단지 1개 (또는 몇몇 [7/41] 경우, 2개)의 할구를 각각의 배아로부터 분리하였다. 첫 번째 실험 세트에서, 모체 배아와 할구 둘 모두를 본래의 마이크로드롭에서 12시간 동안 함께 배양한 후, 추가 48시간 동안 퀸즈 배반포 배지로 옮겼다. 26개의 생검된 배아 중 22개 (85%)가 배반포기로 계속 발달하였고, 단일 할구의 대부분 (21/31)이 분열하여 4개 내지 8개의 세포를 포함하는 세포 클럼프 또는 "배아 소포"를 형성하였다. 이러한 배아를 라미닌과 피브로넥틴으로 보충되고 유사분열 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)가 접종된 배반포 배지의 마이크로드롭으로 옮겼다. 다음날, 상기 마이크로드롭을 앞서 설명된 바와 같이 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 hES 세포를 함유하는 마이크로드롭과 합쳤다. 대부분의 단일 할구 유래된 세포 응집체는 공동이 있는 배아 소포를 형성하였는데, 플레이팅후 28시간내에 자발적으로 부착하지 않는 경우 이들을 26 G 니들로 찌름(poking)으로써 강제로 부착시켰다.
두 번째 실험 세트에서, 모체 배아와 할구를 생검 절차후 12시간 미만 동안 함께 공동배양하였다. 모체 배아를 퀸즈 배반포 배지로 이동시키고, 여기서 배반포기로 계속 발달하게 하였다. 생검된 할구를 세포 분열과 무관하게 상기 기재된 바와 같이 할구 마이크로드롭으로 옮기고, 다른 GFP ES 세포 함유 드롭과 합치지 않으며 약 5일간 배양하였다. 중요하게는, "배아 소포"는 이러한 조건하에서 형성되지 않았지만, 거의 모든 (9/11) 할구 유래된 세포 응집체는 아웃그로쓰를 생성시켰다 (표 11).
둘 모두의 실험 세트에서, 모체 배아를 배반포기로 발달하게 하고, 동결시켰다. 생검된 배아의 80 내지 85%가 건강한 배반포를 형성하였고 (표 11 및 도 11C), 이는 생검된 배아 및 생검되지 않은 배아 둘 모두에 대해 이미 보고된 발생률과 일치하거나 이 보다 높은 발생률이다 (Geber and Sampaio. Hum Reprod 1999; 14(3):782-786; Palmer et al. Hum Reprod 2002; 17(1):25-31).
33개 중 29개 (88%)의 할구 유래된 응집체는 세포 아웃그로쓰를 생성시켰고, 첫 번째 및 두 번째 실험 세트로부터의 아웃그로쓰의 4/20 (20%) 및 4/9 (44%)가 형태학적으로 hES 세포와 유사하였다 (표 11 및 도 11a). 첫 번째 실험 세트에서, 26개의 배아 중 단지 1개 (3.8%)가 안정한 hES 세포주를 생성시켰는데, 이는 이미 보고된 저효율과 일치한다 (Klimanskaya et al. Nature 2006; 444(71 18):481-485). 그러나, 두 번째 실험 세트에서, 생검된 할구가 hES 세포 성장에 유리한 조건하에 놓여진 경우, 15개의 배아 중 3개 (20%)가 안정한 hES 세포주를 생성시켰는데, 이는 배반포를 사용하여 수득한 유도율에 필적하는 유도율이다.
할구 유래된 (hES 세포 유사) 콜로니가 약 50개 세포 또는 그 초과의 세포에 도달한 경우, 이러한 콜로니를 기계적으로 분산시키고, 그 조각들을 최초 아웃그로쓰에 인접한 위치에 플레이팅하였다. 또한, 2차 콜로니를 유사한 크기로 성장시키고, 이들이 트립신을 사용한 정례적 계대에 적응할 때까지 3 내지 5일 마다 새로운 MEF상으로 기계적으로 계대시키고 이미 공지된 바와 같이 동결 (일반적으로 7회 내지 10회 계대 후)시킬 수 있다 (Klimanskaya and McMahon. Handbook of Stem Cells. San Diego: Elsevier Academic Press; 2004 p. 437-449). 각각의 계대에서, 콜로니를 GFP 양성 세포의 부재에 대해 형광현미경하에서 스크리닝하였다. 모든 4개의 hES 세포주는 Oct-4, nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 알칼리 포스파타제에 대해 양성이었다 (도 11b). 시험관내 분화는 모든 3가지 배엽, 조혈 및 내피 세포, 뉴런, 망막 색소 상피(RPE), 박동 심근세포 및 치료적으로 중요한 다른 세포 유형으로부터의 유도체의 존재를 확인해주었다 (도 12). 생체내 분화 잠재력을 평가하기 위해, 세포를 NOD-SCID 마우스의 신피막(kidney capsule) 아래에 주입하였고, 여기서 이러한 세포는 약 6 내지 8주내에 모든 3배엽의 구조로 분화되는 기형종을 형성하였다
모든 4개의 신규 확립된 hES 세포주는 정상적인 핵형 (배아 무파괴[NED]1, 46 XY; NED2, 46 XY; NED3, 46 XX; 및 NED4 46 XY)을 지녔다 (도 14). PCR 분석은 GFP DNA의 부재를 확인해주었는데, 이는 공동배양을 위해 사용되는 GFP+ hES 세포와의 교차오염(cross-contamination) 또는 융합의 가능성을 배제시켰다 (도 13a). 추가의 유전자형결정 분석은 신규한 hES 세포주의 독특한 정체(identity)를 보여주었는데, 이는 본 발명자들의 실험실에서 현재 보존되는 다른 hES 세포주와의 임의의 잠재적인 교차오염을 배제시킨다 (도 13b). 첫 번째 일련의 실험에서, 배아 중 21개는 1개의 할구가 생검된 반면, 5개 (실험 번호 1 & 3으로부터의 것)는 2개의 단일 할구가 분리되었다. 두 번째 일련의 실험에서, 배아 중 13개는 1개의 할구가 생검된 반면, 2개의 배아 (실험 8 & 9로부터의 것)는 2개의 단일 할구가 분리되었다.
표 11. 배아 파괴없이 단일 할구로부터의 hES 세포의 유도
Figure 112009057861673-PCT00010
실시예 12. 할구 생검 및 배양.
추가의 실험 세트에서, 2배 용량의 라미닌을 사용하고, 배아 소포 형성을 방지하기 위해 MEF 세포를 지닌 배반포 배지중에서 늘어난 기간 (5일) 동안 할구를 성장시켰다.
전핵 단계 인간 배아를 5% CO2를 지닌 인큐베이터에서 퀸즈 난할 배지 (Cooper Surgical)중에서 8세포기까지 배양하였다. 피에조를 사용하여 앞서 설명한 바와 같이 개개의 할구를 배아로부터 단리하였다. 요약하면, 개개의 할구 단리를 용이하게 하기 위해 8세포 배아를 0.05% PVA로 보충된 Ca++ 및 Mg++ 비함유 포스페이트 완충 식염수중에서 예비인큐베이션시켰다. 그 후, 배아를 조작을 위해 퀸즈 hepes 배지로 옮겼다. 생검 피펫을 삽입하기 전에, 피에조의 수 회의 펄스를 가함으로써 작은(20 μm) 피펫을 사용하여 투명대상에 구멍 (직경 500 μm)을 생성시켰다. 개개의 할구를 단리하기 위해, 구멍을 통해 생검 피펫 (500 μm)을 삽입시키고, 약한 부압을 가하여 할구를 붙잡았다. 할구의 2/3가 피펫의 내부에 존재하는 경우, 할구를 당겨서 빼내었다. 생검 후, 모체 배아와 할구를 본래의 배양 드롭 (퀸즈 난할 배지)으로 복귀시키고, 12시간 내지 18시간 동안 함께 배양하였다. 그 후, 할구와 모체 배아를 분리하였는데, 상기 모체 배아를 배반포 배지 (퀸즈 배반포 배지)로 옮겨서 배반포로 발달하게 하는 한편, 상기 할구를 MEF를 함유하는 소량의 배양 드롭 (50 ㎕)에 옮겼다. 배반포 배양 배지에 라미닌 (10 ㎕/ml), 피브로넥틴 (10 ㎕/ml) 또는 매트리겔 (10 ㎕/ml)을 보충하였다. 이를 5일간 배양하거나 동일한 배지에서 약 20개의 세포로 구성된 세포 클럼프를 형성할 때까지 배양하였다. 그 후, 인접 GFP ES 세포 배양 드롭을 할구 배양 드롭과 합쳐서 2개의 배지가 함께 혼합되게 하였다. 약 24시간 후, 할구 클럼프의 1/2을 분리하여 동일한 배양 드롭에 플레이팅하였다. ES 콜로니 형성을 매일 검사하고, 배양 배지의 1/2을 매일 새로운 배지로 교체하였다. 그 후, ES 콜로니를 분할시키고, 계대 4까지 새로운 ES 세포 배양 디쉬로 기계적으로 옮긴 후, ES 세포를 대규모 배양을 위해 트립신화에 점진적으로 적응시켰다.
할구가 배아 소포로 발달한 경우, 이의 거의 모두는 ES 세포로 될 잠재력을 지니지 않는 영양막 유사 세포가 되었다. 소포 형성을 방지하고 보다 많은 라미닌을 첨가하여 세포 극성을 간섭함으로써, 대부분의 8세포 할구를 ES 세포가 되도록 유도하였다 (표 12).
표 12. 단일 할구로부터의 ES 세포주의 유도
Figure 112009057861673-PCT00011
실시예 13. hESC 세포주 유도를 위해 hESC 공동배양은 필요치 않다.
추가의 실험군에서, 공동배양이 성공적인 유도를 위해 필요한 지의 여부를 결정하기 위해 GFP-hESC 공동배양을 조사하였다. 해동되어 할구 생검 전에 배반포 배지에서 2시간 동안 배양되는 2개의 동결된 난할기 배아를 사용하여 실험을 수행하였다. 단일 할구를 1개의 배아로부터 분리하고, 2개의 할구를 두 번째 배아로부터 분리하였다. 잔존하는 생검된 배아를 계속 발달하게 하였고, 배반포기에서 동결시켰다. 추출된 할구를 GFP-hESC가 존재하지 않는다는 것을 제외하고는 실시예 11의 두 번째 실험 세트에 대해 설명된 조건과 동일한 조건하에서 배양하였다. 둘 모두의 할구 유래된 응집체는 세포 아웃그로쓰를 생성시켰고, 2개의 배아 중 1개 (50%)는 안정한 hESC 세포주를 생성시켰다. 이러한 콜로니로부터 확립된 안정한 hESC 세포주 (NED5)의 면역염색은 Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA- 1-81, 및 알칼리 포스파타제를 포함하는 다능성 마커의 발현을 확인해주었다 (도 11C). 새로 확립된 hESC 세포주는 정상적인 수컷 (46 XY) 핵형을 지니며 (도 14), 모든 3배엽으로부터의 유도체로 분화되었는데, 이는 튜불린 β III (외배엽), 평활근 액틴 (중배엽), α 페토단백질 (원시 내배엽)에 대한 항체를 사용하여 면역염색하는 것을 포함한다.
실시예 14. 라미닌은 할구가 ICM으로 분화되도록 유도한다.
ICM으로의 향상된 할구 분화의 메커니즘을 조사하기 위해 별도의 연구를 수행하였다. 라미닌과 피브로넥틴의 부재하에서, 해리된 단일 할구는 한결같이 영양외배엽으로 분화되었다 (할구 아웃그로쓰의 0/16 [0%]가 ICM 유사 세포를 함유한 것과 비교하여 할구 아웃그로쓰의 16/16 [100%]가 영양외배엽 세포를 함유하였음). 대조적으로, 라미닌이 배지에 첨가된 경우, 할구 유래된 응집체의 단지 1/14 (7%)가 영양외배엽 유사 소포를 생성시켰고, 13/14 (93%)가 ICM 유사 세포를 산출하였다. 피브로넥틴 단독의 첨가는 계통 전문화(lineage specification)에 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않았다 (아웃그로쓰의 1/6 [17%]가 ICM 유사 세포를 함유하는 것과 비교하여 아웃그로쓰의 5/6 [83%]가 영양외배엽 세포를 함유하였음). 이는 할구가 ICM으로 분화하는 것을 유도하는 데에 있어서 라미닌이 핵심적인 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 라미닌의 부재하에서 형성된 할구 유래된 소포 (도 15A) 및 라미닌의 존재하에서 유래된 ICM 유사 세포 (도 15D)를 영양외배엽 및 ICM/ES의 마커에 대해 각각 면역염색하였다. 예측된 바와 같이, 라미닌없이 형성된 할구 유래된 소포는 사이토케라틴 8 및 cdx2를 포함하는 핵심적인 영양외배엽 마커를 발현하였고 (도 15B,C), 라미닌의 존재하에서 형성된 ICM 유사 아웃그로쓰는 Oct-4를 발현하였다 (도 15E). 흥미롭게도, 밀착 연접 마커 ZO-1에 대한 면역염색 및 투과 전자현미경 및 준초박 절편에 의한 초미세구조 분석 (도 15G-I)은 확립된 hESC 세포주의 배양 배지에 라미닌을 첨가한 경우 밀착 연접을 붕괴시키고, ESC를 탈분극시켜서 ICM 유사 표현형을 나타내도록 유도한다는 것을 밝혀주었다. 또한, ZO-1에 의한 염색은 할구의 배양 배지에 라미닌을 첨가한 경우 밀착 연접을 붕괴시키고, 영양외배엽 분화 경로를 억제한다는 것을 확인해주었다.
실시예 15. 실시예 11 내지 14를 위한 재료 및 방법.
단일 할구 생검
임상용으로 IVF에 의해 생성시킨 나머지 배아를 완전 고지된 동의와 함께 수득하고, 이를 어드밴스드 셀 테크놀로지스 에틱스 어드바이저리 보오드 (EAB) 및 인스티튜셔널 리뷰 보오드 (IRB)의 규정에 맞게 사용하였다. 기증받은 전핵 단계 배아를 제조업자의 지시에 따라 배아 해동 키트 (Cooper Surgical, CAT# ART-8016)를 사용하여 해동시켰다. 모든 절차를 실온에서 수행하였다. 요약하면, 배아를 공기중에서 2분간 해동시킨 후, 37℃에서 3분간 해동시킨 후, 0.5M 수크로스 해동 배지에 언로딩(unloading)하고, 여기서 10분간 유지시켰다. 그 후, 배아를 0.3M 수크로스 해동 배지로 이동시키고, 10분간 인큐베이션시킨 후, 배아 해동 희석액중에서 수 회 세척한 후, 미리평형을 이루어 놓은 배아 배양 배지로 이전시켰다. 해동된 배아를 37℃에서 공기중에서 6% CO2를 지닌 고도로 습윤된 인큐베이터에서 20 ul 드롭의 퀸즈 난할 배지중에서 배양하였다. 해동후 48시간째까지 8세포기로 발달한 배아만이 단일 할구 생검을 받게 하였다. 생검 전에, 피에조 드릴을 사용하여 모든 배아에서 투명대에 작은 구멍 (50 uM 직경)을 생성시킨 후, 0.05% PVA (폴리비닐알코올)로 보충된 Ca++ 및 Mg++ 비함유 PBS 중에서 15분간 인큐베이션시켰다. 할구 생검을 앞서 설명한 바와 같이 피에조 드릴을 사용하여 5% SPS (혈청 단백질 대체물, Cooper Surgical)로 보충된 퀸즈 Hepes 배지중에서 37℃에서 수행하였다. 단지 단일 할구 (또는 소수의 경우 2개의 할구)를 각각의 배아로부터 분리하였다. 실험군 1에서, 모체 배아 및 생검된 할구를 12 내지 24시간 동안 공동배양한 후, 퀸즈 배반포 배지로 옮기고, 추가 48시간 동안 공동배양하였다. 공동배양 모체 배아가 동결된 경우, 할구 클럼프를 하기 설명되는 바와 같이 추가의 아웃그로쓰를 위해 MEF 드롭으로 이동시켰다. 실험군 2에서, 모체 배아와 할구를 12시간 미만 동안 공동배양하였다. 그 후, 이들을 분리하고, 배아를 추가 48시간 동안 퀸즈 배반포 배지에서 배양한 후, 동결시켰다. 실험 2에서 할구를 MEF 세포상에서 인간 태반으로부터의 라미닌 (Sigma)와 피브로넥틴 (인간 태반 유래된 것, Sigma)으로 보충된 퀸즈 배반포 배지중에서 5일간 배양하였다.
배반포 동결
포배강 형성을 확인한 후, 제조업자의 지시에 따라 배반포 동결 키트 (Cooper Surgical, Cat# ART-8015)를 사용하여 모체 배아를 동결시켰다. 모든 절차를 실온에서 수행하였다. 요약하면, 배아를 세정하고, 희석 배지중에서 5분간 배양한 다음, 10분간 5% 글리세롤 동결 배지로 옮긴 후, 최종 9% 글리세롤 + 0.2 M 수크로스 동결 용액으로 이동시켰다. 그 후, 각각의 배아를 0.25ml 배아 동결 스트로(straw) (IMV-ZA475, France)에 로딩시킨 후, 동결하였다. 배아 동결기 (Freeze Control CL- 869, Australia)를 사용하여 배아 동결을 수행하였다. 배아를 2℃/분으로 25℃의 출발 온도에서 -6.5℃가 되게 하였다. 그 후, 상기 배아를 수작업으로 접종하고, -6.5℃에서 10분간 유지시킨 후, 0.3℃/분으로 -45℃로 냉각시키고, 액체 질소 저장 탱크로 옮겼다.
ESC 유도
hESC 배양을 이미 공지된 바와 같이 수행하였다 (Klimanskaya et al., 2006; Klimanskaya et al., 2007; Klimanskaya and McMahon, 2004). 실험군 1에서, 배아 소포 플레이팅하기 2일 전에, MEF 세포를 젤라틴 처리된 60 mm 세포 배양 디쉬상에 50 ul 드롭의 열(row)에 플레이팅하였다. 2개 또는 3개의 드롭 ("보조 드롭")이 할구 아웃그로쓰를 위해 지정된 드롭인 1개의 "할구 드롭"을 둘러쌈에 따라 MEF 세포 드롭이 배열되었다. 둘째날, GFP+ hES 세포의 작은 클럼프를 "보조 드롭"내로 옮기고, 밤새 배양하고, 이러한 드롭 중의 MEF 플레이팅 배지를 hESC 배지로 교체하였다. 셋째날, "할구 드롭" 중의 배지를 5 ug/ml의 피브로넥틴과 2.5 ug/ml의 라미닌으로 보충된 새로 제조된 퀸즈 배반포 배양 배지로 교체하였다. 그 후, 배양 디쉬를 6% CO2 중에서 3시간 이상 동안 예비인큐베이션한 후, 배아 소포를 옮겼다. 소포를 옮긴 날의 다음날, 배지를 작은 유리 피펫을 사용하여 2개의 드롭 사이에 드래깅함으로써 각각의 소포 배양 드롭을 2개 또는 3개의 주위 GFP-hESC 드롭에 연결시켰다. 다음날, 피펫을 사용하여 연결 채널을 넓히고, 배반포 배지를 2일 후에 상기 기재된 바와 같이 유도 배지로 교체하였다. 최초 아웃그로쓰가 분산을 위해 충분히 큰 콜로니를 형성하는 경우 (일반적으로 플레이팅 후 3 내지 5일째), 이를 2개의 조각으로 절개하고, 동일한 드롭내로 다시 플레이팅하였다.
실험군 2에서, 모체 배아와 공동배양한 지 최초 12시간 후에, 5 ug/ml의 피브로넥틴과 5 ug/ml의 라미닌으로 보충되고 MEF 세포를 함유하는 퀸즈 배반포 배지 (실험군 1에서 제조된 것)의 50 ul 드롭중에서 할구를 배양하였다. 할구 배양 드롭 및 주위 GFP ESC 배양 드롭을 5일간 연결시키지 않았다. 이 기간 동안, 대부분의 할구는 내부 세포괴와 유사한 20개 내지 30개 세포를 포함하는 세포의 클럼프를 형성하였다. 플레이팅한 지 6일째에, 할구 배양 드롭 및 주위 GFP ESC 배양 드롭을 실험군 1에서와 같이 연결시키고, 배반포 배지를 7일째에 유도 배지로 교체하였다. 최초 아웃그로쓰를 매일 검사하고, 아웃그로쓰의 증식을 실험군 1에서와 같이 수행하였다. 배양 배지의 본래의 부피의 절반을 격일로 교체하였다. hESC의 안정한 성장을 관찰하자 마자, 혈청을 배양 배지로부터 분리하였다. 상세한 절차는 문헌 [Klimanskaya et al., 2007]에 기재되어 있다. 실험군 3은 hESC- GFP 공동배양이 없다는 것을 제외하고는 실험군 2와 동일한 절차를 따랐다.
면역염색
면역염색을 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 요약하면, 샘플을 2% 파라포름알데히드를 사용하여 10분간 (세포) 또는 40분간 (소포) 고정시키고, 0.1% NP-40을 사용하여 투과시키고, 10%의 염소 및 당나귀 혈청을 각각 함유하는 PBS를 사용하여 1시간 동안 블록킹(blocking)하고, 1차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 각각의 항체 인큐베이션 후, 각 10분간 3회 세척을 수행하였다. 형광 표지되거나 비오티닐화된 2차 항체 (Jackson Immunoresearch 또는 Molecular Probes)를 1시간 동안 첨가하고, 형광 표지된 스트렙타비딘 (Molecular Probes)을 15분간 첨가하여 비오티닐화된 2차 항체를 가시화시켰다. 샘플을 벡타쉴드(Vectashield)와 DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 마운팅하고, 도립 형광현미경 (Nikon)을 사용하여 촬영하였다. 기형종 절편의 퍼옥시다제 염색을 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 요약하면, 슬라이드를 크실렌으로 3회 탈랍(dewaxing)시켰다. 크실렌을 100% 에탄올로 제거하고, 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% H2O2로 블록킹하고, 슬라이드를 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 상기 블록커(blocker)에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 동일한 블록커에서 희석된 1차 항체중에서 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 하기 항원에 대한 1차 항체를 사용하였다: Oct-4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (Chemicon, Temecula, CA), Nanog (Kamiya), βIII튜불린 (Covance), α-페토 단백질, 평활근 액틴 (Dako), cdx2 (Abeam), ZO-1 (Zymed), 사이토케라틴 8 (Developmental Studies Hybridoma Bank).
기형종 형성
6주령 내지 8주령된 NOD-SCID 수컷 마우스를 사용하였다 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). 50개 내지 100개의 세포의 작은 클럼프를 신피막 아래에 주입하고, 이식후 7 내지 12주째에 마우스를 치사시키고, 신장을 4% 파라포름알데히드 중에 밤새 고정시키고, 파라핀에 포매시키고, 절단하고, 면역염색하거나 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색하고, 모든 3배엽의 유도체의 존재에 대해 분석하였다.
GFP 서열의 PCR 분석
WAO1-GFP (H1-GFP), NED1, NED2, NED3 및 NED4 세포로부터의 게놈 DNA를 마이크로디엔에이 키트(MicroDNA kit) (Qiagen)를 사용하여 단리하고, GFP 특이적 PCR 반응을 이미 공지된 바와 같이 수행하였다 (Klimanskaya et al., 2006). PCR 반응을 위한 내부 대조군으로서, 미오게닌(myogenin) 프라이머를 모든 PCR 반응에 포함시켰는데, 이는 이미 공지된 바와 같이 245 bp의 단편을 생성시킨다 (Klimanskaya et al., 2006). PCR 생성물을 3% 아가로스 겔상에서 분리하고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화시켰다.
NED hES 세포로부터의 아세포(blast cell)의 생성
조혈 및 내피 잠재력 둘 모두를 지닌 NED hESC로부터 아세포를 생성시키는 것을 이미 공지된 바와 같이 수행하였다 (Lu et al., 2007). 요약하면, 3.5일령된 배상체(EB)를 모르포겐(morphogen)과 초기 조혈 사이토카인의 배합물로 보충된 스템라인(StemLine) II 무혈청 배지중에서 배양된 hESC로부터 생성시킨 후, 초기 단계 EB를 해리시키고, 개개의 세포를 무혈청 반고형 아세포-콜로니(blast-colony) 성장 배지중에 7일간 플레이팅하였다. 포도같은 아세포 콜로니를 취하여 조혈 및 내피 세포 분화 둘 모두에 대해 플레이팅하였다.
내피 프로제니터 검정
내피 프로제니터 검정을 위해, 아세포를 EGM-2 완전 배지 (Lonza) 중에서 피브로넥틴 코팅된 플레이트 (BD Bioscience)상에 3 내지 5일간 플레이팅하였다. Ac-LDL 흡수를 위해, hES-BC 세포를 피브로넥틴 코팅된 웰상에서 3 내지 5일간 배양하고, 10㎍/ml의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594 표지된 Ac-LDL (Invitrogen)과 6 내지 8시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포를 1X PBS로 3회 세척하고, 4% 파라포름알데히드를 사용하여 30분간 고정시켰다. Ac-LDL의 흡수를 형광현미경하에서 가시화시켰다. vWF (Dako), PECAM-1 (CD31) (Cell Signalling Technologies), VE-카드헤린 (R&D Systems) 및 KDR (Cell Signalling Systems)의 발현을 위해, 세포를 투과시킨 후, 1차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, FITC (Jackson Laboratory)로 표지된 상응하는 2차 항체와 30 내지 60분간 인큐베이션시켰다. 최종 세척후, 세포를 형광현미경하에서 검사하였다.
핵형결정(Karyotyping)
세포를 1:6 비로 젤라틴상에 플레이팅하여다. 세포가 약 50% 컨플루언트 상태가 된 경우, 0.12 ug/ml의 콜세미드(colcemid) (Invitrogen)를 40분간 배양물에 첨가하였다. 세포를 트립신에 의해 수거하고, 37℃에서 12분간 0.075M KCl중에서 인큐베이션시키고, 3:1의 메탄올 대 아세트산을 사용하여 고정시켰다. 스프레드(spread) 분석은 셀 라인 제네틱스, 인크.(Cell Line Genetics, Inc.) (hESC 세포주 NED1 내지 NED4에 대해)에 의해, 그리고 G-밴딩 기술(G-banding technique)을 이용하는 칠드런즈 하스피털(Children's Hospital, Oakland)의 사이토제네틱스 래보러토리(Cytogenetics Laboratory)에 의해 수행되었다.
유전자형결정
새로 유도된 hESC 세포주의 확인은 AmpFISTR 아이덴티파일러 키트(Identifiler kit) (Applied Biosystems)를 사용하는 세그라이트, 인크.(SeqWright, Inc.)에 의해 수행되었다.
RNA 단리 및 PCR에 의한 유전자 발현 분석
전체 RNA를 약 100개의 hESC로부터 단리하고, 공급업자에게 의해 권고된 절차에 따라 알엔에이이지 마이크로 키트(RNAeasy Micro Kit) (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 80 ul의 DEPC-H2O 중에서 용리시켰다. RNA를, 수퍼스크립트(Superscript ) II 역전사효소 (Clontech)를 사용하는 SMART HA 및 SMART CDS 프라이머 IIA (Clontech)에 의한 제 1 가닥 cDNA 합성에 적용하고, cDNA 푸울(pool)을 공급업자에 의해 제시된 바와 같이 수퍼 스마트(Super SMART) cDNA 합성 키트 (Clontech)를 사용하여 구성하였다. 5 ul의 cDNA 푸울을 OCT-4 및 Nanog 발현의 분석을 위해 사용하였는데, 히포크산틴 포스포리보실트랜스퍼제 (HPRT) 유전자를 양성 대조군으로서 사용하였다. H1 ES 세포로부터 단리된 전체 RNA를 양성 대조군으로서 사용하였고, H2O를 음성 대조군으로서 사용하였다. 10 ㎕의 PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔상에서 분리하고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화시켰다.
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Claims (84)

  1. (a) 분화된 세포, 동물의 핵제거된(enucleated) MII기 난자 및 동물의 핵제거된 2세포기 배아를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된(synchronized) 것인 단계;
    (b) 상기 분화된 세포의 핵을 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계;
    (c) 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계;
    (d) 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자가 2세포기로 발달되게 하는 단계;
    (e) 상기 단계 (d)로부터의 상기 활성화된 2세포기 난자의 1개 이상의 핵 및 주위 세포질의 일부 또는 전부를 분리해내는 단계; 및
    (f) 상기 단계 (e)에서 분리된 상기 1개 이상의 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 상기 분화된 세포의 리프로그래밍된(reprogrammed) 핵을 함유하는 단일 세포를 생성시키는 단계로서, 상기 융합은 상기 핵을 상기 2세포기 배아의 2개 세포 사이에 위치시킴으로써 이루어지는 단계
    를 포함하여 분화된 세포의 핵을 리프로그래밍하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 상기 난자가 시클로헥사미드, CsCl2, 칼슘 이오노포어(ionopore), 이오노마이신(ionomycin), 정자 인자(sperm factor), 6-DMAP, SrCl2, 사이토칼라신(cytochalasin) B 또는 이들의 임의의 조합물에 의해 활성화되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (f)에서, 상기 융합 단계가 전기적으로 수행되는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 전기적 융합이, 상기 핵이 양극(positive pole)과 일렬로 정렬되고 전기 충격이 가해지는 첫 번째 단계 및 상기 배아와 상기 핵이 약 90도 회전되고 전기 충격이 가해지는 두 번째 단계의 두 단계로 수행되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (f)로부터 생성된 상기 단일 세포를 할구기(blastomere stage), 상실배기(morula stage) 또는 배반포기(blastocyst stage)로 성장시키는 단계 (g)를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 MII기 난자가 인간 난자인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 핵제거된 2세포기 배아가 인간 배아인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 분화된 세포가 인간 세포인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 MII기 난자와 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 분화된 세포와 상기 MII기 난자가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 분화된 세포와 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 분화된 세포, 상기 MII기 난자 및 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 동일한 종이 인간인 방법.
  14. (a) 분화된 세포, 동물의 핵제거된 MII기 난자 및 동물의 핵제거된 2세포기 배아를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된 것인 단계;
    (b) 상기 분화된 세포의 핵을 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계;
    (c) 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계;
    (d) 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자가 2세포기로 발달되게 하는 단 계;
    (e) 상기 단계 (d)로부터의 상기 2세포기 난자의 1개 이상의 핵 및 주위 세포질의 일부 또는 전부를 분리해내는 단계;
    (f) 상기 단계 (e)에서 분리된 상기 1개 이상의 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 단일 세포를 생성시키는 단계; 및
    (g) 상기 단계 (f)로부터의 상기 단일 세포를 배양하여 동물로 발달되게 하는 단계
    를 포함하여 동물을 생성시키는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 상기 난자가 시클로헥사미드, CsCl2, 칼슘 이오노포어, 이오노마이신, 정자 인자, 6-DMAP, SrCl2, 사이토칼라신 B 또는 이들의 임의의 조합물에 의해 활성화되는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 단계 (f)에서, 상기 융합 단계가 전기적으로 수행되는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 전기적 융합이, 상기 핵이 양극과 일렬로 정렬되고 전기 충격이 가해지는 첫 번째 단계 및 상기 배아와 상기 핵이 약 90도 회전되고 전기 충격이 가해지는 두 번째 단계의 두 단계로 수행되는 방법.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 MII기 난자가 인간 난자인 방법.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 핵제거된 2세포기 배아가 인간 배아인 방법.
  20. 제 14항에 있어서, 상기 분화된 세포가 인간 세포인 방법.
  21. 제 14항에 있어서, 상기 MII기 난자와 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  22. 제 14항에 있어서, 상기 분화된 세포와 상기 MII기 난자가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  23. 제 14항에 있어서, 상기 분화된 세포와 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  24. 제 14항에 있어서, 상기 분화된 세포, 상기 MII기 난자 및 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  25. 제 22항에 있어서, 상기 동일한 종이 인간인 방법.
  26. (a) 분화된 세포, 동물의 핵제거된 MII기 난자 및 동물의 핵제거된 2세포기 배아를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된 것인 단계;
    (b) 상기 분화된 세포의 핵을 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계;
    (c) 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계;
    (d) 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자가 2세포기로 발달되게 하는 단계;
    (e) 상기 단계 (d)로부터의 상기 2세포기 난자의 핵 및 주위 세포질을 분리해내는 단계;
    (f) 상기 단계 (e)에서 분리된 상기 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 단일 세포를 생성시키는 단계로서, 상기 융합은 상기 핵을 상기 2세포기 배아의 2개 세포 사이에 위치시킴으로써 이루어지는 단계; 및
    (g) 상기 단계 (f)로부터의 상기 단일 세포를, 배아 줄기세포가 유래될 수 있는 발달 단계(developmental stage)로 배양하는 단계
    를 포함하여 배아 줄기세포를 생성시키는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 상기 난자가 시클로헥사미드, CsCl2, 칼슘 이오노포어, 이오노마이신, 정자 인자, 6-DMAP, SrCl2, 사이토칼라신 B 또는 이들의 임의의 조합물에 의해 활성화되는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 상기 단계 (f)에서, 상기 융합 단계가 전기적으로 수행되는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 전기적 융합이, 상기 핵이 양극과 일렬로 정렬되고 전기 충격이 가해지는 첫 번째 단계 및 상기 배아와 상기 핵이 약 90도 회전되고 전기 충격이 가해지는 두 번째 단계의 두 단계로 수행되는 방법.
  30. 제 26항에 있어서, 상기 MII기 난자가 인간 난자인 방법.
  31. 제 26항에 있어서, 상기 핵제거된 2세포기 배아가 인간 배아인 방법.
  32. 제 26항에 있어서, 상기 분화된 세포가 인간 세포인 방법.
  33. 제 26항에 있어서, 상기 MII기 난자와 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  34. 제 26항에 있어서, 상기 분화된 세포와 상기 MII기 난자가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  35. 제 26항에 있어서, 상기 분화된 세포와 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  36. 제 26항에 있어서, 상기 분화된 세포, 상기 MII기 난자 및 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  37. 제 34항에 있어서, 상기 동일한 종이 인간인 방법.
  38. 제 26항에 있어서, 상기 배아 줄기세포가 MHC 대립유전자에 대해 반접합성(hemizygous) 또는 동형접합성(homozygous)이고, 상기 분화된 세포가 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이거나, 상기 배아 줄기세포가 상동 재조합, 이형접합성의 상실 또는 둘 모두에 의해 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이 되도록 조작(engineering)되고, 상기 동일한 종이 인간인 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 배아 줄기세포의 뱅크(bank)를 생성시키도록 상기 방법이 여러 차례 반복되며, 상기 배아 줄기세포 각각은 상기 뱅크의 다른 배아 줄기세포와는 상이한 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성인 방법.
  40. 제 14항에 있어서, 상기 단계 (g)가 상기 배양된 세포를 동물의 자궁내로 착상(implanting)시키는 것을 포함하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 착상된 세포와 이러한 세포가 착상된 동물이 동일한 종인 방법.
  42. 제 26항에 있어서, 상기 단계 (g)가,
    (i) 상기 단계 (f)로부터의 상기 단일 세포를 상실배기로 배양하고;
    (ii) 상기 상실배로부터 할구를 단리(isolation)하고;
    (iii) 상기 할구를 배양하여 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터(cluster)를 생성시키고;
    (iv) 상기 2개 또는 그 초과의 할구의 배양된 클러스터를 직접적으로 또는 간접적으로 배아 또는 태아 세포와 접촉시키고;
    (v) 배아 줄기(ES) 세포가 생성될 때까지 상기 (iv)의 2개 또는 그 초과의 할구의 클러스터를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  43. (a) 포유류 모체 배아(parental embryo)로부터 생검된 할구와 상기 모체 배아를 12시간 내지 18시간 동안 함께 배양하고;
    (b) 상기 할구를, 라미닌을 추가로 포함하고 마우스 배아 섬유아세포(MEF)가 접종(seeding)된 배반포 배지로 옮기고;
    (c) 배아 줄기(ES) 세포가 생성될 때까지 상기 (b)의 할구를 배양하는 것을 포함하여, ES 세포를 생성시키는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 MEF가 유사분열 비활성화된(mitotically inactivated) 것인 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 상기 단계 (c)가 배아 소포(embryonic vesicle) 형성을 감소시키는 조건에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 배반포 배지가 2.5 ㎍/ml의 라미닌을 포함하는 방법.
  47. 제 45항에 있어서, 상기 단계 (c)가 MEF 세포가 접종된 배반포 배지에서 5일간 배양하는 것을 포함하는 방법.
  48. 제 43항에 있어서, 상기 단계 (c)가, 상기 할구가 약 20개 세포의 세포 클럼프(clump)를 형성할 때까지 배양하고 이러한 세포 클럼프를 ES 세포가 접종된 배지로 옮기는 것을 추가로 포함하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 ES 세포가 마커를 발현하거나 표지된 것인 방법.
  50. 제 43항에 있어서, 상기 모체 배아가 배반포 배지로 옮겨져서 배반포로 발달 하게 되는 방법.
  51. 제 43항에 있어서,
    (a) 배아를 고정시키고;
    (b) 할구가 단리될 때까지 상기 고정된 배아를 탭핑(tapping)하는 것을 포함하여, 상기 할구가 배아로부터 단리되는 방법.
  52. (a) 분화된 세포, 동물의 핵제거된 MII기 난자 및 동물의 핵제거된 2세포기 배아를 제공하는 단계로서, 상기 MII기 난자와 상기 배아가 동기화된 것인 단계;
    (b) 상기 분화된 세포의 핵을 상기 핵제거된 난자내로 주입하는 단계;
    (c) 상기 핵을 포함하는 상기 난자를 활성화시키는 단계;
    (d) 상기 핵을 포함하는 상기 활성화된 난자가 2세포기로 발달되게 하는 단계;
    (e) 상기 단계 (d)로부터의 상기 2세포기 난자의 핵 및 주위 세포질을 분리해내는 단계;
    (f) 상기 단계 (e)에서 분리된 상기 핵을 상기 핵제거된 2세포기 배아로 융합시킴으로써 단일 세포를 생성시키는 단계로서, 상기 융합은 상기 핵을 상기 2세포기 배아의 2개 세포 사이에 위치시킴으로써 이루어지는 단계;
    (g) 상기 단계 (f)로부터의 상기 단일 세포를 배양하여, 모체 배아로서 사용될 수 있는 상실배를 생성시키는 단계;
    (h) 상기 상실배로부터 할구를 단리하는 단계;
    (i) 상기 할구와 상기 모체 배아를 12시간 내지 18시간 동안 함께 배양하는 단계;
    (j) 상기 할구를, 라미닌을 추가로 포함하고 마우스 배아 섬유아세포(MEF)가 접종된 배반포 배지로 옮기는 단계; 및
    (k) ES 세포가 생성될 때까지 상기 (j)의 할구를 배양하는 단계
    를 포함하여 배아 줄기세포를 생성시키는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, MEF가 유사분열 비활성화된 것인 방법.
  54. 제 52항에 있어서, 상기 단계 (k)가 배아 소포 형성을 감소시키는 조건에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 배반포 배지가 2.5 ㎍/ml의 라미닌을 포함하는 방법.
  56. 제 54항에 있어서, 상기 단계 (k)가 MEF 세포가 접종된 배반포 배지에서 5일간 배양하는 것을 포함하는 방법.
  57. 제 52항에 있어서, 상기 단계 (k)가, 상기 할구가 약 20개 세포의 세포 클럼 프를 형성할 때까지 배양하고 이러한 세포 클럼프를 ES 세포가 접종된 배지로 옮기는 것을 추가로 포함하는 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 상기 ES 세포가 마커를 발현하거나 표지된 것인 방법.
  59. 제 52항에 있어서, 상기 모체 배아가 배반포 배지로 옮겨져서 배반포로 발달하게 되는 방법.
  60. 제 52항에 있어서,
    (a) 상실배를 고정시키고;
    (b) 할구가 단리될 때까지 상기 고정된 상실배를 탭핑하는 것을 포함하여, 상기 할구가 상실배로부터 단리되는 방법.
  61. 제 52항에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 상기 난자가 시클로헥사미드, CsCl2, 칼슘 이오노포어, 이오노마이신, 정자 인자, 6-DMAP, SrCl2, 사이토칼라신 B 또는 이들의 임의의 조합물에 의해 활성화되는 방법.
  62. 제 52항에 있어서, 상기 단계 (f)에서, 상기 융합 단계가 전기적으로 수행되는 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 전기적 융합이, 상기 핵이 양극과 일렬로 정렬되고 전기 충격이 가해지는 첫 번째 단계 및 상기 배아와 상기 핵이 약 90도 회전되고 전기 충격이 가해지는 두 번째 단계의 두 단계로 수행되는 방법.
  64. 제 52항에 있어서, 상기 MII기 난자가 인간 난자인 방법.
  65. 제 52항에 있어서, 상기 핵제거된 2세포기 배아가 인간 배아인 방법.
  66. 제 52항에 있어서, 상기 분화된 세포가 인간 세포인 방법.
  67. 제 52항에 있어서, 상기 MII기 난자와 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  68. 제 52항에 있어서, 상기 분화된 세포와 상기 MII기 난자가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  69. 제 52항에 있어서, 상기 분화된 세포와 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  70. 제 52항에 있어서, 상기 분화된 세포, 상기 MII기 난자 및 상기 핵제거된 2세포기 배아가 동일한 종으로부터 유래되는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 상기 동일한 종인 인간인 방법.
  72. 제 52항에 있어서, 상기 배아 줄기세포가 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이고, 상기 분화된 세포가 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이거나, 상기 배아 줄기세포가 상동 재조합, 이형접합성의 상실 또는 둘 모두에 의해 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성이 되도록 조작되고, 상기 동일한 종이 인간인 방법.
  73. 제 72항에 있어서, 배아 줄기세포의 뱅크를 생성시키도록 상기 방법이 여러 차례 반복되며, 상기 배아 줄기세포 각각은 상기 뱅크의 다른 배아 줄기세포와는 상이한 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동형접합성인 방법.
  74. 제 52항에 있어서, 상기 배반포 배지가 비-ES 세포로 분화되는 것을 억제할 수 있는 인자를 포함하는 방법.
  75. 제 52항에 있어서, 상기 배반포 배지가 밀착 연접(tight junction)을 붕괴시킬 수 있는 인자를 포함하는 방법.
  76. 제 52항에 있어서, 상기 배반포 배지가 영양외배엽(trophectoderm) 분화 경로를 억제할 수 있는 인자를 포함하는 방법.
  77. 제 52항에 있어서, 상기 배반포 배지가 세포를 탈분극시킬 수 있는 인자를 포함하는 방법.
  78. (a) 포유류 모체 배아로부터 생검된 할구를 배양하고;
    (b) 상기 할구를, 라미닌을 추가로 포함하는 배반포 배지로 옮기고;
    (c) 배아 줄기(ES) 세포가 생성될 때까지 상기 (b)의 할구를 배양하는 것을 포함하여, ES 세포를 생성시키는 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 상기 단계 (c)가 배아 소포 형성을 감소시키는 조건에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  80. 제 78항에 있어서, 상기 배반포 배지가 2.5 ㎍/ml의 라미닌을 포함하는 방법.
  81. 제 78항에 있어서, 상기 모체 배아가 배반포 배지로 옮겨져서 배반포로 발달하게 되는 방법.
  82. 제 78항에 있어서,
    (a) 배아를 고정시키고;
    (b) 할구가 단리될 때까지 상기 고정된 배아를 탭핑하는 것을 포함하여, 상기 할구가 배아로부터 단리되는 방법.
  83. 제 78항에 있어서, 상기 (a)의 할구가 상기 포유류 모체 배아와 함께 배양되는 방법.
  84. 제 78항에 있어서, 상기 할구가 이미 유도된 인간 줄기세포와는 배양되지 않는 방법.
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