KR101569204B1 - 배아 줄기 세포 및 배-유도 세포의 유도 - Google Patents

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로버트 랜자
이리나 브이. 클리만스카야
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오카타 세라퓨틱스, 인크.
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/02—Coculture with; Conditioned medium produced by embryonic cells

Abstract

본 발명은 배의 부득이한 파괴없이 배로부터 배아 줄기 세포 및 배-유도된 세포를 생산하는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 배의 파괴없이 유도된 세포 및 세포주를 제공하고, 치료 및 연구 목적으로 이들 세포를 이용하는 것에 관계한다. 또한 IVF와 같은 생식 요법과 연계하여 배의 착상전에 자가 줄기 세포를 확립하고 보관하는 신규한 방법을 제공한다.

Description

배아 줄기 세포 및 배-유도 세포의 유도{DERIVATION OF EMBRYONIC STEM CELL AND EMBRYO-DERIVED CELL}
본 발명은 배아 줄기(ES) 세포 및 배유도(ED) 세포, 이들 세포 및 세포주를 유도하는 신규한 방법, 치료 및 연구 목적으로 이들 세포를 이용하는 용도에 관계한다. 또한, 시험관(in vitro ) 수정과 같은 생식 기술과 연계하여 배 착상전에 자가조혈모세포주(autologous stem cell line)의 확립 및 보관에 관한 신규한 방법에 관계한다.
거의 예외없이, 배아 줄기 세포는 낭포(배반포) 단계 배로부터 생장한다. ES 세포주는 통상적으로 낭포의 내부 세포 물질로부터 분리한다. 이들 세포를 만드는데 이용되는 기술에는 몇가지 문제점들이 있다. 기술적 관점에서 배아를 낭포로 배양하는 것은 성공률이 상대적으로 낮다. 또한, 특정 집단은 유도과정이 착상전, 낭포 단계 배를 파괴하기 때문에 낭포의 내부 세포 물질로부터 유도된 세포주를 이용한 배아 줄기(ES) 세포 연구를 반대한다. 이와 같은 이유로 ES 세포를 통상적으로 생산해내는 낭포-단계 배는 저온 보존(cryopreserve)하거나 나중 사용을 위한 냉동보관할 수 없고 또는 추가 연구를 허용하지 않는다.
본 발명은 연구 및 의약에 이용하기 위한 목적으로 ES 세포, ES 세포주 및 다른 ED 세포를 유도하는 신규한 방법을 제공한다. 여기에서 설명하는 방법은 이들 배아를 파괴하지 않고 배로부터 ES 세포, ES 세포주 및 다른 ED 세포들을 유도할 수 있도록 한다.
발명의 요약
본 발명은 배아 줄기 세포 및 배로부터 유도된 배-유도 세포, 이들 세포 및 세포주를 유도하는 신규한 방법 및 치료 및 연구 목적으로 이들 배아 줄기 세포 및 세포주를 이용하는 용도에 관계한다. 또한, 시험관(in vitro )수정(“IVF")과 같은 생식 기술과 연계하여 배 착상전에 회수한 자가조혈모세포주(autologous stem cell line)의 확립 및 보관에 관한 신규한 방법에 관계한다.
제 1 측면에서, 본 발명은 사람의 배아 줄기(ES) 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 사람의 배에서 얻은 낭포를 배양하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 낭포는 5mM미만의 포도당을 포함하고, 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에서 배양하여 두 개 또는 그이상의 난할구(blastomere) 클러스터를 만든다. 배양된 두 개 또는 그이상의 난할구 클러스터를 직간접적으로 배아 또는 태아세포(fetal cell)와 접촉시키고, 그 다음 두 개 또는 그이상의 난할구 클러스터는 배아 또는 태아 세포 존부하에 추가 배양하여 ES 세포들을 만든다.
특정 구체예에서, 이 방법은 5mM미만의 포도당을 포함하고(또는) 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에서 사람 배아에서 수득한 낭포를 최소 1일 배양하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 이 방법은 ES 세포의 유도를 우선적으로 할 필요없이 낭포 로부터 직접적으로 부분적 분화된 세포를 생산하는데 유사하게 이용된다.
특정 구체예에서, 두 개 또는 그이상의 난할구의 배양 클러스터는 두 개 또는 그이상의 난할구 응집체(aggregate)를 포함하며, 두 개 또는 그이상의 난할구 응집체는 배아 또는 태아 세포와 접촉한다.
특정 구체예에서, 배아 또는 태아 세포와 접촉 동안 또는 접촉후에, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터는 최소 5mM의 포도당을 포함하고(또는) 최소310mosm의 삼투몰농도를 가지는 배지에서 배양한다.
특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 우선 배아로부터 수득하고, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 5mM미만의 포도당을 포함하고(또는) 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에 우선적으로 배양한다. 이들 난할구들은 동일하거나 상이한 배아가 될 수 있으며, 이들 난할구들은 서로 접촉하거나 접촉없이 배양할 수 있으나 동일한 배양 용기 또는 마이크로드롭에서 배양된다.
상기 전술한 특정 구체예에서, 사람 배로부터 난할구의 수득으로 난할구와 나머지 사람 배가 형성되고, 나머지 사람 배는 난할구를 수득한 다음에 파괴되지 않는다. 특정 구체예에서, 나머지 배는 생존가능(viable)하다. 특정 구체예에서, 생존능력을 평가하기 위해 난할구를 제거한 후에 나머지 배를 하루 또는 몇일 더 배양한다. 특정 구체예에서 나머지 배를 저온 보존한다.
상기 언급된 특정 구체예에서, 난할구는 상실배(morula)의 치밀화(compaction)후에 사람 배로부터 수득한다. 특정 구체예에서, 난할구는 할강(blastocoel) 형성전에 사람 배로부터 수득한다. 특정 구체예에서, 난할구는 4- 6 세포 배, 4-10 세포 사람 배 또는 4-8 세포 사람 배로부터 수득한다.
두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포들는 서로 직간접적으로 접촉한다. 특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포들은 응집체로 배양되지 않는다. 특정 다른 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터는 배 또는 태아 세포들과 간접적으로 접촉한다.
특정 다른 구체예에서, 세포(난할구, 난할구 클러스터 및/또는 배 또는 태아 세포들)들은 마이크로드롭 배양기에서 배양된다.
특정 구체예에서, 배(예를 들면, 사람 배)는 미리 냉동시키고, 난할구를 얻기 전에 해동시킨다.
다양한 방법들 및 이들 복합방법들을 이용하여 배로부터 난할구를 제거할 수 있다. 선호적으로는 배의 나머지 생존력을 실질적으로 감소시키지 않고 난할구를 제거한다. 환언하면, 난할구 제거후에, 배의 나머지 부분은 생장을 지속할 수 있다. 특정 구체예에서, 난할구 제거후 최소 1일간 배양물에서 생장 및 생존을 지속하는 능력은 난할구 제거로 인하여 실질적인 생존력 감소가 없었다는 것을 말한다. 특정 구체예에서, 난할구는 사람 배 주변의 투명대(zona pellucida)를 부분적으로 또는 완전하게 제거하여 얻는다. 특정 구체예에서, 난할구가 분리될 때까지 배를 고정시키고, 고정된 배를 태핑(tapping)하여 난할구를 얻는다.
배 또는 태아 세포를 이용한 특정 구체예에서 예시적인 배 또는 태아 세포는 인체 세포이다. 특정 구체예에서, 사람 배 또는 태아 세포는 사람 ES 세포, 사람 ED 세포, 사람 TS 세포, 사람 EG세포, 태반 줄기세포, 양수 세포 또는 줄기 세포 또는 사람 배 암종 세포에서 선택된다. 특정 구체예에서, 배 또는 태아 세포는 선택적으로 섬유모세포 영양세포층(fibroblast feeder layer)상에서 배양한다.
특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 또는 클러스터를 ES 세포의 분화를 저해하는 인자와 함께 배양한다. 특정 구체예에서, 재조합체 Oct-4를 난할구로 도입시키거나 사람 ES 세포를 생산하기 위해 난할구를 배양하는 단계 동안 난할구에서 내생성 Oct-4를 활성화시킨다.
특정 구체예에서, ES 세포 또는 세포주 예를 들면 사람 ES 세포 또는 세포는 만능분화능(pluripotent) 세포이다. 특정 구체예에서, ES 세포들은 Oct-4, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase), SSEA-3, SSEA-4, TRA- 1-60 및 TRA-1-81에서 선택된 하나 또는 그이상의 ES 세포 마커 단백질을 발현한다.
특정 구체예에서, 난할구는 세포 분할을 하고, 하나의 자손 세포를 이용하여 유전자 테스트를 하고 다른 자손 세포를 이용하여 사람 ES 세포를 만든다.
전술한 특정 구체예에서, 이 방법은 난할구에서 유도된 ES 세포들을 분리하고, ES 세포들을 배양하여 ES 세포주를 만드는 단계가 추가로 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 유전적 진단을 실행하는데 수반되는 자가조혈모세포를 만드는 방법을 제공한다. 착상전 유전 진단(pre-implantation genetic diagnosis: PGD) 동안 일반적으로 실행되는 것과 같이 난할구를 배로부터 제거한다. 난할구를 배양하고, 최소 1회 분할되도록 한다. 분할후에, 한 개 자손세포를 이용하여 유전 진단을 하고, 다른 자손 세포를 추가 배양하여(여기에서 설명하는 임의 방법들중 하나를 이용하여) ES 세포 또는 ES 세포주를 만든다. 이와 같은 ES 세포 또는 ES 세포주는 배 또는 배로부터 생성된 개체의 자가 세포 및 조직의 적절한 소스가 될 수 있을 것이다.
다른 측면에서 본 발명은 사람 배 파괴없이 사람 배로부터 유도된 사람 ES 세포를 제공한다. 특정 측면에서, 여기에서 설명하는 방법중 임의 하나를 이용하여 ES 세포를 만든다.
다른 측면에서, 본 발명은 사람 배의 파괴없이 사람 배로부터 유도된 사람 ES 세포주를 제공한다. 특정 측면에서, 여기에서 설명하는 방법중 임의 하나를 이용하여 ES 세포주를 만든다.
특정 구체예에서, 사람 ES 세포 또는 ES 세포주는 기존에 확인된 난할구-유도된 ES 세포주의 하나 또는 그 이상의 특징들을 가진다. 특정 구체예에서 사람 ES 세포 또는 ES 세포주는 만능분화능이고, Oct-4, SSEA-I, nanog, 알칼리 포스파타제 및 Res-1중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 ES 세포 마커 단백질을 발현한다. 특정 구체예에서 사람 ES 세포 또는 ES 세포주는 정상적인 핵형(karyotype)을 유지한다.
다른 측면에서 본 발명은 난할구에서 직접적으로 만들어진 분화된 세포 또는 조직을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 난할구에서 생산된 사람 ES 세포 또는 ES 세포주에서 유도된 분화된 세포 또는 조직을 제공한다. 특정 구체예에서, 분화된 세포 또는 조직은 한계열로 구속된다(lineage committed). 특정 구체예에서, 분화된 세포또는 조직은 중배엽(mesodermal), 내배엽(endodermal) 또는 외배엽(ectodermal) 세 포 또는 조직이다. 특정 구체예에서, 분화된 세포 또는 조직은 부분적으로 또는 최종적으로 분화되었다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 사람 ES 세포 또는 ES 세포주를 원하는 세포 또는 조직으로의 분화를 유도함으로써 원하는 분화된 세포 또는 조직을 만드는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 특정 발생 계통을 따라 ES 세포 또는 ES 세포주의 분화를 촉진시키는 하나 또는 그 이상의 물질과 난할구에서 만들어진 ES 세포 또는 ES 세포주를 접촉시키는 것을 포함한다.
다른 측면에서 본 발명은 난할구로부터 유도된 ES 세포 또는 세포주에서 만들어진 분화된 세포 또는 조직을 포함하는 조성물 및 준비물을 제공한다. 특정 구체예에서, 조성물 및 준비물은 약학적으로 수용가능한 캐리어내에서 조제된 약학 조제물이다.
다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명하는 방법중 임의의 것을 이용하여 난할구로부터 만들어진 ES 세포 또는 세포주의 효과량을 투여함으로써 환자에 세포 치료로 치유될 수 있는 질환 치료 방법을 제공한다.
다른 측면에서 본 발명은 난할구 배양물로부터 직접적으로 만들어진 또는 ES 세포 또는 세포주로부터 만들어진 분화된 세포 또는 조직의 효과량을 투여함으로써 환자에 세포 치료로 치유될 수 있는 질환 치료 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 영양 줄기(trophoblast stem: TS) 세포를 만드는 방법을 제공한다. 이 방법은 5mM미만의 포도당을 포함하고(또는) 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에서 사람 배로부터 수득된 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만들고; 두 개 또는 그 이상의 배양된 난할구 클러스터를 직간접적으로 배 또는 태아 세포와 접촉시키고; TS 세포가 만들어질 때까지 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 추가 배양하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 방법은 5mM미만의 포도당을 포함하고(또는) 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에서 최소 1일간 사람 배에서 수득된 난할구를 배양하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구의 배양된 클러스터는 두 개 또는 그 이상의 난할구 응집체를 포함하는데, 두 개 또는 그 이상의 난할구 응집체를 배 또는 태아 세포와 접촉시킨다.
특정 구체예에서, 배 또는 태아 세포 접촉 후에, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터는 최소 5mM의 포도당을 포함하고(또는) 최소 310mosm의 삼투몰농도를 가지는 배지에서 배양한다.
특정 구체예에서, 하나의 난할구는 배로부터 수득되며, 두 개 또는 그이상의 난할구는 5mM미만의 포도당을 포함하고(또는) 310mosm의 삼투몰농도를 가지는 배지에서 처음에 배양된다. 이들 난할구는 동일한 또는 상이한 배로부터 수득될 수 있으며, 이들 난할구는 서로 직간접적으로 접촉하면서 배양되거나 접촉없이 배양될 수 있으나 동일한 배양 용기 또는 마이크로드롭에서 배양된다.
다음의 또는 전술한 특정 구체예에서, 사람 배로부터 난할구의 수득으로 난할구와 나머지 사람 배가 수득되는데, 나머지 사람 배는 난할구 수득후에도 파괴되지 않는다. 특정 구체예에서 나머지 배도 생존능이 있다. 특정 구체예에서, 나머지 배의 생존능을 평가하기 위해 난할구 제거후 하루 또는 몇일 배양한다. 특정 구체예에서 나머지 배를 저온 보존한다.
상기 특정 구체예에서, 난할구는 상실배(morula)의 치밀화(compaction)후에 사람 배로부터 수득한다. 특정 구체예에서, 난할구는 할강(blastocoel) 형성전에 사람 배로부터 수득한다. 특정 구체예에서, 난할구는 4-6 세포 배, 4-10 세포 사람 배 또는 4-8 세포 사람 배로부터 수득한다.
두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포들은 서로 직간접적으로 접촉한다. 특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포들은 응집체로 배양되지 않는다. 특정 다른 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터는 배 또는 태아 세포들과 간접적으로 접촉한다.
특정 다른 구체예에서, 세포(난할구, 난할구 클러스터 및/또는 배 또는 태아 세포들)들은 마이크로드롭 배양기에서 배양된다.
특정 구체예에서, 배(예를 들면 사람 배)는 미리 냉동시켰고, 난할구를 얻기 전에 해동시킨다.
다양한 방법들 및 이들 복합방법들을 이용하여 배로부터 난할구를 제거할 수 있다. 선호적으로는 배의 나머지 생존력을 실질적으로 감소시키지 않고 난할구를 제거한다. 환언하면, 난할구 제거후에, 배의 나머지 부분은 생장을 지속할 수 있다. 특정 구체예에서, 난할구 제거후 최소 1일간 배양물에서 생장 및 생존을 지속하는 능력은 난할구 제거로 인한 실질적인 생존력 감소가 없었다는 것을 말한다. 특정 구체예에서, 난할구는 사람 배 주변의 투명대(zona pellucida)를 부분적으로 또는 완전하게 제거하여 얻는다. 특정 구체예에서, 난할구가 분리될 때까지 배를 고정시키고, 고정된 배를 태핑(tapping)하여 난할구를 얻는다.
배 또는 태아 세포를 이용한 특정 구체예에서 예시적인 배 또는 태아 세포는 인체 세포이다. 특정 구체예에서, 사람 배 또는 태아 세포는 사람 ES 세포, 사람 ED 세포, 사람 TS 세포, 사람 EG세포, 태반 줄기세포, 양수 세포 또는 줄기 세포 또는 사람 배 암종 세포에서 선택된다. 특정 구체예에서, 배 또는 태아 세포는 선택적으로 섬유모세포 영양세포층(fibroblast feeder layer)상에서 배양한다.
특정 구체예에서, 이 방법에는 난할구로부터 유도된 TS 세포를 분리하는 단계가 추가 포함된다. 특정 구체예에서, 이 방법은 난할구로부터 유도된 TS 세포들로부터 TS 세포주를 확립하는 단계가 추가 포함된다.
특정 구체예에서, 예시적인 TS 세포 또는 TS 세포주는 cdx-2, fgfr2, PL-I 및 사람 융모성 고나도트로핀(hCG)에서 선택된 최소 한가지 TS 세포 마커 단백질을 발현한다. 특정 구체예에서, 예시적인 TS 세포 또는 TS 세포주는 Oct-4 또는 α-페토 단백질을 발현시키지 않는다.
다른 측면에서 본 발명은 사람 배의 파괴없이, 사람 배로부터 유도되는 사람 TS 세포를 제공한다. 특정 구체예에서, 예시적인 TS 세포 또는 TS 세포주는 cdx-2, fgfr2, PL-I 및 사람 융모성 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin (hCG))에서 선택된 최소 한가지 TS 세포 마커 단백질을 발현한다. 특정 구체예에서, 예시적인 TS 세포 또는 TS 세포주는 Oct-4 또는 α-페토 단백질을 발현시키지 않는다.
특정 측면에서 본 발명은 난할구로부터 생산된 TS 세포 또는 TS 세포주로부터 유도된 분화된 세포 또는 조직을 제공한다.
다른 측면에서 본 발명은 배로부터 난할구를 분리시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 배를 고정시키고, 고정된 배를 난할구가 분리될 때까지 태핑하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 배의 나머지 부분으로부터 단일 난할구가 분리된다. 특정 구체예에서 배의 나머지 부분으로부터 다중 난할구들이 분리된다. 특정 구체예에서, 이 방법을 배로부터 난할구를 수득하는데 이용된 다른 방법(예를 들면, 투명대의 제거, 효소에 노출, Ca2+ 및/또는 Mg2+ 없는 배지에 노출)과 복합한다. 특정 구체예에서, 배는 마이크로피펫을 이용하여 고정시킨다. 특정 구체예에서 배는 4-16 세포 단계 배, 4-10 세포 단계 배, 또는 8-10 세포 단계 배이다.
다른 측면에서 본 발명은 사람 배의 파괴없이, 배아 줄기 세포 연구를 실행하는 방법을 제공한다. 이 방법은 사람 배의 파괴없이, 사람 배로부터 유도된 사람 ES 세포, ES 세포주를 수득하는 단계를 포함한다. 난할구로부터 ES 세포 또는 세포주를 유도하는 방법들중 임의 방법을 이용하면 이와 같은 세포주를 만들 수 있을 것이다. 일단 생성된 사람 ES 세포 또는 ES 세포주를 이용하여 배아 줄기 세포 연구를 실행하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 배아 줄기 세포 연구 실행은 하나 또는 그 이상의 인자들과 사람 ES 세포 또는 ES 세포주를 접촉시키고, ES 세포 또는 ES 세포주를 하나 또는 그 이상의 중배엽(mesodermal), 내배엽(endodermal) 또는 외배엽(ectodermal) 세포 타입으로 분화를 촉진시키는 인자들을 동정하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서 본 발명은 배아 줄기(ES) 세포를 만드는 방법을 제공한다. 이 방법은 포유류 배로부터 수득한 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만들고; 두 개 또는 그 이상의 난할구의 배양된 클러스터를 배아 또는 태아 세포와 직간접적으로 접촉시키고; ES 세포가 생성될 때까지 (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서 두 개 또는 그 이상의 난할구의 배양된 클러스터는 두 개 또는 그 이상의 클러스터 응집체를 포함하고, 두 개 또는 그 이상의 난할구 응집체를 배 또는 태아 세포와 접촉시킨다.
특정 구체예에서 배 또는 태아 세포와 접촉하는 동안 또는 후에, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 최소 5mM의 포도당을 포함하고(또는) 최소 310mosm의 삼투몰농도를 가지는 배지에 배양시킨다.
특정 구체예에서, 하나의 난할구는 배로부터 처음에 수득되며, 두 개 또는 그이상의 난할구는 5mM미만의 포도당을 포함하고(또는) 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에서 처음에 배양된다. 이들 난할구는 동일한 또는 상이한 배로부터 수득될 수 있으며, 이들 난할구는 서로 직간접적으로 접촉하면서 배양되거나 접촉없이 배양될 수 있으나 동일한 배양 용기 또는 마이크로드롭에서 배양된다.
상기 또는 다음의 특정 구체예에서, 배로부터 난할구의 수득으로 난할구와 나머지 배가 수득되는데, 나머지 배는 난할구 수득후에도 파괴되지 않는다. 특정 구체예에서 나머지 배도 생존능이 있다. 특정 구체예에서, 나머지 배는 생존능을 평가하기 위해 난할구 제거후 하루 또는 몇일 배양한다. 특정 구체예에서 나머지 배를 저온 보존한다.
상기 특정 구체예에서, 난할구는 상실배(morula)의 치밀화(compaction)후에 배로부터 수득한다. 특정 구체예에서, 난할구는 할강(blastocoel) 형성전에 배로부터 수득한다. 특정 구체예에서, 난할구는 4-6 세포 배, 4-10 세포 배 또는 4-8 세포 사람 배로부터 수득한다.
두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포들는 서로 직간접적으로 접촉한다. 특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포들은 응집체로 배양되지 않는다. 특정 다른 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터는 배 또는 태아 세포들과 간접적으로 접촉한다
특정 다른 구체예에서, 세포(난할구, 난할구 클러스터 및/또는 배 또는 태아 세포들)들은 마이크로드롭 배양기에서 배양된다.
특정 구체예에서, 배(예를 들면 사람 배)는 미리 냉동시켰고, 난할구를 얻기 전에 해동시킨다.
다양한 방법들 및 이들 복합방법들을 이용하여 배로부터 난할구를 제거할 수 있다. 선호적으로는 배의 나머지 생존력을 실질적으로 감소시키지 않고 난할구를 제거한다. 환언하면, 난할구 제거후에, 배의 나머지 부분은 생장을 지속할 수 있다. 특정 구체예에서, 난할구 제거후 최소 1일간 배양물에서 생장 및 생존을 지속하는 능력은 난할구 제거로 인하여 실질적인 생존력 감소가 없었다는 것을 말한다. 특정 구체예에서, 난할구는 사람 배 주변의 투명대(zona pellucida)를 부분적으로 또는 완전하게 제거하여 얻는다. 다른 특정 구체예에서, 난할구가 분리될 때까지 배를 고정시키고, 고정된 배를 태핑(tapping)하여 난할구를 얻는다.
배 또는 태아 세포를 이용한 특정 구체예에서 예시적인 배 또는 태아 세포는 생쥐 세포 또는 인체 세포이다. 특정 구체예에서, 특정 구체예에서 배 또는 태아 세포는 난할구와 동일한 종이다. 특정 구체예에서, 사람 배 또는 태아 세포는 사람 ES 세포, 사람 ED 세포, 사람 TS 세포, 사람 EG세포, 태반 줄기세포, 양수 세포 또는 줄기 세포 또는 사람 배 암종 세포에서 선택된다. 특정 구체예에서, 배 또는 태아 세포는 선택적으로 섬유모세포 영양세포층(fibroblast feeder layer)상에서 배양한다.
특정 구체예에서, 이 방법은 난할구로부터 유도된 ES 세포를 분리하고, ES 세포주를 생성하는 단계가 추가 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 ES 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 포유류 배로부터 난할구를 수득하고, 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만들고; 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아세포와 응집시키고; 응집된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 태아 또는 배 세포를 응집된 난할구 클러스터가 ES 세포 성질을 나타낼 때까지 배양하고; 배아 세포의 난할구로부터 유도된 ES 세포를 분리시키는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 TS 세포를 만드는 방법을 제공한다. 이 방법은 포유류 배로부터 난할구을 수들하고, 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만들고, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포를 응집시키고; 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터의 파생물(outgrowth)을 수득하고, 이때 파생물은 영양세포 또는 배자밖내배엽 세포(extraembryonic endoderm cell)의 성질을 나타내고; 파생물과 FGF-4를 접촉시켜 TS 세포를 만들고; 그리고 난할구로부터 유도된 TS 세포를 분리시키는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 포유류 배는 사람 배이며 TS 세포는 사람 세포이다. 특정 다른 구체예에서, 이 방법은 TS 세포주를 만들기 위해 난할구로부터 유도된 TS 세포를 배양시킴으로써 TS 세포주를 생산하는 것을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 사람 배아 줄기(ES) 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 사람 배로부터 수득된 난할구를 5mM미만의 포도당을 포함하고(또는) 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에 배양시켜 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만들고; 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터의 생장 및 성장을 충분히 촉진시킬 수 있는 배지와 직간접적으로 접촉시키고; 그리고 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 추가 배양시켜 ES 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 이 방법은 사람 배로부터 수득된 난할구를 5mM미만의 포도당을 포함하고(또는) 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에 최소 1일간 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만드는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터의 생장 및 성장을 충분히 촉진시킬 수 있는 배지는 배 또는 태아 세포로 조건화시킨 배지이다.
특정 다른 구체예에서 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터의 생장 및 성장을 충분히 촉진시킬 수 있는 배지는 ACTH가 보충된 배지이다.
특정 측면에서 본 발명은 배아 줄기 세포를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 배 배지에 난할구를 배양하는 단계를 포함하며, 이때 난할구는 배로부터 수득된 것이며, 배는 생존능을 유지하고 있다. 이 방법은 하기 조건하에 배양된 난할구를 배아 줄기 세포와 직간접적으로 접촉하는 단계를 포함하는데, 이때 조건으로서 접촉은 Chung et al., Nature (2006) 439:216-9에서 설명된 바와 같이 배양된 난할구와 배아 줄기 세포가 응집됨으로써 실행되지 않는다.
예를 들면 배양된 난할구는 마이크로드롭에서 배양될 수 있고, 배아 줄기 세포는 별도의 마이크로드롭에서 배양된다. 각 마이크로드롭에는 단일 난할구 또는 다중 난할구가 포함될 수 있다. 난할구를 포함하는 마이크로드롭을 당분야에 공지의 임의 수단을 이용하여 배아 줄기 세포를 포함하고 있는 마이크로드롭에 연결시키거나 합칠 수 있다. 한 구체예에서, 두 개 마이크로드롭의 연결 또는 합병은 파라핀 오일 또는 Squibb 오일과 같은 가벼운 미네랄 오일하에 두 개 드롭간에 피펫 조작으로 드래그(drag)하여 실행할 수 있다.
ES 또는 ED 세포를 만드는 방법도 상실배 단계 배, 내부 세포 물질(inner cell mass) 또는 배 디스크(embryonic disk), 또는 단일 배아 세포 또는 단일 배아 생식 세포로부터 단일 세포를 배양하는데 이용할 수도 있을 것이다.
한 구체예에서, 난할구는 상실배 치밀화 전에 배로부터 수득한다. 전체 한 개 세포 접합체(zygote)를 이용할 수도 있으나 이 방법은 세포주 유도에서 전체 배를 이용하는 것에 대한 도덕적 저항(반대)를 우회하는 장점을 제공하지는 못한다. 따라서, 선호되는 방법은 두 개 세포 단계와 난할구 발생 단계사이의 배로부터 도너 세포를 이용하는 것이다. 다른 구체예에서, 배는 할강(blastocoel) 형성 전에 수득된다. 난할구는 배 주변의 투명대를 부분적으로 또는 완전하게 제거하여 얻을 수도 있다. 생검된(biopsied) 배를 착상시키거나 저온 보존할 수 있다. 초기 배는 in vivo 또는 in vitro에서 수정된 난모세포로부터 수득할 수 있었을 것이고, 저온 보존하거나 할 수도 있었거나 또는 할 수 없었을 것이다.
배로부터 수득된 난할구 배양물을 임의 적절한 세포 배양물과 직간접적으로 접촉시켜 ES 세포주 또는 ED 세포주 또는 이들 두가지를 만든다. 임의 적절한 세포에는 배아 줄기 세포 예를 들면, 이미 확립된 세포주, 배 암종 세포, 뮤린 배아 세포를 포함하는 배아 섬유모세포, 다른 배-유사 세포, 배아 기원 세포 또는 배로부터 유도된 세포, 당분야에 공지된 세포 및 American Type Culture Collection, Manassas, VA 201 10-2209, USA, 및 다른 소스로부터 이용할 수 있는 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는 세포들이 포함된다.
난할구는 난할구로부터 유도된 ES 세포의 분화를 저해시키는 인자들과 배양시킬 수도 있다. 이와 같은 인자들에는 영양 세포 발생과 관련된 유전자의 발현을 차단하거나 변화시키는 임의 인자들이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 한 구체예에서, 난할구는 헤파린 존재하에 배양된다. 다른 구체예에서, Oct-4를 난할구로 도입시키거나 또는 난할구에서 내생성 Oct-4 발현을 유도한다.
다른 구체예에서, 배에서 수득된 난할구는 세포 분할을 하며, 하나의 후손 세포는 유전자 테스트에 이용되며, 다른 후손 세포를 이용하여 ES 세포 또는 세포 주를 만든다.
난할구에서 생산되는 ES 세포는 만능분화능이거나 일부 한정된 분화전능성(definitions totipotent)일 것이다. ES 세포의 만능분화능의 정도는 ES 세포 마커 단백질을 검사하여 결정할 수 있다. 이와 같은 단백질은 당분야에 공지된 것들로, Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA- 1-60, TRA-1-81, 알칼리 포스파타제가 포함된다.
ES 또는 ED 세포를 생산하는 본 발명의 방법을 사람 배 뿐만 아니라 사람의 것이 아닌 배 예를 들면, 사람이 아닌 포유류 배, 다른 영장류 배, 말 배, 조류 배 또는 개 배를 이용하여 실행할 수 있을 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 분화된 선조세포(progenitor)를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (i) 최소 한 개 세포, 적절하게는 두 개 세포를 가지나 치밀한 상실배 단계로 발생되지 않은 배로부터 난할구 세포를 수득하고; 그리고(ii) 난할구의 분화를 유도하여 배아 줄기 세포주의 생성없이 분화된 선조세포를 만드는 단계를 포함한다.
분화된 선조세포를 이용하여 세포, 조직 및/또는 기관 이식 분야에 유익하게 이용되어 세포, 조직 및/또는 기관을 유도할 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 분화된 선조세포를 만드는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (i) 최소 한 개 세포, 적절하게는 두 개 세포를 가지나 치밀한 상실배 단계로 발생되지 않은 배로부터 난할구 세포를 수득하고; (ii) 하나 이상의 세포 응집체를 수득하기 위해 난할구를 배양하고; (iii) 난할구의 분화를 유도하여 배아 줄기 세포주의 생성없이 분화된 선조세포를 만드는 단계를 포함한다.
분화된 선조세포를 이용하여 세포, 조직 및/또는 기관 이식 분야에 유익하게 이용되어 세포, 조직 및/또는 기관을 유도할 수 있을 것이다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성되는 ES 또는 ED 세포를 분화시키는 방법 또한 제공한다. ES 또는 ED 세포는 중배엽, 내배엽 및 외배엽 기원의 세포 타입을 포함하는 임의 세포 타입으로 분화될 수 있을 것이다. 예를 들면, 난할구를 ES 또는 ED 세포의 분화를 유도하는 인자들과 배양시킬 수 있다. 한 구체예에서, 난할구는 FGF-4 존재하에 배양한다. 일부 구체예에서, 난할구로부터 유도된 ES 또는 ED 세포를 분화안된 세포주로써 미분화된 ES 세포를 전달하는 중간 단계없이 원하는 세포 또는 조직 타입으로 직접적으로 분화된다.
배로부터 수득된 난할구를 분화된 세포 타입 예를 들면 난할구로부터 ES 세포를 먼저 만들지 않고 중배엽, 내배엽 또는 외배엽으로 분화시키는 방법도 고려할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 만들어진 ES 또는 ED 세포, ES 세포로부터 유도된 ES 세포주, ED 세포로부터 유도된 ED 세포주 뿐만 아니라 ES 또는 ED 세포 또는 세포주로부터 유도된 분화된 세포들도 포함한다.
본 발명에서 제공하는 ES 또는 ED 세포 또는 ES 또는 ED세포로부터 유도된 세포들은 세포 치료를 받을 수 있는 질환의 치료에 유용하다. 이와 같은 세포와 제약학적으로 수용가능한 매체 또는 캐리어를 포함하는 약학 조성물도 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 만들어진 TS 세포는 TS 세포 마커 예를 들면, 섬유모 세포 생장 인자 수용체 2 (fgfr2), 태반 락토겐 1 (PL-I) 및 에오메조데르민(eomesodermin)(mEomes)을 발현시킬 수 있다. TS 세포는 또한 Oct-4 또는 α-페토단백질의 발현이 부족하다.
TS 세포를 또한 배양하여 TS 세포 또는 분화된 세포주를 만들 수 있다.
본 발명은 또한 배로부터 난할구를 분리하는 신규한 방법을 제공한다.
이 방법은 배를 고정시키고, 고정된 배를 난할구가 분리될 때까지 태핑하는 단계를 포함한다. 배는 당분야의 당업자에 공지된 임의 수단을 이용하여 고정시킬 수 있을 것이다. 한 구체예에서, 배는 마이크로피펫을 이용하여 고정시키고, 마이크로피펫 홀더를 태핑하여 난할구를 분리시킨다. 다른 구체예에서, 배는 칼슘 및 마그네슘이 없는 배지에서 배양시킨다. 배는 2-세포 내지 16 세포 단계가 될 수 있다. 한 구체예에서, 배는 4세포 단계 내지 10 세포 단계이다. 다른 구체예에서 배는 6-8세포 단계 배이다. 또 다른 구체예에서, 배는 8-10 세포 단계 배이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 치료를 요하는 환자의 상태를 치료하기 위한 약물 제조에 상기에서 설명하는 세포 배양물을 이용하는 용도를 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 치료를 요하는 환자의 상태를 치료하기 위한 약물 제조에 상기에서 설명하는 약학 준비물을 이용하는 용도를 제공한다.
상기 설명한 특정 구체예에서, 난할구는 포유류 배로부터 수득된다. 예시적인 포유류 배에는 생쥐, 들쥐, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 사람이 아닌 영장류들의 배 그리고 사람 배를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 상기 전술한 특정 구체예에서, 난할구는 사람 배로부터 수득되며, 이 방법은 ES 세포, ES 세포주, TS 세포, TS 세포주, ED 세포 또는 이들의 부분적으로 또는 분화 종료된 세포 타입을 만드는 것을 포함한다.
상기 전술한 특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배아 또는 태아 세포와 직간접적으로 접촉시킬 수 있다. 특정 다른 구체예에서, 배아 또는 태아 세포는 난할구와 동일한 종이 된다. 특정 구체예에서, 배아 또는 태아 세포는 사람 세포이다. 이용된 특정 배아 또는 태아 세포와 관계없이, 세포들은 영양공급세포층(feeder layers) 존부하에 생장될 수 있다.
특정 구체예에서, 배아 또는 태아 세포와의 접촉이 필수적인 것은 아니다. 특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 생존 및/또는 성숙을 촉진시키는데 충분한 하나 또는 그 이상의 인자들 존재하에 배양하여 난할구로부터 ES 세포, TS 세포 및/또는 ED 세포들이 만들어질 수 있다.
본 발명은 배로부터 수득된 난할구로부터 ES 세포, TS 세포 및/또는 ED 세포를 생산하는 다양한 방법들을 고려한다. 특정 구체예에서, 배양물은 세포 타입의 복합물을 만든다. 원하는 경우 배양물에서 하나 또는 그 이상의 특정 세포 타입을 분리할 수 있고, 추가로 실질적으로 정제된 세포 또는 세포주 집단을 만들기 위해 추가 배양한다.
본 발명은 전술한 또는 다음의 특징과 본 발명의 구체예의 복합을 고려한다.
도 1A는 단일 사람의 난할구의 생검을 보여준다. 도 1B-C는 GFP-포지티브 사 람 배아줄기(hES) 세포의 콜로니에 근접한 난할구 유도된 파생물(화살표)을 나타낸다. 도 1D는 hES 세포 콜리니의 형태를 보여준다. 도 1E 는 hES 세포에서 Oct-4 착색을 보여준다. 도 1F-H 는 미발달 내배엽(α-페토 단백질, 도 1F), 중배엽(평활근 악틴, 도 1G), 외배엽(튜블린 β III, 도 1H)의 분자 마커 면역형광 분석을 나타낸다(Scale bar: 도 1A: 50㎛ 도 1B-H는 200㎛).
도 2(a)는 단일 난할구의 생검을 보여준다; 2(b)는 난할구-생검된 배가 부화된 포배기(hatching 배반포)로의 발생을 보여준다; 2(c) 및 (d)에서는 GFP-포지티브 hES 세포의 콜로니에 근접한 난할구 유도된 파생물을 보여준다; 2(e)는 난할구 유도된 hES 세포 콜로니의 형태를 보여준다.
도 3에서는 단일 난할구로부터 유도된 사람 ES세포의 특징화 결과를 보여준다. 도 3(a) 내지 3(g)에서는 만능분화능의 분자 마커의 면역형광 착색을 보여준다: (a) Oct-4 및 이에 상응하는 DAPI 착색 (b), (c)TRA-l-60, (d) TRA- 1-81, (e) SSEA-3, (f) SSEA-4, (g) 알칼리 포스파타제 (Scale bar, 200㎛). 도 3(h)에서는 두 개의 단일-난할구 유도된 hES 세포주(MAOl 및 MA09)의 크로모좀 스프레드를 나타낸다.
도 4는 단일 난할구-유도된 사람 ES 세포가 세가지 생식 층으로의 in vitro 분화를 보여준다. 도 4(a)에서는 7주간 NOD-SCID 생쥐의 신장 캡슐하에 사람 ES 세포의 이식후 기형종(teratoma) 형성을 보여준다. 삽입체는 인접 부분에서 확대하여 보여주는데; 좌측, Nestin으로 착색된 신경 조직(외배엽); 중앙, 알파 평활근 악틴(중배엽); 우측 cdx2로 착색된 내장(내배엽)으로 세가지 생식 층이 모두 존재 하는 것을 확인함. 도 4(b) 내지 4(d)에서는 (b) 외배엽 (튜블린 β III), (c) 중배엽(평활근 악틴), 그리고 (d) 원시(primitive) 내배엽 (α-페토 단백질)의 분자 마커의 면역형광 분석을 나타낸다. 도 4(e) 내지 (i)는 단일 난할구-유도된 사람 ES 세포가 in vitro에서 특정 치료 관심이 되는 세포로의 분화 결과를 나타낸다; (e) Matrigel상에 도말시킨 내피 세포가 모세관과 같은 전형적인 구조를 형성하는 것을 보여준다; (f) 내피 세포에 의한 Ac-LDL 취입, (g) 및 (h)는 망막색소상피(retinal pigment epithelium (RPE))에서 착색된 표현형과 전형적인 “조약돌(cobblestone)” 모양을 보여주고(g), 베스트로핀 착색(h)을 보여준다. 도 4(i)에서는 RT-PCR의 결과를 나타내는데, RPE 세포로 분화된 사람 ES 세포에 PEDF (라인 1 및 2)와 RPE65 (라인 3 및 4)이 존재한다는 것을 확인시켜준다 (라인 1 및 3: hES-유도된 RPE 세포; 라인 2 및 4: 태아 RPE 대조군).
도 5는 단일 난할구-유도된 사람 ES 세포주(MAOl 및 MA09)와 공동 배양에 이용된 세포주(WA01)의 마이크로세틀라이트(microsatellite)와 PCR 분석을 나타낸다. 도 5(a), (b), (c)는 각각 마엘로게닌, SRY, eGFP의 존재를 감지하기 위한 PCR결과를 나타낸 것이다. 도 5(d)는 마이크로세틀라이트(microsatellite) 분석 결과를 나타낸다.
도 6 (a-i)에서는 난할구의 hES 세포주로의 유도없이 분리된 난할구로부터 기진된 배-유도된 직접 분화된 세포의 상이한 형태들의 사진을 나타낸 것이다.
도 7에서는 단일 난할구-유도된 hES 세포주의 만능분화능 표식 발현의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 상부 패널, Oct-4; 중앙 패널, nanog; 아래 패 널, GAPDH. 라인 1, 주형 없음; 라인 2, 네가티브 대조군 (MEFs); 라인 3, MAOl; 라인 4, MA09; 라인 5, WAOl.
도 8에서는 단일-난할구 유도된 RPE의 마커 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 각 겔에서: 라인 1, 네가티브 대조군 (미분화된 hES세포, 라인 WA09); 라인 2, hES 세포로부터 RPE.
분리된 사람 난할구를 유도하여 만능분화능 배아 줄기 세포로 증식시키기 위한 기존 시도들이 성공하지 못하였다(Geber S. et al., Hum. Reprod. 10:1492-1496 (1995)). 본 발명은 여기에서 설명하는 신규한 방법을 이용하여 배의 생존능력에 영향없이, 배로부터 줄기 세포가 생성된다는 발견에 일부 근거한다. 한 구체예에서, 이와 같은 방법들은 배의 파괴없이(배의 파괴가 있는 경우에 생존력이 상당히 변화된다), 배로부터 단일 난할구를 분리하기 위해 착상전 유전자 진단(PGD)에 현재 이용되는 것과 관련된 in vitro 기술을 이용한다. 여기에서 설명하는 것과 같이, 배가 출생을 위한 정상적인 배 발생의 간섭없이, 배로부터 제거한 단일 난할구로부터만능분화능 사람 배아 줄기 (hES) 세포와 세포주를 만들 수 있다.
여기에서 설명하는 방법은 줄기세포 연구 및 발생 생물학 분야에 상당한 발전을 제공할 수 있는 중요한 용도를 가진다. ES 세포, ES 세포주, TS 세포 및세포주, 그리고 이로부터 분화된 세포들을 기초 발생 생물학 연구에 이용할 수 있고, 다수의 질환 및 질병을 치료하는데 치료요법적으로 이용할 수 있다. 또한, 이들 세포들을 이용하여 이들 세포의 생장, 분화, 생존 또는 이동을 조절하는데 이용될 수 있는 인자 및 조건들을 확인하는 스크리닝 검사를 할 수 있다. 확인된 물질들을 이용하여 in vitro 및 in vivo의 세포 거동을 조절하거나 세포 또는 무세포 요법의 기초를 이룰 수 있다.
여기에서 설명하는 본 발명을 충분히 이해하기 위해 다음의 설명을 제시한다.
다른 언급이 없는 한, 여기에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당분야에 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 여기에서 설명하는 것과 등가의 또는 유사한 방법 및 재료를 본 발명의 방법 빛 테스트에 이용할 수 있지만 적절한 방법 및 재료들을 하기에서 설명한다. 재료, 방법 및 실시예는 설명을 목적으로 하는 것이며, 이에 국한시키고자 하는 의도는 아니다.
여기에서 언급하는 공보, 특허, 출원 및 다른 문헌들은 참고문헌으로 첨부된다.
명세서를 통하여 “포함하다(comprises)”또는 “포함하는(comprising)”와 같은 변수는 언급한 수가 포함되는 또는 언급된 정수 또는 정수 군단을 포함하는 것을 의미하며 임의 다른 군 또는 군단을 배제시키는 것은 아니다.
여기에서 언급된 “부정관사 ("a", "an")”는 문법적으로 하나 또는 그 이상을 의미하며, 예를 들면 “한 요소”는 한 개 요소 또는 그 이상의 요소를 의미한다.
“난할구("blastomere")”는 배로부터 수득되는 최소 하나의 난할구(예를 들면, 1, 2, 3, 4 등)을 의미한다. “두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터("cluster of two or more blastomeres")”는 난할구의 in vitro 배양 동안에 생성되는 세포를 말한다. 예를 들면, 배로부터 난할구를 수득하고, 배양한 후에, 이는 일반적으로 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터(일반적으로 난할구 유도된 파생물로 알려짐)를 만들기 위해 최소 1회 분할한다. 클러스터는 배 또는 태아 세포와 함께 추가 배양될 수 있다. 궁극적으로, 난할구-유도된 파생물은 분할을 계속할 수 있다. 이들 구조로부터, ES 세포, TS 세포, 및 부분적으로 분화된 세포 타입은 배양 방법 과정후에도 발달될 수도 있다.
상기에서 요약한 바와 같이, 본 발명은 배의 부득이한 파괴없이, 초기 단계 배의 단일 난할구로부터 ES 세포, ES 세포주, 및 분화된 세포 타입을 유도하는 방법을 제공한다. 이들 방법의 다양한 특징은 하기에서 설명한다.
상기 및 하기에서 설명하는 본 발명의 다양한 측면 및 구체예의 모든 조합도 고려한다.
난할구의 제거
배로부터 착상전 다양한 발생 단계에서 난할구를 제거할 수 있는데, 예를 들면, 상실배의 조밀화전에, 상실배의 조밀화 단계 동안, 상실배의 조밀화 직후, 할강형성 전에 또는 배반포(blastocyst) 단계 동안에 제거할 수 있다. 특정 구체예에서, 난할구(한개 난할구, 두 개 또는 그이상의 난할구)를 배로부터 4-16 세포 단계에서 또는 4-10 세포 단계에서 또는 4-8 세포 단계에서 제거한다.
한 구체예에서, 본 발명은 배아줄기 세포를 만드는 배반포의 생검 방법을 제공하고, 배반포의 나머지는 착상시켜, 임신이 되어 아기가 출생하도록 한다. 이와 같은 예로써, 당분야에 당업자에 공지된 임의 수단으로 배반포로부터 투명대(zona pellucida)를 제거하고, 배반포를 생검한다.
다른 구체예에서, 사람 ES 세포 유도와 연관된 반대 여론은 착상전 유전자 진단(PGD)에서 이용되는 것(이때, 단일 난할구를 배로부터 제거함)과 유사한 기술을 이용하여 회피한다. 한 구체예에서, 단일 난할구를 상실배 조밀화전에 제거한다. 생검된 난할구는 세포 분할을 하고, 하나의 후손 세포는 유전자 테스트에 이용하고 나머지 세포를 이용하여 사람 줄기 세포를 만든다. 생검된 배아를 배반포 단계에서 착상시키거나 또는 나중에 착상을 위해 냉동할 수도 있다.
특정 구체예에서, 생검(예를 들면 배로부터 난할구의 제거)은 두 단계로 구성된다. 첫째는 배를 에워싸는 투명대에 구멍을 만들거나 일부 경우에 완전히 제거한다. 일단 구멍이 만들어지면, 세포(적절하게는 하나 또는 두 개)를 사람 배로부터 떼어낸다. 특정 적절한 구체예에서, 이 방법은 투명대를 제거하거나 또는 적출(extraction) 구멍을 만들고, 이 방법은 물리적 조작, 화학적 처리 또는 효소적 절단과 같은 하나 또는 그 이상의 기술을 이용하여 실행할 수 있다. 이용될 수 있는 예시적인 기술에는 다음이 포함된다;
● 투명대 부분 절개(Partial zone dissection (PZD)): 마이크로피펫을 이용하여 투명대의 부분적 절개;
● 투명대 천공(Zona drilling): Tyrode 산으로 부분적 처리를 통하여 투명대의 화학적 개방;
● 투명대 천공(Zona drilling): 프로네이즈 또는 다른 프로테아제로 부분적 처리를 통하여 투명대의 효소적 개방;
● 투명대를 얇게 하는 방법: Tyrode 산 또는 레이져를 이용하여 투명대를 얇게 함;
● 레이져를 이용한 투명대의 포인트형 개방;
● Piezo 마이크로조작기를 이용하여 투명대의 포인트형 기계적 개방.
한 구체예를 간략하게 설명하기 위해, 이 과정은 8-10 세포기 배에서 실행한다. 배를 홀딩 피펫으로 고정하여 미네랄 오일하에 생검 배지 드롭에 위치시킨다. 투명대는 산성화된 Tyrode's 용액(Sigma, St. Louis, Mo. 63178)을 보조부화피펫을 통하여 방출하여 국소적으로 분해(digest)한다. 일단 구멍이 만들어지면, 세포(난할구)는 구멍을 통하여 빨아낼 수 있다.
다른 구체예를 설명하기 위해, 배반포의 투명대를 하나 또는 그이상의 효소 또는 프로네이즈와 같은 효소 혼합물로 처리하여 부분적으로 분해시킬 수도 있다. 고유 투명대를 가진 배반포를 간단히 프로네이즈 (Sigma) 처리하면, 투명대가 제거된다. 프로네이즈와 유사한 또는 동일한 프로테아제 활성을 가진 다른 타입의 프로테아제를 이용할 수도 있다.
Ca++/Mg++ 없는 PBS에서 투명대-나화된 배(zona-denuded embryos)를 해체함으로써 단일 난할구를 수득할 수도 있다.
본 발명은 또한 단일 난할구를 분리하는 신규하고 좀더 효과적인 방법을 제공한다. 배를 고정시키고, 고정된 배는 단일 난할구가 배반포로부터 떨어져 나올때까지 태핑시킨다. 이 방법은 사람 배에 국한시키는 것이 아니라 다른 종 예를 들면 사람이 아닌 포유류, 생쥐, 토끼, 돼지, 양, 개 및 영장류를 포함하는 사람이 아닌 배에서도 실행할 수 있다.
배는 당분야에 당업자에 공지된 임의 방법을 이용하여 고정시킬 수 있다. 한 구체예에서, 배는 마이크로피펫을 이용하여 고정시키고, 마이크로피펫 홀더는 태핑시켜 난할구를 분리한다. 다른 구체예에서, 배는 칼슘과 마그네슘이 없는 배지에서 배양한다. 배는 2세포 단계내지 16세포 단계일 수 있다. 한 구체예에서, 배는 4세포기 내지 10세포기이다. 다른 구체예에서, 배는 6-8세포기 배이다. 다른 구체예에서 배는 8-10세포기 배이다. 특정 구체예에서 배의 나머지 생존능을 실질적으로 감소시키지 않으면서 최소 한 개 난할구를 제거하는데 충분한 힘으로 태핑한다. 최소 1일간 나머지 배를 배양하고, 배양물에서 나머지 배가 분할을 지속한다는 것을 확인함으로써 생존능이 유지되는 것을 볼 수 있다.
전술한 방법중 하나를 이용하여 배로부터 난할구(한개 난할구 또는 한 개이상의 난할구)를 얻을 수 있다. 난할구를 제거하는데 특정 방법을 단독으로 이용하거나 다른 방법과 복합하여 이용할 수도 있다.
특정 구체예에서, 배는 포유류 배이다. 특정 구체예에서, 포유류 배는 사람 배이다. 예시적인 포유류에는 쥐, 들쥐, 소, 개, 고양이, 양, 햄스터, 돼지, 사람이 아닌 영장류 및 사람이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
전술한 특정 구체예중에 하나에서, 배의 나머지를 파괴시키지 않고 배로부터 난할구를 떼어낸다. 나머지 배(제거된 난할구를 뺀 배)를 배양하거나 저온 보존할 수 있다. 특정 구체예에서, 나머지 배는 나머지 배가 분할을 계속 할 수 있는지를(여전히 생존하는) 확인하는데 충분한 시간동안 배양하고, 일단 생존력이 확인되면 나머지 배는 저온 보존한다. 특정 구체예에서, 나머지 배는 바로 저온 보존한다.
특정 다른 구체예에서, 다중 난할구를 단일 배로부터 떼어내고, 배는 다중 난할구의 제거동안에 제거후에 배가 파괴된다.
다중 난할구를 한 실험에서 함께 이용할 수 있는데, 예를 들면, 초기 난할구 배양 동안에 다중 난할구를 응집시킴으로써 함께 이용할 수 있다. 또는 다중 난할구를 별도 실험에서 이용하여 단일 배로부터 생성될 수 있는 세포 타입 또는 라인의 수를 최대화시키려는 시도로 이용될 수 있다.
난할구가 유도되는 배는 유성(sexual) 또는 무성(asexual) 방법으로 만들 수 있다. 특정 구체예에서, 배는 난자와 정자가 수정하여 만들어진다. 특정 다른 구체예에서, 배는 체세포 핵 전달, 단성생식(parthenogenesis), 수단위생식(androgenesis) 또는 다른 무성 생식 기술을 이용하여 만든다. 무성 생식 기술에 의해 유도된 배는 수정에 의해 생성된 배와 동일한 모양이 아닐 수도 있다는 것을 알아야 한다. 그러나, 외양의 임의 차이에도 불구하고, 용어 “배(embryo)”에는 무성 생식 산물, 수정 산물 또는 유성 생식의 다른 수단에 의한 산물도 포함된다.
난할구의 배양 및 ES 세포의 생산
배로부터 일단 난할구가 제거되면, 분리된 난할구를 우선 임의 타입의 배지 예를 들면, Quinn's 절단배지(Cooper Surgical Inc. Cat #ART1529)와 같은 배아 배지에서 우선적으로 배양할 수 있다. 배의 생장을 지원하는 임의 배지를 이용할 수 있는데, 임의 시판되는 조제물의 제용을 배제하지 않는다. 여기에서 사용된 바와 같이 용어 “배아 배지("embryo medium")”는 배양물에서 난할구(특히 사람의 난할구)의 생존을 촉진시키는 배지를 말한다. 특정 구체예에서, 배아 배지는 5mM 미만의 포도당을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 삼투몰농도가 310mosm미만을 가지는 배지가 된다. 특정 다른 구체예에서, 배아 배지는 5mM미만의 포도당을 포함하고 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지가 된다. 특정 구체예에서, 초기 난할구를 배양하는데 이용되는 배지는 300mosm 미만, 280mosm 미만, 또는 260mosm 미만의 삼투몰 농도를 가지고, 선택적으로 5mM 미만의 포도당을 포함하는 배지가 된다. 특정 구체예에서, 초기 난할구를 배양하는데 이용되는 배지는 260-28080mosm의 삼투몰 농도를 가지고, 선택적으로 5mM 미만의 포도당을 포함하는 배지가 된다. 난할구의 초기 배양에 이용되는 배지에서 삼투몰농도와 포도당의 특정 농도에 상관없이 배지에는 항생제, 미네랄, 아미노산 및 시판되는 배지 조성물에서 흔히 볼 수 있는 다른 인자들이 보충될 수도 있다.
난할구는 표준 ES 세포 배지에서는 처음에 잘 자라지 않을 수도 있다. 그러나, 여기에서 상세히 설명하는 바와 같이, 난할구가 특정 배 또는 태아 세포 존재하에 배양되거나 또는 1회 또는 그 이상 분할되면, 난할구 클러스터는 ES 세포 배지에서 선택적으로 배양되거나 또는 배아 배지로부터 ES 세포 배지로 배지를 점진적으로 대체하여 서서히 옮길 수는 있을 것이다. 여기에서 사용된 바와 같이 ES 세포 배지는 배양물에서 ES 세포 유지를 촉진시키는 배지를 말하고, 이를 이용하여 난할구 클러스터를 배양할 수도 있는데, 그 이유는 이들은 분할을 계속하여 ES 세포, ED 세포 등을 만들기 때문이다. 이와 같은 배지는 최소한 ES 세포에 대해 최적화된 것이다. 특정 구체예에서, ES 세포 배지에는 최소 5mM 포도당(상대적으로 높은 농도의 포도당)이 포함된다. 특정 다른 구체예에서, ES 세포 배지는 최소 310mosm의 삼투몰농도를 가진다. 특정 다른 구체예에서, 배지에는 최소 5 mM 포도당 및 최소 310mosm 삼투몰농도를 가진다. 특정 구체예에서, 이와 같은 배지는 최소 320mosm의 삼투몰농도, 또는 최소 330mosm의 삼투몰농도를 가지고 선택적으로 최소 5mM 포도당을 포함한다. 특정 구체예에서 배지는 약 310-340mosm 삼투몰농도을 가지고, 선택적으로 최소 5 mM 포도당을 포함한다. ES 세포 배지에는 ES 세포 생장을 촉진시키는 당분야에 공지된 인자들이 보충될 수 있는데, 배지에는 항생제, 미네랄, 아미노산 및 시판되는 배지 조성물에서 흔히 볼 수 있는 다른 인자들이 포함될 수 있다.
특정 구체예에서, 사람 또는 다른 포유류 배로부터 난할구를 수득하고 배아 배지에서 배양시킨다. 바람직하게는 난할구는 최소 1일간 또는 난할구가 최소 1회 분할될 때까지 배아 배지에서 배양시킨다. 그러나, 난할구를 1일이상(최소 2, 3, 4일 등) 배아 배지에서 배양시킬 수도 있고/또는 난할구는 난할구 클러스터로 분할되기 전까지 배 또는 태아 세포와 접촉시키면서 배양시킬 수도 있다. 배아 배지에서 배양될 때 난할구는 1회 또는 그이상 분할하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만들 수 있다. 난할구 클러스터의 배양에는 난할구와 이의 후손과 함께 배양하는 것이 포함된다. 특정 구체예에서 난할구가 분할되고, 후손은 응집체로 배양된다.
한 구체예에서, 난할구는 마이크로드롭에서 배양될 수 있다. 각 마이크로드롭에는 단일 난할구 또는 다중 난할구를 포함할 수 있다. 최소 약 1일 후에, 최소 2-3일후에, 또는 최소 4일 후에 배양된 난할구가 분할하여 소포 또는 응집체를 형성한다. 배아 세포와 직간접적으로 접촉하기 전에 난할구의 배양 잇점은 배아 세포가 난할구로 과도 생장하는 것을 방지하는 것이다.
난할구를 우선적으로 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만든 후에, 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터는 배 또는 태아 세포와 직간접적으로 접촉하거나 또는 배 또는 태아 세포 없이 난할구 성숙을 추가 촉진시키는 배지와 직간접적으로 접촉한다. 이와 같은 배지에는 배 또는 태아 세포로 조건화된 배지 또는 난할구 성숙을 촉진시키는 생장인자 또는 사이토킨이 보충된 배지를 포함한다. 특정 구체예에서 배지에는 ACTH(아드네로코르티코트로픽 호르몬: adrenocorticotropic hormone)이 보충된다.
배 또는 태아 세포와 직간접적으로 배양물의 구체예를 위해, 포유류로부터 배 또는 태아 세포가 유도될 수도 있다. 특정 구체예에서, 배 또는 태아 세포는 생쥐 또는 사람 세포이다. 예시적인 배 또는 태아 세포에는 배아 줄기(ES) 세포(배반포, 난할구에서 유도되거나 또는 다른 방법에 의해 유도된, 그리고 체세포 핵 전달 또는 다른 무성 생식을 이용하여 유도된), 배아 생식 세포, 배아 육종 세포, 태반 세포, 영양세포/영양막배엽(trophectoderm) 세포, 영양 줄기 세포, 근원(primordial) 생식 세포, 배아 생식 세포, 양수 세포, 양막 줄기 세포, 태반 세포, 태반 줄기 세포, 그리고 탯줄 세포를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 배 또는 태아 세포와 직간접적으로 난할구가 접촉하는 특정 구체예에서, 난할구를 배양하는 배지에는 ACTH 또는 난할구의 성숙을 촉진시키는 다른 생장 인자 또는 사이토킨이 추가 보충된다.
이용하였을 때, 배 또는 태아 세포는 세포의 영양공급층 존부하에 생장할 수 있다. 영양공급 세포를 이용하여 배 또는 태아 세포의 유지를 도와주고 이들의 분화를 방지할 수도 있다. 특정 영양공급 세포는 이용되는 특정 배 또는 태아 세포에 근거하여 선택될 수 있다. 예시적인 영양공급세포에는 섬유모세포 영양공급세포가 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 섬유모세포 영양공급세포는 배 또는 태아 세포와 동일한 종에서 유도되거나 또는 상이한 종에서 유도될 수 있다. 유사하게, 영양공급세포 및 배 또는 태아 세포는 난할구와 동일한 종에서 유도되거나 상이한 종에서 유도될 수 있다. 특정 구체예에서, 영양공급세포에 조사(irradiated)하거나 다른 조치를 하여 배 또는 태아 세포에 대해 상대적으로 과다 생장을 하지 못하도록 한다. 예시적인 영양공급세포에는 생쥐 배아 섬유모세포(mouse embryonic fibroblasts:MEF), 사람 배아 섬유모세포, 사람 포피 섬유모세포, 사람 피부 섬유모세포, 사람 자궁내막(endometrial) 섬유모세포, 사람 난관( oviductal) 섬유모세포, 태반 세포가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 다른 동물(포유류, 닭에서 유도된 유사한 세포 타입도 고려할 수 있다.
한 구체예에서, 영양공급세포 및/또는 배아 세포는 난할구와 동일한 배에서 유도된 자가 세포인 사람 세포가 된다.
배 또는 태아 세포는 ES 배지 또는 배 또는 태아 세포의 생장을 지원하는 임의 배지 예를 들면, Knockout DMEM (Invitrogen Cat # 10829-018)에서 생장시킬 수 있다.
예시적인 배 또는 태아 세포에는 배아 줄기 세포 예를 들면, 이미 확립된 라인에서 유도된 배아 줄기 세포, 배아 암종 세포, 뮤린 배아 섬유모세포, 다른 배유사 세포, 배아 기원의 세포 또는 배로부터 유도된 세포들이 포함되나 이에 국한시키지 않으며, 이들중 많은 것들이 당분야에 공지되어 있으며, American Type Culture Collection, Manassas, VA 201 10-2209, USA, 및 다른 기관으로부터 구할 수 있는 것들이다.
배 또는 태아 세포를 배양된 난할구에 바로 첨가하거나 또는 배양된 난할구에 직접 접촉하지는 않지만 근접하게 생장시킬 수 있다. 다양한 직간접 공동 배양 시스템으로 배 또는 태아 세포로부터 시그날 또는 인자들을 배양된 난할구에 제공하는 것이 가능하다. 여기에서 사용된 것과 같이 “배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 접촉”은 직접 또는 간접 또는 공동 배양의 임의 방법을 말한다.
특정 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포의 접촉은 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포를 응집시키는 것을 포함한다. 다른 특정 구체에에서, 접촉은 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 공동 배양시켜 세포가 배 또는 태아 세포와 직접 접촉하여 응집되지 않도록 하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 접촉은 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터와 배 또는 태아 세포의 공동 배양으로 세포들이 동일한 배양 용기에서 유지되나 세포의 직접적인 접촉없이 유지되도록 하거나 접촉 마이크로드롭으로 유지된다.
특정 구체예에서, 이 방법은 Chung et al., Nature (2006) 439:216-9에서 설명하는 것과 같이 배양된 난할구와 배아 세포의 응집에 의해 접촉되지는 않는다는 전제하에 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터가 배 또는 태아 세포와 직간접적으로 접촉하는 단계를 포함한다. 또는 난할구 배양물과 배 또는 태아 세포 배양물을 간접적으로 연결하거나 합친다. 이 방법은 당분야에 공지의 방법을 이용하면 되는데 예를 들면, Cooper Surgical ACT# ART4008, 파라핀 오일 또는 Squibb's 오일과 같은 가벼운 미네랄 오일하에 두 개 드롭간에 피펫 조작으로 드래그하면 된다. 이와 같은 연결은 유리 모세관 또는 유사한 도구를 이용하면 가능하다. 배양된 난할구와 배아세포간에 간접 연결로 배아 배지(난할구가 배양된)와 ES 세포 배지(사람 배아 세포아 생장된)가 점진적으로 혼합되게 된다. 다른 구체예에서, 난할구를 나머지 배와 공동 배양할 수도 있다. 예를 들면, 난할구를 마이크로드롭 배양 시스템 또는 당분야에 공지된 다른 배양 시스템에서 나머지 배와 공동 배양하면, 세포-세포 접촉은 허용하지 않으나 세포-분비된 인자 또는 세포 매트릭스 접촉은 허용할 수 있다. 마이크로드롭의 용적이 감소될 수도 있는데 예를 들면 50㎕에서 약 5㎕로 감소되어 시그날이 강화된다. 다른 구체예에서 배 세포는 사람이외의 다른 종 예를 들면, 사람이 아닌 영장류 또는 생쥐가 될 수 있다.
특정 구체예에서, 난할구, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터, 그리고 배 또는 태아 세포를 배양하는데 이용되는 특정 배지 조성물은 종에 따라 약간씩 변화될 수 있다. 추가로, 난할구 클러스터 또는 배아 세포를 배양하는데 이용된 것과는 상이한 배지 조성물로부터 얻는 초기 난할구 배양물 잇점이 있는지는 종에 따라 약간씩 달라질 수도 있다.
특정 구체예에서, 난할구를 별도 배양하는데 이용되는 배지와 배 또는 태아 세포를 배양하는데 이용되는 배지가 반드시 동일할 필요는 없다. 배지가 상이한 구체예에서, 난할구가 처음으로 배양된 배지와 상이한 배지에 난할구 또는 난할구 클러스터가 처음 노출되는 기간이 있다(예를 들면 세포는 배 또는 태아 세포가 배양되는 배지에 서서히 노출될 것이다). 이와 같은 구체예에서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터(현재 여러차례 분할되어 세포와 세포 파생물 클러스터가 만들어짐)는 점진적으로(배지 교환을 통하여) 이동되어 ES 세포 배지 성질을 가지는 배지에서 배양될 것이다.
약 3-4일후에, 난할구는 ES 세포 성질을 보인다. 특히, 세포가 지속적으로 분할하고 난할구 후손 클러스터를 생성하기 때문에, 다양한 세포 타입이 출현하고 표현형에 따라 동정할 수 있을 것이다. 출현된 세포 타입들중에서, 영양막배엽 유사 세포, ES 세포 및 부분적으로 또는 최종적으로 분화된 ED세포가 있다. 이와 같이 이러한 방법등을 이용하여 ES 세포, TS 또는 다른 영양막배엽 세포, 또는 ED 세포를 만들 수 있다. 특정 이론에 국한시키고자 함은 아니지만, 수일 또는 수주일에 걸쳐, 배 또는 태아 세포에 의해 분비되는 인자 또는 세포외 매트릭스에 의해 분비되는 인자로 인하여 배양된 난할구는 ES 세포 생장을 보이는 것으로 간주된다. 추가로, 일부 측면에서 난할구 자손의 분할 클러스터는 착상전 배반포 발생동안에 관찰되는 변화를 닮는다. 그러한 것으로 이들 배양동안에 출현하는 세포 타입을 전체 배반포 또는 ICM을 도말하였을 때 관찰되는 세포 타입으로 어느 정도 반복된다(recapitulate).
특정 구체예에서, 난할구 배양 조건에는 세포의 분화를 강화하거나 저해할 수 있는 인자들을 세포에 접촉하여 예를 들면, 세포를 비-ES 세포, 영양막배엽 또는 다른 세포 타입으로의 분화를 방지하는 것이 포함될 수 있다. 이와 같은 조건에는 헤파린을 배양된 세포와 접촉시키거나 세포로 Oct-4를 도입시키거나(배지에 Oct-4를 포함시켜) 또는 세포에서 내생 Oct-4를 활성화시키는 것들이 포함된다. 다른 구체예에서, 당분야에 공지된 임의 수단 예를 들면 CDX-2 RANi를 난할구에 도입시켜 난할구가 TS 세포로의 분화를 저해시키는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는 수단으로 cdx-2의 발현을 막는다.
상기에서 상세하게 설명한 것과 같이 본 발명은 배로부터 수득된 난할구에서 ES 세포, ED 세포, TS 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 이와 같은 방법을 이용하여 난할구를 얻는 배를 파괴시키지 않고 ES 세포, ED 세포, TS 세포 및 세포주를 생산할 수 있을 것이다.
난할구의 배양 및 ED 세포 생산
과거에, 내부 세포 물질의 장기 배양을 이용하여 배아 줄기 세포주를 만들었다. 연속적으로, 배아 줄기 세포를 배양하고 조건적으로 유전적으로 변형시키고 그기고 분화를 유도하여 치료용 세포를 만들었다. US 특허 출원 No. 11/025,893 (US 2005/0265976A1로 공개됨)에서는 배아 줄기 세포주의 생산없이 세포의 분화를 직접적으로 유도함으로써 내부 세포 물질 세포 또는 상실배-유도된 세포로부터 분화된 선조세포를 생산하고, 이러한 분화된 세포, 조직 기관을 이식 치료에 이용하는 것에 대해 설명한다. 이들 세포는 ES 세포주가 아닌 배의 세포에서 유도되었기 때문에 이러한 세포를 배유도(ED)된 세포라고 한다. 난할구-유도된 ED 세포는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 만들어진 사람의 ES 세포보다 더 광범위한 분화 포텐셜을 가진다. 그 이유는 ED 세포는 당분야에 공지 기술 예를 들면 뮤린 ES 세포주를 생식 라인 세포로 분화시키는 방법을 이용하여 생식-라인 세포로 바로 분화될 수 있기 때문이다. 대조적으로, 내부 물질 세포에서 유도된 사람 ES 세포주는 생식-라인 세포로 분화될 수 있을 것으로 예측하지 않는다. 이와 같은 현상은 돼지, 소, 닭, 들쥐와 같은 동물에서 내부 물질 세포에서 유도된 ES 세포에서 관찰된 것들이고, 생식-라인은 분화시에 분기되는 처음 세포 계통중에 하나라는 사실 때문일 것이다.
본 발명의 방법중 일부에서 배가 상실배 조밀화 발생 단계로 진입하기 전에 최소 두 개 세포를 가진 배로부터 난할구를 유도하여 분화된 선조세포로 직접적으로 분화시켜 세포 요법 및 이식을 위한 세포, 조직 및 기관의 생성에 이용된다. 원하는 경우, 유전적 변형을 유도하여 예를 들면 상실배 또는 배반포를 생산하기 위해 핵 전달 전에 체세포로 유전적 변형을 도입시키거나 또는 체세포를 재프로그램할 수 있는 인자들과 체세포의 DNA의 병렬 배치를 통하여 미분화된 세포로 체세포의 재프로그램전에 체세포로 유전적 변형을 도입시키거나 이들 방법에의해 만들어진 ES 세포주로 유전적 변형을 도입시킨다. [US 특허 출원 No. 10/831,599 (US 2004199935로 공개됨), PCT/US06/30632 August 3, 2006, 및 US 예비 특허 출원 Nos. 60/705,625, 60/729,173 및 60/818,813 참고. 참고문헌으로 전문 첨부됨.] 따라서, 본 발명의 분화된 선조세포는 배아 줄기 세포의 만능분화능 또는 배아 세포의 만능분화능을 소유하지 않고, 기본적으로 조직-특이적 부분적으로 또는 완전하게 분화된 세포들이다. 이와 같은 분화된 선조세포는 세 가지 배아 생식 층 예를 들면 내배엽, 중배엽 및 외배엽중의 임의에서 세포를 발생시킨다. 예를 들면, 분화된 선조 세포는 뼈, 연골, 평활근, 유전자 발현에서 태아기 패턴을 가지고 있어 반흔없는 상처 치료를 촉진할 수 있는 피부, 조혈 또는 혈액모세포(중배엽), 완성내배엽(definitive endoderm), 간, 원시장관(primitive gut), 췌장 베타 세포 그리고 호흡기 상피(내배엽); 뉴우런, 신경교 세포, 모낭 또는 망막 뉴우런 및 망악 색소 상피를 포함하는 눈 세포로 분화될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 분화된 선조 세포는 텔로메라제의 촉매 성분(TERT)를 발현시킬 필요가 없고, 불사화될 필요도 없으며 또한 선조세포는 영장류 배아 줄기 세포의 세포 표면 마커: [SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 알칼리 포스파타제 활성에 포지티브; SSEA-I에 네가티브.]와 같은 배아 줄기 세포에서 볼 수 있는 세포 표면 마크를 발현시킬 필요가 없다. 또한 본 발명의 분화된 선조세포는 배상체(embryoid body)와는 구별되는데, 예를 들면 배상체는 배아 줄기 세포에서 유도된 것이며, 본 발명의 분화된 줄기 세포는 난할구로부터 유도된 것이다.
바람직하게는 본 발명의 분화된 세포는 배아 줄기 세포없이 난할구-유도된 세포를 배양하여 만든다. 분화 유도 물질 존재하여 난할구를 배양하거나 세포로 유전자 변형을 유도하여 배아 줄기 세포의 생장을 막음으로써 미분화된 배아 줄기 세포의 생장을 막을 수 있다.
발생에서 포유류 난할구에 등가의 난할구 또는 세포 소스로 임의 척추동물 배를 이용할 수도 있을 것이다. 특히, 사람 난할구는 사람 세포 근거한 치료법 생성에 중요한 용도를 가진다. 시험관(in vitro) 수정에 의해 고유 배를 만들 수 있었을 것이고, 정상적인 유성 생식에 의해 생식 기관내에 수정, 인공 수정, 또는 배우자 난관내 이식법(gamete intrafallopian transfer: GIFT) 및 체세포 핵 전달에 의해 고유 배를 유도할 수 있을 것이다.
분화
여기에서 이미 난할구를 분리시키는 방법에 대해 설명하였다. 특정 원하는 분화된 세포 타입을 만드는데 유용한 것으로 공지된(하기 특허 목록 참고) 생장 인자, 혈청, 호르몬, 세포외 매트릭스등의 다양한 복합을 포함한 분화-유도 조건하에 ES 세포 또는 세포주를 통하여 또는 직접적으로 분리된 난할구를 분화되도록 유도할 수 있다.(표 1의 예시 분자 리스트 참고) [PCT/US2006/0 13573 April 11, 2006, US Application No. 60/835,779, August 3, 2006, 60/792,224 April 14, 2006, 60/801,993 May 19, 2006, PCT/US2006/013519 April 11, 2006, US 출원 No. 11/025,893 (US 20050265976), WO2005/070011 August 4, 2005, WO 2006/080952 August 3, 2006 공개]-참고문헌은 전문 첨부된다. 예를 들면 세포의 단일 세포 유도된 집단으로 분리된 것과 같은 다양한 유도 세포 타입상에서 난할구 또는 ES 세포를 배양할 수도 있고, 또는 하기 표 1에서 보여주는 인자와 같은 특정 세포외 매트릭스 성분 및 분화 유도 인자 또는 이들의 복합하에서 배양할 수도 있다.
Figure 112008083268379-pct00001
EGF R/ErbB 수용체 패밀리
15) EGF 수용체
16) ErbB2
17) ErbB3
18) ErbB4
19) EGF/ErbB 수용체 모음 (상기 15-18)
FGF 리간드
20) FGF 산성
21) FGF 염기성
22) FGF-3
23) FGF-4
24) FGF-5
25) FGF-6
26) KGF/FGF-7
27) FGF-8
28) FGF-9
29) FGF-10
30) FGF-11
31) FGF-12
32) FGF-13
33) FGF-14
34) FGF-15
35) FGF-16
36) FGF-17
37) FGF-18
38) FGF-19
39) FGF-20
40) FGF-21
41) FGF-22
42) FGF-23
43) FGF 리간드 모음 (상기 20-38)
FGF 수용체
40) FGF R1
41) FGF R2
42) FGF R3
43) FGF R4
44) FGF R5
45) FGF 수용체 모음 (상기 40-44)
FGF 조절물질
46) FGF-BP
Hedgehogs
47) Desert Hedgehog
48) Sonic Hedgehog
49) Indian Hedgehog
50) Hedgehogs 모음(상기 47-49 )
Hedgehog 조절물질
51) Gas1
52) Hip
53) Hedgehog 조절물질 모음 (상기 51-52)
IGF 리간드
54) IGF-I
55) IGF-II
56) IGF 리간드 모음 (상기 54-55)
IGF-I 수용체 (CD221)
57) IGF-I R
GF 결합 단백질 (IGFBP) 패밀리
58) ALS
59) IGFBP-4
60) CTGF/CCN2
61) IGFBP-5
62) Endocan
63) IGFBP-6
64) IGFBP-1
65) IGFBP-rpl/IGFBP-7
66) IGFBP-2
67) NOV/CCN3
68) IGFBP-3
69) GF 결합 단백질 패밀리 모음(상기 58-68)
수용체 티로신 카이나제
70) Axl
71) ClqR1/CD93
72) DDR1
73) Flt-3
74) DDR2
75) HGF R
76) Dtk
77) IGF-II R
78) Eph
79) 인슈린 R/CD220
80) EphA1
81) M-CSF R
82) EphA2
83) Mer
84) EphA3
85) MSP R/Ron
86) EphA4
87) MuSK
88) EphA5
89) PDGF R 알파
90) EphA6
91) PDGF R 베타
92) EphA7
93) Ret
94) EphA8
95) ROR1
96) EphB1
97) ROR2
98) EphB2
99) SCF R/c-kit
100) EphB3
101) Tie-1
102) EphB4
103) Tie-2
104) EphB6
105) TrkA
106) TrkB
107) TrkC
108) VEGF R1/Flt-1
109) VEGF R2/Flt-1
110) VEGF R3/Flt-4
111) 수용체 티로신 카이나제 모음 (상기 70-110)
프로테오글리칸(Proteoglycans)
112) 어그리칸(Aggrecan)
113) 루미칸(Lumican)
114) 비글리칸(Biglycan)
115) 미메칸(Mimecan)
116) 데코른(Decorn)
117) NG2/MCSP
118) 엔도칸(Endocan)
119) 오스테오어드헤린(Osteoadherin)
120) 엔도레펠린(Endorepellin)
121) Syndecan-1/CD138
122) 글리피칸(Glypican) 2
123) 신데칸(Syndecan)-3
124) 글리파칸(Glypican) 3
125) 테스티칸(Testican) 1/SPOCK1
126) 글리피칸(Glypican) 5
127) 테스티칸(Testican) 2/SPOCK2
128) 글리피칸(Glypican) 6
129) 테스티칸(Testican) 3/SPOCK3
130) 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(Heparan sulfate proteoglycan)
131) 헤파린
132)콘드로이틴설페이트 프로테오글리칸(Chondroitin sulfate proteoglycan)
133) 히알루론산
134) 데마탄 설페이트 프로테오글리칸(Dematan sulfate proteoglycan)
프로테오글리칸 조절물질
135) 아릴설파타제(Arylsulfatase) A/ARSA
136) HAPLN1
137) 엑소스토신(Exostosin)-like 2
138) HS6ST2
139) 엑소스토신(Exostosin)-like 3
140) IDS
141) 프로테오글리칸 조절물질 모음(상기 135-140)
SCF, Flt-3 리간드 & M-CSF
142) Flt-3
143) M-CSF R
144) Flt-3 리간드
145) SCF
146) M-CSF
147) SCR F/c-kit
148) 인자 모음(상기 142-147)
악티빈(Activins)
149) 악티빈 A
150) 악티빈 B
151) 악티빈 AB
152) 악티빈 C
153) 악티빈 모음(상기 149-152)
BMPs(뼈 형성 단백질: Bone Morphogenetic Proteins)
154) BMP-2
155) BMP-3
156) BMP-3b/GDF-10
157) BMP-4
158) BMP-5
159) BMP-6
160) BMP-7
161) BMP-8
162) 데카펜타플레지(Decapentaplegic)
163) BMPs 모음(상기 154-162)
GDFs(생장 분화 인자:Growth Differentiation Factors)
164) GDF-1
165) GDF-2
166) GDF-3
167) GDF-4
168) GDF-5
169) GDF-6
170) GDF-7
171) GDF-8
172) GDF-9
173) GDF-10
174) GDF-11
175) GDF-12
176) GDF-13
177) GDF-14
178) GDF-15
179) GDFs 모음 (상기 164-178)
GDNF 패밀리 리간드
180) 아르테민(Artemin)
181) 뉴루투린(Neurturin)
182) GDNF
183) 페르세핀(Persephin)
184) GDNF 리간드모음 (상기 180-183)
TGF-베타
185) TGF-베타
186) TGF-베타 1
187) TGF-베타 1.2
188) TGF-베타 2
189) TGF-베타 3
190) TGF-베타 4
191) TGF-베타 5
192) LAP (TGF-bata 1)
193) Latent TGF-베타 1
194) TGF-베타 모음(상기 185-193)
기타 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드
195) Lefty
196) Nodal
197) MIS/AMH
198) 기타 TGF-베타 리간드 모음(상기 195-197)
TGF-베타 슈퍼패밀리 수용체
199) 악티빈 RIA/ALK-2
200) GFR 알파-1
201) 악티빈 RIB/ALK-4
202) GFR 알파-2
203) 악티빈 RIIA
204) GFR 알파-3
205) 악티빈 RIIB
206) GFR 알파-4
207) AKL-1
208) MIS RII
209) ALK-7
210) Ret
211) BMPR-IA/ALK-3
212) TGF-베타 RI/ALK-5
213) BMPR-IB/ALK-6
214) TGF-베타 RII
215) BMPR-II
216) TGF-베타 RIIb
217) 엔도글린(Endoglin)/CD105
218) TGF-베타 RIII
219) TGF-베타 패밀리 수용체 모음 (상기 199-219)
TGF-베타 슈퍼패밀리 조절물질
220) 암니온레스(Amnionless)
221) GASP-2/WFIKKN
222) 그레멜린(Gremlin)
224) 카론테(Caronte)
225) NCAM-1/CD56
226) 세르베루스(Cerberus) 1
227) 노긴(Noggin)
228) 크로딘(Chordin)
229) PRDC
230) 크로딘-Like 1
231) 크로딘-Like 2
232) Smad1
233) Smad4
234) Smad5
235) Smad7
236) Smad8
237) CRIM1
238) 크립토(Cripto)
239) Crossveinless-2
240) Cryptic
241) SOST
242) DNA
243) Latent TGF-베타 bp1
244) TMEFF1/Tomoregulin-1
245) FLRG
246) TMEFF2
247) 폴리스타틴(Follistatin)
248) TSG
249) 폴리스타틴-like 1
250) 바조린(Vasorin)
251) GASP-1/WFIKKNRP
252) TGF 조절물질 모음 (상기 220-251)
VEGF/PDGF 패밀리
253) 뉴로필린(Neuropilin)-1
254) PIGF
255) PIGF-2
256) 뉴로필린-2
257) PDGF
258) VEGF R1/Flt-1
259) PDGF R 알파
260) VEGF R2/Flk-1
261) PDGF R 베타
262) VEGF R3/Flt-4
263) PDGF-A
264) VEGF
265) PDGF-B
266) VEGF-B
267) PDGF-C
268) VEGF-C
269) PDGF-D
270) VEGF-D
271) PDGF-AB
272) VEGF/PDGF 패밀리 모음 (상기 253-271)
Dockkopf 단백질 & Wnt 저해물질
273) Dkk-1
274) Dkk-2
275) Dkk-2
277) Soggy-1
278) WIF-1
279) 인자 모음 (상기 273-278)
Frizzled & 관련 단백질
280) Frizzled-1
281) Frizzled-2
282) Frizzled-3
283) Frizzled-4
284) Frizzled-5
285) Frizzled-6
286) Frizzled-7
287) Frizzled-8
288) Frizzled-9
289) sFRP-1
290) sFRP-2
291) sFRP-3
292) sFRP-4
293) MFRP
294) 인자 모음 (상기 280-293)
Wnt 리간드
295) Wnt-1
295) Wnt-2
296) Wnt-3
297) Wnt-3a
298) Wnt-4
299) Wnt-5
301) Wnt-5a
302) Wnt-6
303) Wnt-7
304) Wnt-8
305) Wnt-8a
306) Wnt-9
307) Wnt-10a
308) Wnt-10b
309) Wnt-11
310) Wnt 리간드 모음 (상기 295-309)
기타 Wnt-관련 분자
311) 베타-카테닌(Catenin)
312) LRP-6
313) GSK-3
314) ROR1
315) 크레멘(Kremen)-1
316) ROR2
317) 크레멘-2
318) WISP-1/CCN4
319) LRP-1
320) 인자 모음(상기 311-319)
다른 생장 인자들
321) CTGF/CCN2
322) NOV/CCN3
323) EG-VEGF/PK1
324) 오스테오크린(Osteocrin)
325) 헤파소신(Hepassocin)
326) PD-ECGF
327) HGF
328) 프로그래눌린(Progranulin)
329) 베타-NGF
330) 트롬보포에틴(Thrombopoietin)
331) 인자 모음 (상기 321-330)
스테로이드 호르몬
332) 17베타-에스트라디올(Estradiol)
333) 테스토스테론(Testosterone)
334) 코르티존(Cortisone)
335) 덱사메타손(Dexamethasone)
세포외/막 단백질[Extracellular/Memrane Proteins]
336) 플라스마 피브로넥틴
337) 조직 피브로넥틴
338) 피브로넥틴 단편
339) 콜라겐 Type I (gelatin)
340) 콜라겐 Type II
341) 콜라겐 Type III
342) 테나신(Tenascin)
343) 매트릭스 메탈로프로테나제(Matrix Metalloproteinase) 1
344) 매트릭스 메탈로프로테나제 2
345) 매트릭스 메탈로프로테나제 3
346) 매트릭스 메탈로프로테나제 4
347) 매트릭스 메탈로프로테나제 5
348) 매트릭스 메탈로프로테나제 6
349) 매트릭스 메탈로프로테나제 7
350) 매트릭스 메탈로프로테나제 8
351) 매트릭스 메탈로프로테나제 9
352) 매트릭스 메탈로프로테나제 10
353) 매트릭스 메탈로프로테나제 11
354) 매트릭스 메탈로프로테나제 12
355) 매트릭스 메탈로프로테나제 13
356) ADAM-1
357) ADAM-2
358) ADAM-3
359) ADAM-4
360) ADAM-5
361) ADAM-6
362) ADAM-7
363) ADAM-8
364) ADAM-9
365) ADAM-10
366) ADAM-11
367) ADAM-12
368) ADAM-13
369) ADAM-14
370) ADAM-15
371) ADAM-16
372) ADAM-17
373) ADAM-18
374) ADAM-19
375) ADAM-20
376) ADAM-21
377) ADAM-22
378) ADAM-23
379) ADAM-24
380) ADAM-25
381) ADAM-26
382) ADAM-27
383) ADAM-28
384) ADAM-29
385) ADAM-30
386) ADAM-31
387) ADAM-32
388) ADAM-33
389) ADAMTS-1
390) ADAMTS-2
391) ADAMTS-3
392) ADAMTS-4
393) ADAMTS-5
394) ADAMTS-6
395) ADAMTS-7
396) ADAMTS-8
397) ADAMTS-9
398) ADAMTS-10
399) ADAMTS-11
400) ADAMTS-12
401) ADAMTS-13
402) ADAMTS-14
403) ADAMTS-15
404) ADAMTS-16
405) ADAMTS-17
406) ADAMTS-18
407) ADAMTS-19
408) ADAMTS-20
409) Arg-Gly-Asp
410) Arg-Gly-Asp-Ser
411) Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro
412) Arg-Gly-Glu-Ser
413) Arg-Phe-Asp-Ser
414) SPARC
415) Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg
416)
Cys-Ser-Arg-Ala-Arg-Lys-Glu-Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ser-Ala-Asp-Arg
417) 엘라스틴(Elastin)
418) 트로펠라스틴(Tropelastin)
419) Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys
420) Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro
421) 라미닌(Laminin)
422) Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly
423) Ser-Asp-Gly-Arg-Gly
424) 비트로넥틴(Vitronectin)
425) 슈퍼피브로넥틴
426) 트롬보스폰딘(Thrombospondin)
427) TIMP-1
428) TIMP-2
429) TIMP-3
430) TIMP-4
431) 피브로모듈린(Fibromodulin)
432) 플라보리딘(Flavoridin)
433) 콜라겐 IV
434) 콜라겐 V
435) 콜라겐 VI
436) 콜라겐 VII
437) 콜라겐 VIII
438) 콜라겐 IX
439) 콜라겐 X
440) 콜라겐 XI
441) 콜라겐 XII
442) 엔탁틴(Entactin)
443) 피브릴린(Fibrillin)
444) 신데칸(Syndecan)-1
445) 케라틴 설페이트 프로테오글리칸(Keratan sulfate proteoglycan)
대기 산소(Ambient Oxygen)
446) 0.1-0.5% 산소
447) 0.5-1% 산소
448) 1-2% 산소
449) 2-5% 산소
450) 5-10% 산소
451) 10-20% 산소
동물 혈청
452) 0.1% 소 혈청
453) 0.5% 소 혈청
454) 1.0% 소 혈청
455) 5.0% 소 혈청
456) 10% 소 혈청
457) 20% 소 혈청
458) 10% 말 혈청
인터루킨( Interleukins )
459) IL-1
460) IL-2
461) IL-3
462) IL-4
463) IL-5
464) IL-6
465) IL-7
466) IL-8
467) IL-9
468) IL-10
469) IL-11
470) IL-12
471) IL-13
472) IL-14
473) IL-15
474) IL-16
475) IL-17
476) IL-18
프로테아제(Proteases)
477) MMP-1
478) MMP-2
479) MMP-3
480) MMP-4
481) MMP-5
482) MMP-6
483) MMP-7
484) MMP-8
485) MMP-9
486) MMP-10
487) MMP-11
488) MMP-12
489) MMP-13
490) MMP-14
491) MMP-15
492) MMP-16
493) MMP-17
494) MMP-18
495) MMP-19
496) MMP-20
497) MMP-21
498) MMP-22
499) MMP-23
500) MMP-24
501) 카텝신(Cathepsin) B
502) 카텝신 C
503) 카텝신 D
504) 카텝신 G
505) 카텝신 H
506) 카텝신 L
507) 트립신
508) 펩신
509) 엘라스타제
510) 카르복시펩티다제 A
511) 카르복시펩티다제 B
512) 카르복시펩티다제 G
513) 카르복시펩티다제 P
514) 카르복시펩티다제 W
515) 카르복시펩티다제 Y
516) 키모트립신(Chymotrypsin)
517) 플라스미노겐(플라스미노겐)
518) 플라스민(Plasmin)
519) u-type 플라스미노겐 활성물질
520) u-type 플라스미노겐 활성물질
521) 플라스미노겐 활성물질 저해물질-1
522) 카르복시펩티다제 Z
아미노산
522) 알라닌
523) 아르기닌
524) 아스파라진
525) 아스파르트산
526) 시스테인
527) 글루타민
528) 글루타민산
529) 글리신
530) 히스티딘
531) 이소루이신
532) 루이신
533) 리신
534) 메티오닌
535) 페닐알라닌
536) 프롤린
537) 세린
538) 트레오닌
539) 트립토판
540) 티로신
541) 발린
프로스타글란딘
542) 프로스타글란딘 A1
543) 프로스타글란딘 A2
544) 프로스타글란딘 B1
545) 프로스타글란딘 B2
546) 프로스타글란딘 D2
547) 프로스타글란딘 E1
548) 프로스타글란딘 E2
549) 프로스타글란딘 F1 알파
550) 프로스타글란딘 F2 알파
551) 프로스타글란딘 H
552) 프로스타글란딘 I2
553) 프로스타글란딘 J2
554) 6-케토-프로스타글란딘 F1a
555) 16,16-디메틸-프로스타글란딘 E2
556) 15d-프로스타글란딘 J2
557) 프로스타글란딘 모음 (상기 542-557 )
레티노이드 수용체 항진제/길항제
558) 메소프렌산
559) 모든 트란스 레티노산(retinoic acid)
560) 9-시스 레티노산
561) 13-시스 레티노산
562) 레티노이드 항진제 모음 (상기 558-561 )
563) 레티노이드 길항제
564) 레티노산 수용체 이소타입 RAR알파
565) 레티노산 수용체 이소타입 RAR베타
566) 레티노산 수용체 이소타입 RAR감마
567) Retinoic X 수용체 이소타입 RAR알파
568) Retinoic X 수용체 이소타입 RAR베타
569) Retinoic X 수용체 이소타입 RAR감마
기타 유도물질(Inducers)
570) 식물 렉틴
571) 세균성 렉틴
572) 포르스콜린(forskolin)
573) 포로볼 미리스테이트 아세테이트(Phorbol myristate acetate)
574) 폴리-D-리신
575) 1,25-디하이드록시비타민 D
576) 인히빈(Inhibin)
577) 헤레굴린(Heregulin)
578) 글리코겐
579) 프로게스테론(rogesterone)
580) IL-1
581) 세로토닌(Serotonin)
582) 피브로넥틴-45kDa 단편
583) 피브로넥틴-70kDa 단편
584) 포도당
585) 베타 멀캅토에탄올
586) 헤파리나제
587) 뇌하수체 추출물
588) 융모성 생식샘자극호르몬(chorionic gonadotropin)
589) 아드레노코르티코트로픽(adrenocorticotropic) 호르몬
590) 티록신(thyroxin)
591) 봄베신(Bombesin)
592) 뉴로메딘(Neuromedin) B
593) 가스트린-방출 펩티드(Gastrin-Releasing Peptide)
594) 에피네프린(Epinephrine)
595) 이소프로테레놀(Isoproterenol)
596) 에탄올
597) DHEA
598) 니코틴산
599) NADH
600) 바소프레신
602) 바소토신
603) 엥지오텐신 I
604) 엥지오텐신 II
605) 엥지오텐신 I 전환 효소
606) 엥지오텐신 I 전환 효소 저해물질
607) 콘드로이티나제 AB
608) 콘드로이티나제 C
609) 뇌 나트리우레틱(Natriuretic) 펩티드
610) 칼시토닌(Calcitonin)
611) 칼슘 이오노포어(ionophore) I
612) 칼슘 이오노포어(ionophore) II
613) 칼슘 이오노포어(ionophore) III
614) 칼슘 이오노포어(ionophore) IV
615) 브래드키닌(Bradykinin)
616) 알부민
617)플라스모네이트(Plasmonate)
618) LIF
619) PARP 저해물질
620) 리소포스파티딕산
621) (R)-METHANANDAMIDE
622) 1,25-디하이드록시비타민 D3
623) 1,2-디데카노일-글리세롤 (10:0)
624) 1,2-디옥타노일-SN-글리세롤
625) 1,2-디올레일-글리세롤 (18:1)
626) 11,12-에폭시에코사트리에논산(EPOXYEICOSATRIENOIC ACID)
627) 12(R)-HETE
628) 12(S)-HETE
630) 12(S) HPETE
631) 12-메톡시도데카논산(METHOXYDODECANOIC ACID)
632) 13(S)-HODE
633) 13(S)-HPODE
634) 13,14-디하이드로-PGE1
635) 13-케토옥타데카디에논산(KETOOCTADECADIENOIC ACID)
636) 14,15-에폭시에코사트리에논산(EPOXYEICOSATRIENOIC ACID)
637) 1400W
638) 15(S)-HETE
639) 15(S)-HPETE
640) 15-케토에코사트리에논산(KETOEICOSATETRAENOIC ACID)
641) 17-아릴아민-젤다나마이신(geldanamycin)
642) 17-옥타데시논산(OCTADECYNOIC ACID)
643) 17-페닐-트리노르-PGE2
644) 1-아실-PAF
645) 1-헥사데실-2아라키도노일-522
646) 글리세롤
647) 1-헥사데실-2
648) 1-헥사데실-2-O-아세틸-글리세롤
649) 1-헥사데실-2-O-메틸-글리세롤
650) 1-옥타데실-2-메틸글리세로-3 PC
651) 1-올레오일-2-아세틸-글리세롤
652) 1-스테로일-2-리노레오일-글리세롤
653) 1-스테로일-2-아라키도노일-글리세롤
654) 2,5-디터트부틸하이드로퀴논
655) 24(S)-하이드록시콜레스테롤
656) 24,25-디하이드록시비타민 D3
657) 25-하이드록시비타민 D3
658) 2-아라키도노일글리세롤
659) 2-플루오로팔미트산
660) 2-하이드록시미리스트산
661) 2-메톡옥시안티마이신 A3
662) 3,4-디클로로이소코우마린
663) 그란자임 B 저해물질
664) 4-아미노피리딘
665) 4-하이드록시페닐레티나미드
666) 4-옥사테트라데카논산
667) 5(S)-HETE
668) T(S)-HPETE
669) 5,6-에폭시에코사트리에논산
670) 5,8,11,14-에코사테트라논산
671) 5,8,11-에코사트리논산
672) 5-하이드록시데카노에이트
673) 5-요오도튜베르시딘(iodotubercidin)
674) 5-케토에코사테트라논산(KETOEICOSATETRAENOIC ACID)
675) 5'-N-에틸카르복사아미도아데노신 (NECA)
676) 6,7-ADTN HBr
677) 6-포르밀인돌 [3,2-B] 카르바졸
678) 7,7-디메틸에코사데에논산(DIMETHYLEICOSADIENOIC ACID)
679) 8,9-에폭시에코사트리에논산(EPOXYEICOSATRIENOIC ACID)
680) 8-메톡시메틸-IBMX
681) 9(S)-HODE
682) 9(S)-HPODE
683) 9,10-옥타데세노아미드(OCTADECENOAMIDE)
684) a-3
685) aa-861
686) 아세틸 (N)-s-파르네실-1-시스테인
687) 아세틸-파르네실-시스테인
688) Ac-Leu-Leu-Nle-CHO
689) 아코니틴(ACONITINE)
690) 악티노마이신 D
691) 아드레닌산 (22:4, n=6)
692) 1mM
693) AG-1296
694) AG1478
695) AG213 (Tyrphostin 47)
696) AG-370
697) AG-490
698) AG-879
699) AGC
700) AGGC
701) Ala-Ala-Phe-CMK
702) 아라메티신(alamethicin)
703) 알레스타틴(Alrestatin)
704) AM 92016
705) AM-251
706) AM-580
707) 아만티딘(AMANTIDINE)
708) 아밀로라이드(AMILORIDE)
709) 아미노-1,8-나프탈이미드 [4-아미노-1,8-522) 나프탈이미드]
710) 아미노벤자미드 (3-ABA)[3-522)아미노벤자미드 (3-ABA)]
711) 아미다론(AMIODARONE)
712) 아난다미드(ANANDAMIDE) (18:2,n=6)
713) 아난다미드 (20:3,n=6)
714) 아난다미드 (20:4,n=6)
715) 아난다미드 (22:4,n=6)
716) 아니소마이신(anisomycin)
717) 아피디콜린(aphidicolin)
718) 아라키도나미드(ARACHIDONAMIDE)
719) 아라키돈산 (20:4, n=6)
720) 아라키도닐-PAF
721) 아리스톨로킨산(aristolochic acid)
722) 아르바닐(Arvanil)
723) 아스코마이신(ascomycin) (FK-520)
724) B581
725) BADGE
726) 바필로마이신(bafilomycin) A1
727) BAPTA-AM
728) BAY 11-7082
729) BAY K-8644
730) 벤자밀(BENZAMIL)
731) 베프리딜(BEPRIDIL)
732) 베스타민(Bestatin)
733) 베타-라파콘(lapachone)
734) 베툴리닌산(Betulinic acid)
735) 베자필브레이트(bezafibrate)
736) 블레비스타틴(Blebbistatin)
737) BML-190
738) Boc-GVV-CHO
739) 봉크레킨산(bongkrekic acid)
740) 브레펠딘(brefeldin) A
741) 브로모-7-니트로인다졸 [3-브로모-7-니트로인다졸]
742) 브로모-cAMP [8-브로모-cAMP]
743) 브로모-cGMP [8-브로모-cGMP]
744) 부메타니드(BUMETANIDE)
745) BW-B 70C
746) C16 쎄라미드(CERAMIDE)
747) C2 쎄라미드
748) C2 디하이드로쎄라미드(DIHYDROCERAMIDE)
749) C8 쎄라미드
750) C8 쎄라민
750) C8 디하이드로쎄라미드
751) CA-074-Me
752) 칼펩틴(calpeptin)
754) 칼포스틴(calphostin) C
755) 칼리쿨린(calyculin) A
756) 캄포테신(camptothecin)
757) 칸타리딘(cantharidin)
758) CAPE
759) 캅사이신(E)
760) 캅사제핀(capsazepine)
761) 카르바실린(CARBACYCLIN)
762) 카스타노스페르민(castanospermine)
763) CDC
764) 쎄루레린(Cerulenin)
765) CGP-37157
766) 케레리트린(chelerythrine)
767) 씨젤리타존(CIGLITAZONE)
768) 씨마트롤(CIMATEROL)
769) CinnGEL 2Me
770) 씨라졸린(CIRAZOLINE)
771) 씨토코(CITCO)
772) 클로피르레이트(CLOFIBRATE)
773) 클로니딘(clonidine)
774) 클로프로스테놀(CLOPROSTENOL) Na
775) 클로자핀(clozapine)
776) C-PAF
777) 큐르큐민(Curcumin)
778) 사이클로 [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val]
779) 사이클로헥사미드
780) 단백질 합성 저해물질
781) 사이클로렉시미드-N-에틸에타노에이트
782) 사이클로파민
783) 사이클로피아존산(CYCLOPIAZONIC ACID)
784) 사이클로스포린 A
785) 시페르메트린(cypermethrin)
786) 시토칼라신 B
787) 시토칼라신 D
788) D12-프로스타글란딘 J2
789) D609
790) 다나칸탈(damnacanthal)
791) 단트롤렌(DANTROLENE)
792) 데코이닌(decoyinine)
793) 데실유비퀴논(Decylubiquinone)
794) 데옥시마노지르마이신(deoxymannojirimycin)(1)
795) 데옥시노르지르마이신deoxynorjrimycin(1)
796) 데프레닐(Deprenyl)
797) 디아조옥시드(DIAZOXIDE)
798) 디부티릴사이클(dibutyrylcyclic) AMP
799) 디부티릴사이클 GMP
800) 디클로로벤자밀(DICHLOROBENZAMIL)
801) 디호모-감마-리놀렌산
802) 디하이드로스핑고신(DIHYDROSPHINGOSINE)
803) 딘도일메탄(DINDOLYLMETHANE)
804) 디리티아젬(DILTIAZEM)
805) 디페닐렌이오도니움(diphenyleneiodonium) C1
806) 디피리다몰(dipyridamole)
807) DL-디하이드로스핑고신(DIHYDROSPHINGOSINE)
808) DL-PDMP
809) DL-PPMP
810) 도코사헥사논산(DOCOSAHEXAENOIC ACID)(22:6 n-3)
811) 도코사펜타논산(DOCOSAPENTAENOIC ACID)
812) 도코사트리에논산(DOCOSATRIENOIC ACID) (22:3 n-3)
813) 독소루비신(doxorubicin)
814) DRB
815) E-4031
816) E6-베르바민(berbamine)
817) E-64-d
818) 에베세렌(Ebselen)
819) EHNA HCl
820) 에코사-5,8-디에논산(20:2 n-22)
821) 에코사디에논산(20:2 n-6)
822) 에코사펜타논산(20:5 n-3)
823) 에코사트리에논산(20:3 n-3)
824) 에난티오-PAF C16
825) 에피바티딘 (+/-)
826) 에토포시드
827) 파레실티오아세트산(FARNESYLTHIOACETIC ACID)
828) FCCP
829) 피프로닐(FIPRONIL)
830) FK-506
831) 플레카이니드(FLECAINIDE)
832) 플루페나민산(FLUFENAMIC ACID)
833) 플루나리진(FLUNARIZINE)
834) 플루프로스테놀(FLUPROSTENOL)
835) 플루스피리린(FLUSPIRILINE)
836) FPL-64176
837) 푸모니신(Fumonisin) B1
838) 푸록산(Furoxan)
839) 감마-리놀렌산(18:3 n-6)
840) 젤다나마이신(geldanamycin)
841) 제니스테인(genistein)
842) GF-109203x
843) 진게롤(GINGEROL)
844) 클리오톡신(Gliotoxin)
845) 클리피진(GLIPIZINE)
846) 글리부라이드(GLYBURIDE)
847) BM6006
848) Go6976
849) 그레이나톡신(GRAYANOTOXIN) III
850) GW-5074
851) GW-9662
852) H7]
853) H-89
854) H9
855) HA-1004
856) HA1077
857) HA14-1
858) HBDDE
859) 헤레날린(Helenalin)
860) 히노키티올(Hinokitiol)
861) 히스타민(HISTAMINE)
862) HNMPA-(AM)3
863) Hoechst 33342 (세포 침투성)(비스벤자미드)
864) 후페르진 A[(-)-후페르진 A]
865) IAA-94
866) IB-MECA
867) IBMX
868) ICRF-193
869) 이카루가마이신(Ikarugamyin)
870) 인디루빈(Indirubin)
871) 인디루빈-3'-모녹심(monoxime)
872) 인도메타신(indomethacin)
873) 쥬글론(juglone)
874) K252A
875) 카바인(Kavain) (+/-)
876) KN-72
877) KT-5720
878) L-744,932
879) 라트루쿨린(Latrunculin) B
880) 라벤두스틴(Lavendustin) A
881) L-cis-딜티아젬
882) 루코톡신(LEUKOTOXIN) A(9,10-EODE)
883) 루코톡신 B(12,13-EODE)
884) 루코트리엔(LEUKOTRIENE) B4
885) 루코트리엔 C4
886) 루코트리엔 D4
887) 루코트리엔 E4
888) 루펩틴(Leupeptin)
889) LFM-A13
890) 리도카인
891) 리놀아미드(LINOLEAMIDE)
892) 리놀레산(LINOLEIC ACID)
893) 리놀레산 (18:3 n-3)
894) 리폭신(LIPOXIN) A4
895) L-NAME
896) L-NASPA
897) 루페르아미드(LOPERAMIDE)
898) LY-171883
899) LY-294002
900) LY-83583
901) 리코린(Lycorine)
902) LYSO-PAF C16
903) 마놀라이드(Manoalide)
904) 마누마이신(manumycin) A
905) MAPP, D-드리트로
906) MAPP, L-에리트로
907) 마스토파란(mastoparan)
908) MBCA
909) MCI-186
910) M이-28170
911) MEAD ACID(20:3 n-9)
912) MEAD 에탄올아미드
913) 테토트렉세이트
914) 메톡시 베라파밀
915) 메비놀린(Mevinolin) (로바스타틴)
916) MG-132
917) 밀리논(Milrinone)
918) 미녹시딜(MINOXIDIL)
919) 미녹시딜 설페이트
920) 미소프로스톨, 자유산
921) 미토마이신 C
922) ML7
923) ML9
924) MnTBAP
925) 마나스트롤(Monastrol)
926) 모넨신(monensin)
927) MY-5445
928) 미코페놀산(Mycophenolic acid)
929) N,N-디메틸스핑고신(DIMETHYLSPHINGOSINE)
930) N9-이소프로필로뮤신(Isopropylolomoucine)
931) N-아세틸-루코트리엔 E4
932) NapSul-Ile-Trp-CHO
933) N-아라키노일글리신
934) 니카르디핀(NICARDIPINE)
935) 니페디핀(NIFEDIPINE)
936) 니풀민산(NIFLUMIC ACID)
937) 니게르신(Nigericin)
938) 니굴디핀(NIGULDIPINE)
939) 니메슐리든(Nimesulide)
940) 니모디핀(NIMODIPINE)
941) 니트리엔디핀(NITRENDIPINE)
942) N-니놀올레일글리신(LINOLEOYLGLYCINE)
943) 노코다졸(nocodazole)
944) N-페닐안트라닉(PHENYLANTHRANILIC) (CL)
945)NPPB
946) NS-1619
947) NS-398
948) NSC-95397
949) OBAA
950) 오카다노산(okadaic acid)
951) 올리고마이신(oligomycin) A
952) 올로뮤신(olomoucine)
953) 오우아비신(ouabain)
954) PAF C16
955) PAF C18
956) PAF C18:1
957) 팔미틸에탄올아미드(PALMITYLETHANOLAMIDE)
958) 파르테놀리드(Parthenolide)
959) 판실린(PAXILLINE)
960) PCA 4248
961) PCO-400
962) PD 98059
963) PENITREM A
964) 펩스타민(pepstatin)
965) 페나밀(PHENAMIL)
966) 페난트리디논 [6-(5H)-페난트리디논]
967) 페녹시벤자민(Phenoxybenzamine)
968) 펜토라민(PHENTOLAMINE)
969) 페니토인(PHENYTOIN)
970) 포스파티딘산, 디팔미토일
971) 피세아토놀(Piceatannol)
972) 피프리트린(pifithrin)
973) 피모자이드(PIMOZIDE)
974) 피나시딜(PINACIDIL)
975) 피록시캄(piroxicam)
976) PP1
977) PP2
978) 프라조신(prazocin)
979) 프레게놀론 16알파 카르보니트릴
980) PRIMA-1
9810 프로카이나미드(PROCAINAMIDE)
982) 프로파페논(PROPAFENONE)
983) 프로피디움 요오드(propidium iodide)
984) 프로파올(S-)
985) 퓨로마이신
986) 퀘르세틴(quercetin)
987) 퀴니딘(QUINIDINE)
988) 퀴닌(QUININE)
989) 라파마이신(rapamycin)
991) 레스베라트롤(resveratrol)
992) 레티노산, (모두 트란스형)
993) REV-5901
994) RG-14620
995) RHC-80267
996) RK-682
997) Ro 20-1724
998) Ro 31-8220
999) 로리프람(Rolipram)
1000) 로스코비틴(roscovitine)
1001) 로트레린(Rottlerin)
1002) RWJ-60475-(AM)3
1003) 라이노딘(RYANODINE)
1004) SB 202190
1005) SB 203580
1006) SB-415286
1007) SB-431542
1008) SDZ-201106
1009) S-파르네실-L-시스테인 ME
1010) 쉬코닌(Shikonin)
1011) 시구아조단(siguazodan)
1012) SKF-96365
1013) SP-600125
1014) 스핑고신(SPHINGOSINE)
1015) 스프리토마이신(Splitomycin)
1016) SQ22536
1017) SQ-29548
1018) 스타우로스포린(staurosporine)
1019) SU-4312
1020) 슈마린(Suramin)
1021) 스와인소닌(swainsonine)
1022) 마목시펜(tamoxifen)
1023) 탄쉬온(Tanshione)IIA
1024) 탁솔=파클리탁셀(paclitaxel)
1025) 테트라하이드로카나비놀-7- 산
1026) 테트라드린(TETRANDRINE)
1027) 탈리도미드(thalidomide)
1028) THAPSIGARGIN
1029) 티오시툴린(Thiocitrulline) [L-티오시툴린 HCl]
1030) 티오르판(Thiorphan)
1031) TMB-8
1032) 토라자미드(TOLAZAMIDE)
1033) 톨부타미드(TOLBUTAMIDE)
1034) 토실-Phe-CMK (TPCK)
1035) TPEN
1036) 트레퀸신(Trequinsin)
1037) 트리쵸스타틴-A
1038) 트리플로오르페라진(trifluoperazine)
1039) TRIM
1040) 트리프톨리드(Triptolide)
1041) TTNPB
1042) 튜니카마이신(Tunicamycin)
1043) 트립포스틴(tyrphostin) 1
1044) 트립포스틴 9
1045) 트립포스틴 AG-126
1046) 트립포스틴 AG-370
1047) 트립포스틴 AG-825
1048) 트립포스틴-8
1049) U-0126
1050) U-37883A
1051) U-46619
1052) U-50488
1053) U73122
1054) U-74389G
1055) U-75302
1056) 바닐로마이신(valinomycin)
1057) 발프론산(Valproic acid)
1058) 베라파밀(VERAPAMIL)
1059) 베라트리딘(VERATRIDINE)
1060) 빈블라스틴(vinblastine)
1061) 비노포세틴(vinpocetine)
1062) W7
1063) WIN 55,212-2
1064) 위스코스타틴(Wiskostatin)
1065) 워트마닌(Wortmannin)
1066) WY-14643
1067) 쎄스토스포긴(Xestospongin) C
1068) Y-27632
1069) YC-1
1070) 요힘빈(Yohimbine)
1071) 자프리나스트(Zaprinast)
1072) 자르다베린(Zardaverine)
1073) ZL3VS
1074) ZM226600
1075) ZM336372
1076) Z-프롤일-프로리날
1077) zVAD-FMK
1078) 아스코르베이트
1079) 5-아자시티딘
1080) 5-아자데옥시씨티딘(azadeoxycytidine)
1081) 헥사메틸렌 비스아세타미드 (HMBA)
1082) 소디움 부티레이트
1083) 디메틸 술폭시드
1084) 구세코이드(Goosecoid)
1085) 글리코겐 합성효소 카이나제-3
1086) 갈렉틴(Galectin)-1
1087) 갈렉틴-3
세포 흡착 분자
1086) 카드헤린(Cadherin) 1 (E-카드헤린)
1087) 카드헤린 2 (N-카드헤린)
1088) 카드헤린 3 (P-카드헤린)
1089) 카드헤린 4 (R-카드헤린)
1090) 카드헤린 5 (VE-카드헤린)
1091) 카드헤린 6 (K-카드헤린)
1092) 카드헤린 7
1093) 카드헤린 8
1094) 카드헤린 9
1095) 카드헤린 10
1096) 카드헤린 11 (OB-카드헤린)
1097) 카드헤린 12 (BR-카드헤린)
1098) 카드헤린 13 (H-카드헤린)
1099) 카드헤린 14 (카드헤린 18과 동일)
1100) 카드헤린 15 (M-카드헤린)
1101) 카드헤린 16 (KSP-카드헤린)
1102) LI 카드헤린
상기 나열한 것들은 특정 발생 계통을 따라 ES 세포 또는 ED 세포의 분화를 촉진하는데 이용할 수 있는 예시적인 인자 및 조건들이다. 스크리닝 검사, 발생 및 줄기세포 생물학의 연구를 위해 또는 치료요법제를 만들기 위해, 부분적으로 또는 최종적으로 분화된 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 타입 세포를 이용할 수도 있다. 부분적으로 또는 최종적으로 분화된 세포 타입은 약리학적 준비물의 형태로 실질적으로 정제되어 조제되거나 또는 선택적으로 저온 보존될 수 있다.
ES 세포의 만능분화능( Pluripotency )
본 발명의 방법에 의해 만들어진 사람 ES 세포 또는 세포주의 만능분화능은 사람 ES 세포 마커 단백질의 발현을 감지함으로써 결정할 수 있을 것이다.
이와 같은 단백질로는 옥타머 결합 단백질 4 (Oct-4), 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen:SSEA)-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 알칼리 포스파타제등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 일부 구체예에서, 가상 ES 세포주는 13, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100회 계대후에도 만능분화능을 유지한다. 정상적인 핵형(karyotype)의 유지에 대해 ES 세포를 검사할 수도 있을 것이다. 당분야에 공지된 방법을 이용하여 본 발명에 따라 만들어진 ES 세포가 외배엽, 중배엽, 내배엽 계통의 세포로 분화시킴으로써 만능분화능을 확인할 수도 있다. in vivo에서 ES 세포를 면역결손 생쥐(예를 들면 SCID 생쥐)로 이식하고, 기형종(teratoma)의 형성을 평가함으로써 만능분화능을 테스트할 수도 있다.
특정 구체예에서, 난할구로부터 만들어진 ES 세포 또는 세포주는 하나 또는 그이상의 ES 세포 마커 단백질을 발현한다. 추가적으로 또는 대안으로, 특정 구체예에서, 세포는 정상 핵형을 유지한다. 추가적으로 또는 대안으로 특정 구체예에서, 세포는 13, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100회 계대이후에도 만능분화능을 유지한다.
전술한 것에 대해 세포 또는 세포주를 수득하기 위해 난할구를 얻기위해 이용된 배의 파괴없이 난할구로부터 생성된 ES 세포 또는 세포주를 만들 수 있다. 이와 같은 특징의 세포는 현재 이용되는 배의 파괴가 부득이한 방법을 이용하여 만들어진 ES 세포 및 세포주에서 얻는 세포와는 구별된다.
TS 세포 생산
본 발명은 ES 세포주의 생성전에 그리고 생성없이 분리된 난할구로부터 세포형을 직접적으로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 예로써, 사람 영양포 줄기("TS") 세포는 난할구 파생물과 FGF-4의 접촉에 의해 생성되는데, 형태학적으로 영양포 및/또는 배외구조(extraembryonic) 내배엽과 유사하나 ES 세포와는 닮지 않는다. 예를 들면, FGF-4를 파생물의 배양 배지에 첨가한다. TS 세포는 당분야에 표준 과정을 이용하여 cdx-2, fgfr2, PL-I 및 사람 융모막 고나도트로핀(hCG)와 같은 단백질의 발현을 검사함으로써 감지할 수 있다. Oct-4 및 α-페토 단백질과 같은, 그러나 이에 국한되지 않는 단백질의 발현이 없는 것으로 TS 세포 확인을 증빙할 수 있을 것이다.
정제된 조제물 및 세포주의 생산
특정 구체예에서, 세포주를 만들 수 있다. 예를 들면 특정 세포 타입이 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터(난할구-유도된 파생물)를 포함하는 배양물에서 확인되면, 세포는 추가 이용을 위해 나머지 배양물로부터 분리시킬 수 있다. 일단 분리되면 원하는 세포는 정제된 또는 실질적으로 정제된 집단으로 증식될 수 있거나 세포주로 유지시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 배에서 수득한 난할구를 배양함으로써 생산된 ES 세포는 난할구-유도된 파생물 배양물로부터 분리시키고, 배반포 단계 배로부터 ES 세포주를 만들 때 개발된 표준 기술을 이용하여 ES 세포주를 만든다. 다른 구체예에서, 원하는 부분적으로 분화된 ED 세포는 형태에 근거하여 선별할 수도 있는데, 배양물로부터 세포를 분리시키고 정제하거나 추가 사용을 위해 분석할 수도 있다.
예시적인 세포주는 안정적 세포주를 포함한다. 이와 같은 방법으로 확립된 ES 세포주는 기존의 ES 세포주의 성질, 예를 들면, 분화 능력, 단백질 발현, 핵형 등의 성질을 보유할 수도 있다. 또는 이와 같은 방법으로 확립된 ES 세포주는 하나 또는 그 이상의 방식에서 기존의 ES 세포주와 다를 수도 있다.
ES 및 ED 세포의 치료요법적 용도
본 발명의 ES 또는 ED 세포는 ES 세포가 유용한 임의 용도에 적합하다. 본 발명은 본 발명의 ES 세포의 치료요법적 효과량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 세포 요법으로 치료가능한 질병 치료 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 미래에 사람 배로인하여 어린이의 질병 치료, 조직 치유, 이식, 세포의 허약 치료 또는 세포 기능이상 치료가 필요할 경우, 사람 배 착상전에 난할구를 제거한 후, 난할구는 상기에서 설명하는 것과 같이 배양하여 세포 치유용 사람 ES 세포를 얻고 보관한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 난할구로부터 유도된 세포, 치밀화전의 상실배, 치밀화 상실배 또는 구획화된(sectioned) 배반포는 in vitro 또는 in vivo에서 바로 분화되어 배아 줄기 세포주를 만들지 않고 분화되는 또는 분화된 세포를 만든다. 직접 분화 방법에 대해 U.S. 특허 출원 no. 20050265976, December 1, 2005, 국제 특허 공보 no. WOOl 29206, April 26, 2001,참고 자료를 첨부한다. 본 발명의 세포는 의학, 수의학, 생물학 연구에 유용하며, 세포 치료 예를 들면 알레르기 세포 치료법에 이용하기 위한 세포를 제공함으로써 질병 치료에도 유용하다.
또 다른 구체예에서, ES 세포 또는 세포주를 난할구로부터 유도하고, 하나 또는 그 이상의 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 세포 타입을 만들기 위해 ES 세포 또는 세포주의 분화를 유도한다. 예시적인 세포 타입에는 RPE 세포, 조혈 줄기세포, 조혈 세포 타입(예를 들면, RBCs, 혈소판 등), 췌장 베타 세포, 피부 세포, 심근세포(cardiomyocytes), 평활근 세포, 내피 세포, 간세포, 뉴우런, 글리아, 골근육 세포, 도관(vascular) 세포 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. ES 세포 자체가 질병 또는 질환 치료에 이용될 수는 있지만, 본 발명은 치료요법적으로 이용될 수 있는 분화된 세포 타입의 생산도 고려한다.
본 발명의 방법은 난할구로부터 줄기 세포를 만드는데 이용될 수 있는데, 이때 줄기 세포는 MHC 항원에 대해 반접합성(hemizygous) 또는 동종접합성(homozygous)이다. 이들 세포는 이식 또는 세포 치료동안에 감소된 면역원성(immunogenicity)에 유용하다. 생산된 줄기세포를 MHC 유전자에서 복합성이 감소된 뱅크로 어셈블할수도 있다.
본 발명의 난할구는 MHC 항원에 대해 반접합성 또는 동종접합성인 배로부터 유도할 수 있다. 이와 같은 배는 MHC 항원에 대해 반접합성 또는 동종접합성이 되도록 선별하거나 MHC 항원에 대해 반접합성 또는 동종접합성이 되도록 당분야에 공지된 임의 방법으로 만들 수도 있다. 또는 난할구로부터 유도된 줄기 세포를 유전자 표적화를 이용하여 MHC 항원에 대해 반접합성 또는 동종접합성으로 만들 수도 있다(참고, WO 03/018760 March 6, 2003; 미국 예비 특허 출원 no. 60/729,173, 전문을 참고문헌으로 첨부함).
상기에서 언급된 신규한 기술에 의해 만들어진 ES 세포 및 사람 배유도 세포는 세포 생물학, 약물 개발에 관련된 연구에 유용하거나, 세포 요법 예를 들면, 혈액 질환, 혈관 질환, 심장 질환, 암 치료용 조혈 및 혈액혈관생성 세포의 생산, 그리고 상처 치료, 당뇨병 치료에 유용한 췌장 베타 세포, 막망세포상피변성증(retinitis pigmentosa), 황반부변성(macular degeneration)과 같은 막망 질환 치료에 유용한 신경 세포와 같은 망막 세포와 망막색소상피 세포, 파킨슨 질환 및 알츠하이머 질환, 만성 통증, 발작, 정신질환 및 척수 손상 치료에 유용한 뉴우런, 심주전과 같은 심장 질환 치료에 유용한 심장 근육 세포, 반흔없이 상처 복구를 위한 상처, 화상, 신속한 상처 복구 및 피부 노화 치료를 위해 유용한 피부 세포, 간경화와 같은 간 질환 치료용 간 세포, 신부전과 같은 신장 질환 치료를 위한 신장 세포, 관절염 치료를 위한 연골, 폐 질환 치료를 위한 폐 세포, 골다공증과 같은 빼 질환 치료를 위한 뼈 세포의 생산을 포함하나 이에 국한시키지 않는 세포 치료에 유용한다.
이와 같은 세포 치료법은 본 발명의 ES 세포와 증식 인자, 분화 결정 인자(lineage-commitment), 소요의 유전자 또는 단백질과 복합이용에 관계할 수 있다. 치료 방법에는 이식을 위해 직접 적절한 줄기 또는 전구 세포를 제공하여, in vivo에서 조직 재생이 되거나 in vitro에서 원하는 조직을 만들고, 해당 개체에 조직을 제공하는 것이 포함될 수도 있다.
제약학적 조제물
본 발명은 ES 세포, ES 세포주, TS 세포, 및 다양하게 부분적으로 그리고 최종적으로 분화된 세포 및 세포주를 만드는 방법을 제공한다. 이와 같이 만들어진 세포 및 세포주를 in vivo 및 in vitro에서 연구할 수도 있다. 특정 구체예에서, 이들 세포 연구로 기본적인 발생 생물학 및 줄기 세포 생물학에 관한 정보를 제공한다. 특정 다른 구체예에서, 이들 세포 및/또는 세포의 증식, 분화, 생존을 조절하는데 이용되는 인자들의 연구로 다양한 질병 또는 질환을 치료하거나 경감시키기 위한 줄기세포 근거한 치료법을 개발하는데 이용할 수 있을 것이다. 다른 구체예에서, 이와 같은 방법에 의해 만들어진 세포 및 세포주를 치료요법적으로 이용될 수 있는 물질 및 조건을 확인하는 스크리닝 검사에 이용할 수도 있다. 확인된 치료제를 이용하여 세포 치료법을 개발하거나 환자로 제공하면 그 자체가 유용할 것이다.
특정 구체예에서, ES 세포, ES 세포주, TS 세포, TS 세포주, 또는 부분적으로 또는 최종적으로 분화된 세포는 세포와 약학적으로 수용가능한 캐리어 또는 부형제와 복함시킴으로써 약학 조제물형태로 만들 수도 있다. 특정 구체예에서, 약학 조제물에는 캐리어 단위 용적당 특정 수의 세포를 포함하여 세포 요법으로 세포의 특정 약량을 제공하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들면, 약학적 조제물은 치료되는 질환 및 투여 경로에 적절한 캐리어 용적당 1×105 세포, 1×106 세포, 2×106 세포, 3×106 세포, 4×106 세포, 5×106 세포, 1×107 세포, 또는 1×107 세포 이상으로 운반할 수 있도록 조제될 수 있다.
연구 실행 방법
상기에서 상세하게 설명한 것과 같이 배아 줄기 세포는 배의 파괴에 대해 정치적 그리고 도덕적 반대에 의해 부분적으로 저지되어왔었다. 본 발명은 ES 세포 및 세포주를 포함하는 세포 및 세포주를 효과적으로 생성시키는 대안법을 제공할 뿐만 아니라 본 발명은 ES 세포 유도 과정의 일부로 새로운 배의 파괴를 요구하지 않는 방법을 제공한다. 나머지 배는 저온 보존하거나 또는 영구적으로 보관하거나 향후 추가 연구를 위해 보관할 수도 있다.
일부의 경우에 새로운 배의 부득이한 파괴없이 ES 세포 및 세포주(또는 ES 세포에서 분화된 부분적으로 또는 최종적으로 분화된 세포 타입 또는 배로부터 바로 분화된)를 유도하는 능력은 이와 같은 방법에 반영된 상당한 기술적 발전을 넘어 실질적인 장점을 제공할 것이다. 이와 같은 근거로, 본 발명은 사람 배의 파괴없이, 배아 줄기 세포 연구를 실행하는 새로운 방법을 제공한다. 이 방법은 사람 배의 파괴없이, 사람 배로부터 유도된 사람 ES 세포 또는 ES 세포주를 수득하는 방법이다. 여기에서 설명하는 방법을 이용하여 사람 배로부터 수득한 난할구로부터 ES 세포 또는 세포주를 만들 수 있다.
ES 세포 또는 세포주를 유도하면, 이 방법으로 사람 ES 세포 또는 ES 세포주를 이용한 배아 줄기 세포 연구를 실행할 수 있다. 이와 같은 방법은 새로운 배의 파괴 없이 ES 세포 연구를 실행하는 길을 제공한다.
특정 구체예에서, 배아 줄기 세포 연구는 ES 세포 또는 세포주의 분화 능력을 검사하는 연구와 연관된다. 예를 들면, 이 연구는 하나 또는 그 이상의 인자들과 사람 ES 세포 또는 ES 세포주를 접촉시키고, ES 세포 또는 ES 세포주를 하나 또는 그 이상의 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 세포 타입으로 분화를 촉진시키는 인자를 확인하는 것과 연계될 수 있다. 다른 구체예에서, 배아 줄기 세포 연구는 ES 세포 및 이로부터 분화된 세포의 가망 치료요법적 용도의 연구와 관계한다.
특정 연구 목적과 무관하게, 이 방법은 세계에 연구자들 특히 배 파괴를 규제하는 법이 있는 나라에서 일하는 연구자들과의 협력 기회를 확장시킬 수 있다.
다른 언급이 없는다, 여기에서 사용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 동일한 의미를 가진다. 충돌이 있는 경우에 본 발명의 정의를 포함하는 명세서에 따라 조절할 수 있다. 또한, 다른 언급이 없는 한, 단수에는 복수 개념이 포함되고, 복수 용어에는 단수도 포함된다.
여기에서 설명하는 세포, 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 발생 생물학 , 세포 생물학과 연관하여 또는 이의 기술적 용어 및 명명법은 당분야에 공지공용의 것들이다.
예시적 방법 및 재료를 설명하였으나, 여기에서 설명하는 것과 유사한 또는 등가의 방법 및 재료도 본 발명의 실행 또는 테스테에 이용될 수 있을 것이다.
여기에서 언급한 모든 공보 및 참고문헌은 전문이 첨부된다. 문서 번호가 언급되어 있지만, 이와 같은 언급으로 이들 문서의 일부가 당분야에 공통적인 지식의 일부가 된다는 것을 말하는 것은 아니다.
명세서를 통하여 “포함하다(comprise)” 또는 이들 용어의 변형은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하나 임의 다른 정수 또는 정수군을 배제한다는 것은 아니다.
본 발명을 더 잘 이해할 수 있도록 하기 위해 다음의 실시예를 제시한다. 이와 같은 실시예는 설명을 목적으로 함이며, 본 발명의 범위를 임의 대상으로 제한하는 의도는 아니다.
실시예 1: 사람 ES 세포주의 생성
임상적 목적으로 in vitro 수정을 통하여 생산된 미사용된 배를 얻었다. 표준 등급 시스템(Veeck, L.L. et al., An Atlas of Human Gametes and Conceptuses, Parthenon, New York, NY, 1999)을 이용하면, 이들 배중 6개는 등급 I 또는 II(대칭적이며, 세포질 분절화(fragmentation)가 거의 없거나 없는 고른 세포 분할) 이며, 나머지 10개 배는 등급 III(다양한 분절화)이었다. 균등하지 않는 크기와 중간내지 심각한 분절화(등급 IV 및 V)를 보이는 난할구를 가진 배들을 본 연구에서 제외하였다. 전핵(Pronuclear) 및 다중 세포기 사람 배를 해동시키고, 5.5% CO2/5%O2/89.5%N2의 고습화된 배양기에서 파라핀 오일(Cooper Surgical Inc. Cat # 4008)하에 Quinn's 절단 배지(Cooper Surgical Inc., Cat # ARTl 526) 20㎕에서 8-10 세포기가 될 때까지 배양하였다.
산성 티로이드 용엑 또는 다중 Piezo 펄스를 이용하여 투명대를 파괴시키고, 개별 난할구는 나화(denuded)된 배로부터 배를 마이크로페펫으로 잡고, 피펫홀더를 부드럽게 태핑하여 기계적으로 분리하였다. 기존에 설명된 바와 같이(Nagy, A. et al., Manipulating the Mouse Embryos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2002), 분리된 난할구들은 플라스틱 조직 배양 플레이트의 바닥에 있는 함몰부를 이용하여 서로 접촉을 피하도록 배열하여 동일 배지(Quinn's 절단 배지(Cooper Surgical Inc., Cat # ARTl 526))로 함께 배양하였다.
분리된 난할구의 대부분(58%)은 최소 한번 분할하고, 이들중 약 절반(53개중 28개)은 소포 또는 클럼프를 형성하여 2-3일이내에 세포 파생물을 만들었다(도 1B, C). 이 과정 동안, 마이크로드롭 세트를 준비하는데, 이 세트는 미토마이신 C-러치된 생쥐 배아 섬유모세포(MEF) 영양공급세포 층상에서 생장한 녹생 형광 단백질(GFP)-라벨된 hES 세포를 포함하는 hES 배양 배지(Knockout-DMEM (Invitrogen Cat # 10829-018; 5% 플라스마네이트, 5% 혈청 대체물, 10% 태아 소 혈청, 20ng/ml 루키미아 저해 인자(LIF), 8-16ng/ml 염기성 섬유모세포 생장 인자(bFGF) 보충됨) 몇 마이크로드롭으로 에워싼 난할구-유도된 응집체를 포함하는 50㎕ 난할구 배지 드롭으로 구성된다. 생쥐에서 실시한 기존 실험에서(Chung et al., Nature (2006) 439:216-219)는 단일 난할구로부터 ES 세포 유도에 세포 공동 배양이 중요하다고 하였다. 그러나, 이와 같은 기존 연구에서 이용된 응집 시스템을 이용할 수 없는데 그 이유는 생쥐와는 달리, 사람 난할구는 ES 세포와 단단한 응집체를 형성하지 않기 때문이다. 따라서, 드롭사이에 플레이트 바닥을 유리 모세관으로 긁어서 난할구-유도된 소포/클럼프를 포함하는 마이크로드롭을 미토마이신 C 처리된 생쥐 배아 섬유모세포(MEFs)와 GFP-포지티브 사람 배아 줄기(hES) 세포를 접종한 한 개 내지 두 개 주변 마이크로드롭으로 병합하였다.
최초 파생물 형성후에 배지의 약 절반은 파생물이 약 50-100 세포가 될 때까지 이틀에 한번씩 교환하였다. 비록 수일간에 걸쳐 초기 파생물은 일반적으로 상이한 형태의 세포를 포함하는데 우리는 몇 가지 피할수 없는 사실을 관찰하였다: (1) 영양막배엽(trophectoderm)을 닮은 세포를 인계받았다, (2) ES 세포를 처음에 닮은 세포가 분화되었다; (3) ES 유사 세포는 미분화 증식을 계속하였다.
이들 모든 결과는 사람 배로부터 ES 세포가 유도되는 경우에, 특히 면역절제술(immunosurgery)을 이용하여 영양막배엽을 제거하지 않고 고유 배반포를 플레이트할 경우에 전형적인 것이다. 가상 사람 ES 세포를 hES 배양 배지(매 1-2일마다 교체)에서 새로운 MEF 영양공급층상에서 기계적으로 계대하였다. 기계적 이산(dispersion)을 통하여 콜로니를 계대하고 충분한 세포가 생산되어 트립신에 순응하기 시작할 때까지 매 2-3일간 새로운 영양공급층으로 옮겼다. 콜로니 형태, 생장률, 과정 및 이용된 배양 배지는 배반포-유도된 ES 세포의 것들과 유사하다.
다음의 과정을 이용하여 사람 난할구로부터 유도된 세포의 핵형( Karyotyping)을 결정한다: 회수전날 대체한 ES 배양 배지에 젤라틴상에서 세포를 세포가 약 50% 합류될때까지 계대하였다. Colcemid (Invitrogen)를 배양물에 40분에 걸쳐 0.12㎕/㎖ 농도로 첨가하였다. 그 다음 세포를 PBS로 2회 세척하고 트립신처리하고, 10% FBS (Hyclone)이 포함된 DMEM (Invitrogen)에서 원심분리하였다. 0.075 M KCl를 펠렛에 첨가하고, 세포는 37℃에서 10분간 배양하였다. 그 다음 세포를 원심분리시키고, 10분간 3:1 메탄올/아세트산(Baker)으로 고정시키고, 다시 원심분리시키고, 이 고정액에 현탁시켰다. 10개 세포에서 G-밴딩을 이용하여 중기(metaphase) 세포상에서 세포유전적 분석을 실시하였다.
이들 실험 결과는 표 2에 나타내었다. 표 2의 10가지 결과는 Chung et al, Nature (2006) 439:216-219에서 설명하는 것과 같이 ES 세포를 분리하는 방법을 이용하여 얻은 것들이다. 19가지 ES 세포형 파생물과 두 가지 안정적인 사람 ES 세포주(MAOl 및 MA09)를 얻었다. MAOl 및 MA09 세포주는 7개월 이상 미분화 증식을 유지하였다. 초기 파생물에는 수일간에 걸쳐 일반적으로 상이한 형태의 세포를 포함하고 있지만, 사람 배반포로부터 ES 세포 유도의 전형적인 사실들이 관찰되었다. 예를 들면, 이용된 6개 등급 I/II 배중 두 개가 정상적인 핵형을 나타내는 안정적 hES 세포주를 만들었고 (line MAOl 46,XX; line MA09 46,XX; 도 3(h)) 그리고 25계대이상에서 까지 만능분화능의 분자 마커를 유지하였다(도 3(a) 내지 (g)). 이들 두 라인은 알칼리 포스파타제에 포지티브였고, Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (도 7)를 발현하였다. 마이크로세틀라이트(Microsatellite) 분석에서 실험실 다른 hES 세포주와 공동배양에 이용된 ES 세포주로 오염된 라인들은 배제하였다. 핵형 및 마이크로세틀라이트 분석에서 융합(fusion)(새로운 라인 두 개 모두 암컷이며, 공동 배양에 이용된 WAOl 사람 ES 세포는 수컷이다) (도 5(d)).
폴리메라제 쇄 반응(PCR) 분석으로 난할구-유도된 사람 ES 세포주 모두에서 GFP 및 Y-염색체 유전자 서열이 없다는 것을 확인하였다(도 5(a) 내지 (c)).
통상적인 PCR 반응은 lOOng 게놈 DNA, Amplitaq Gold 폴리메라제 (ABI3 Foster City, CA), FES/FPS, vWA31, D22S417, D10S526, D5S592 게놈 마이크로세틀라이트 서열(Coriell, Camden, NJ)에 특이적인 프라이머 쌍으로 실시하였다. 각 쌍에서 단일 프라이머들에는 6-Fam 형광 라벨로 엔드-라벨링하였다. 폴리메라제를 활성화시키기 위해 94℃에서 10분간 배양시킨 후에, 94℃, 45초; 56℃, 60초, 72℃ 60초의 사이클을 30회 실시하여 증촉시켰다. 라벨된 암플리콘을 분리시키고, ABI 3730 시퀀스를 이용하여 크기를 잰다. eGFP, 아멜로게닌(amelogenin), SRY 유전자증폭을 위해, 게놈 DNA를 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 분리시키고, 반응당 50㎕에서 200 ng DNA를 eGFP, 아멜로게닌 및 SRY 증폭에 이용하였다. eGFP 에 이용된 프라이머는 포워드(forward) 5'- TTGAATTCGCCACCATGGTGAGC-3'(SEQ ID NO: 1) 와 리버스(reverse) 5'- TTGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3'(SEQ ID NO: 2) 이며, PCR 반응은 이미 설명한 것과 같이 실시하였다. 성 결정을 위해, 아멜로게닌 및 SRY 유전자를 PCR를 통하여 증폭시켰다. 아멜로게닌에 이용된 프라이머는 포워드 5'- CTCATCCTGGGCACCCTGGTTATATC-3' (SEQ ID NO: 3), 리버스, 5'- GGTACC ACTTCAAAGGGGTAAGC AC-3' (SEQ ID NO: 4)이며, Y 염색체에 대해 1310bp 단편을 만들었고, X 염색체에 대해 1490bp 단편을 만들었다. Y-염색체 특이적 SRY 유전자의 경우에 이용된 프라이머는 포워드, 5'- GATCAGCAAGC AGCTGGGATACCAGTG-3' (SEQ ID NO: 5), 그리고 리버스, 5'- CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3' (SEQ ID NO: 6)이며, 330bp DNA 단편을 증폭시켰다. PCR 반응의 대조군으로, 미오게닌 프라이머, 포워드 5'- TCACGGTGGAGGATATGTCT-S' (SEQ ID NO: 7) 및 리버스 5'- GAGTCAGCTAAATTCCCTCG-3' (SEQ ID NO: 8)를 SRY PCR 반응에 포함시켰는데, 245bp 단편을 만들었다. PCR 산물들은 아가로즈 겔상에서 분리시켜 에티디움 브로마이드 착색으로 눈으로 확인할 수 있다.
6개의 등급I/II 배중 두 개(33%)(또는 35개 난할구중 2개; 등급 III-V배를 포함하는 91개 난할구중 2개)만이 hES 세포주를 생성하였지만, 성공률은 통상적인 방법에 의해 생성된 것과 유사하다. 우리는 난할구 파생의 최초 단계에서 조건을 최적화하면 성공률이 추가로 늘어날 수 있다고 본다.
단일 사람 난할구로부터 유도된 배아줄기세포
실험번호 이용된 배의 수 회수된
난할구의 수		 분할된
난할구의 수		 파생물 수 ES유사세포
파생물의 수		 형성된 ES
세포 수		 비고
1 20 10 4 1 0 0 w/o ES 공동배양
2 1 6 3 0 0 0 w/o ES 공동배양
3 2 11 6 5 4 1 ES 공동배양
4 1 7 6 1 1 0 ES 공동배양
5 2 12 7 3 3 0 ES 공동배양
6 2 12 7 5 4 1 ES 공동배양
7 2 11 7 4 3 0 ES 공동배양
8 1 6 3 0 0 0 ES 공동배양
9 1 4 3 3 2 0 ES 공동배양
10 2 12 7 6 2 0 ES 응집
(상이한기술)
16 91 53 28 19 2
실시예 2: 사람 ES 세포의 분화
in vitro 및 기형종에서 당분야에 공지된 기술을 이용하여 사람 ES 세포가 상이한 생식 층으로 분화하는 능력을 분석하였다.
간단하게 설명하면, in vitro 실험의 경우, 사람 ES 세포를 콜라게나제 또는 트립신으로 처리하여 분리시키고, 그 다음 배상체(embryoid body)(EB) 배지에서 영양공급세포없이 배양 배지에서 배양시켰다. 약 1주일 후에, ES 세포는 배상체(EB)를 형성하였다. 그 다음 EB를 4% 포름알데히드에 고정시키고, PBS로 세척한 후 파라핀에 박아둔 다음 절단하고, 조직 특이적 항체(원시 내배엽의 경우는 α-페토단백질, 중배엽의 경우 근육 악틴, 외배엽의 경우 βIII튜블린)를 이용하여 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 유도체 존재를 분석하였다. (도 4).
단일 난할구-유도된 사람 ES 세포는 in vitro에서 소요의 특정 치료용 세포로 분화될 수 있는데 예를 들면, Matrigel상에 재도말시킨 후에 전형적인 모세혈관과 유사한 구조(도 4e)를 형성하는 내피 세포-von Willebrand Factor (vWF)를 높은 수준으로 발현시키고, 아세틸화된 저밀도 리포프로테인(Ac-LDL)을 취입하는(도 4f)-를 포함한 세포로 분화될 수 있다. 망막 색소 상피(RPE) 클러스터도 흡착성 사람 ES 세포 배양물 및 배상체에서 나타나고, 이들을 이용하여 공지의 방법으로 계대가능한 RPE 라인을 확립하였다. 이와 같은 RPE 라인들은 착색된 표현형과 전형적인 “조약돌(cobblestone)"(도 4(g)), 베스트로핀 면역착색(도 4(h))을 나타내고, 베스트로핀, RPE65, CRALBP, PEDF을 발현시킨다(RT-PCR로 확인 (도 4(i) 및 도 8).
기형종을 유도하기 위해, 50-100개 hES 세포의 작은 클럼프를 배양물로부터 기계적으로 떼내고, 마취하에 6-8주령의 NOD-SCID 생쥐의 신장 캡슐하에 이식하였다. 2-3주후에, 신장을 제거하고, 4% 파라포름알데히드에 하룻밤동안 고정시키고, PBS에 24시간 동안 세척한 후 파라핀에 묻어, 잘라낸 후 세가지 생식 층: 외배엽, 중배엽, 내배엽의 존재에 대해 분석하였다.
또는, 약 1백만 hES 세포를 NOD-SCID 생쥐의 뒤허벅다리에 주사하였다. 약 2개월 후에, 쥐들을 죽이고, 기형종을 잘라낸 후 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 파라핀에 묻고, 나눈다.
상이한 생식 층의 존재는 분자 표식의 존재를 결정함으로써 확인하였다; 내배엽의 경우는 α-페토단백질, 중배엽의 경우 근육 악틴, 외배엽의 경우 βIII튜블린(도 1F-H). 기형종에는 신경로제트(외배엽), 간 및 조혈세포(중배엽), 간, 호흡기 및 내장 상피(내배엽)을 포함하는 이들 세가지 생식층의 조직을 포함하고 있었다(도 4(a)). 면역조직학적 분석을 위해, 세포를 2% 파라포름알데히드에 고정시키고, 0.1% NP-40로 삼투시키고, 1시간 동안 PBS(Invitrogen)에서 10% 염소 혈청, 10% 당나귀 혈청(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)으로 차단시켰다. 4℃에서 하룻밤동안 1차 항체들과 함께 항온처리하였다. 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS로 세척시킨 후에, 형광 라벨된 또는 바이오티닐화된 제2 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)를 한 시간 동안 첨가하였다; 일부 샘플들은 형광 라벨된 스트렙타아비딘(Amersham, Piscataway, NJ)으로 15분간 추가 항온처리하였다. PBS/Tween으로 추가 세척시킨 후에 샘플들을 Vectashield+DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 탑재시키고, 형광 현미경(Nikon)으로 관찰하였다. 제조업자의 지시에 따라 Vector Red kit (vector Laboratories, Burlingame, CA)를 이용하여 알칼리 포스파타제를 감지하였다. 이용된 항체들은 항-Oct-4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 항-SSEA-3, 항-SSEA-4 (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa), 항-TRA-I-60, 항-TRA-I-8 1 (Chemicon), 튜블린 β III (BABCO, Berkeley, CA), 항-α페토단백질(DACO), 및 항-평활근 악틴 (Sigma-Aldrich)이다.
난할구-유도된 세포주 MAOl 및 MA09은 특정 세포 타입으로 좀더 쉽게 분화될 수 있는 것으로 보인다. 예를 들면, 부정배(embryoid) 중간물질, 기질 영양공급층(stromal feeder layer) 또는 저밀도 계대(low-density passaging) 필요없이 신경 선조세포(progenitor)가 만들어졌다. 라미닌-피복된 기질상에 이동되어 한정배지(라미닌 및 염기성 섬유모세포 생장인자를 포함하는)에 유지되면, 이들은 Nestin, β III 튜블린 및 Pax6와 같은 뉴우런 및 뉴우런 선조세포 마커의 발현을 시작하였다. MA0l 사람 ES 세포는 WAOl (Hl)-GFP 세포보다 3-5배, WA09 (H9) 세포보다는 5-10배 효과적으로 조혈 콜로닌 형성 단위(CFU)를 형성하였다. MA09 사람 ES 세포는 조혈 분화에 대해 WA09세포와 유사한 포텐셜을 가지는 것으로 보이나 WA01-GFP 및 WA09 세포와 비교하였을 때 내피 계통으로의 분화 능력은 더 높다는 것을 알 수 있다.
실시예 3 ED 세포 생산
상기 표 2에서 볼 수 있는 것과 같이, 분리된 난할구로부터 배유도세포 생산은 ES 세포주의 생산보다 더 빈번하게 발생한다. 분할된 53개 분리된 난할구중 19개 배양물이 직접적인 분화된 세포 형을 만들었고, 단지 2개만 ES 세포주를 생성하였다. 도 6 에서는 직접 분화를 통하여 관찰된 분화된 세포 형태의 다양성을 보여준다.
실시예 4. ED 유도된 내배엽 및 췌장 베타 세포 생산
여기에서 설명된 것과 같이 분리된 난할구 또는 유사한 ED 세포를 높은 수준의 NODAL을 발현시키는 유사분열적으로 비활성인 영양공급세포에 첨가하거나 또는 NODAL와 동일한 수용체를 활성화시키는 TGF 베타 패밀리의 구성원 예를 들면 상대적으로 높은 수준은 악티빈-A를 발현시키나 인히빈 또는 폴리스타틴은 낮은 수준으로 발현시키는 CMO세포를 발현시키는 세포주에 첨가한다. 그 다음 세포를 0.5% 혈청이 보충된 DMEM 배지에 5일간 배양하였다. 5일 후에, 최종 내배엽 세포를 포함하는 생성된 세포를 유세포분류기(flow cytometry) 또는 CXCR4 수용체에 특이적 항체를 이용한 자석 비드 소팅과 같은 다른 친화력-근거한 세포 분류 기술을 이용하여 정제하고, 미국 특허 출원 11/025,893 (US 20050265976 공개-참고문헌으로 첨부)에서 설명한 것과 같은 분리된 소 췌장 베타 세포에서 얻은 세포 추출물에 대해 침투화시키고 노출시켰다. 국제 출원 PCT/US2006/0 13573 (April 11, 2006) 및 미국 출원 No. 60/835,779, (August 3, 2006)에서 설명하는 기술을 이용하여 베타 세포로 분화되도록 유도된 생성 세포를 클론하였다. 이들 세포는 사람 배아 줄기 세포주로부터 이들 세포의 분화를 위한 공지 기술을 이용하여 췌장 베타 세포 또는 베타 세포 전구체로 직접 분화시키거나 또는 유도세포 중배엽 세포주 상에 세포를 배양함으로써 직접 분화시킨다(국제 특허 출원 PCT/US2006/013573 April 11, 2006 및 미국 출원 60.835,779, August 3, 2006, 참고문헌으로 첨부함)
실시예 5. 배의 파괴없이 배아 줄기 세포 유도
임상적 목적으로 in vitro 수정에 의해 생성된 배를 얻었다.
전핵(Pronuclear) 및 다중 세포기 사람 배를 해동시키고, 5.5% CO2/5%O2/89.5%N2의 고습화된 배양기에서 파라핀 오일(Cooper Surgical Inc. Cat # 4008)하에 Quinn's 절단 배지(Cooper Surgical Inc., Cat # ARTl 526) 20㎕에서 8-10 세포기가 될 때까지 배양하였다.
산성 티로이드 용엑 또는 다중 Piezo 펄스를 이용하여 투명대를 파괴시키고, 개별 난할구는 나화(denuded)된 배로부터 배를 마이크로페펫으로 잡고, 피펫홀더를 부드럽게 태핑하여 기계적으로 분리하였다. 배는 저온 보존하였다.
분리된 난할구는 실시예 1과 같이 배양하였다.
실시예 6. 배아 줄기 세포의 유도를 위한 단일 난할구의 분리 및 착상전 유전적 진단
임상적 목적으로 in vitro 수정에 의해 생성된 배를 얻었다.
전핵(Pronuclear) 및 다중 세포기 사람 배를 해동시키고, 5.5% CO2/5%O2/89.5%N2의 고습화된 배양기에서 파라핀 오일(Cooper Surgical Inc. Cat # 4008)하에 Quinn's 절단 배지(Cooper Surgical Inc., Cat # ARTl 526) 20㎕에서 8-10 세포기가 될 때까지 배양하였다.
산성 티로이드 용엑 또는 다중 Piezo 펄스를 이용하여 투명대를 파괴시키고, 개별 난할구는 나화(denuded) 배로부터 배를 마이크로페펫으로 잡고, 피펫홀더를 부드럽게 태핑하여 기계적으로 분리하였다. 배는 저온 보존하였다.
분리된 난할구는 세포 분할을 지속한다. 하나의 후손 세포는 유전자 테스트에 이용되고 상이한 후손 세포는 실시예 1과 같이 배양하여 사람 ES 세포를 만든다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUNG, YOUNG LANZA, ROBERT KLIMANSKAYA, IRINA V. <120> DERIVATION OF EMBRYONIC STEM CELLS AND EMBRYO-DERIVED CELLS <130> 103080-P02-003 <140> 11/800,366 <141> 2007-05-03 <150> 60/839,622 <151> 2006-08-22 <150> 60/831,698 <151> 2006-07-17 <150> 60/798,065 <151> 2006-05-04 <150> 60/797,449 <151> 2006-05-03 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 ttgaattcgc caccatggtg agc 23 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ttgaattctt acttgtacag ctcgtcc 27 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 ctcatcctgg gcaccctggt tatatc 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ggtaccactt caaaggggta agcac 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 gatcagcaag cagctgggat accagtg 27 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 ctgtagcggt cccgttgctg cggtg 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 tcacggtgga ggatatgtct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 gagtcagcta aattccctcg 20 1

Claims (84)

  1. (a) 5mM미만의 포도당을 포함하는 배지에 사람 배로부터 수득한 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 생성시키고;
    (b) 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 분리된 배 세포 또는 태아 세포와 직간접적으로 접촉시키고;
    (c) (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하여 배아 줄기 (ES) 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 사람 배아 줄기 (ES) 세포를 생산하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, (a)는 5mM미만의 포도당을 포함하고, 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에 사람 배로부터 수득한 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만드는 것을 포함하는 것인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 난할구는 1회 또는 그 이상 분할하고, (b)의 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터는 두 개 또는 그 이상의 난할구 응집체를 포함하며, 이때 (b)는 두 개 또는 그 이상의 난할구 응집체를 분리된 배 세포 또는 태아 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, (c)는 최소 5mM의 포도당을 포함하고 최소 310mosm의 삼투몰농도를 가지는 배지에 (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, (a)는 사람 배로부터 수득된 두 개 또는 그 이상의 난할구를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 두 개 또는 그 이상의 난할구는 동일한 사람 배로부터 수득된 것인 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 두 개 또는 그 이상의 난할구는 상이한 사람 배로부터 수득된 것인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 사람 배로부터 난할구를 수득하면 난할구와 나머지 사람 배가 생성되는데, 나머지 사람 배는 난할구를 수득한 후에 파괴되지 않는 것인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 나머지 사람 배는 살아있는 것인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 나머지 사람 배는 저온 보존(cryopreserve)된 것인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구는 상실배 치밀화후에 사람 배로부터 수득되는 것인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구는 할강(blastocoel) 형성전에 사람 배로부터 수득되는 것인 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구는 4-10 세포 사람 배로부터 수득되는 것인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터 및 분리된 배 세포 또는 태아 세포는 응집체로 배양되지 않는 것인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 분리된 배 세포 또는 태아 세포와 간접 접촉시키는 것인 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, (a)는 5mM미만의 포도당을 포함하고 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지를 포함하는 마이크로드롭 배양물에 난할구를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 배 세포 또는 태아 세포는 마이크로드롭 배양물에서 배양되는 것인 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 배는 이미 냉동되었고, 사람 배를 난할구 수득전에 해동시키는 것인 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구는 사람 배 주변의 투명대(zona pellucida)를 부분적으로 또는 완전하게 제거함으로써 수득되는 것인 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구는 배를 고정화시키고, 난할구가 분리될 때까지 고정화된 배를 태핑하여 수득되는 것인 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 배 세포 또는 태아 세포는 사람 배 세포 또는 태아 세포인 것인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 사람 배 세포 또는 태아 세포는 사람 ES 세포, 사람 배-유도된 (ED) 세포, 사람 영양 줄기 (TS) 세포, 사람 배아 생식 (EG) 세포, 태반 줄기 세포, 양수 줄기 세포 또는 사람 배 암종 (EC) 세포에서 선택되는 것인 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 사람 배 세포 또는 태아 세포는 섬유모세포 영양공급층상에서 배양되는 것인 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구 또는 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터는 ES 세포의 분화를 저해시키는 인자와 함께 배양되는 것인 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 ES 세포를 생산하기 위해 난할구를 배양하는 단계동안에 난할구에서 내생 Oct-4를 활성화시키거나 또는 재조합 옥타머-결합 전사 인자 4 (Oct-4)를 난할구에 도입시키는 것인 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 ES 세포는 만능분화능인 것인 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 ES 세포는 옥타머-결합 전사 인자 4 (Oct-4), 알칼린 포스파타제, 단계 특이적 배아 항원 3 (SSEA-3), 단계 특이적 항원 4 (SSEA-4), 배틀 오브 트라팔가 (TRA-1-60) 및 배틀 오브 트라팔가 (TRA-1-81)에서 선택된 하나 또는 그 이상의 ES 세포 마커 단백질을 발현시키는 것인 방법.
  28. 제 1 항에 있어서, 난할구는 세포 분할을 하며 한 개 후손 세포는 유전자 테스트에 이용하고, 상이한 후손 세포는 사람 ES 세포를 생산하는데 이용하는 것인 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구로부터 유도된 ES 세포를 분리시키고, ES 세포주를 생성하기 위해 ES 세포를 배양하는 단계가 추가 포함된 것인 방법.
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  36. 원하는 분화된 세포 또는 조직을 생산하는 방법으로서,
    (a) 5mM미만의 포도당을 포함하는 배지에 사람 배로부터 수득한 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 생성시키고;
    (b) 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 분리된 배 세포 또는 태아 세포와 직간접적으로 접촉시키고;
    (c) (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하여 배아 줄기 (ES) 세포를 생산하고,
    (d) (c)에서 생산된 ES 세포를 원하는 세포 또는 조직으로 분화시키는 단계를 포함하고,
    사람 배로부터 난할구를 수득한 후 생성된 나머지 사람 배는 난할구를 수득한 후에 파괴되지 않는 것인 방법.
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  42. (a) 5mM미만의 포도당을 포함하는 배지에 사람 배로부터 수득한 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 생성시키고;
    (b) 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 분리된 배 세포 또는 태아 세포와 직간접적으로 접촉시키고;
    (c) (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하여 영양 줄기 (TS) 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 영양 줄기 (TS) 세포를 생산하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, (a)는 5mM미만의 포도당을 포함하고, 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에 사람 배로부터 수득한 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만드는 것을 포함하는 것인 방법.
  44. 제 42 항에 있어서, 난할구는 1회 또는 그 이상 분할하고, (b)는 두 개 또는 그 이상의 난할구 응집체를 분리된 배 세포 또는 태아 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  45. 제 42 항에 있어서, (c)는 최소 5mM의 포도당을 포함하고 최소 310mosm의 삼투몰농도를 가지는 배지에 (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  46. 제 42 항에 있어서, (a)는 사람 배로부터 수득된 두 개 또는 그 이상의 난할구를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 두 개 또는 그 이상의 난할구는 동일한 사람 배로부터 수득된 것인 방법.
  48. 제 46 항에 있어서, 두 개 또는 그 이상의 난할구는 상이한 사람 배로부터 수득된 것인 방법.
  49. 제 42 항에 있어서, 사람 배로부터 난할구를 수득하면 난할구와 나머지 사람 배가 생성되는데, 나머지 사람 배는 난할구를 수득한 후에 파괴되지 않는 것인 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 나머지 사람 배는 살아있는 것인 방법.
  51. 제 49 항에 있어서, 나머지 사람 배는 저온 보존된 것인 방법.
  52. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 배는 이미 냉동되었고, 사람 배를 난할구 수득전에 해동시키는 것인 방법.
  53. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구는 상실배 치밀화전에 사람 배로부터 수득되는 것인 방법.
  54. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구는 할강(blastocoel) 형성전에 사람 배로부터 수득되는 것인 방법.
  55. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구는 사람 배 주변의 투명대(zona pellucida)를 부분적으로 또는 완전하게 제거함으로써 수득되는 것인 방법.
  56. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 난할구로부터 유도된 TS 세포를 분리하는 단계가 추가로 포함된 것인 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 난할구로부터 유도된 TS 세포로부터 TS 세포주를 확립하는 단계가 추가로 포함된 것인 방법.
  58. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, TS 세포는 카우달 타입 호메오박스 2 (cdx-2), 섬유모세포 생장 인자 수용체 2 (fgfr2), 태반 락토겐 1 (PL-1) 및 사람 융모막 고나도트로핀 (hCG)에서 선택된 최소 하나의 TS 세포 마커 단백질을 발현시키는 것인 방법.
  59. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, TS 세포는 옥타머-결합 전사 인자 4 (Oct-4) 또는 α-페토 단백질 (AFP)을 발현시키지 않는 것인 방법.
  60. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 배 세포 또는 태아 세포는 사람 배 세포 또는 태아 세포인 것인 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 사람 배 세포 또는 태아 세포는 사람 배아 줄기 세포, 배-유도된 (ED) 세포, TS 세포, 사람 배 암종 (EC) 세포, 태반 줄기 세포, 양수 줄기 세포 또는 사람 배아 생식 (EG) 세포인 것인 방법.
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  65. 제 49 항에 있어서, 난할구로부터 유도된 TS 세포를 분리시키고, TS 세포주를 생성하기 위해 TS 세포를 배양하는 단계가 추가 포함된 것인 방법.
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  78. (a) 5mM미만의 포도당을 포함하는 배지에 사람 배로부터 수득한 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 생성시키고;
    (b) 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터의 생장 및 생존을 촉진시키는데 충분한 배지를 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터에 직간접적으로 접촉시키고;
    (c) (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하여 ES 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 사람 배아 줄기 (ES) 세포를 생산하는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, (a)는 5mM미만의 포도당을 포함하고, 310mosm미만의 삼투몰농도를 가지는 배지에 사람 배로부터 수득한 난할구를 배양하여 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 만드는 것을 포함하는 것인 방법.
  80. 제 78 항 또는 제 79 항에 있어서, 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터의 생장 및 생존을 촉진시키는데 충분한 배지는 분리된 배 세포 또는 태아 세포로 조건화된 배지인 것인 방법.
  81. 제 78 항에 있어서, 배양된 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터의 생장 및 생존을 촉진시키는데 충분한 배지에 아드레노코르티코트로픽 호르몬 (ACTH)이 보충된 것인 방법.
  82. 제 1 항 내지 제 3 항, 및 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는 최소 5mM의 포도당을 포함하고 최소 310mosm의 삼투몰농도를 가지는 배지에 (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  83. 제 42 항 내지 제 44 항, 및 제 46 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는 최소 5mM의 포도당을 포함하고 최소 310mosm의 삼투몰농도를 가지는 배지에 (b)의 두 개 또는 그 이상의 난할구 클러스터를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  84. 제 1 항, 제 42 항, 및 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서, (a)가 사람 배로부터 수득된 단일의 난할구를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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