ES2600555T3 - Reparación y regeneración de tejido ocular usando células derivadas del post parto - Google Patents

Abstract

Células multipotentes o pluripotentes aisladas del cordón umbilical humano para su uso en el tratamiento de una condición degenerativa ocular en un pacient, donde las células se pueden obtener del tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre y donde las células tienen las siguientes características: a. potencial de experimentar al menos 40 duplicaciones en cultivo; b. unión y expansión en un recipiente de cultivo de tejido recubierto o sin recubrir, en donde el recipiente de cultivo de tejido recubierto comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina o fibronectina; c. producción de vimentina y actina del músculo liso alfa; d. producción de cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, HLA-A,B,C, PDGFr-alfa y CD90 como se detectan por citometría de flujo; e. expresión aumentada de genes endógenos que codifican interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-XC) y proteína 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa en relación a la expresión endógena de interleucina 8, reticulon 1, ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X-C) y proteína 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa en una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal, o una célula de la médula ósea de las crestas ilíacas, como se caracterizan por matriz de oligonucleótidos; f. falta de producción de CD31, CD34, CD45, CD 117 y CD141 como se detectan por citometría de flujo; g. son capaces de auto-renovarse y expandirse; h. crecimiento en alrededor del 5% a alrededor del 20% de oxígeno; i. requieren L-valina para el crecimiento; j. carecen de expresión de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, B7-H2, HLA-G y CD 178 como se detectan por citometría de flujo; k. expresión de PD-L2 como se detecta por citometría de flujo; l. secreción de MCP-1, IL-6, GCP-2, IL-8, TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF y BDNF como se detectan por ELISA; m.falta de secreción de SDF-1 alfa, VEGF, TGF-beta2, ANG2 y PDGFbb como se detectan por ELISA; y n. una disminución en la expresión de los genes siguientes en relación a una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal, o una célula de de la médula ósea de las crestas ilíacas como se ensayan por micromatriz: caja homeótica 2 de la baja estatura; proteína 2 de choque térmico de 27 kDa; ligando 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de células del estroma); elastina; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); caja homeótica 2 de mesénquima; homólogo 1 de caja homeótica de "sine oculis"; cristalina, alfa B; activador de morfogénesis 2 asociado a "dishevelled"; proteína DKFZP586B2420; similar a neuralin 1; tetranectina; dominio tres de homología con src (SH3) y rico en cisteínas; gen 1 de translocación de linfocitos B, antiproliferativa; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripción 3 relacionado con el enanismo; proteína hipotética FLJ23191; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de procolágeno C-endopeptidasa; homólogo 7 de "frizzled"; gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C; proteína de caja homeótica iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína 2 de vesícula sináptica; ADNc FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 similar al receptor de citocinas; canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia/baja, subfamilia N, miembro 4; proteína DKFZP586L151; coactivador de la transcripción con motivo de unión a PDZ (TAZ); homólogo 2 de caja homeótica de "sine oculis"; proteína KIAA1034; respuesta de crecimiento precoz 3; caja homeótica de "distal less" 5; proteína hipotética FLJ20373; familia 1 de aldo-ceto reductasas, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; fibronectina 1; proencefalina; integrina, tipo beta 1 (con dominios de repetición similares a EGF); clon de ADNc EUROIMAGE 1968422; EphA3; proteína KIAA0367; receptor de péptido natriurético C/guanilato ciclasa C (receptor del péptido atrial natriurético C); proteína hipotética FLJ14054; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); proteína de membrana asociada a vesícula 5; proteína 1 de la matriz extracelular tipo fibulina que contiene EGF; similar a proteína 3 de interacción con BCL2/adenovirus E1B de 19 kDa; proteína 1 de unión a AE; polipéptido 1 de la subunidad VIIa de la citocromo c oxidasa (músculo); neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1; y proteína 2 de unión al factor de crecimiento insulinoide, 36 kDa.

Description

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Reparacion y regeneracion de tejido ocular usando celulas derivadas del post parto Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

Esta invention se relaciona con el campo de la terapia basada en celulas o regenerativa para enfermedades y desordenes oftalmologicos. Especlficamente, la invencion suministra composiciones farmaceuticas, dispositivos y metodos para la regeneracion o reparacion de celulas y tejidos en el ojo, usando celulas derivadas de postparto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Puesto que el ojo es un organo complejo del cuerpo, puede experimentar muchas enfermedades y otras condiciones perjudiciales que afectan su habilidad funcional normal. Muchas condiciones se asocian con el dano o degeneration de celulas oculares especlficas, y tejidos que se componen estas celulas. Por ejemplo, las enfermedades y condiciones degenerativas del nervio optico y de la retina son las causas mas comunes de ceguera en este momento. El dano o degeneracion de la cornea, los lentes y tejidos oculares asociados representan otra causa significativa de la perdida de vision a nivel mundial.

La retina contiene siete capas de celulas alternativas y procesos que convierten una senal luminosa a una

senal neural. Los fotones de ores de la retina y epitelio pigmentario de la retina (RPE - de la retina pigment

epithelium) componen una unidad funcional que, debido a muchos trastornos, pierde el balance por mutaciones geneticas o condiciones ambientales (incluyendo la edad) esto resulta en la perdida de foto receptores debido a apoptosis o degeneracion secundaria, que conlleva a una reduccion progresiva de la vista y, en algunos casos, a la ceguera (para una revision, refierase a, por ejemplo, Lund, R.D. et al., 2001, Progress in De la retina and Eye Research - Progreso en investigation De la retina y Ocular) 20: 415-449). Dos tipos de enfermedades oculares que se clasifican dentro de esta tendencia son la degeneracion medular relacionada con la edad (AMD - age-related macular degeneration) y retinosis pigmentaria (RP)

AMD es la causa mas comun de perdida de vision en los Estados Unidos en aquellas personas que tiene 50

anos o mas, y su prevalencia se incrementa con la edad. El principal trastorno en AMD parece deberse a la

disfuncion RPE y cambios en las membranas de Bruch, por ejemplo, deposition de llpidos, vinculacion cruzada de protelnas y baja en la unidad de nutrientes (referirse a Lund et al., 2001 supra). Una variedad de elementos podrlan contribuir a la degeneracion macular, incluyendo la composition genetica, la edad, la nutrition, el cigarrillo y la exposition a la luz.

La RP es considerada un trastorno hereditario - mas de 100 mutaciones han sido asociadas con la perdida de foto receptores (referirse a Lund et al., 2001, supra). Aunque la mayorla de mutaciones se enfocan en los foto - receptores, algunas afectan directamente las celulas RPE. Juntas, estas mutaciones afectan procesos tales como el trafico molecular entre foto receptores y celulas RPE y la foto transduction, por ejemplo.

Otras retinopatlas menos comunes, pero tambien debilitadoras podrlan involucrar una degeneracion celular progresiva que puede conllevar a la perdida de la vision y la ceguera. Estas incluyen, por ejemplo, retinopatla diabetica y la membrana neo vascular de la coroidea (CNVM - choroidal neovascular membrane). La retinopatla diabetica podrla calificarse como (1) no proliferativa o retinopatla de fondo, caracterizada por un incremento en permeabilidad capilar, edema, hemorragia, micro - aneurismas, y exudados, o (2) retinopatla proliferativa, caracterizada por una neo - vascularization que se extiende desde la retina hasta los vltreos, creando cicatrices, formaciones de tejidos fibrosos, y una separation potencial de la retina. En la CNVM, vasos sangulneos anormales que se derivan de los coroides se extienden a lo largo de las capas de la retina. Los vasos nuevos fragiles se rompen facilmente, causando que se acumulen sangre y fluido dentro de las capas de la retina.

Danos o degeneraciones progresivas del nervio optico y otros nervios relacionados al ojo incluyen otra causa importante de la perdida de la vision y de la ceguera. Un buen ejemplo es el glaucoma, una condition del ojo que se conforma de una combination de enfermedades graves que causan la perdida de la vision al danar el nervio optico. Una presion intraocular elevada (IOP - intraocular pressure) debido a un drenaje ocular inadecuado es la principal causa del glaucoma, pero tambien puede desarrollarse sin una IOP elevada. El glaucoma se puede desarrollar por el envejecimiento del ojo, o puede ocurrir como resultado de una lesion, inflamacion, tumor ocular, o en casos avanzados de cataratas o diabetes, o puede ser causado por ciertos farmacos, tal como los esteroides. Las principales caracterlsticas de la neuropatla optica del glaucoma incluyen los cambios de las propiedades de la cabeza del nervio optico, una reduction en el numero de celulas ganglionares retlnales sobrevivientes, y la perdida de la vision. Ha sido propuesto que una secuencia de eventos conllevan a la degeneracion de la cabeza del nervio optico con la muerte lenta de las celulas ganglionares retlnales que se observan en la enfermedad, y que la secuencia de eventos puede ser desacelerada o prevenida por medio del uso de agentes neuro - protectores (Osborne et al., 2003, Eur. J. Ophthalmol. 13 (Supp 3): S19-S26).

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El dano celular de las condiciones degenerativas tambien afecta a otras partes del ojo. Por ejemplo, las cataratas son una consecuencia de una u opacificacion gradual de los lentes cristalinos. Se cree que una vez que esto empieza, el desarrollo de las cataratas se desarrolla a lo largo de uno o mas senderos que culminan en el dano de las fibras de los lentes. Esta condition se la trata actualmente con una remocion y reemplazo quirurgicos de los lentes afectados. Otro ejemplo involucra a la cornea y a los componentes conjuntivos vecinos que conforman la superficie ocular. El epitelio del limbo, ubicado entre la cornea y la conjuntiva bulbar, contiene celulas madre epiteliales de la cornea. Una deficiencia celular epitelial del limbo (LECD - Del limbo epithelial cell deficiency) es una condicion que ocurre, por ejemplo, en el slndrome de Stevens-Jonhnson y quemaduras termales o qulmicas. LECD conlleva a menudo a un desbalance entre el epitelio corneal el epitelio conjuntivo en el cual la cornea es cubierta por celulas epiteliales conjuntivas invasoras, que comprometen severamente a la superficie de la cornea y afectan la agudeza visual (Nakamura, T. y Kinoshita, S., 2003. Cornea 22 (Supp. 1): S75-S80).

La reciente llegada de la terapia que se basa en celulas madres para la reparation y regeneration de tejidos suministran tratamientos prometedores para varias patologlas de degeneration de celulas y trastornos oculares que se mencionaron anteriormente. Las celulas madres son capaces de auto renovarse y diferenciarse para generar una variedad de linajes celulares. El trasplante de aquellas celulas puede utilizarse como una herramienta cllnica para reconstituir un tejido, restaurando de esa forma la funcionalidad fisiologica y anatomica. La aplicacion de la tecnologla de celulas madres es muy amplia, e incluye diseno de tejidos, entrega de terapia de genes, y terapia celular, en otras palabras, la entrega de agentes biologicamente terapeuticos a ubicaciones especlficas en una forma exogena por medio de celulas o componentes celulares vivientes suministrados que producen o contienen aquellos agentes (para una revision, referirse a Tresco, P.A. et al., 2000, Advanced Drug Delivery Reviews (Revisiones de Entregas Avanzadas de Farmacos) 42: 2-37).

La WO 2004/072273 describe celulas progenitoras humanas que se extraen de gelatina de Wharton.

Lodie et al. (2002) Tissue Engineering 8(5):739-751 describe el analisis de poblaciones distintas segun los informes de celulas madre derivadas de medula osea multipotentes.

Tremain et al. (2001) Stem Cells 19:408-418 describe el analisis microSAGE de 2.353 genes expresados en una colonia derivada de una celula individual de celulas madre mesenquimales humanas indiferenciadas.

La US 2003/032179 describe un metodo para extraer y recuperar celulas madre tipo embrionarias.

Mitchell et al. (2003) Stem Cells 21(1):50-60 describe que las celulas de la matriz de la gelatina de Wharton forma neuronas y glia.

La US 5.919.702 describe un metodo de production para tejido de cartllago que usa celulas aisladas de gelatina de Wharton.

La WO 03/068937 describe celulas madre tipo embrionarias derivadas de placenta mamlfera del post-parto.

Weiss et al. (2003) Experimental Neurology 182(2):288-299 describe celulas madre porcinas derivadas del tejido conector de la mucosa del cordon umbilical.

La US 2003/161818 describe cultivos, productos y metodos que usan celulas madre.

Van Hoffelen et al. (2003) Investigative Ophthalmology & Visual Science 44(1):426-434 describe la incorporation de celulas progenitoras del cerebro murinas en la retina de mamlferos en desarrollo.

Un obstaculo para materializar el potencial terapeutico de la tecnologla de celulas madre ha sido la dificultad de obtener suficientes numeros de celulas. Una fuente de celulas madre es el tejido embrionario o fetal. Las celulas madre embrionarias y progenitoras han sido aisladas de varias especies mamlferas, incluyendo humanos, y varios de esos tipos de celulas han mostrado su capacidad de auto renovation y expansion, as! como de diferenciacion a varios tipos de linajes celulares. En sistemas de modelos animales, se ha reportado que las celulas madre embrionarias se han diferenciado en fenotipos de celulas RPE, y tambien han mejorado la supervivencia de los foto receptores huespedes despues del trasplante (Haruta, M. et al., 2004, Investig. Ophthalmol. Visual Sci. 45: 1020-1025; Schraermeyer, U. et al., 2001, Cell Transplantation (Trasplante de Celulas) 10: 673-680). Sin embargo, la derivation de celulas madres de fuentes embrionarias o fetales ha levantado muchas preguntas eticas las cuales serla preferible evitar al identificar otras fuentes de celulas multi-potentes o pluri-potentes.

Un tejido adulto tambien puede producir celulas madres utiles para terapias ocular basada en celulas. Por ejemplo, las celulas madres de la retina y de la cornea en si pueden ser utilizadas para la terapia de reemplazo de celulas en el ojo. Adicionalmente, se ha reportado que las celulas madre neurales de los hipocampos se han integrado con la retina de huespedes, adoptando ciertas caracterlsticas neurales y gliales (refierase a Lund, R.L. et al., 2003, J. Leukocyte Biol. 74: 151-160). Las celulas madres neurales preparadas de la corteza fetal de rata han demostrado diferenciarse a lo largo de una ruta celular RPE despues del trasplante al espacio sub de la retina de ratas

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adultas Enzmann, V. et al., 2003, Investig. Ophthalmol. Visual Sci. 44: 5417-5422). Se ha reportado que celulas madres de medula osea se han diferenciado en celulas neurales de la retina y foto receptores despues de su trasplante en retinas huespedes (Tomita, M. et al., 2002, Stem Cells (Celulas Madre) 20: 279-283; Kicic, A. et al., 2003, J. Neurosci. 23: 7742-7749). Tambien se ha reportado una reconstruction de superficie ocular en un sistema de modelo de conejo, utilizando celulas madre epiteliales cultivadas de la mucosa Nakamura, T. & Kinoshita, S., 2003, supra). Aunque estos reportes son prometedores para el uso de celulas progenitoras y madre adultas en la terapia que se basen celulas para el ojo, debe mencionarse que las poblaciones de celulas madre adultas son en comparacion raras y a menudo solo se las puedo obtener por medio de procedimientos invasivos. Ademas, las celulas madre adultas pueden tener una habilidad mas limitada para expandirse en cultivos en comparacion con las celulas madres embrionarias.

Por lo tanto, existe una necesidad de fuentes alternas de provisiones adecuadas de celulas que tengan la habilidad de tener compatibilidad, aumentar o reemplazar las funciones celulares perdidas en el ojo. Un suministro confiable, bien caracterizado y abundante de poblaciones sustancialmente homogeneas de aquellas celulas serla una ventaja para una variedad de aplicaciones diagnosticas y terapeuticas en la reparation y regeneration ocular, incluyendo ensayos de analisis de farmacos, soporte trofico ex vivo o in vitro de celulas oculares y de otros tipos, y terapias que se basan en celulas in vivo.

RESUMEN DE LA INVENCION

La invention proporciona celulas multipotentes o pluripotentes aisladas del cordon umbilical humano para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene una condition degenerativa ocular, en donde las celulas se pueden obtener del tejido del cordon umbilical humano sustancialmente libre de sangre y en donde las celulas tienen las siguientes caracterlsticas:

a. potencial de experimentar al menos 40 duplicaciones en cultivo;

b. union y expansion en un recipiente de cultivo de tejido recubierto o sin recubrir, en donde el recipiente de cultivo de tejido recubierto comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina o fibronectina;

c. production de vimentina y actina del musculo liso alfa;

d. produccion de cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, HLA-A,B,C, PDGFr-alfa y CD90 como se detectan por citometrla de flujo;

e. expresion aumentada de genes endogenos que codifican interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X- C) y protelna 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa en relation a la expresion endogena de interleucina 8, reticulon 1, ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X-C) y protelna 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa en una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de la medula osea de las crestas illacas, como se caracterizan por matriz de oligonucleotidos;

f. falta de produccion de CD31, CD34, CD45, CD 117 y CD141 como se detectan por citometrla de flujo;

g. son capaces de auto-renovarse y expandirse;

h. crecimiento en alrededor del 5% a alrededor del 20% de oxlgeno;

i. requieren L-valina para el crecimiento;

j. carecen de expresion de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, B7-H2, HLA-G y CD 178 como se detectan por citometrla de flujo;

k. expresion de PD-L2 como se detecta por citometrla de flujo;

l. secretion de MCP-1, IL-6, GCP-2, IL-8, TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF y BDNF como se detectan por ELISA.

m. falta de secrecion de SDF-1 alfa, VEGF, TGF-beta2, ANG2 y PDGFbb como se detectan por ELISA; y

n. una disminucion en la expresion de los genes siguientes en relacion a una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de de la medula osea de las crestas illacas como se ensayan por micromatriz: caja homeotica 2 de la baja estatura; protelna 2 de choque termico de 27 kDa; ligando 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de celulas del estroma); elastina; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); caja homeotica 2 de mesenquima; homologo 1 de caja homeotica de “sine oculis”; cristalina, alfa B; activador de morfogenesis 2 asociado a “dishevelled”; protelna DKFZP586B2420; similar a neuralin 1; tetranectina; dominio tres de homologla con src (SH3) y rico en cistelnas; gen 1 de translocation de linfocitos B, antiproliferativa; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcription 3 relacionado con el enanismo; protelna hipotetica FLJ23191; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de procolageno C-endopeptidasa; homologo 7 de “frizzled”; gen hipotetico BC008967; colageno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C; protelna de caja homeotica iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoprotelna 2 de veslcula sinaptica; ADNc FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 similar al receptor de citocinas; canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia/baja, subfamilia N, miembro 4; protelna DKFZP586L151; coactivador de la transcripcion con motivo de union a PDZ (TAZ); homologo 2 de caja homeotica de “sine oculis”; protelna KIAA1034; respuesta de crecimiento precoz 3; caja homeotica de “distal less” 5; protelna hipotetica FLJ20373; familia 1 de aldo-ceto reductasas, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; fibronectina 1; proencefalina; integrina, tipo beta 1 (con dominios de repetition similares a EGF); clon de ADNc EUROIMAGE 1968422; EphA3; protelna KIAA0367; receptor de

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peptido natriuretico C/guanilato ciclasa C (receptor del peptido atrial natriuretico C); protelna hipotetica FLJ14054; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); protelna de membrana asociada a veslcula 5; protelna 1 de la matriz extracelular tipo fibulina que contiene EGF; similar a protelna 3 de interaccion con BCL2/adenovirus E1B de 19 kDa; protelna 1 de union a AE; polipeptido 1 de la subunidad Vila de la citocromo c oxidasa (musculo); neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; y protelna 2 de union al factor de crecimiento insulinoide, 36 kDa.

La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de una condicion degenerativa ocular, que comprende un portador farmaceuticamente aceptable y una cantidad efectiva para tratar la condicion degenerativa ocular de celulas multipotentes o pluripotentes de la invencion. La invencion tambien proporciona el uso de las celulas de la invencion en la fabricacion de un medicamento para tratar un paciente que tiene una condicion degenerativa ocular.

Esta invencion proporciona composiciones aplicables a terapia basada en celulas o regenerativa para enfermedades y trastornos oftalmicos. En particular, la invencion ofrece composiciones farmaceuticas para la regeneration o reparation de tejido ocular usando celulas derivadas del tejido del cordon umbilical humano.

Un aspecto de la divulgation presenta una celula derivada del postparto, derivada del tejido de la placenta o del cordon umbilical sustancialmente libre de sangre, donde la celula es capaz de auto renovarse y expandirse en cultivos y tiene el potencial de diferenciarse en una celula de un fenotipo neural; donde la celula requiere L - valina para crecer y es capaz de crecer con por lo menos alrededor de un 5% de oxlgeno. Esta celula tiene ademas una o mas de las siguientes caracterlsticas: (a) el potencial de por lo menos 40 doblajes en cultivos; (b) la adherencia y expansion en portadores de cultivos de tejidos no cubiertos o cubiertos con gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina, o fibronectina; (c) la production de por lo menos un factor de tejido, vimentina, y actina de musculo liso alfa; (d) la produccion de por lo menos uno de Cd 10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (e) la falta de produccion de por lo menos uno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, y HLA-DR,DP,DQ,, tal como se detecte por citometrla de flujo; (f) la expresion de un gen, que en relation a una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquima, o una celula de medula osea de cresta illaca, que se ha incrementado por lo menos un codigo genetico de: interleucina 8; reticulon 1; ligando de quimioquina (motivo CXC) 1 (actividad estimulante de crecimiento de la melanoma, alfa); ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 6 (protelna quimiotactica de granulocitos 2); ligando de quimioquina (motivo C-X C-) 3; factor de necrosis tumoral, protelna inducida por alfa-3; miembro 2 de la super - familia Lectina tipo C; Tumor de Wilms 1; miembro A2 de la familia aldehldo deshidrogenasa 1; renina; receptor de lipoprotelna oxidada de baja densidad 1; IMAGEN: 4179671 de clon de Homo sapiens; protelna quinasa C zeta; protelna hipotetica DKFZp564F013; reduction en el cancer de ovario 1; gen de Homo sapiens del clon DKFZp547k1113; (g) expresion de un gen, que en relacion a una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquima, o una celula de medula osea de cresta illaca, que tiene reducida por lo menos una de las siguientes codificaciones geneticas: homeobox de corta estatura 2; protelna 27 kDa de golpe de calor 2; ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 12 (factor derivado de celula estromal 1); elastina (estenosis aortica supra - valvular, el slndrome de Williams-Beuren); ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); homeobox de mesenquimas 2 (homeobox que previene el crecimiento); homeobox homologo de oculis sine 1 (Drosophila); cristalina, alfa B; activador asociado con la morfogenesis desalineada 2; Protelna DKFZP586B2420; similar al neuralin 1; tetranectina (protelna que vinculadora de plasminogenos); src arbol de homologla tres (SH3 - src homology three) y dominio rico en cistelna; hidroxilasa - 25 de colesterol; factor de transcription relacionado con enanismo - 3; receptor interleucina 11, alfa; potenciador de endopeptidasa C de procolageno; homologo de frizzled (ensortijado) 7 (Drosophila); gen hipotetico BC008967; colageno, de tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabrachion); protelna homeobox iroquois 5; hephaestin; integrina, beta 8; glicoprotelnas de veslculas sinapticas 2; neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; protelna vinculadora del factor de crecimiento similar a la insulina 2, 36 kDa; ADNc FLJ12280 fis de Homo sapiens, clon MAMMA1001744; factor similar al receptor de citosina 1; canales activados por el calcio de conduction intermedia / pequena del potasio, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; co - activador transcripcional con motivo de union de PDZ-(TAZ); homologo de homeobox oculis sine 2 (Drosophila); Protelna KIAA1034; protelna de membrana asociada a la veslculas 5 (myobrevin); protelna matricial extracelular similar a la -fibulina que contiene EGF- 1; respuesta de crecimiento temprano 3; homeobox cercana 5; protelna hipotetica FLJ20373; familia aldoketo reductasa 1, miembro C3 (hidroxiesteroide deshidrogenasa lafa 3, tipo II); biglicano; co - activador transcripcional con motivo de vinculacion PDZ-(TAZ); fibronectina 1; proencefalina; integrina, tipo beta-1 (con dominios repetidos similares a EGF); insertion de tamano completo del ADNc del clon EUROIMAGE 1968422 en el ARNm de homo sapiens; EphA3; protelna KIAA0367;receptor de peptidos natriureticos C / guanilato ciclasa C (receptor de peptidos atrionatriuretico C); protelna hipotetica FLJ14054; ARNm de homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); BCL2 / protelna tipo tres que interactua con el adenovirus E1B 19kDa; protelna de vinculacion de AE 1; polipeptido de la subunidad VIIa citocromo de oxidasa del citocromo c (musculo); similar al neuralin 1; gen de translocation celular B 1; protelna hipotetica FLJ23191; y DKFZp586L151; (h) secretion de por lo menos uno de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1a, RAnTeS, y TIMP1; y (i) la falta de secrecion de por lo menos uno de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1b, 1309, MDC, y VEGF, tal como se detecto con ELISA.

La celula derivada de postparto de la invencion es una celula derivada del tejido del cordon umbilical. En otras realizaciones de la divulgacion es una celula derivada de la placenta. En realizaciones especlficas de la divulgacion, la

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celula tiene las caracterlsticas identificativas de cualquiera de: tipo de celula PLA 071003 (P8) (Numero de Acceso ATCC PTA-6074); tipo de celula PLA 071003 (P11) (Numero de Acceso ATCC PTA-6075); tipo de celula PLA 071003 (P16) (Numero de Acceso ATCC PTA-6079). En realizaciones especlficas de la invention, la celula tiene todas las caracterlsticas identificativas de cualquiera de tipo de celula UMB 022803 (P7) (Numero de Acceso ATCC PTA-6067); o el tipo de celula UMB 022803 (P17) (Numero de Acceso ATCC PTA-6068).

En ciertas realizaciones, las celulas derivadas del cordon umbilical humano se alslan en la presencia de una o mas actividades enzimaticas que incluyen la actividad metaloproteasa, la actividad mucolltica y la actividad proteasa neutral. Preferiblemente, las celulas tienen un cariotipo normal, que se mantiene mientras las celulas son pasadas en cultivos. Las celulas derivadas de postparto de la invencion incluyen a cada una de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, y HLA-A,B,C y no incluye ninguna de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, o HLA-DR,DP,DQ, como se detecta por citometrla de flujo.

Otro aspecto de la invencion destaca una poblacion celular que incluye las celulas derivadas del cordon umbilical humano como se acaba de describir. En una realization, la poblacion de las celulas derivadas del cordon umbilical es sustancialmente homogenea. En una realizacion especlfica, la poblacion incluye una llnea celular clonica de celulas derivadas del cordon umbilical humano. En otra realizacion, la poblacion es heterogenea y se conforma de celulas derivadas del cordon umbilical humano y por lo menos otro tipo de celulas. En ciertas realizaciones, el otro tipo de celula puede ser astrocitos, oligodendrocitos, neuronas, progenitoras neurales, celulas madres neurales, celulas madre epiteliales de la retina, celulas madre epiteliales corneales u otras celulas madre multipotentes. En otras realizaciones, la poblacion celular es cultivada en contacto con uno o mas factores que estimulan la diferenciacion de celulas madres hacia un linaje neural o epitelial.

Tambien se destaca de acuerdo con esta divulgation un lisado celular preparado de celulas derivadas de postparto. El lisado de celulas podrla separarse a una fraction de membrana enriquecida y a una fraction celular soluble. La divulgacion tambien destaca una matriz extracelular producida por las celulas derivadas del postparto, as! como un medio acondicionado en el cual las celulas han crecido.

Otro aspecto de la invencion destaca las celulas para el uso en un metodo para el tratamiento de pacientes que tengan condiciones oculares degenerativas, que involucra la administration al paciente de celulas multipotentes o pluripotentes aisladas de tejidos de cordon umbilical de postparto, en una cantidad efectiva para tratar la condition ocular degenerativa. En ciertas realizaciones, la condicion ocular degenerativa es una condicion aguda tal como el trauma cerebral, el trauma del nervio optico o una lesion ocular. En otras realizaciones, es una condicion degenerativa cronica o progresiva, tal como la degeneration macular, retinosis pigmentarla, retinopatla diabetica, glaucoma o deficiencia celular epitelial del limbo. En ciertas realizaciones, las celulas se inducen in vitro para diferenciarse a celulas de linajes neurales o epiteliales antes de su administracion.

En ciertas realizaciones, las celulas son administradas con por lo menos otro tipo de celulas, como en el caso de asctrocitos, oligodendrocito, neuronas, progenitores neurales, celulas madre neurales, celulas madre epiteliales de la retina, celulas madre epiteliales corneales, u otro tipo de celula madre multipotente. En esta realizaciones, el otro tipo de celula puede ser administrado simultaneamente con, o antes, o despues, de las celulas derivadas de postparto. Asimismo, en estas otras realizaciones las celulas son administradas con por lo menos otro agente, tal como un farmaco para terapia ocular, u otro agente acompanante beneficioso tal como agentes anti inflamatorios, agentes anti apopticos, antioxidantes o factores de crecimiento. En estas realizaciones, el otro agente puede ser administrado simultaneamente, antes, o despues de las celulas postparto.

En varias realizaciones, las celulas son administradas a la superficie de un ojo, o son administradas al interior de un ojo o a una ubicacion cercana al ojo, por ejemplo, atras del ojo. Las celulas pueden ser administradas por medio de una canula o desde un dispositivo implantado en el cuerpo del paciente dentro o en la proximidad del ojo, o pueden ser administradas por implantes de una matriz o supercontigo que contenga a las celulas.

Otro aspecto de la invencion destaca una composition farmaceutica para su uso en el tratamiento de pacientes que tengan condiciones degenerativas oculares, que involucra un portador farmaceuticamente aceptable y celulas multipotentes o pluripotentes aisladas de tejido de cordon umbilical postparto en una cantidad efectiva para tratar la condicion degenerativa ocular. Las celulas de postparto son celulas derivadas del tejido del cordon umbilical humano como se acaba de describir. La condicion degenerativa ocular puede ser una condicion aguda, cronica o progresiva. En ciertas realizaciones, la composicion incluye celulas que han sido inducidas in vitro para diferenciarse en celulas de linaje neural o epitelial antes de la formulation de la composicion.

En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica incluye por lo menos otro tipo de celulas, tal como asctrocitos, oligodendrocito es, neuronas, progenitores neurales, celulas madre neurales, celulas madre epiteliales de la retina, celulas madre epiteliales corneales, u otra celula madre multipotente. En esta u otras realizaciones, la composicion farmaceutica incluye por lo menos otro agente, tal como un farmaco para tratar desordenes degenerativos oculares u otro activo acompanante beneficioso, por ejemplo, agentes anti inflamatorios, agentes anti apopticos, antioxidantes o factores de crecimiento.

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En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas son formuladas para su administracion a la superficie del ojo. Alternativamente, pueden ser formuladas para su administracion en el interior del ojo o en proximidad al ojo (por ejemplo, atras del ojo). Las composiciones tambien pueden ser formuladas como una matriz o un supercontigo que contenga las celulas.

De acuerdo a otro aspecto de la invencion, se incluye un equipo para su uso en el tratamiento de pacientes que tengan condiciones degenerativas oculares. El equipo se conforma de un portador farmaceuticamente aceptable, una poblacion de celulas multipotentes o pluripotentes de la invencion aisladas de tejido de cordon umbilical de postparto, e instrucciones para utilizar el equipo en metodos para tratar a los pacientes. El equipo tambien puede contener uno o mas componentes adicionales, tales como reactivos e instrucciones para el cultivo de celulas, o una poblacion de por lo menos otro tipo de celulas, o uno o mas activos utiles en el tratamiento de condiciones degenerativas oculares.

De acuerdo a otro aspecto de la divulgacion, se suministra un metodo para tratar a pacientes que tengan condiciones degenerativas oculares, que involucra la administracion a los pacientes de una preparacion hecha de celulas multipotentes o pluripotentes aisladas de placentas o cordones umbilicales de postparto, en una cantidad efectiva para tratar las condiciones degenerativas oculares, cuya preparacion involucra un lisado de celulas (o una fraccion de esta) o un medio acondicionado en el cual crecieron las celulas, o una matriz extracelular de celulas. Preferiblemente, las celulas son derivadas de postparto como se acaba de describir. En otro aspecto, la divulgacion destaca una composicion farmaceutica que incluye un portador farmaceuticamente aceptable y una preparacion hecha de celulas de postparto, que podrla ser un lisado celular (o una fraccion de este) de celulas postparto, en una matriz extracelular de estas o un medio acondicionado en el cual se cultivaron las celulas de postparto. Los equipos para practicar este aspecto de la divulgacion tambien estan incluidos. Esto podrla incluir uno o mas portadores farmaceuticamente aceptables u otro activo o reactivo, uno o mas lisados de celulas o su fraccion, una matriz extracelular o un medio acondicionado de celulas de postparto, e instrucciones para el uso de los componentes del equipo.

Otro aspecto de la invencion destaca un metodo para incrementar la supervivencia, el crecimiento o la actividad de las celulas a ser trasplantadas para tratar desordenes oculares degenerativos. El metodo involucra el cocultivo de celulas para el trasplante de celulas cultivadas derivadas de tejidos de la placenta o umbilicales de postparto, bajo condiciones efectivas para incrementar la supervivencia, el crecimiento o la actividad de las celulas a ser trasplantadas. Preferiblemente, las celulas de postparto son las celulas descritas anteriormente. Un equipo para practicar el metodo tambien se provee. El equipo incluye las celulas cultivadas de postparto e instrucciones para co- cultivarlas para su trasplante con las celulas postparto bajo condiciones efectivas para incrementar la supervivencia, el crecimiento o la actividad de las celulas a ser trasplantadas.

Otras caracterlsticas y ventajas de esta invencion seran evidentes despues de leer las descripciones y ejemplos detallados a continuacion.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS Definiciones

A continuacion se establecen varios terminos usados a lo largo de la especificacion y tambien se definen las declaraciones.

Las celulas madre son celulas que no han sido diferenciadas y que se definen por la habilidad de auto - renovarse individualmente, y de diferenciarse para producir celulas de progenie, incluyendo progenitores auto renovables, progenitores no renovables, y celulas diferenciadas terminalmente. Las celulas madres tambien se caracterizan por su habilidad a diferenciarse in vitro a celulas funcionales de varios linajes celulares de multiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), as! como para dar lugar a tejidos de multiples capas germinales despues de su trasplante, y para contribuir sustancialmente a la mayorla, o tal vez a todos, los tejidos despues de su inyeccion a blastocistos.

Las celulas se clasifican de acuerdo a su desarrollo potencial como: (1) totipotentes; (2) pluripotentes; (3) multipotentes; (4) oligopotentes; y (5) unipotentes. Las celulas totipotentes pueden dar lugar a todos los tipos de celulas embrionarias y extra embrionarias. Las celulas pluripotentes pueden dar lugar a todo tipo de celulas embrionarias. Las celulas multipotentes incluyen aquellas que pueden dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, organo o sistema fisiologico particular (por ejemplo, las celulas madre hematopoyeticas (HSC - hematopoietic stem cells) pueden producir progenies que incluyen HSC (auto renovacion), progenitores oligopotentes restringidas a celulas sangulneas, y todo tipo de celulas y elementos (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre). Las celulas que son oligopotentes pueden dar lugar a un subconjunto mas restringido de linajes celulares que las celulas madres multipotentes; y las celulas que son un y potentes pueden dar lugar a un linaje individual de celulas (por ejemplo, celulas madre espermatogenicas).

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Las celulas madre tambien se categorizar en base a la fuente de donde fueron obtenidas. Una celula madre adulta es generalmente una celula no diferenciada multipotente encontrada en el tejido con multiples tipos de celulas diferenciadas. La celula madre adulta puede renovarse. Bajo circunstancias normales, tambien puede diferenciarse para producir tipos especializados de celulas del tejido donde se origino, y posiblemente de otros tipos de tejidos. Una celula madre embrionaria es una celula pluripotente de la masa celular interna de un embrion en etapa de blastocisto. Una celula madre fetal es una que se origina del tejido o membranas fetales. Una celula madre postparto es una celula multipotente o pluripotente que se origina sustancialmente del tejido embrionario disponible despues de nacimiento, especlficamente, de la placenta y del cordon umbilical. Se ha descubierto que estas celulas poseen propiedades caracterlsticas de celulas madre pluripotentes, incluyendo una proliferation rapida y el potencial para diferenciarse en muchos linajes celulares. Las celulas madre postparto podrlan ser entregados por la sangre (por ejemplo, como aquellas obtenidas de la sangre del cordon umbilical) o no entregados por la sangre (por ejemplo, como aquellos obtenidos de tejidos sin sangre del cordon umbilical y de la placenta.

El tejido embrionario es definido tlpicamente como tejido que se origina del embrion (que en los humanos corresponde al perlodo desde la fertilization hasta alrededor de seis semanas de desarrollo. El tejido fetal se refiere al tejido que se origina del feto, que en los humanos corresponde al perlodo desde alrededor de seis semanas de desarrollo hasta el parto. El tejido extra embrionario es el tejido asociado con, pero que no se origina de, el embrion o el feto. Los tejidos embrionarios incluyen membranas extra embrionarias (el corion, el amnios, el saco vitelino y los alantoides), el cordon umbilical y la placenta (que en si forman el corion y la basal decidua materna).

La diferenciacion es el proceso por el cual una celula no especializada (“no comprometida”) o menos especializada adquiere las caracterlsticas de una celula especializada, tal como una celula nerviosa o una celula de musculo, por ejemplo. Una celula diferenciada es una que ha tomado una position mas especializada (“comprometida”) dentro del linaje de una celula. El termino comprometida, cuando se lo aplica al proceso de diferenciacion, se refiere a una celula que ha procedido en la ruta de diferenciacion a un punto en el cual, bajo circunstancias normales, continuara a diferenciarse a un tipo de celula especlfico o subconjunto de tipos celulares, y no puede, bajo circunstancias normales diferenciarse a un tipo de celula diferente o revertirse a un tipo celular menos diferenciado. La des - diferenciacion se refiere al proceso por el cual una celula se revierte a una posicion menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una celula. Tal como se usa aqul, el linaje de una celula define la herencia de la celula, en otras palabras, de que celula proviene y a que celulas puede dar lugar. El linaje de una celula ubica a esta dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciacion.

En un sentido amplio, una celula progenie ahora es una celula que tiene la capacidad de crear progenie que es mas diferenciada que ella misma, y que a la vez retienen la capacidad para reabastecer la reserva de progenitores. Por tal definition, las celulas madre en si tambien son celulas progenitoras, tal como son los precursores mas inmediatos a las celulas diferenciadas terminalmente. Cuando esta invention se refiere a las celulas, en el sentido amplio que se usa continuation, esta definicion amplia de celula progenitora puede ser utilizada. En un sentido menos amplio, una celula progenitora se define a menudo como una celula que es intermedia en el sendero de diferenciacion, en otras palabras, surge de una celula madre y es intermedia en la production de un tipo de celula o subconjunto de tipos de celulas maduras. Este tipo de celula progenitora generalmente no puede auto renovarse. De esa misma forma, si este tipo de celula es referenciado en este documento, se usara el termino celula progenitora no renovable o como una celula progenitora intermedia o una celula precursora.

Tal como se usa aqul, la frase diferenciarse en un linaje o fenotipo ocular se refiere a una celula que se vuelve parcial o completamente comprometida a un fenotipo ocular especlfico, incluyendo sin limitarse a, celulas madre de la retina y de la cornea, celulas epiteliales del pigmento de la retina y del iris, foto receptores, ganglios de la retina y otros linajes neurales opticos (por ejemplo, glia de la retina, microglia, astrocitos, celulas de Mueller), de celulas que formen lentes cristalinos y celulas epiteliales de la esclera, cornea, limbo y conjuntiva. La frase diferenciarse en un linaje o fenotipo neural se refiere a una celula que se vuelve parcialmente o completamente comprometida a un fenotipo neural especlfico del CNS o PNS, en otras palabras, una neurona o una celula glial, o la segunda categoria incluyendo pero sin limitarse a asctrocitos, oligodendrocitos, celulas Schwann y micro glia.

Las celulas que se usan como ejemplo aqui y que son preferidas para el uso en esta invencion son referidas generalmente como celulas derivadas de postparto (o PPDCs - postpartum derived cells). Tambien podrian ser referidas a veces mas especlficamente como celulas derivadas de tejido de cordon umbilical o celulas derivadas de la placenta de la divulgation (UDCs - umbilical cord tissue-derived cells o PDCs - placenta-derived cells). Adicionalmente, las celulas pueden ser descritas como celulas madre no embrionarias o celulas progenitoras no embrionarias, siendo usado el segundo termino en un sentido mas amplio. El termino derivado es usado para indicar que las celulas han sido obtenidas de su fuente biologica y han sido cultivadas o manipuladas de otra forma in vitro (por ejemplo, cultivadas en un Medio de Crecimiento para expandir su poblacion y / o producir una linea celular). La manipulation in vitro de celulas madre umbilicales y las caracterlsticas unicas de las celulas derivadas de tejido de cordon umbilical de esta invencion se describen en detalle a continuacion. Las celulas aisladas de tejido de cordon umbilical de postparto con otros metodos tambien son consideradas adecuadas para su uso en esta invencion. Estas otras celulas son referidas aqui como celulas de postparto (en vez de celulas derivadas de postparto).

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Se usan varios terminos para describir las celulas en cultivos. Los cultivos celulares se refieren en general a celulas tomadas de un organismo vivo y cultivadas bajo condiciones controladas (“en cultivos” o “cultivadas”). Un cultivo celular primario es un cultivo de celulas, tejidos, u organos tomados directamente de un organismo antes del primer sub cultivo. Las celulas se expanden en el cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento bajo condiciones que facilitan el crecimiento y / o division celular, resultando en una poblacion celular mas grande. Cuando las celulas se expanden en cultivos, la tasa de proliferation de las celulas se mide a veces por la cantidad de tiempo necesario para que las celulas se doblen en numero. Esto es referido como tiempo de doblaje.

Una llnea celular es una poblacion de celulas formada por uno o mas sub - cultivos de un cultivo celular primario. Cada ronda de sub cultivos se conoce como un pase. Cuando las celulas son sub - cultivadas, se dice que han sido pasadas. Una poblacion especlfica de celulas, o una llnea celular, tambien son referidas a o caracterizadas por el numero de veces que han sido pasadas. Por ejemplo, una poblacion celular cultivada que ha sido pasada 10 veces puede ser referida como un cultivo P 10. El cultivo primario, en otras palabras, el primer cultivo despues del aislamiento de las celulas del tejido, es designado P0. Despues del primer sub cultivo, las celulas son descritas como un cultivo secundario (P1 o pase uno) despues de segundo sub cultivo, las celulas se vuelven un cultivo terciario (P2 o pase dos), y as! progresivamente. Se entiende para aquellas personas en la industria que podrlan existir muchos doblajes poblacionales durante el perlodo de pases; por lo tanto el numero de doblajes poblacionales de un cultivo es mayor que el numero de pases. La expansion de las celulas (en otras palabras, el numero de doblajes poblacionales) durante el perlodo entre los pases depende de muchos factores, incluyendo sin limitarse a la densidad de siembra, el medio del sub estrato, las condiciones de crecimiento y el tiempo entre pases.

Un medio acondicionado es un medio en el cual una celula o poblacion especlfica de celulas ha sido cultivada, y despues removida. Cuando las celulas son cultivadas en un medio, puede que secreten factores celulares que suministraran soporte trofico a las otras celulas. Aquellos factores troficos incluyen, pero no se limitan a hormonas, citoquinas, matrices extracelulares (ECM - extracellular matrix), protelnas, veslculas, anticuerpos y granulos. El medio que contiene los factores celulares es el medio acondicionado.

Generalmente, un factor trofico se define como una sustancia que promueve la supervivencia, el crecimiento, la diferenciacion, la proliferacion y / o la maduracion de una celula, o estimula un incremento en actividad de una celula. La interaction entre celulas por medio de factores troficos puede ocurrir entre celulas de tipos diferentes. La interaccion de celulas por medio de factores troficos se encuentra esencialmente en todo tipo de celulas, y es una forma particularmente significativa de comunicacion entre los tipos de celulas neurales. Los factores troficos tambien pueden funcionar en una forma autocrina, en otras palabras, una celula puede producir factores troficos que afectan su propia supervivencia, crecimiento, diferenciacion, proliferacion y / o maduracion.

Cuando se haga referencia a celulas vertebradas cultivadas, el termino senectud (tambien senectud replicante o senectud celular) se refiere a una propiedad atribuible a cultivos celulares finitos; especlficamente, su incapacidad de crecer mas alla de un numero finito de doblajes de poblacion (a veces referido como el llmite de Hayflick). Aunque la senectud celular fue descrita usando celulas tipo fibroblastos, la mayorla de celulas humanas normales que pueden crecer exitosamente en un cultivo experimentan senectud celular. La duration de vida in vitro de los diferentes tipos celulares varla, pero la maxima duracion de vida es comunmente menos de 100 doblajes de poblacion (este es el numero de doblajes totales para todas las celulas en el cultivo para alcanzar la senectud y por lo tanto que este cultivo ya no podra dividirse mas despues de eso). La senectud no depende de un tiempo cronologico, pero en vez de eso se mide por el numero de divisiones celulares, o doblajes de poblacion, que el cultivo ha experimentado. Por lo tanto, las celulas se vuelven inactivas al remover factores esenciales de crecimiento y pueden retomar el crecimiento y la division cuando los factores de crecimiento son re-introducidos, y despues de eso experimentarlan la misma cantidad de doblajes que si hubieran crecido continuamente. Similarmente, cuando las celulas son congeladas en nitrogeno llquido despues de varios numeros de doblajes de poblacion y despues se descongelan y se cultivan, estas experimentan sustancialmente el mismo numero de doblajes que si las celulas se hubieran mantenido sin congelarse en el cultivo. Las celulas que alcanzan la senectud no estan muertas o son moribundas; estas son de hecho resistentes a la muerte programada celular (apoptosis), y se han mantenido en su Estado no divisorio por perlodos tan largos como tres anos. Estas celulas estan muy vivas y son muy activas metabolicamente, pero no se dividen. El Estado no divisorio de las celulas que han alcanzado la senectud todavla no ha podido ser reversible con ningun agente biologico, qulmico o viral.

Los terminos ocular, oftalmico y optico son usados intercambiablemente en este documento para definir “de, o acerca, o relacionado con el ojo”.

El termino condition (o afliccion) ocular degenerativa es un termino inclusivo que abarca condiciones, desordenes o enfermedades agudas y cronicas del ojo, incluyendo la conexion neural entre el ojo y el cerebro, relacionado con el dano, degeneracion o perdida celular. Una condicion ocular degenerativa puede relacionarse con la edad, o podrla resultar de una lesion o un trauma, o podrla estar relacionada a una enfermedad o afeccion especlfica. Condiciones degenerativas oculares agudas incluyen, pero no estan limitadas a, condiciones asociadas con la muerte o el compromiso celular que afecte el ojo incluyendo condiciones que surjan de insuficiencia cerebrovascular, trauma cerebral focal o difuso, dano cerebral difuso, condiciones infecciosas o inflamatorias del ojo, ruptura o separation de la retina, lesiones intraoculares (contusion, penetration, compresion, laceration) u otra

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lesion flsica (por ejemplo quemadas flsicas o qulmicas). Las condiciones degenerativas oculares cronicas (incluyendo condiciones progresivas) incluyen, pero no estan limitadas a, retinopatlas y otros desordenes de la retina / macro - oculares tales como retinosis pigmentaria (RP), degeneracion macular relacionada con la edad (AMD - age-related macular degeneration), membrana neovascular coroidea (CNVM - choroidal neovascular membrane); retinopatlas tales como retinopatla diabetica, retinopatla oclusiva, retinopatla de celulas falciformes y retinopatla hipertensiva, oclusion de vena de la retina central, estenosis de la arteria carotida, neuropatlas opticas tales como glaucoma y slndromes relacionados; desordenes de los lentes y del ojo exterior, por ejemplo, deficiencia de las celulas madre del limbo (LSCD - del limbo stem cell deficiency), tambien referida como deficiencia celular epitelial del limbo (LECD - del limbo epithelial cell deficiency), tal como ocurre en una lesion qulmica o termica, el slndrome de Steven-Johnson, queratopatla inducida por lentes de contacto, Penfigoide cicatricial ocular, enfermedades congenitas de aniridia o displasia ectodermica, varias deficiencias endocrinas asociadas con la queratitis.

El termino tratamiento (o tratamiento de) una condicion degenerativa ocular se refiere a mejorar los efectos de, o retrasar, interrumpir o reversar el progreso de, o retrasar o prevenir el inicio de, una condicion degenerativa ocular tal como se define aqul.

El termino cantidad efectiva se refiere a una concentracion o cantidad de un reactivo o composicion farmaceutica, tal como un factor de crecimiento, activo de diferenciacion, factor trofico, poblacion celular u otro agente, que es efectivo para producir los resultados esperados, incluyendo el crecimiento celular y / o la diferenciacion in vitro o in vivo, o el tratamiento de condiciones degenerativas oculares, como se describe aqul. En relacion a los factores de crecimiento, una cantidad efectiva podrla variar entre alrededor de 1 ng por mililitro hasta alrededor de 1 pg por mililitro. En relacion a las PPDCs administradas a pacientes in vivo, una cantidad efectiva puede variar desde tan pocos como algunos cientos o menos hasta tantos como algunos millones o mas. En realizaciones especlficas, una cantidad efectiva puede variar desde 103-1011, mas especlficamente de por lo menos alrededor de 104 celulas. Serla apreciado que el numero de celulas a ser administrado dependa de los datos especlficos del desorden a ser tratado, incluyendo pero sin limitarse al tamano o al volumen total / area de superfine a ser tratada, as! como la proximidad del lugar de administracion a la ubicacion de la region a ser tratada, entre otros factores familiares al biologo medico.

Los terminos perlodo efectivo (o tiempo) y condiciones efectivas se refieren a un perlodo de tiempo u otras condiciones controlables (por ejemplo, temperatura, humedad para metodos in vitro), necesarias o preferidas para que una composicion necesaria o preferida de activos farmaceuticos alcance los resultados deseados.

El termino paciente o sujeto se refiere a animales, incluyendo mamlferos, preferiblemente humanos, que son tratados con las composiciones farmaceuticas o de acuerdo a los metodos aqul descritos.

El termino portador (o medio) farmaceuticamente aceptable, que podrla ser usado intercambiablemente con el termino portador o medio biologicamente compatible, se refiere a reactivos, celulas, compuestos, materiales, composiciones, y / o formas de dosis que ademas de ser compatibles con las celulas y otros agentes a ser administrados terapeuticamente, estan dentro del alcance de un juicio medico solido, apropiado para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritacion, respuesta alergica u otra complicacion excesivas y tomando en cuenta que tenga una tasa de beneficio / riesgo conmensurada.

Algunos terminos se usan aqul en referencia a la terapia de reemplazo de celulas. Los terminos transferencia autologa, trasplante autologo, autoinjerto y similares se refieren a tratamientos donde el donante celular tambien es el receptor de la terapia de reemplazo celular. Los terminos transferencia alogenica, trasplante alogenico, aloinjerto y similares se refieren a tratamientos donde el donante de celulas es de la misma especie que el receptor de la terapia de reemplazo de celulas, pero no es el mismo individuo. Una transferencia de celulas en la cual la compatibilidad de las celulas del donante ha sido emparejada con un receptor se refiere a veces como una transferencia singenica. Los terminos transferencia xenogenica, trasplante xenogenico, xeno - injerto y similares se refieren a tratamientos donde el donante celular es de una especie diferente al receptor de la terapia de reemplazo de celulas.

Descripcion

Las condiciones degenerativas oculares, que cubren desordenes y enfermedades agudas, cronicas y progresivas que tienen diferentes razones, tienen una caracterlstica en comun de la disfuncion o perdida de un grupo especlfico o vulnerable de celulas oculares. Esta similitud permite el desarrollo de metodos terapeuticos similares para la reparacion o regeneracion de tejidos oculares vulnerables que han sido danados o perdidos, a traves, especlficamente de terapias que se basan en celulas. El desarrollo de la terapia celular para condiciones oculares degenerativas ha sido limitado comparativamente a unos pocos tipos de celulas madre o progenitoras, incluyendo las celulas madres derivadas oculares en si (por ejemplo, las celulas madre de la retina y corneales), celulas madre embrionarias y algunos tipos de celulas madres o progenitoras (por ejemplo, celulas madre neurales, mucosa sales, epiteliales y de medula osea). Los inventores han identificado una nueva fuente significativa de celulas madre para este proposito, mas especlficamente, celulas aisladas de la placenta y del cordon umbilical de postparto. En esa misma forma, en sus varias realizaciones aqul descritas, esta invencion destaca composiciones

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farmaceuticas para su uso en la reparacion y regeneracion de tejidos oculares, que se basan en el uso de celulas progenitoras y poblaciones celulares aisladas de tejidos de postparto. La invention es aplicable a cualquier condition degenerativa ocular, pero se espera que sea particularmente apropiado para varios trastornos oculares para los cuales el tratamiento o la cura hasta este punto han sido diflciles o no han existido. Estos incluyen, pero no se limitan a, degeneration macular relacionada con la edad, retinosis pigmentarias, retinopatla diabetica o de otro tipo, el glaucoma, y otras neuropatlas opticas, y trastornos asociados con la deficiencia de las celulas madres del limbo.

Las celulas madre o progenitoras aisladas del tejido del cordon umbilical de postparto de acuerdo a cualquier metodo conocido en la industria se espera que sean apropiadas para su uso en esta invencion. En una realization principal, sin embargo, la invencion utiliza celulas derivadas de postparto (PPDCs) como se acaba de definir, que se derivan del tejido del cordon umbilical que es libre de sangre, preferiblemente de acuerdo al metodo establecido a continuation. Las PPDCs son capaces de auto - renovarse y de expandirse en cultivos y tienen el potencial de diferenciarse en celulas de otros fenotipos ciertas realizaciones destacan poblaciones, composiciones farmaceuticas o componentes y productos que contienen esas celulas, y metodos para el uso de las composiciones farmaceuticas para el tratamiento de pacientes con condiciones degenerativas agudas o cronicas. Las celulas derivadas de postparto han sido caracterizadas por sus propiedades de crecimiento en cultivos, por sus marcadores de superficie celulares, por su expresion genetica, por su habilidad de producir ciertos factores troficos bioqulmicos, y por sus propiedades inmunologicas.

Preparacion de PPDCs

De acuerdo a los metodos aqul descritos, la placenta y el cordon umbilical de mamlferos se recupera en el momento o un poco despues de la finalization de embarazos de duration completa o parcial, por ejemplo, despues de la expulsion en el nacimiento. El tejido postparto puede ser transportado desde el lugar del nacimiento hasta un laboratorio en un contenedor esteril tal como un matraz, vaso de precipitados, platos de cultivos, o una bolsa. El contenedor podrla tener una solution o un medio, incluyendo pero sin limitarse a una solution salina, tal como, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium) o tampon de fosfato salino (PBS - phosphate buffered saline), o cualquier solucion usada para el transporte de organos utilizados para trasplantes, tal como la solucion de University of Wisconsin o una solucion perfluorada. Uno o mas agentes antibioticos y / o antimicoticos que incluyen pero no se limitan a la penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nestina, podrlan agregarse al medio o al tampon. El tejido de postparto puede ser enjuagado con una solucion anticoagulante tal como una solucion que contenga heparina. Es preferible mantener el tejido alrededor de 4 - 10 °C antes de la extraction de las PPDCs. Es aun mas preferible que el tejido no se ha congelado antes de la extraccion de las PPDCs.

El aislamiento de las PPDCs debe ocurrir preferiblemente en un entorno aseptico. El cordon umbilical podrla separarse de la placenta por medios conocidos en la industria. Alternativamente, del cordon umbilical y la placenta son utilizados sin separation. La sangre y los vestigios son removidos preferiblemente del tejido de postparto antes del aislamiento de las PPDCs. Por ejemplo, el tejido de postparto podrla lavarse con una solucion de amortiguamiento, tal como pero sin limitarse a tampon fosfato salino. El enjuague de amortiguador tambien puede incluir uno o mas agentes antimicoticos y / o antibioticos, tales como pero sin limitarse a penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina.

De acuerdo a una realizacion de la divulgation, el tejido de postparto que incluye a toda la placenta o un

fragmento o una parte de esta se separa por fuerza mecanica (fuerzas de desmenuce o de ruptura). En una

realizacion importante, el procedimiento de aislacion tambien utiliza un proceso de digestion enzimatica. Muchas enzimas son conocidas en la industria por su utilidad para aislar celulas individuales de matrices complejas de

tejidos para facilitar el crecimiento en cultivos. Variando desde una digestion debil (por ejemplo,

desoxirribonucleasas y proteasas neutrales, dispasas) a una digestion fuerte (por ejemplo, papalna y tripsina), aquellas enzimas estan disponibles comercialmente. Una lista no exhaustiva de enzimas compatibles con este proceso incluyen actividades enzimaticas mucollticas, metaloproteasas, proteasa as neutrales, proteasas serinas (tal como la tripsina, la quimotripsina o la elastasa), y desoxirribonucleasas. Actualmente se prefieren las actividades enzimaticas seleccionadas de actividades metaloproteasas, proteasas neutrales y mucollticas. Por ejemplo, las colagenasas son conocidas por su utilidad en el aislamiento de varias celulas de tejidos. Las desoxirribonucleasas pueden digerir ADN monocatenario y pueden minimizar el aglutinamiento de celulas durante el aislamiento. Los metodos preferidos involucran tratamiento enzimatico con, por ejemplo, colagenasa dispasa, o colagenasa, dispasa y hialuronidasa, y aquellos metodos son provistos en las realizaciones en las que se prefiere, una mezcla de colagenasa y la dispasa proteasa neutral son usadas en el paso de separacion. Aun mas ideal son aquellos metodos que utilizan digestion en la presencia de por lo menos una colagenasa del Clostridium histolyticum, y cualquiera de las actividades proteasas, dispasa y termolisina. Aun mas preferidos son los metodos que utilizan digestion con ambas actividades enzimaticas de la colagenasa y la dispasa. Tecnicos con experiencia apreciara que muchos de estos tratamientos enzimaticos son conocidos en la industria para el aislamiento de celulas de varias fuentes de tejidos. Por ejemplo, las series de combinaciones enzimaticas de LIBERASE Blendzyme (Roche) son apropiadas para su uso en metodos instantaneos. Otras fuentes de enzimas son conocidas, y el tecnico con experiencia tambien pueden obtener esas enzimas directamente de sus fuentes naturales. El tecnico con experiencia en esta equipado para evaluar enzimas nuevas, o adicionales o combinaciones enzimaticas por su utilidad en el aislamiento de las

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celulas de la invencion. Los tratamientos enzimaticos preferidos duran 0.5, 1, 1.5, o 2 horas o mas. En otras realizaciones importantes, el tejido es incubado a 37 °C durante el tratamiento enzimatico del paso de separation.

En algunas realizaciones de la invencion el tejido de postparto es separado en secciones que contienen varios aspectos del tejido. Las secciones separadas se disocian entonces por disociacion mecanica y / o enzimatica de acuerdo a los metodos descritos aqul. Las celulas de linaje neonatal o maternal pueden identificarse por cualquier metodo conocido en la industria, por ejemplo, por analisis de cariotipos o hibridacion in situ para un cromosoma Y.

Las celulas aisladas o el tejido de postparto de donde crecen las PPDCs podrlan utilizarse para iniciar, o sembrar, cultivos celulares. Las celulas aisladas se transfieren a portadores esteriles de cultivos de tejidos ya sean sin cobertura o cubiertos por una matriz extracelular o ligandos tales como laminina, el colageno (nativo, desnaturalizado o vinculado transversalmente), gelatina, fibronectina, y otras protelnas de matrices extracelulares. Las PPDCs se cultivan en cualquier medio de cultivo que sean capaces de sostener el crecimiento de las celulas tales como, pero sin limitarse a, DMEM (de alta o baja glucosa), DMEM avanzada, DMEM/MCDB 201, medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F 10), medio F 12 de Ham (F 12), medio de Iscove modificado por Dulbecco, medio de crecimiento de celulas madre mesenquimas (MSCGM - Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM/F12, RPMI 1640, y CELL-GRO-FREE. El medio de cultivo podrla suplementarse con uno o mas componentes incluyendo, por ejemplo, suero bovino fetal (FBS - fetal bovine serum), preferiblemente alrededor de del 2 - 15% (volumen / volumen); suero equino (ES - equine serum); suero humano (HS - human serum); betamercaptoetanol (BME o 2- ME), preferiblemente alrededor de un 0.0 01% (volumen / volumen); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF - platelet-derived growth factor), factor de crecimiento epidermico (EGF - epidermal growth factor), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF - fibroblast growth factor), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF - vascular endothelial growth factor), factor de crecimiento similar a la insulina - 1 (insulin-like growth factor-1), factor inhibidor de leucocitos (LIF - leukocyte inhibitory factor) y eritropoyetina; aminoacidos, incluyendo L-valina, y uno o mas agentes antibioticos y / o antimicoticos para controlar la contamination microbiana, tal como, por ejemplo, la penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina, y distatina ya sean solas o en combination. El medio de cultivo incluye preferiblemente un medio de crecimiento (DMEM - de baja glucosa, suero, BME, y un agente anti bi otico).

Las celulas se siembran en portadores de cultivo a una densidad que permita el crecimiento celular. En una realization importante, las celulas se cultivan a alrededor de cero hasta 5% del volumen de CO2 en el aire. En algunas realizaciones importantes, las celulas se cultivan a alrededor de dos a 25% de O2 en el aire, preferiblemente alrededor de cinco a 20% de O2 en el aire. Las celulas se cultivan preferiblemente alrededor de 25 a 40 °C y mas preferiblemente se cultivan a 37 °C. Las celulas se cultivan preferiblemente en una incubadora. El medio en el portador de cultivo puede ser estatico o puede ser agitado, por ejemplo, usando un bio - reactor. Se cultivan preferiblemente las PPDCs en condiciones de bajo estres oxidativo (por ejemplo, con la adicion de glutation, vitaminas C, catalasa, vitamina E, N- acetilcistelna). El termino “bajo estres oxidativo”, como se utiliza aqul, se refiere a condiciones donde no exista o exista un dano radicalmente mlnimo a las celulas cultivadas.

Los metodos para la selection del medio de cultivo mas apropiado, preparation del medio, y para tecnicas de cultivo celular son conocidas en la industria y estan descritas en varias fuentes incluyendo Doyle et al., (eds.), 1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (CULTIVO CELULAR Y DE TEJIDOS: PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO), John Wiley & Sons, Chichester; y Ho and Wang (eds.), 1991, ANIMAL CELL BIOREACTORS (BIO - REACTORES DE CELULAS ANIMALES), Butterworth-Heinemann, Boston.

Despues de cultivar las celulas aisladas o los fragmentos de tejidos durante un perlodo de tiempo suficiente, las PPDCs habran crecido, ya sea por un resultado de migration desde el tejido de postparto o por division celular, o por ambos factores. En algunas realizaciones de la invencion, las PPDCs son pasadas, o removidas a un portador de cultivos separado que contienen un medio fresco del mismo tipo o un tipo diferente que el que se uso inicialmente, donde la poblacion celular se expandio mitoticamente. Las celulas de la invencion pueden ser utilizadas en cualquier momento entre el pase cero y la senectud. Las celulas son pasadas preferiblemente entre alrededor de tres a 25 veces, es mas preferible que sean pasadas entre 4 y 12 veces, y mas aun entre 10 y 11 veces. Se puede realizar donation y / o sub donation para confirmar que una poblacion clonica de celulas ha sido aislada.

En algunos aspectos de la invencion, los tipos diferentes de celulas presentes en el tejido de postparto se fraccionan a sub-poblaciones de las cuales las PPDCs pueden ser aisladas. Esto puede lograrse usando tecnicas estandar de separacion celular incluyendo, pero sin limitarse a, tratamiento enzimatico para vice asociar el tejido postparto en sus celulas componentes, seguido de un clonaje y seleccion de tipos especlficos de celulas, por ejemplo pero sin limitarse a la seleccion basada en marcadores morfologicos y / o bioqulmicos; cultivo selectivo de las celulas deseadas (seleccion positiva, destruction selectiva de celulas no deseadas (seleccion negativa; separacion basada en un aglutinamiento celular diferencial en la poblacion mixta de acuerdo a, por ejemplo, el aglutinamiento de la soya; procedimientos de congelamiento-descongelamiento; propiedades de adherencia diferencial de las celulas en la poblacion mixta; filtration; centrifugation convencional y zonal; elutriacion centrlfuga (centrifugacion en contra de la corriente); separacion de unidades usando la gravedad; distribucion contracorriente; electroforesis; y clasificacion de celulas por fluorescencia activada (FACS - fluorescence activated cell sorting). Para

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una revision de tecnicas de selection clonica y separation celular, refierase a Freshney, 1994, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (CULTIVOS DE CELULAS ANIMALES: UN MANUAL DE TECNICAS BASICAS), 3ra Ed., Wiley-Liss, Inc., Nueva York.

El medio de cultivo se cambia como sea necesario, por ejemplo, aspirando cuidadosamente el medio del plato, por ejemplo, con una pipeta, y reabasteciendo con un medio fresco. Se continua con la incubation hasta que un numero o densidad suficiente de celulas se acumule en el plato. Las realizaciones originales de tejido es plantado podrlan removerse y las celulas que quedan tripnizarse usando tecnicas estandar o un escarbado celular. Despues de la tripnizacion, las celulas se recolectan, se remueven a un medio fresco y se incuban como se acaba de mencionar. En algunas realizaciones, el medio se cambia por lo menos una vez cada 24 horas despues de la tripnizacion para remover cualquier celula flotante. Las celulas que quedan en el cultivo se consideran como PPDCs.

Las PPDCs pueden ser conservadas criogenicamente. De esa misma forma, en una realization importante descrita en mayor detalle a continuation, las PPDCs utilizadas para una transferencia autologa (ya sea de la madre o del nino) pueden derivarse de tejidos apropiados de postparto despues del nacimiento de un nino, despues pueden ser conservadas criogenicamente para que esten disponibles en caso de que lleguen a necesitarse posteriormente hara un trasplante.

Caracteristicas de las PPDCs

Las PPDCs podrlan caracterizarse, por ejemplo, por propiedades de crecimiento (por ejemplo, capacidad de doblaje de poblacion, tiempo de doblaje, pases hasta la senectud), analisis de cariotipos (por ejemplo, cariotipos normales; linaje maternal o neonatal), citometrla de flujo (por ejemplo, analisis FACS), inmunohistoqulmica y / o inmunocitoqulmica (por ejemplo, para la detection de epltopos), perfil de expresion genetica (por ejemplo, ensayos de chips geneticos; reaction en cadena de polimerasas (por ejemplo, PCR transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, y PCR convencional)), ensayos de protelnas, secretion protelnica (por ejemplo, por ensayos de aglutinamiento de plasma o analisis del medio acondicionado de PPDCs, por ejemplo, Ensayo por Inmunoabsorcion Ligado a Enzimas (ELISA - Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)), reaccion de linfocitos mixtos (por ejemplo, como medida de estimulacion de las PBMCs), y / u otros metodos conocidos en la industria.

Ejemplos de PPDCsdivulgadas en la presente derivadas del tejido de la placenta se depositaron con la American Type Culture Collection (ATCC - Coleccion Americana de Tipos de Cultivo, Manassas, VA) y se les asigno numeros de acceso ATCC de la siguiente forma: (1) la cepa designada PLA 071003 (P8) fue depositada el 15 de junio de 2004 y se le asigno el numero de acceso PtA-6074; (2) la cepa designada PLA 071003 (P11) fue depositada el 15 de junio de 2004 y se le asigno el numero de acceso PTA-6075; y (3) la cepa designada PLA 071003 (P16) fue depositada el 16 de junio de 2004 y se le asigno el numero de acceso PTA-6079. Ejemplos de PPDCs derivados de tejido umbilical fueron depositados en la American Type Culture Collection el 10 de junio de 2004 y se asignaron numeros de acceso ATCC de la siguiente forma: (1) la cepa designada UMB 022803 (P7) se le asigno el numero de acceso PTA-6067; y (2) la cepa designada UMB 022803 (P17) se le asigno el numero de acceso PTA-6068.

En varias realizaciones, las PPDCs poseen una o mas de las siguientes caracteristicas de crecimiento (1) requieren L - valina para crecer en cultivos; (2) son capaces de crecer en atmosferas que contienen oxlgeno a alrededor de un 5% hasta alrededor de un 20% (3) tienen el potencial de por lo menos 40 doblajes en cultivos antes de alcanzar la senectud; y (4) se adhieren y expanden a portadores cubiertos o no cubiertos de cultivos de tejidos, en donde la cobertura de los portadores de cultivos de tejidos incluyen coberturas de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina o fibronectina.

En ciertas realizaciones las PPDCs poseen un cariotipo normal, que se mantiene mientras las celulas son pasadas. Un analisis de cariotipos es particularmente util para identificar y distinguir celulas neonatales de maternales que se derivan de la placenta. Los metodos para analizar los cariotipos estan disponibles y son conocidos por los tecnicos en la industria.

En otras realizaciones de la divulgation, las PPDCs podrlan caracterizarse por su production de ciertas protelnas, incluyendo (1) la produccion de por lo menos un factor de tejidos, vimentina, y actina de musculo liso-alfa; y (2) la produccion de por lo menos uno de los marcadores de superfine CD 10, CD 13, CD44, CD73, CD90, PDGFr- alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C, como se detecto por citometrla de flujo. En otras realizaciones, las PPDCs de la divulgacion podrlan caracterizarse por una falta de produccion de por lo menos uno de los marcadores de superficie CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, y HLA-DR,DP,DQ, como se detecto por citometrla de flujo. Son particularmente preferidas las celulas que producen por lo menos 2 de los factores de tejidos, vimentina, y actina de musculo liso - alfa. Mas preferidos aun son aquellas celulas que producen las tres de factores protelnicos de tejido, vimentina y actina de musculo liso - alfa.

En otras realizaciones, las PPDCs podrlan caracterizarse por su expresion genetica, que en relation a celulas humanas de fibroblastos, celulas madre mesenquimas, o celulas de medula osea iliaca, tienen un incremento de codification genetica de por lo menos una de interleucina 8; retlculon 1; ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 1

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(actividad estimuladora del crecimiento de melanoma, alfa) ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 6 (granulocito, protelna quimiotactica 2); ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 3; factor de necrosis tumoral, protelna inducida por alfa-3; miembro 2 de la super - familia Lectina de tipo C; Tumor de Wilms 1; miembro A2 de la familia aldehldo deshidrogenasa 1; renina; receptor de lipoprotelna oxidada de baja densidad 1; clon IMAGEN: 4179671 de Homo sapiens:; protelna quinasa C zeta; protelna hipotetica DKFZp564F013; reduccion en el cancer de ovario 1; y el gen de Homo sapiens del clon DKFZp547k1113.

En otras realizaciones, las PPDC pueden caracterizarse por expresion genetica, que en relacion a una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquima, o una celula de medula osea de cresta illaca, es reducida para una codificacion genetica de por lo menos uno de: homeobox de estatura corta 2; protelna 27 kDa de golpe de calor 2; ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 12 (factor derivado de celulas estromales 1); elastina (estenosis aortica supra valvular, slndrome Williams-Beuren); ARNm de homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); homeobox de mesenquima 2 (homeobox especlfico que previene el crecimiento); homologo 1 de homeobox sine oculis (Drosophila); cristalina, alfa B; activador asociado con morfogenesis desalineada 2; protelna DKFZP586B2420; similar a la neuralina 1; tetranectina (protelna que vincula el plasminogeno); homologla de src 3 (HS3 - src homology three) y el dominio rico en cistelna; hidroxilasa 25 de colesterol; factor de transcripcion relacionado con enanismo 3; receptor de interleucina 11, alfa; pro-colageno se-impulsador de endpeptidasas; homologo ensortijado 7 (Drosophila); gen hipotetico BC008967; colageno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabrachion); protelna de homeobox iroquois 5; hephaestin; integrina, beta 8; glicoprotelna veslculas sinaptica 2; neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; protelna vinculadora del factor de crecimiento similar a la insulina 2, 36 kDa; Homo sapiens ADNc FLJ12280 fis, MAMMA1001744 clon; factor similar al receptor citoquina 1; los canales activados por el calcio de conduccion intermedia / pequena de potasio, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; co-activador transcripcional con motivo de vinculacion PDZ-(TAZ); homologo de homeobox oculis sine 2 (Drosophila); Protelna KIAA1034; protelna de membrana asociada con las veslculas 5 (myobrevin); protelna matricial extracelular similar a la fibulina que contiene EGF 1; respuesta de crecimiento temprano 3; homeobox cercana 5; protelna hipotetica FLJ20373; familia aldoceto reductasa 1, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide Dehydrogenase, tipo II); biglicano; co-activador transcripcional con motivo de vinculacion PDZ-(TAZ); fibronectina 1; proencefalina; integrina, similar a beta-1 (con dominios que se repiten similares a EGF); Euroimage 1968422 de ADNc del clon insertado completamente en el ARNm de Homo sapiens; EphA3; Protelna KIAA0367; receptor del peptido natriuretico C / guanilato ciclasa C (receptor de peptidos atrionatriureticos C); protelna hipotetica FLJ14054; ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); BCL2 / protelna similar a la 3 que interactua con el adenovirus E1B; protelna de vinculacion AE 1; y el polipeptido VII a de la subunidad de oxidasa de citocromo c 1 (musculo).

En otras realizaciones, las PPDCs podrlan caracterizarse por la secrecion de por lo menos uno de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1a, RANTES, y TIMP1. En cuerpos alternos, las PPDCs podrlan caracterizarse por la falta de secrecion de por lo menos uno de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1 b, 1309, MDC, y VEGF, como lo detecto ELISA.

En realizaciones importantes, las celulas contienen dos o mas de lo que se listo anteriormente como caracterlsticas de crecimiento, production de marcadores de protelna / superficie, expresion genetica o secrecion de sustancias. Mas preferidas son aquellas celulas que tienen 3, 4 o 5 o mas de las caracterlsticas. Aun mas idoneas son aquellas PPDCs que tienen 6, 7, 8 o mas de estas caracterlsticas. Las mas idoneas son las que presentan todas las caracterlsticas mencionadas.

Entre las celulas que actualmente son mas preferidas para el uso de la invention en varios aspectos son las celulas de postparto que tienen las caracterlsticas que se acaban de describir y aun mas, especlficamente, aquellas celulas que tienen cariotipos normales y los mantienen cuando se van pasando, y aun mas aquellas celulas que expresan cada uno de los marcadores CD10, CD 13, CD44, CD73, cD90, PDGFr-alfa, y HLA-A,B,C, donde las celulas producen protelnas inmunologicamente detectables que corresponden a los marcadores listados, y que adicionalmente a lo anterior no producen protelnas que corresponden a ninguno de los siguientes marcadores Cd31, CD34, CD45, CD117, CD141, o HLA-DR,DP,DQ, tal como se detecta por citometrla de flujo.

Ciertas celulas al tener el potencial de diferenciarse a llneas de varios fenotipos no son estables y por lo tanto pueden diferenciarse espontaneamente. Actualmente se prefiere usar para la invencion celulas que no se diferencian espontaneamente, por ejemplo a lo largo de las llneas neurales. Las celulas preferidas, cuando se cultivan en un medio de crecimiento, son sustancialmente estables en referencia a los marcadores celulares producidos en su superficie, y en referencia a la tendencia de expresion de varios genes, por ejemplo como se determina usando el Affymetrix GENECHIP (CHIP GENETICO). Las celulas se mantienen substancialmente constantes, un ejemplo en sus caracterlsticas de marcadores de superficie cuando se estan pasando, a traves de multiples doblajes de poblacion.

Sin embargo, una caracterlstica de las PPDCs es que ellas podrlan ser inducidas deliberadamente a diferenciarse en varios fenotipos de linaje al exponerlas a condiciones de cultivos celulares que inducen a la diferenciacion. Durante su uso en el tratamiento de ciertas condiciones degenerativas oculares, las PPDCs podrlan ser inducidas a diferenciarse en fenotipos neurales usando uno o mas metodos conocidos en la industria. Por

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ejemplo, como se muestra aqul, las PPDCs podrlan ser chapadas en matraces cubiertas con laminina en un medio neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contenga B27 (suplemento B27, Invitrogen), L-glutamina y penicilina/estreptomicina, combinacion que se refiere aqul como medio de Expansion Progenitor Neural (NPE - Neural Progenitor Expansion). El medio NPE podrla suplementarse aun mas con bFGF y / o EGF. Alternativamente, las PPDCs podrlan ser inducidas a diferenciarse in vitro al (1) co-cultivar las PPDCs con celulas progenitoras neurales, o (2) cultivar las PPDCs en un medio acondicionado con celulas progenitoras neurales.

La diferenciacion de las PPDCs en fenotipos neurales puede demostrarse por medio de una morfologla celular bipolar con procesos extendidos. Las poblaciones celulares inducidas podrlan marcar positivo para la presencia de nestina. Las PPDCs diferenciadas podrlan evaluarse por la deteccion de nestina, TuJ1 (BIII tubulina), GFAP, tirosina hidroxilasa, GABA, 04 y/o MBP. En algunas realizaciones, las PPDCs han exhibido la capacidad para formar cuerpos tridimensionales caracterlsticos de la formacion de neuroesferas por parte de las celulas madres neuronales.

Poblaciones, modificaciones, componentes y productos celulares

La invencion ofrece poblaciones de celulas aisladas del tejido del cordon umbilical para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene una condicion degenerativa ocular. Estas poblaciones incluyen las PPDCs descritas anteriormente. En algunas realizaciones la poblacion celular es heterogenea. Una poblacion celular heterogenea de la invencion puede comprender al menos alredeor del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de PPDCs. Las poblaciones celulares heterogeneas de la invencion pueden comprender celulas madre no embrionarias u otras celulas progenitoras no embrionarias, como celulas progenitoras epiteliales o neuronales, o puede comprender adicionalmente celulas completamente diferenciadas. En algunas realizaciones, la poblacion es sustancialmente homogenea, es decir, se conforma sustancialmente de PPDCs unicamente (preferiblemente por lo menos alrededor de 96%, 97%, 98%, 99% o mas PPDCs). La poblacion celular homogenea de la invencion incluye celulas derivadas del tejido del cordon umbilical. Se prefiere que las poblaciones homogeneas de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical no contengan celulas de linaje materno. Las poblaciones homogeneas de celulas derivadas de la placenta pueden ser de linaje neonatal o materno. La homogeneidad de una poblacion celular puede lograrse por cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo clasificacion celular (por ejemplo citometrla de flujo) o por expansion clonica de acuerdo con metodos conocidos. Asl, las poblaciones de PPDc homogeneas preferidas pueden comprender una llnea celular clonal de celulas derivadas del postparto. Dichas poblaciones son particularmente utiles cuando se ha aislado un clon celular con funcionalidad altamente deseada.

Adicionalmente se presenta en este documento poblaciones de celulas incubadas en la presencia de uno o mas factores, o bajo condiciones, que estimulan la diferenciacion de celulas madres a lo largo de un sendero deseado (por ejemplo, neural, epitelial). Aquellos factores son conocidos en la industria y el tecnico experimentado apreciara que aquella determinacion de condiciones adecuadas para que se pueda lograr la diferenciacion con experimentos rutinarios. La optimizacion de aquellas condiciones puede lograrse por medio de diseno y analisis experimental estadlstico, por ejemplo la metodologla de la respuesta de la superficie permite una optimizacion simultanea de multiples variables, por ejemplo en un cultivo biologico. Actualmente los factores preferidos incluyen, pero no se limitan a, factores tales como de crecimiento o troficos, agentes que facilitan la desmetilacion, co-cultivos con celulas de linaje neural o epitelial o cultivos en medios acondicionados para celulas de linaje neural o epitelial, asl como otras condiciones conocidas en la industria para estimular la diferenciacion de celulas madres a lo largo de estos senderos (para factores utiles en la diferenciacion neural, refierase a, por ejemplo, Lang, K.J.D. et al., 2004, J. Neurosci. Res. 76: 184-192; Johe, K.K. et al., 1996, Genes Devel. 10: 3129-3140; Gottleib, D., 2002, Ann. Rev. Neurosci. 25: 381-407).

Las celulas de postparto, preferiblemente PPDCs, tambien pueden ser modificadas geneticamente para producir productos geneticos terapeuticamente utiles, o para que produzcan agentes antineoplasicos para el tratamiento de tumores, por ejemplo. Las modificaciones geneticas pueden ser logradas usando una variedad de vectores incluyendo, pero sin limitarse a, vectores integrales virales, por ejemplo, vector del retrovirus o vectores virales adenoasociados; vectores replicativos no integradores, por ejemplo, vectores del virus papiloma, vectores SV40, vectores adenovirales; o vectores virales de replicacion defectiva. Otros metodos para introducir ADN en las celulas incluyen el uso de liposomas, electroporacion, una pistola de partlculas, o por inyeccion directa de ADN.

Las celulas huesped son preferiblemente transformadas o transfectadas con ADN controlado por, o en asociacion operativa con, uno o mas elementos apropiados de control de expresion tales como secuencias promotoras o impulsadoras, terminadores transcripcionales, lugares de poliadenlacion, entre otras, y un marcador seleccionable. Cualquier promotor puede ser utilizado para dirigir la expresion del gen insertado, por ejemplo, los promotores virales incluyen, pero no se limitan a, promotor / impulsador CMV, SV 40, virus del papiloma, virus Epstein-Barr o promotor genetico de elastina. En algunas realizaciones, los elementos de control usados para manejar la expresion del gen de interes pueden permitir a la expresion regulada del gen para que el producto sea sintetizado solo cuando se necesite hacerlo in vivo. Si se desea una expresion transitoria, se usaran preferiblemente promotores constitutivos en vectores no integradores y / o de replicacion defectiva. Alternativamente, promotores

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inducibles podrlan utilizarse para manejar la expresion del gen insertado cuando sea necesario. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, aquellos asociados con las protelnas metalotionelna y de golpe de calor.

Despues de la introduccion del ADN foraneo, podrla permitirse el crecimiento de celulas disenadas en un medio de crecimiento enriquecido y cambiado posteriormente a un medio selectivo. El marcador seleccionables en el ADN foraneo otorga resistencia a la seleccion y permite que las celulas integren establemente el ADN foraneo como, por ejemplo, en un plasmido, a sus cromosomas y crecen en forma de focos que, a cambio, puede ser clonados y expandidos en llneas celulares. Este metodo puede ser usado ventajosamente para disenar llneas celulares que expresan el producto genetico.

Las celulas pueden ser disenadas geneticamente para “noquear” o “tumbar” factores de expresion que promueven inflamacion o rechazo en el lugar del implante. Tecnicas regulatorias negativas para la reduccion de niveles de expresion genetica objetiva o niveles de actividad del producto genetico objetivo tal como se menciona a continuacion. “Regulacion negativa”, como se menciona aqul, se refiere a una reduccion en el nivel y / o actividad del producto genetico objetivo en la ausencia del tratamiento regulatorio. La expresion de un gen nativo a una celula neuronal o glial puede ser reducida o noqueada usando varias tecnicas incluyendo, por ejemplo, la inhibicion de la expresion al desactivar el gen usando la tecnica de recombinacion homologa. Tlpicamente, un exon que codifica una region importante de la protelna (o un exon 5' a esa region) se interrumpe por un marcador positivo seleccionable, por ejemplo, neo, previniendo la produccion de ARNm normal del gen objetivo y resultando en la desactivacion de ese gen. Un gen tambien puedes ser desactivado al crear una eliminacion en una parte del gen, o al borrar totalmente el gen. Al usar un armazon con las dos regiones de la homologla al gen objetivo que estan alejadas en el genoma, las secuencias que intervienen en las dos regiones pueden ser borradas (Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos 88:3084). Anti - sentido, enzimas ADN, ribozimas, pequenos ARN que interfiere (siARN - small interfering RNA) y otras moleculas similares que inhiben la expresion del gen objetivo tambien pueden ser usados para reducir el nivel de la actividad del gen objetivo. Por ejemplo, moleculas ARN anti - sentido que inhiben la expresion de complejos geneticos importantes de histocompatibilidad (HLA - histocompatibility gene complexes) han demostrado ser los mas versatiles en relacion a respuestas inmunologicas. Adicionalmente, moleculas de triple helice pueden ser utilizadas para reducir el nivel de actividad genetica objetiva. Estas tecnicas estan descritas detalladamente por L.G. Davis et al. (eds), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (METODOS BASICOS EN BIOLOGIA MOLECULAR), 2da ed., Appleton & Lange, Norwalk, CN.

En otros aspectos, la divulgacion suministra lisados celulares y fracciones celulares solubles preparadas de celulas madre de postparto, preferiblemente PPDCs, o poblaciones celulares heterogeneas u homogeneas que contienen PPDCs, as! como PPDCs o sus poblaciones que han sido modificadas geneticamente o que han sido estimuladas para diferenciarse a lo largo de un sendero neuro - genetico. Aquellos lisados y sus fracciones tienen muchos usos. El uso de fracciones de lisados celulares solubles (en otras palabras, substancialmente libres de membranas) in vivo, por ejemplo, permiten al entorno intracelular beneficioso a ser usado alogenicamente en un paciente sin introducir una cantidad considerable de protelnas celulares superficiales que muy posiblemente activarlan un rechazo, u otras respuestas inmunologicamente adversas. Los metodos para lisar celulas son bien conocidos en la industria e incluyen varias formas de una mecanica, ruptura enzimatica o ruptura qulmica, o una combinacion de ellas. Aquellos lisados pueden prepararse directamente de celulas en su medio de crecimiento y por lo tanto contendrlan factores de crecimiento secretados y similares, o podrlan ser preparadas de celulas que fueron lavadas de un medio en, por ejemplo, PBS u otra solucion. Las celulas lavadas pueden ser re - suspendidas en concentraciones mayores que la densidad poblacional original si se desease.

En una realizacion de la divulgacion, se preparan lisados completos, por ejemplo, al separar las celulas sin su separacion subsiguiente de las fracciones celulares. En otra realizacion, una fraccion de membrana celular se separa de una fraccion soluble de las celulas por metodos rutinarios conocidos en la industria, por ejemplo, centrifugacion, filtracion, o metodos similares.

En algunas realizaciones de la divulgacion, se menciona que lisados celulares o fracciones celulares solubles preparadas de celulas derivadas de postparto podrlan ser utilizadas en su forma natural, o altamente concentrados, por medio de por ejemplo, ultrafiltracion o liofilizacion, o incluso secas, purificadas parcialmente, combinadas con portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables conocidos en la industria, o combinados con otros componentes tales como composiciones biologicas, por ejemplo composiciones protelnicas farmaceuticamente utiles. Los lisados celulares o sus fracciones pueden ser utilizados in vitro o in vivo, por si solas o por ejemplo, con celulas vivas autologas o singenicas. Los lisados, si se introducen in vivo, podrlan ser introducidos localmente o en un sitio del tratamiento, o remotamente para suministrar, por ejemplo, los factores de crecimiento celular necesarios al paciente.

En otra realizacion de la divulgacion, las celulas de postparto, preferiblemente PPDCs, pueden ser cultivadas in vitro para generar productos biologicos en una alta tasa. Por ejemplo, aquellas celulas, que producirlan naturalmente un producto biologico particular de interes (por ejemplo, un factor trofico), o que hayan sido disenadas geneticamente para producir un producto biologico, que puede ser expandido clonicamente usando las tecnicas de cultivos descritas aqul. Alternativamente, las celulas pueden ser expandidas en un medio que induce diferenciacion a un linaje deseado. En cualquier caso, los productos biologicos generados por la celula y secretados al medio

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pueden ser aislados facilmente del medio acondicionado usando tecnicas de separacion estandar, por ejemplo, como la precipitation proteinica diferencial, cromatografia de intercambios de iones, cromatografia de filtration con gel, electroforesis, y HPLC, solo para nombrar algunas. Un “biorreactor” puede ser utilizado para aprovechar el metodo de flujo para la alimentation, por ejemplo, un cultivo tridimensional in vitro. Esencialmente, en la medida que un medio fresco esta siendo pasado por un cultivo tridimensional, el producto biologico es lavado del cultivo y entonces puede ser aislado de la salida de materiales, como se menciono anteriormente.

Alternativamente, un producto biologico de interes podria permanecer dentro de la celula y, por lo tanto, su recoleccion podria requerir que las celulas sean lisadas, como se describio anteriormente. El producto biologico puede entonces ser purificado usando una o mas de las tecnicas listadas anteriormente.

En otras realizaciones, la divulgation describe medios acondicionados de las celulas cultivadas de postparto, preferiblemente PPDCs, para usarse in vitro e in vivo como se describe a continuation. El uso de un medio acondicionado como el que se acabo de mencionar permite que los factores troficos beneficiosos secretados por las celulas de postparto puede hacer usados a lo genica mente en un paciente sin introducir celulas intactas que pudiesen activar rechazos, u otras respuestas inmunologicamente adversas. El medio acondicionado es preparado produciendo celulas en un medio de cultivo, removiendo las celulas entonces del medio.

De acuerdo a la divulgacion, medios acondicionados preparados de poblaciones de celulas derivadas de postparto pueden ser usadas en su forma natural, o concentradas, por ejemplo, por medio de ultrafiltracion o liofilizacion, o hasta secadas, o parcialmente purificadas, combinadas con portadores farmaceuticamente aceptables o diluyentes conocidos en la industria, o combinadas con otros componentes como composiciones biologicas, por ejemplo composiciones proteinicas farmaceuticamente utiles. Medios acondicionados pueden ser utilizados in vitro o in vivo, solos o por ejemplo, con celulas vivas autologas o singenicas. El medio acondicionado, si es introducido in vivo, puede ser introducido localmente en el lugar del tratamiento, o remotamente para suministrar, por ejemplo los factores de crecimiento celular o troficos al paciente.

En otra realization de la divulgacion, una matriz extracelular (ECM - extracellular matrix) producida al cultivar celulas de postparto (preferiblemente PPDCs) en sustratos liquidos, solidos o semisolidos se prepara, se recolecta y se utiliza como una alternativa a implantar celulas vivas en un sujeto que necesite la reparation o el reemplazo del tejido. Las celulas cultivadas in vitro, en un medio de trabajo tridimensional como se describe en otras realizaciones de este documento, bajo condiciones que hagan que una cantidad deseada de ECM sea secretado al medio de trabajo. La composition y el nuevo tejido son removidos, y el ECM es procesado para darle mas uso, por ejemplo, como una preparation inyectable. Para lograr esto, las celulas del medio de trabajo son muertas y cualquier vestigio es removido el medio de trabajo. Este proceso puede ser ejecutado en varias formas diferentes. Por ejemplo, el tejido viviente puede ser congelado abruptamente en nitrogeno liquido sin un conservador criogenico, o el tejido puede ser inmerso en agua destilada esteril para que las celulas estallen en respuesta a la presion osmotica.

Una vez que las celulas esten muertas, las membranas celulares pueden alterarse y los vestigios celulares pueden ser removidos con un tratamiento con un enjuague con un detergente suave, tal como EDTA, CHAPS o un detergente zwitterionico. Alternativamente, el tejido debe ser digerido enzimaticamente y / o extraido con reactivos que descomponen las membranas celulares y permiten la remocion de los contenidos celulares. Ejemplos de aquellas enzimas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasa, Dispasas, proteasas, y nucleasas. Ejemplos de detergentes incluyen detergentes no ionicos tales como, por ejemplo, alcohol de polieter de alquilaril (TRITON X- 100), etanol de polietoxi de octilfenoxi (Rohm and Haas Filadelfia, PA), BRIJ-35, un eter lauril de polietoxietanol (Atlas Chemical Co., San Diego, CA), polisorbato 20 (TWEEN 20), un monolaurato de sorbitan polietoxietanol (Rohm and Haas), eter lauril de polietileno (Rohm and Haas); y detergentes ionicos tales como, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio, alcoholes alifaticos superiores sulfatados, alcanos sulfonados y alkylarenes sulfonados que contienen de 7 a 22 atomos de carbono en una cadena ramificada o no ramificada.

La recaudacion de la ECM puede ser logrado en varias formas, dependiendo, por ejemplo, si el nuevo tejido ha sido formado en un medio de trabajo tridimensional que es biodegradable o no biodegradable. Por ejemplo, si el medio de trabajo no es biodegradable, la ECM puede ser removida exponiendo al medio de trabajo a sonicacion, chorros de agua de alta presion, raspado mecanico, o un tratamiento ligero con detergentes o enzimas, o cualquier combination de lo anterior.

Si el medio de trabajo es biodegradable, la ECM puede ser recolectada, por ejemplo, permitiendo que el medio de trabajo se degrade o se disuelva en una solution. Alternativamente, si el medio de trabajo biodegradable esta compuesto de un material que puede ser inyectado junto con la ECM, el medio de trabajo y la ECM pueden ser procesadas en conjunto para su subsiguiente inyeccion. Alternativamente, el ECM puede ser removido del medio de trabajo biodegradable por medio de cualquier metodo descrito anteriormente para la recaudacion de la ECM de un medio de trabajo que no sea biodegradable. Todos los procesos de recoleccion son disenados preferiblemente para no desnaturalizar la ECM.

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Despues de que ha sido recolectada, la ECM puede ser procesada aun mas. Por ejemplo, la ECM puede ser homogeneizada a pequenas partlculas usando tecnicas bien conocidas en la industria tales como sonicacion, para que puedan pasar por medio de una aguja quirurgica. Los componentes de la ECM pueden ser vinculados transversalmente, si se desease, por irradiacion gamma. Preferiblemente, la ECM puede ser irradiada entre 0.25 a 2 mega rads para esterilizar y vincular transversalmente la ECM. Vincular transversalmente con qulmicos usando agentes que son toxicos, tales como el Glutaraldehldo, es posible pero no es generalmente recomendable.

Las cantidades y / o tasas de protelnas, tales como los varios tipos de colageno que estan presentes en la ECM, pueden ser ajustados al mezclar la ECM producida por las celulas de la invencion con uno o mas tipos de celulas adicionales. Ademas, sustancias biologicamente activas tales como las protelnas, factores de crecimiento y / o farmacos, pueden ser incorporadas a la ECM. Ejemplos de sustancias biologicamente activas incluyen factores de crecimiento de tejidos, tales como TGF-beta, y similares, que promueven la salvacion y reparacion de tejidos en el lugar de la inyeccion. Aquellos agentes adicionales pueden ser utilizados en cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, por ejemplo, con lisados celulares completos, fracciones celulares solubles, o componentes purificados y productos producidos por las celulas.

Composiciones farmaceuticas

En otra realizacion, la invencion suministra composiciones farmaceuticas que utilizan celulas de postparto, preferiblemente PPDCs, poblaciones celulares y componentes celulares, productos en varios metodos para tratamiento de condiciones oculares degenerativas. Ciertas realizaciones cubren composiciones farmaceuticas que se componen de celulas vivas (por ejemplo, PPDCs solas o agregadas y mezcladas con otros tipos de celulas). Otras realizaciones de la divulgacion cubren composiciones farmaceuticas que contienen componentes celulares PPDC (por ejemplo, lisados celulares, fracciones celulares solubles, medios acondicionados, ECM, o componentes de cualquiera de lo que se acaba de mencionar) o productos (por ejemplo, factores troficos y otros factores biologicos producidos naturalmente por las PPDCs o por medio de modificacion genetica, medios acondicionados de cultivos PPDC). De cualquier forma, la composicion farmaceutica puede incluir otros agentes activos, tales como agentes anti - inflamatorios, agentes anti - apopticos, antioxidantes, factores de crecimiento, factores neuro - troficos o neuro - regenerativos, neuro regeneradoras o farmacos oftalmicos conocidos en la industria.

Ejemplos de otros componentes que pueden ser agregados a composiciones farmaceuticas PPDCs incluyen, pero no se limitan a: (1) otros farmacos neuro protectores o neuro beneficiosos; (2) componentes seleccionados de matrices extracelulares, tal como uno o mas tipos de colageno conocidos en la industria, y/o factores de crecimiento, plasma rica en plaquetas, y farmacos (Alternativamente, las PPDCs pueden ser disenadas geneticamente para expresar y producir factores de crecimiento); (3) agentes anti - apopticos (por ejemplo, eritropoyetina (EPO), mimeticuerpo, trombopoyetina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) -I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasas); (4) compuestos anti-inflamatorios (por ejemplo, los inhibidores de quinasa de p38 MAP, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, y medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos (AINES) (tales como TEPOXALINA, TOLMETINA, y SUPROfEnO); (5) agentes inmunosupresores o inmunomoduladores, tales como inhibidores de la calcineurina, inhibidores de mTOR, antiproliferativas , corticosteroides y varios anticuerpos; (6) antioxidantes tales como probucol, vitaminas C y E, conenzyme Q- 10, glutation, L-cistelna y N-acetilcistelna; y (6) anestesicos locales, por nombrar algunos.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen celulas de postparto (preferiblemente PPDCs) o sus componentes o sus productos, formulados con un portador o medio farmaceuticamente aceptable que podrla incluir agua, solucion salina (tal como la solucion de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas y carbohidratos, tales como la lactosa, amilosa, o almidon, esteres de acidos graso, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona aquellas preparaciones pueden ser esterilizadas, si se desease, mezcladas con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsiones, sales que influencian la presion osmotica, amortiguadores, y colorantes. Tlpicamente, pero no exclusivamente, las composiciones farmaceuticas que incluyen componentes o productos celulares, pero no celulas vivas, se formulan como llquidos. Las composiciones farmaceuticas que incluyen celulas vivas PPDC son formuladas tlpicamente como llquidos, semisolidos (por ejemplo, geles) o solidos (por ejemplo, matrices, supercontigos y similares, tal como sea apropiado para la ingenierla de tejidos oftalmicos).

Las composiciones farmaceuticas pueden incluir componentes auxiliares que resultarlan familiares a los qulmicos o biologos medicinales. Por ejemplo, podrlan mantener antioxidantes en rangos que varlan dependiendo del tipo de oxidante que se use. Rangos razonables para antioxidantes comunmente usados son de alrededor de 0.01% hasta alrededor de 0.15 por ciento (masa sobre volumen) de EDTA alrededor de 0.0 1% hasta alrededor de el 2.0 por ciento de (masa sobre volumen) de sodio sulfito, y alrededor de 0.0 1% hasta alrededor de 2.0 por ciento (masa sobre volumen) de Disulfito de sodio. Un tecnico con experiencia podrla usar una presion de alrededor de 0.1 por ciento (masa sobre volumen) por cada uno de los elementos que se acaban de mencionar. Otros compuestos representativos incluyen glicina mercaptopropionil, N-acetil cistelna, beta-mercaptoetilamina, glutation y especies similares, aunque tambien podrlan emplearse otros agentes antioxidantes adecuados para la administration ocular, por ejemplo, acido ascorbico y sus sales o sulfitos o metabisulfito de sodio.

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Un agente amortiguador que puede ser usado para mantener el pH de las formulaciones de gotas en el ojo en el rango de alrededor 4.0 - 8.0, para minimizar la irritacion del ojo. Para inyecciones intravltreas o intraoculares directas, las formulaciones deben tener un pH de 7.2 a 7.5, preferiblemente un pH de 7.3 - 7.4. Las composiciones oftalmologicas tambien podrlan incluir agentes de tonicidad para su administracion al ojo. Entre aquellas apropiadas estan cloruro de sodio para hacer formulaciones aproximadamente isotonicas con 0.9 por ciento de solucion salina.

En ciertas realizaciones, se formulan composiciones farmaceuticas con agentes que mejoran la viscosidad. Ejemplos de agentes son hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, y polivinilpirrolidona. Las composiciones farmaceuticas podrlan tener cosolventes anadidos si fuese necesario. Cosolventes apropiados podlan incluir glicerina, polietilenglicol (PEG), polisorbato, propilenglicol, y alcohol de polivinilo. Tambien se pueden incluir conservantes, por ejemplo, Cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorobutanol, acetato o nitrato fenilmercurico, timerosal o metilo o propilparabenos.

Las formulaciones para inyecciones son disenadas preferiblemente para una sola administracion y no contienen conservantes. Las soluciones inyectables deben tener una isotonicidad equivalente al 0.9 % de solucion de cloruro de sodio (osmolalidad de 290 - 300 miliosmoles). Esto puede lograrse al agregar cloruro de sodio u otros co - solventes que se acaban de listar, o excipientes tales como agentes amortiguadores y antioxidantes, como se lista anteriormente.

Los tejidos de la camara anterior del ojo son banados por el humor acuoso, mientras la retina se encuentra bajo continua exposicion al vltreo. Estos fluidos / geles existen en estado alto de reduccion de oxidacion por que contienen componentes antioxidantes y enzimas. Por lo tanto, podrla ser ventajoso el incluir un agente reductor en las composiciones oftalmologicas. Agentes reductores apropiados incluyen N-acetilcistelna, acido ascorbico o un tipo de sal, y sulfito o metabisulfito de sodio, con acido ascorbico y / o N-acetilcistelna o glutation que es particularmente adecuado para soluciones inyectables.

Las composiciones farmaceuticas que se conforman de celulas, componentes celulares o productos celulares pueden ser entregadas al ojo de un paciente por medio de una o varias modalidades conocidas en la industria. En una realizacion que podrla ser guiada para su uso en algunas instancias, las composiciones son entregadas topicamente al ojo en gotas o en lavados. En otra realizacion, las composiciones podrlan ser entregadas a varias ubicaciones dentro del ojo por medio de una inyeccion intraocular periodica o por infusion en una solucion de irrigacion tal como BSS o BSS PLUS (Alcon USA, Fort Worth, TX). Alternativamente, las composiciones podrlan aplicarse en otras formas de dosis oftalmologicas conocidas por tecnicos con experiencia, tales como geles o liposomas formados previamente o en ese lugar, por ejemplo como se presenta en la patente de Estados Unidos 5,718,922 de Herrero-Vanrell. En otra realizacion, la composicion puede ser entregada a o a traves del lente de un ojo que necesite el tratamiento por medio de un lente de contacto (por ejemplo, Lidofilcon B, Bausch & Lomb CW79 o DELTACON (Deltafilcon A) u otro objeto que resida temporalmente en la superficie del ojo. En otras realizaciones, apoyos tales como un escudo corneal de colageno (por ejemplo escudos cordiales disponibles de BIO-COR, Summit Technology, Watertown, Mass.) pueden implementarse. Las composiciones tambien pueden ser administradas por infusion al globo ocular, ya sea por medio de una canula de una bomba osmotica (ALZET, Alza Corp., Palo Alto, Calif.) o por la implementacion de capsulas emisoras por tiempo (OCCUSENT) o discos biodegradables (OCULEX, OCUSERt). Estas rutas de administracion tienen la ventaja de suministrar continuamente la composicion farmaceutica al ojo. Esto puede ser una ventaja para una entrega local a la cornea, por ejemplo.

Las composiciones farmaceuticas que contienen celulas vivas en un portador semisolido o solido son formuladas tlpicamente para su implantacion quirurgica en el lugar del dano o trastorno ocular. Serla apreciado que composiciones llquidas tambien puedan administrarse por procedimientos quirurgicos. En realizaciones especlficas, las composiciones farmaceuticas semisolidas o solidas pueden incluir geles, redes, supercontigos celulares semi permeables y similares, que podrlan ser no biodegradables o biodegradables. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, podrla ser conveniente o apropiado el aislar celulas exogenas de sus alrededores, pero al mismo tiempo permitir que las celulas secreten y entreguen moleculas biologicas a las celulas de sus alrededores. En estas realizaciones, las celulas podrlan formularse como implantes autonomos que incluyen PPDCs o poblaciones celulares que contengan PPDCs rodeadas por una barrera no degradable, especlficamente permeable que separa flsicamente a las celulas trasplantadas del tejido huesped. Tales implantes son referidos a veces como “inmuno - protectores” puesto que tienen la capacidad de evitar que celulas y moleculas inmunologicas maten a las celulas trasplantadas en la ausencia de una inmunosupresion inducida farmacologicamente (para revisar aquellos dispositivos y metodos, refierase, por ejemplo, a ., P.A. Tresco et al., 2000, Adv. Drug Delivery (Entrega de Farmacos) Rev. 42: 3-27).

En otras realizaciones, diferentes variedades de geles y redes degradables son utilizadas para las composiciones farmaceuticas de la invencion. Por ejemplo, materiales degradables particularmente aptos guiados para la liberation sostenida incluyen pollmeros biocompatibles, tales como el poli (acido lactico), poli (acido glicolico - co - lactico), metilcelulosa, acido hialuronico, colageno, y similares. La estructura, selection y uso de pollmeros degradables en los medios de entregas de farmacos han sido revisados en algunas publicaciones, incluyendo, A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies (Pollmeros para Tecnologlas Avanzadas) 3:279. Patente de Estados Unidos 5,869,079 de Wong et al. presenta combinaciones de entes hidrofllico sus hidrofobicos en una

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liberacion sostenida biodegradable de implantes oculares. Adicionalmente, la patente de Estados Unidos 6,375,972 de Guo et al., la patente de Estados Unidos 5,902,598 de Chen et al., la patente de Estados Unidos 6,331,313 de Wong et al., la patente de Estados Unidos 5,707,643 de Ogura et al., la patente de Estados Unidos 5,466,233 de Weiner et al. y la patente de Estados Unidos 6,251,090 de Avery et al. cada una describe dispositivos y sistemas de implantes oculares que pueden ser utilizados para entregar composiciones farmaceuticas.

En otras realizaciones, por ejemplo, para la reparacion de lesiones neurales, tales como un nervio optico danado o roto, podrla ser deseable o apropiado el entregar las celulas en un supercontigo o matriz biodegradable, preferiblemente bio - reabsorbible o bio - absorbible. Estos bio - materiales tlpicamente tridimensionales contienen las celulas vivas adheridas al supercontigo, dispersas dentro del supercontigo, o incorporadas en una matriz extracelular atrapada en el supercontigo. Una vez implantadas en la region objetiva del cuerpo, estos implantes se integran con el tejido huesped, donde las celulas trasplantadas se establecen gradualmente (referirse a, por ejemplo, P.A. Tresco et al., 2000, supra; refierase tambien a D.W. Hutmacher, 2001, J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 12: 107174).

Ejemplos de materiales para supercontigos o matrices (a veces referidos colectivamente como “medios de trabajo”) que podrlan ser utilizados en esta invencion incluyen esteras no tejidas, espumas porosas o peptidos auto ensamblables. Los esteros no tejidos pueden, por ejemplo, formarse usando fibras de con pollmero absorbible sintetico de acidos glicolico y lactico (PGA/PLA), vendidos bajo la marca VICRYL (Ethicon, Inc., Somerville, NJ), espumas compuestas de, por ejemplo, co - pollmero poli (Caprolactona epsilon) / poli (acido glicolico) (PCL/PGA), formado por procedimientos tales como congelacion - secado, o liofilizacion, como se cubrio en la patente de Estados Unidos numero 6,355,699, tambien podrlan utilizarse. Hidrogel es tales como peptidos auto ensamblables (por ejemplo, RAD16) tambien pueden ser utilizados. Redes degradables que se forman en el lugar de la aplicacion tambien son apropiados para su uso en la invencion (referirse, por ejemplo, a Anseth, K.S. et al., 2002, J. Controlled Release (Emision Controlada) 78: 199 - 209; Wang, D. et al., 2003, Biomaterials (Bio - Materiales) 24: 3969-3980; publicacion de la patente de Estados Unidos 2002/0022676 de He et al.). Estos materiales se formulan como fluidos apropiados para su inyeccion, y pueden ser inducidos en una variedad de formas (por ejemplo, cambios de temperatura, pH, exposicion a la luz) para formar redes de hidrogel degradable in situ o in vivo.

En otra realizacion, el medio de trabajo es un fieltro, que puede ser compuesto de un hilo hecho de material bio - absorbible, por ejemplo, co - pollmeros o mezclas PGA, PLA, PCL o acido hialuronico. El hilo se convierte en un fieltro usando tecnicas estandares de procesamiento textil que consisten en prensar, cortar, cardar y tejer. En otra realizacion, las celulas son sembradas en supercontigos de espuma que pueden ser estructuras compuestas.

En muchas de las realizaciones que se acaban de mencionar, el medio de trabajo puede ser moldeado en una forma util. Es mas, serla apreciado que las PPDCs pudiesen cultivarse en dispositivos quirurgicos o implantables pre - formados, no degradables, por ejemplo, en una forma que corresponda a aquella usada para la preparacion de rollos endovasculares GDC que contengan fibroblastos, por ejemplo (Marx, W.F. et al., 2001, Am. J. Neuroradiol. 22: 323 - 333).

La matriz, supercontigo o dispositivo puede ser tratado antes de la inoculacion de celulas para mejorar la adherencia de las mismas. Por ejemplo, antes de la inoculacion, matrices de nylon podrlan ser tratadas con 0.1 mol de acido acetico e incubadas en pBs polilisina, y/o colageno para cubrir el nylon. Poliestireno puede ser tratado similarmente usando acido sulfurico. Las superficies externas de un medio de trabajo tambien pueden ser modificadas para mejorar la adherencia o el crecimiento de las celulas y la diferenciacion del tejido tales como la cobertura de plasma en el medio de trabajo o la adicion de una o mas protelnas (por ejemplo, colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glicoprotelnas, glucosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, sulfato- 4 - de condroitina, sulfato- 6 - de condroitina, sulfato de dermatan, sulfato de queratina), una matriz celular, y / u otros materiales tales como, pero sin limitarse a, gelatina, anginatos, agar, agarosa, gomas vegetales, entre otras.

Los medios de trabajo que contienen celulas vivas se preparan de acuerdo a los metodos conocidos en la industria. Por ejemplo, las celulas pueden ser cultivadas libremente en un frasco de cultivos para alcanzar la sub - confluencia o confluencia, extraldas del cultivo e inoculadas en el medio de trabajo. Se pueden agregar factores de crecimiento al medio de cultivo antes, durante, o despues de la inoculacion de las celulas para activar su diferenciacion y formacion del tejido, si se desease. Alternativamente, los medios de trabajo en si pueden ser modificados para que sus celulas de crecimiento se mejoren, o para que el riesgo de rechazo del implante se ha reducido. Por lo tanto, uno o mas componentes biologicamente activos, incluyendo, pero sin limitarse a, factores anti inflamatorios, inmunosupresores o de crecimiento, podrlan agregarse al medio de trabajo para una emision local.

Metodos de Utilizacion

Las celulas derivadas del tejido del cordon umbilical humano, o poblaciones celulares, y de acuerdo a la divulgacion, componentes de o productos producidos por aquellas celulas, pueden ser utilizadas en una variedad de formas para dar apoyo y facilitar la reparacion y regeneration de celulas y tejidos oculares. Aquellos usos cubren metodos in vitro, ex vivo e in vivo.

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Metodos in vitro y ex vivo:

En una realizacion de la divulgacion, las PPDCs pueden ser utilizadas in vitro para examinar una amplia variedad de componentes para detectar su efectividad y citotoxicidad de agentes farmaceuticos, factores de crecimiento, factores regulatorios, y similares. Por ejemplo, aquella examinacion podrla ser realizada en poblaciones sustancialmente homogeneas de PPDCs para evaluar la eficacia o la toxicidad de componentes candidatos a ser formulados con, o co - administrados con, las PPDCs para el tratamiento de una condicion ocular. Alternativamente, aquella examinacion puede ser realizada en las PPDCs que han sido estimuladas para diferenciarse en un tipo de celulas que se encuentra en el ojo, o sus progenitoras, con el fin de evaluar la eficacia de los nuevos candidatos de farmacos farmaceuticos. En esta realizacion, las PPDCs se mantienen in vitro y expuestas al componente a ser probado. La actividad de un componente potencialmente citotoxico puede ser medida por su habilidad de danar o matar a las celulas en el cultivo. Esto podrla evaluarse facilmente de con tecnicas de marcacion vitales. El efecto de los factores de crecimiento o regulatorios puede ser evaluado al analizar el numero o robustez de las celulas cultivadas, cuando se las compara con celulas que no han sido expuestas a los factores. Esto podrla lograrse usando tecnicas citologicas y / o histologicas estandar, incluyendo el uso de tecnicas inmunocitoqulmicas utilizando anticuerpos que definen antlgenos celulares de un tipo especlfico.

En otra realizacion, como se menciona anteriormente, las PPDCs pueden ser cultivadas in vitro para generar productos biologicos que son generados naturalmente por las celulas, o producidos por las celulas cuando se inducen a su diferenciacion en otros linajes, o generados por las celulas por medio de modification genetica. Por ejemplo, se descubrio que TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1, RANTES, 1309, TARC, MDC, e IL-8 fueron secretadas de las celulas derivadas del tejido del cordon umbilical que fueron cultivadas en un medio de crecimiento. Se descubrio que TIMP1, TPO, KGF, HGF, HBEGF, BDNF, MIP1a, MCP-1, RANTES, TARC, Eotaxina, e IL-8 fueron secretadas de las PPDCs derivadas de la placenta en medio de crecimiento (referirse a los ejemplos). Algunos de estos factores troficos, tales como BDNF e IL-6, tienen roles importantes en la regeneration neural. Otros factores troficos, que todavla no han sido detectados o examinados, para su uso en reparation o regeneracion de tejidos oculares, es muy posible que sean producidos por PPDCs y posiblemente sean secretados al medio.

En este aspecto, otra realizacion de la divulgacion destaca a PPDCs para la production de medios acondicionados, ya sea de PPDCs no diferenciados o de PPDCs incubados bajo condiciones que estimulan la diferenciacion. Tales medios acondicionados se contemplan para su uso en cultivos in vitro o ex vivo de celulas precursoras epiteliales o neurales, por ejemplo, o in vivo para dar apoyo a celulas trasplantadas conformadas de poblaciones homogeneas de PPDCs o poblaciones heterogeneas conformadas de PPDCs y otros progenitores, por ejemplo.

Una realizacion de la divulgacion incluye el uso de lisados de celulas PPCD, fracciones celulares solubles o sus componentes, o ECM o sus componentes, para una variedad de propositos. Como se menciona anteriormente, algunos de estos componentes pueden ser usados en composiciones farmaceuticas. En otras realizaciones, un lisado celular o un eCm se utiliza para cubrir o tratar de otra forma sustancias o dispositivos a ser usados quirurgicamente, o para su implantation, o para propositos ex vivo, o para promover las diferenciacion o supervivencia de celulas o tejidos contactados en el curso de esos tratamientos.

Como se describe en los ejemplos 13 y 15, las PPDCs demostraron la habilidad de apoyar la sobrevivencia, crecimiento y diferenciacion de celulas progenitoras neurales adultas cuando se las produce en co - cultivos con aquellas celulas. Asimismo, los resultados experimentales establecidos en el ejemplo 18 indican que las PPDCs pueden funcionar para dar apoyo a celulas de la retina por medio de mecanismos troficos. De esa misma forma, en otra realizacion, las PPDCs son utilizadas ventajosamente en co - cultivos in vitro para suministrar soporte trofico a otras celulas, en particular a celulas neurales y progenitoras neurales y oculares (por ejemplo, celulas madre neurales y celulas madre epiteliales de la retina o de la cornea). Para co - cultivos, podrla desearse que las PPDCs y otras celulas deseadas sean co - cultivadas bajo condiciones en las cuales los dos tipos de celulas esten en contacto. Esto puede lograrse, por ejemplo, al sembrar las celulas como poblaciones heterogeneas de celulas en medios de cultivo o en un sub estrato de cultivos adecuado. Alternativamente, las PPDCs pueden producirse para entrar en confluencia, y entonces servir como un sub estrato del segundo tipo de celulas deseado en el cultivo. En esta realizacion reciente, las celulas pueden ser separadas aun mas flsicamente, por ejemplo, por una membrana o un dispositivo similar, de tal forma que el otro tipo de celula pueda ser removido y usado separadamente, despues del perlodo de co -cultivo. El uso de las PPDCs en co - cultivo para promover la expansion y diferenciacion de tipos de celulas neurales u oculares podrla encontrar aplicabilidad en las areas de investigation y cllnicas / terapeuticas. Por ejemplo, co - cultivos PPDC pueden ser utilizados para facilitar el crecimiento y la diferenciacion de aquellas celulas en el cultivo, para propositos basicos de investigacion o para el uso de ensayos para la examinacion de farmacos, por ejemplo. Co - cultivos PPDC pueden ser usados tambien para la expansion ex vivo de progenitores neurales u oculares para su administration posterior para propositos terapeuticos. Por ejemplo, celulas progenitoras neurales u oculares podrlan ser cosechadas de un individuo, expandidas ex vivo en un co - cultivo con PPDCs, y entonces regresadas al individuo (transferencia autologa) u otro individuo (transferencia singenica o alogenica). En estas realizaciones, serla apreciado que, despues de la expansion ex vivo, la poblacion mixta de celulas que

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contienen las PPDCs y los progenitores pudiesen administrarse a un paciente que necesite el tratamiento. Alternativamente, en situaciones donde una transferencia autologa es apropiada o deseable, las poblaciones celulares co - cultivadas pueden ser separadas flsicamente en el cultivo, permitiendo la remocion de los progenitores autologos para su administration al paciente.

Metodos in vivo:

Como se establece en los ejemplos 16, 17 y 18, las PPDC han demostrado poder trasplantarse efectivamente en el cuerpo, para suministrar funciones neurales o de la retina perdidas en modelos animales aceptados por su similitud de eficacia en humanos. Estos resultados dan soporte a una realization importante de la invention, donde las PPDCs son utilizadas en terapia celular para tratar condiciones oculares degenerativas. Una vez que se ha trasplantado a la ubicacion vivo en el ojo, las PPDCs pueden diferenciarse as! mismas en uno o mas fenotipos, o pueden suministrar soporte trofico a celulas oculares in situ, o pueden ejercer un efecto beneficioso en ambas formas, entre otras.

Las PPDCs pueden administrarse solas (por ejemplo, como poblaciones sustancialmente homogeneas) o como mezclas con otras celulas. Como se acaba de describir, las PPDCs pueden ser administradas en una manera formulada en una preparation farmaceutica con una matriz o un supercontigo, o con portadores convencionales farmaceuticamente aceptables. En los casos en los que las PPDCs son administradas con otras celulas, estas pueden ser administradas simultaneamente o secuencialmente con las otras celulas (ya sea antes o despues de las otras celulas). Las celulas que pueden ser administradas en conjunto con PPDCs incluyen, pero no se limitan a, neuronas, asctrocitos, oligodendrocitos, celulas progenitoras neurales, celulas madre neurales, celulas progenitoras oculares, celulas madre epiteliales de la retina o de la cornea y / u otras celulas madre multipotentes. Las celulas de diferentes tipos pueden ser mezcladas con las PPDCs inmediatamente o un poco despues de su administracion, o pueden ser co - cultivadas juntas por un perlodo de tiempo antes de su administracion.

Las PPDCs pueden ser administradas con otros farmacos, moleculas biologicas beneficiosas, tales como factores de crecimiento, factores troficos, medios acondicionados (de cultivos de celulas de postparto o progenitoras o diferenciadas), u otros reactivos, tales como agentes anti inflamatorios, agentes anti apopticos, antioxidantes, factores de crecimiento, factores neuro - troficos, o farmacos neuro - regenerativos o neuro - protectores conocidos en la industria. Cuando las PPDCs son administradas con otros agentes, pueden ser administradas juntas o en una composition farmaceutica individual, o en composiciones farmaceuticas separadas, simultaneamente o secuencialmente con otros agentes (ya sea antes o despues de la administracion de los otros agentes).

Ejemplos de otros componentes que pueden ser administrados con celulas de postparto incluyen, pero no se limitan a: (1) otros farmacos neuro - protectores o neuro - beneficiosos; (2) componentes seleccionados de matrices extracelulares, como uno o mas tipos de colageno conocidos en la industria, y / o factores de crecimiento, plasma rico en plaquetas, y farmacos (Alternativamente, las celulas pueden ser disenadas geneticamente para expresar y producir factores de crecimiento); (3) agentes anti - apopticos (por ejemplo, eritropoyetina (EPO), EPO mimeticuerpo, trombopoyetina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) -I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasas); (4) compuestos anti-inflamatorios (por ejemplo, los inhibidores quinasa p38 MAP, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, sirolimus, y medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos (AINES) (tales como TEPOXALINA, TOLMETINA, y SUPROFENO); (5) agentes inmunosupresores o inmuno - moduladores, tales como inhibidores de la calcineurina, inhibidores de mTOR, anti - proliferativos, corticosteroides y varios anticuerpos; (6) antioxidantes tales como probucol, vitaminas C y E, conenzyme Q-10, glutation, L-cistelna y N-acetilcistelna; y (6) anestesias locales, solo para nombrar algunas.

En una realizacion, las PPDCs son administradas como celulas no diferenciadas, por ejemplo, como cultivadas en un medio de crecimiento. Alternativamente, las PPDCs pueden ser administradas despues de su exposition en cultivos con condiciones que estimulan la diferenciacion hacia un fenotipo deseado.

Las celulas pueden ser implantadas quirurgicamente, injertadas o administradas de otra forma directamente o indirectamente al lugar del dano o trastorno ocular. Cuando las celulas son administradas en dispositivos semisolidos o solidos, comunmente es adecuada una implantation quirurgica en una ubicacion precisa del cuerpo como medio de administracion. Sin embargo, composiciones farmaceuticas llquidas o fluidas pueden ser administradas a una ubicacion mas general en el ojo (por ejemplo, superficialmente o intraocularmente).

Otras realizaciones de la divulgation cubren metodos de tratamientos de condiciones degenerativas oculares administrando composiciones farmaceuticas que contienen componentes (por ejemplo lisados celulares o sus componentes) o productos (por ejemplo, factores troficos y otros factores biologicos celulares que son producidos naturalmente por PPDCs o por medio de una modification genetica, medio acondicionado de un cultivo PPDC) celulares PPDC. Nuevamente, estos metodos pueden involucrar la administracion de otros reactivos tales como factores de crecimiento, factores neuro - troficos o farmacos neuro - regenerativos o neuro - protectores conocidos en la industria.

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Las formas y reglmenes de dosis para administrar las PPDCs o cualquiera de las otras composiciones farmaceuticas descritas aqul se desarrollan de acuerdo a la buena practica medica, tomando en consideracion la condicion individual del paciente, por ejemplo, naturaleza y medida de la condicion degenerativa ocular, edad, sexo, masa corporal y la condicion medica general, y otros factores conocidos para los practicantes de medicina. Por lo tanto, la cantidad efectiva de una composicion farmaceutica a ser administrada a un paciente se determina por estas consideraciones conocidas en la industria.

Podrla ser deseable o apropiado inmuno - suprimir farmacologicamente a un paciente antes de iniciar la terapia celular. Esto puede lograrse por medio del uso sistematico de agentes inmunosupresores sistemicos o locales, o podrla lograrse por medio de la entrega de las celulas en un dispositivo encapsulado, como se describio anteriormente. Este y otros medios para reducir o eliminar la respuesta inmunologica a las celulas trasplantadas son conocidos en la industria. Como una alternativa, las PPDCs pueden modificarse geneticamente para reducir su inmuno - genicidad, como se menciono anteriormente.

La supervivencia de celulas trasplantadas en un paciente vivo puede determinarse por medio del uso de una variedad de tecnicas de escaneo, por ejemplo, tomografla axial computarizada (CAT - computerized axial tomography o CT), imagenes de resonancia magnetica (MRI - magnetic resonance imaging) o tomografla de emision de positrones (PET - positron emission tomography). Determinar la supervivencia del trasplante puede ser hecho post mortem al remover el tejido y examinarlo visualmente o por medio de un microscopio. Alternativamente, las celulas pueden ser tratadas con colorantes que son especlficos para celulas neurales u oculares o productos derivados, por ejemplo, neurotransmisores. Las celulas trasplantadas tambien pueden ser identificadas por una incorporacion previa de colorantes de trazabilidad tales como micro - esferas etiquetadas con rodamina o fluorescelna, azul rapido, micro - partlculas ferricas, bisbenzamida o productos geneticos generadores de informes introducidos geneticamente, como el beta-galactosidasa o beta-glucuronidasa.

Una integracion funcional de las celulas tras plan dadas en el tejido ocular de un sujeto puede ser evaluado al examinar la restauracion de la funcion ocular que fue danada o que se enfermo. Por ejemplo, la efectividad en el tratamiento de degeneracion macular u otras retinopatla as puede determinarse por la mejora de la agudeza visual y la evaluacion de anormalidades y la calificacion de fotograflas estereoscopicas del color del fondo del ojo. (Age- Related Eye Disease Study Research Group (Grupo de Investigacion de Estudio de Enfermedades del Ojo relacionadas a la edad), NEI, NIH, AREDS Informe No. 8, 2001, Arch. Ophthalmol. 119: 1417-1436).

Equipos y Bancos

En otro aspecto, la invencion suministra equipos que utilizan celulas de postparto, preferiblemente PPDCs, poblaciones celulares, sus componentes y productos en varios metodos para regeneracion y reparacion ocular como se describe anteriormente. Donde se utiliza para el tratamiento de condiciones oculares degenerativas, u otro tratamiento programado, los equipos pueden incluir una o mas poblaciones celulares, incluyendo por lo menos celulas de postparto y un portador farmaceuticamente aceptable (llquido, semisolido o solido). Los equipos tambien podrlan tener opcionalmente formas de administrar las celulas, por ejemplo por inyeccion. Los equipos tambien podrlan incluir instrucciones de uso de las celulas. Los equipos preparados para su uso en hospitales de campo, tales como para usos militares podrlan incluir suplementos de procedimientos completos incluyendo supercontigos de tejidos, estructuras quirurgicas, y similares, donde las celulas serlan utilizadas en conjunto para la reparacion de lesiones agudas. Equipos para metodos de ensayos e in vitro como se describe en este documento podrlan contener, por ejemplo, uno o mas de (1) PPDCs o componentes o productos de PPDCs, (2) reactivos para practicar el metodo in vitro, (3) otras celulas o poblaciones celulares, como sea apropiado, y (4) instrucciones para realizar el metodo in vitro.

En otro aspecto, la divulgacion tambien suministra information para el almacenamiento de tejidos, celulas, componentes celulares y poblaciones celulares de la invencion. Como se menciono anteriormente, las celulas son conservadas criogenicamente facilmente. La divulgacion, por lo tanto, suministra metodos para la conservation criogenica de las celulas en un banco, donde las celulas son almacenadas congeladas y asociadas con una caracterizacion completa de las celulas basandose en obviedades inmunologicas, bioqulmicas y geneticas. Las celulas congeladas pueden ser descongeladas y expandidas o usadas directamente para terapia autologa, singenica o alogenica, dependiendo de los requerimientos del procedimiento y las necesidades del paciente. Preferiblemente, la informacion de cada muestra conservada criogenicamente es almacenada en una computadora, y se puede buscar basandose en los requerimientos del cirujano, del procedimiento y del paciente haciendo emparejamientos adecuados en la caracterizacion de las celulas o poblaciones. Preferiblemente, las celulas de la invencion son cultivadas y expandidas a la cantidad deseada de celulas y las composiciones terapeuticas celulares son preparadas ya sea por separado o como co - cultivos, en la presencia o ausencia de una matriz o soporte. Aunque para algunas aplicaciones podrla ser preferible el usar celulas preparadas frescamente, el resto podrla ser conservado criogenicamente y almacenado acogera las celulas e ingresar la informacion en la computadora para asociar los registros informaticos con las muestras. Aun cuando no fuese necesario el emparejar una fuente o donante con un recipiente de aquellas celulas, para propositos inmunologicos, el sistema de almacenamiento hace facil el emparejar, por ejemplo, propiedades deseables bioqulmicas o geneticas de las celulas almacenadas a las necesidades terapeuticas. Despues de emparejar las propiedades deseadas con una muestra almacenada, la muestra es

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recuperada y preparada para su uso terapeutico. Lisados celulares, ECM o componentes celulares preparados como se describe aqui tambien pueden ser conservados criogenicamente o de otra forma (por ejemplo, con liofilizacion) y almacenados de acuerdo a esta invencion.

Los siguientes ejemplos son suministrados para describir la invencion en mayor detalle. Su intention es ilustrar, y no limitar al invencion.

Como se utiliza en los siguientes ejemplos y en otras realizaciones de la especificacion, el termino medio de crecimiento se refiere generalmente a un medio suficiente para el cultivo de PPDCs. En particular, un medio actualmente preferido para el cultivo de celulas de la invencion es el Medio Esencial Modificado de Dulbecco (tambien abreviado DMEM - Dulbecco's Modified Essential Media en este documento). Particularmente preferido es el DMEM - de baja glucosa (tambien referido como DMEM - LG (low glucose) en este documento) (Invitrogen, Carlsbad, CA). El DMEM - de baja glucosa es suplementado preferiblemente con un 15% (volumen / volumen) de suero bovino fetal (por ejemplo, suero bovino fetal definido, Hyclone, Logan UT), antibioticos / antimicoticos ((preferiblemente 50 - 100 Unidades / mililitro de penicilina, 50-100 pg / mililitros de estreptomicina, y 0 - 0.25 microgramos / mililitros de anfotericina B; Invitrogen, Carlsbad, CA)), y 0.001% (volumen / volumen) de 2- mercaptoetanol (Sigma, St. Louis MO). Tal como se usa en los ejemplos a continuacion, el medio de crecimiento se refiere a DMEM - de baja glucosa con un 15% de suero bovino fetal y antibioticos / antimicoticos (cuando se incluye penicilina / estreptomicina, es preferiblemente a 50 Unidades / mililitro y 50 pg / mililitro respectivamente; cuando se utiliza penicilina / estreptomicina / anfotericina B, es preferible a 100 unidades / mililitro, 100 pg/mililitro y 0.25 microgramos / mililitro, respectivamente). En algunos casos se utiliza medio diferente de crecimiento, o se suministran diferentes suplementaciones, y estas son indicadas normalmente en el texto como suplementaciones al medio de crecimiento.

Las siguientes abreviaciones pueden aparecer en los ejemplos y en otras realizaciones en la especificacion y las declaraciones: ANG (o Ang2) para angiopoyetina 2; APC (antigen-presenting cells) para las celulas que contienen antigenos; BDNF (brain-derived neurotrophic factor) para el factor neuro - trofico derivado del cerebro; BDNF (brain-derived neurotrophic factor) para el factor neuro - trofico derivado del cerebro; bid (BID) para "bis in die" (dos al dia); CK18 para citoqueratina 18; CNS (central nervous system) para el sistema nervioso central; ligando CXC 3 para el ligando receptor de quimioquinas 3; DMEM (DMEM for Dulbecco's Minimal Essential Medium) para el Medio Esencial Minimo de Dulbecco; DMEM: lg (DMEM with low glucose) (o DMEM: Lg, DMEM: LG) de DMEM con bajo nivel de glucosa; EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) para acido etilendiaminotetraacetico; EGF (epidermal growth factor) (o E) para el factor de crecimiento epidermico; FACS para (fluorescent activated cell sorting) clasificacion de celulas activadas con fluorescencia; FBS (fetal bovine serum) para el suero fetal bovino; FGF (fibroblast growth factor) (o F) para el factor de crecimiento de fibroblastos; GCP-2 (granulocyte chemotactic protein- 2) para la proteina de quimiotaxis de granulocitos -2; GF AP (glial fibrillary acidic protein) para la proteina acida glial fibrilar; HB-EGF (heparin-binding epidermal growth factor) para el factor de crecimiento epidermico de vinculacion a heparina; HCAEC (Human coronary artery endothelial cells) para las celulas endoteliales de la arteria coronaria Humana; HGF (hepatocyte growth factor) para el factor de crecimiento de hepatocitos; hMSC (Human mesenchymal stem cells) para las celulas madre mesenquimales humanas; HNF-1 alfa (hepatocyte-specific transcription factor) para el factor de transcripcion especifico de hepatocitos; HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) para las celulas endoteliales de la vena umbilical humana; 1309 para una quimiocina y el ligando para el receptor CCR8; IGF- 1 (insulin-like growth factor 1) para el factor de crecimiento similar a la insulina-1; IL-6 para la interleucina-6; IL-8 para la interleucina 8; K19 (keratin 19) para la queratina 19; K8 (keratin 8) para la queratina 8; KGF (keratinocyte growth factor) para el factor de crecimiento de queratinocitos; LIF (leukemia inhibitory factor) para el factor inhibidor de la leucemia; MBP (myelin basic protein) para la proteina basica de la mielina; MCP-1 (monocyte chemotactic protein 1) para la proteina quimiotactica de monocitos 1; MDC (macrophage-derived chemokine) para la quimiocina derivada de macrofagos; MIP 1 (macrophage inflammatory protein 1 alpha) para proteina inflamatoria de macrofagos alfa 1; MIP1beta (macrophage inflammatory protein 1beta) para proteina inflamatoria de macrofagos beta 1; MMP (matrix metalloprotease) para la matriz de metaloproteasas; MSC (mesenchymal stem cells) para las celulas madre mesenquimales; NHDF (Normal Human Dermal Fibroblasts) para fibroblastos dermicos humanos normales; NPE (Neural Progenitor Expansion media) para medios de Expansion Progenitores Neurales; O4 para oligodendrocitos o marcadores de diferenciacion glial 04; PBMC (Peripheral blood mononuclear cell) para celulas perifericas mononucleares de sangre; PBS (phosphate buffered saline) para tampon fosfato salino; PDGFBB (platelet derived growth factor) para factor de crecimiento derivado de plaquetas; PO para "per os" (por la boca); PNS (peripheral nervous system) para el sistema nervioso periferico; Rantes (o RANTES - regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) para activacion regulada de las celulas T normales expresadas y secretadas; rhGDF-5 (recombinant human growth and differentiation factor 5) para el factor de diferenciacion y crecimiento recombinante humano 5; SC por via subcutanea; SDF-1 alfa (stromal-derived factor 1alpha) para el factor derivado de estromas 1 alfa; SHH para el sonic hedgehog; SOP (standard operating procedure) para procedimiento operativo estandar; TARC (thymus and activation-regulated chemokine) para el timo y quimioquinas de activacion regulada; TCP (Tissue culture plastic) para el plastico para cultivo de tejidos; TCPS (tissue culture polystyrene) para poliestireno para cultivo de tejido; TGFbeta2 (transforming growth factor beta2) de factor de crecimiento transformante beta 2; TGF beta-3 (transforming growth factor beta-3) para factor de crecimiento transformante beta-3; TIMP1 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) para tejido inhibidor de metaloproteinasas matriciales 1; TPO para trombopoyetina; TuJ1 para

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tubulina BIII; VEGF (vascular endothelial growth factor) para el factor de crecimiento endotelial vascular; vWF (von Willebrand factor) para el factor de von Willebrand; y alpfFP (alpha-fetoprotein) para fetoproteina alfa.

EJEMPLO 1

Derivacion de celulas del tejido de postparto

Este ejemplo describe la preparacion de celulas derivadas de postparto de tejidos placentarias y del cordon umbilical. Los cordones umbilicales y placentas de postparto fueron obtenidos en el momento del nacimiento ya sea de un embarazo de termino completo o parcial. Las celulas fueron cosechadas de cinco donantes separados de tejidos umbilicales y placentarios. Diferentes metodos de aislamiento celular fueron probados por su habilidad de produccion celular con: 1) el potencial para diferenciarse en celulas con diferentes fenotipos, una caracteristica comun de las celulas madre, o 2) el potencial de suministrar factores troficos utiles para otras celulas y tejidos.

Metodos y Materiales

Aislamiento celular umbilical. Los cordones umbilicales fueron obtenidos del National Disease Research Interchange (Intercambio Nacional de Investigation de Enfermedades - NDRI, Filadelfia, PA). Los tejidos fueron obtenidos despues de partos normales. El protocolo de aislamiento celular fue realizado asepticamente en una campana de flujo laminar. Para remover la sangre y los vestigios, se lavo el cordon en tampon fosfato salino (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) con la presencia de antimicoticos y antibioticos (100 Unidades / mililitros de penicilina, 100 pg / mililitros de estreptomicina, 0.25 microgramos / mililitros de anfotericina B). Los tejidos fueron desasociados mecanicamente entonces en platos de cultivos de 150 cm2 con la presencia de 50 ml de medio (DMEM - de baja glucosa o DMEM - de alta glucosa; Invitrogen), hasta que el tejido que de desmenuzado en una pulpa fina. Los tejidos picados fueron transferidos a tubos conicos de 50 ml (aproximadamente 5 g de tejido por tubo). Este tejido fue digerido entonces en un medio DMEM - de baja glucosa o un medio DMEM - de alta glucosa, cada uno con antimicoticos y antibioticos como se menciono antes. En algunos experimentos, se uso una mezcla de enzimas de colagenasa y dispasa (("C:D;" colagenasa (Sigma, St Louis, MO), 500 Unidades / mililitro; dispasa (Invitrogen), 50 U/mililitro en DMEM - de baja glucosa). En otros experimentos se uso una mezcla de colagenasa, dispasa y hialuronidasa ("C:D:H") (colagenasa, 500 Unidades / mililitro; dispasa 50 Unidades / mililitro; y hialuronidasa (Sigma), 5 Unidades / mililitro, en DMEM - de baja glucosa). Los tubos conicos que contenian el tejido, el medio y las enzimas de digestion fueron incubados a 37 °C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 revoluciones por minuto durante dos horas.

Despues de la digestion, los tejidos fueron centrifugados a 150 x g durante cinco minutos, los materiales flotantes fueron aspirados. El pellet fue re - suspendido en 20 ml de medio de crecimiento (DMEM: de baja glucosa (Invitrogen), 15% (volumen / volumen) de suero fetal bovino (FBS; suero bovino definido; ; Lote#AND18475; Hyclone, Logan, UT), 0.001% (volumen / volumen) de) 2-mercaptoetanol (Sigma), 1 ml por 100 ml de antibioticos/antimicoticos como se describio anteriormente. La suspension celular fue filtrada a traves de un servidor de celulas de nylon de 70 pm (BD Biosciences). Un enjuague adicional de 5 ml que contenia el medio de crecimiento fue pasado a traves del filtro. La suspension celular fue pasada entonces a traves de un cernidor celular de nylon de 40 pm (BD Biosciences) y perseguida con un enjuague de 50 ml adicionales del medio de crecimiento.

La filtration fue resuspendida en el medio de crecimiento (volumen total de 50 ml) y centrifugada a 150 x g durante cinco minutos. El material flotante fue aspirado y las celulas fueron re-suspendidas en 50 ml de medio de crecimiento fresco. Este proceso se repitio dos veces mas.

Al final de la centrifugation el material flotante fue aspirado y el pellet de celulas fue re - suspendido en 5 ml de medio de crecimiento fresco. El numero de celulas viables fue determinado usando coloration de Tripano azul. Las celulas se cultivaron entonces bajo condiciones estandar.

Las celulas aisladas de cordones umbilicales fueron sembradas a 5000 celulas/centimetro cuadrado en matraces T de 75 cm2 cubiertos de gelatina (Corning Inc., Corning, NY) en un medio de crecimiento con antibioticos / antimicoticos como se describio anteriormente. Despues de dos dias (en varios experimentos, las celulas se incubaron de 2 - 4 dias), el medio consumido era aspirado de los matraces. Las celulas fueron lavadas con PBS tres veces para remover los vestigios y las celulas derivadas de la sangre. Las celulas fueron re - abastecidas con medio de crecimiento y se les permitio crecer hasta alcanzar la confluencia (alrededor de 10 dias desde el pase cero) al pase uno. En pases subsiguientes (desde el pase uno al dos y asi progresivamente), las celulas alcanzaron su- confluencia (75 - 85% de confluencia) en cuatro - cinco dias. Para estos pases subsiguientes, las celulas fueron sembradas a 5000 celulas / centimetro cuadrado. Las celulas fueron cultivadas en una incubadora humidificada con un 5% de dioxido de carbono y oxigeno atmosferico, a 37 °C.

Aislamiento celular placentario. El tejido placentaria o fue obtenido de NDRI (Filadelfia, PA). Los tejidos fueron de un embarazo y fueron obtenidos en el momento de una entrega quirurgica normal. Las celulas placentarias fueron aisladas como se describio en el aislamiento umbilical.

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El siguiente ejemplo aplica al aislamiento de poblaciones separadas de celulas derivadas maternales y derivadas neonatales del tejido placentario.

El protocolo de aislamiento celular fue realizado asepticamente en una campana de flujo laminar. El tejido placentario fue lavado en tampon fosfato salino (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) con antimicoticos y antibioticos (como se describio anteriormente) para remover la sangre y los vestigios. El tejido placentario fue separado entonces en tres secciones: llnea superior (el lado o aspecto neonatal) la llnea del medio (aislamiento celular mixto neonatal y maternal) y la llnea inferior (lado o aspecto maternal).

Las secciones separadas fueron lavadas individualmente varias veces en PBS con antibioticos / antimicoticos para remover aun mas la sangre y los vestigios. Cada seccion fue desasociada mecanicamente en platos de cultivos de tejido de 150 cm2 en la presencia de 50 ml de DMEM / de baja glucosa, a una pulpa fina. La pulpa fue transferida a tubos conicos de 50 ml. Cada tubo contenla aproximadamente 5 g de tejido. El tejido fue digerido ya sea en DMEM - de baja glucosa o en DMEM - de alta glucosa, ambos medios con antimicoticos y antibioticos (100 Unidades / mililitro de penicilina, 100 pg / mililitro de estreptomicina, 0.25 microgramos / mililitros de anfotericina B) y enzimas digestivas. En algunos experimentos una mezcla de enzimas de colagenasa dispasa ("C:D") fue utilizada conteniendo colagenasa (Sigma, St Louis, MO) a 500 Unidades / mililitros y dispasa (Invitrogen) a 50 Unidades / mililitro en DMEM - de baja glucosa. En otros experimentos se utilizo una mezcla de colagenasa, dispasa e hialuronidasa (C:D:H) (colagenasa, 500 Unidades por mililitro; y dispasa 50 Unidades / mililitro, e hialuronidasa (Sigma), 5 Unidades / mililitro en DMEM - de baja glucosa. Los tubos conicos que contenlan el tejido, medio y enzimas digestivas fueron incubados durante dos horas at 37 °C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 revoluciones por minuto.

Despues de la digestion, los tejidos fueron centrifugados a 150 x g durante cinco minutos, el material flotante resultante fue aspirado. El pellet fue re - suspendido en 20 ml de medio de crecimiento con penicilina / estreptomicina / anfotericina B. La suspension celular fue filtrada a traves de una cernl debera celular de nylon de 70 pm (BD Biosciences), perseguida por un enjuague con 5 ml adicionales de medio de crecimiento. La suspension celular total fue pasada a traves de un filtro celular de nylon de 40 pm (BD Biosciences) seguido por 5 ml adicionales de medio de crecimiento como un enjuague.

La filtracion fue resuspendida en el medio de crecimiento (volumen total de 50 ml) y centrifugado a 150 x g durante cinco minutos. Este proceso fue repetido dos veces mas. Despues de la centrifugacion final, el material flotante fue aspirado y el pellet de celulas fue re - suspendido en 5 ml de medio de crecimiento fresco. Un conteo de celulas fue determinado usando la prueba de exclusion de tripano azul. Las celulas fueron cultivadas entonces a condiciones estandar.

Aislamiento de celulas LIBERASE. Las celulas fueron aisladas de tejidos umbilicales en un medio DMEM- de baja glucosa con LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) (2.5 miligramos por mililitro, Blendzyme 3; Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) e hialuronidasa (5 Unidades / mililitro, Sigma). La digestion del tejido y el aislamiento de las celulas fue, como se describio para otras digestiones de proteasas anteriormente, usando la mezcla LIBERASE / hialuronidasa en lugar de las mezclas enzimaticas C:D o C:D:H. La digestion de tejidos con LIBERASE resulto en que el aislamiento de las poblaciones celulares de los tejidos de postparto se expandieron facilmente.

El Aislamiento celular usando otras combinaciones enzimaticas. Los procedimientos fueron comparados para aislar las celulas del cordon umbilical usando varias combinaciones enzimaticas. Las enzimas comparadas para la digestion incluyeron: i) colagenasa; ii) dispasa; iii) hialuronidasa; iv) mezcla de colagenasa: dispasa (C:D); v) mezcla de colagenasa: hialuronidasa (C:H); vi) mezcla de dispasa: hialuronidasa (D:H); y vii) mezcla de colagenasa: dispasa: hialuronidasa (C:D:H). Las diferencias en el aislamiento celular utilizando estas diferentes condiciones de digestion enzimatica se observaron (Tabla 1-1).

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Tabla 1-1 Aislamiento de celulas del tejido de cordon umbilical usando varias combinaciones enzimaticas.

Enzimas de Digestion

Celulas Aisladas Expansion de celulas

Colagenasa

X X

Dispasa

+ (>10 h) +

Hialuronidasa

X X

Colagenasa : Dispasa

++ (< 3 h) ++

Colagenasa : Hialuronidasa

++ (< 3 h) +

Dispasa : Hialuronidasa

+ (>10 h) +

Colagenasa : Dispasa : Hialuronidasa

+++ (< 3 h) ++ +

Clave: + = buena, ++ = muy buena, +++ = excelente, X = no hubo exito bajo las condiciones probadas

Aislamiento de celulas de la sangre residual en los cordones. Se hicieron otros intentos de aislar grupos de celulas del cordon umbilical con diferentes metodos. En una instancia, el cordon umbilical fue dividido y lavado con un medio de crecimiento para desalojar los coagulos de sangre y el material gelatinoso. La mezcla de sangre, material gelatinoso y medio de crecimiento fue recolectado y centrifugado a 150 x g. El pellet fue re- suspendido y sembrado en matraces cubiertos con gelatina en un medio de crecimiento. De estos experimentos una poblacion celular fue aislada y se expandio facilmente.

Aislamiento de celulas de la sangre del cordon. Tambien se aislaron las celulas de las muestras de sangre del cordon obtenidas del NRDI. El protocolo de aislamiento usado aqul fue el de la aplicacion internacional de patente US0229971 by Ho et al (Ho, T. W. et al., WO2003025149 A2). Las muestras (50 ml y 10.5 mililitros, respectivamente) de sangre del cordon umbilical (NDRI, Filadelfia, PA) fueron mezcladas con amortiguador de lisis (155 mM de cloruro de amonio filtrado y esterilizado, 10 mmol de bicarbonato de potasio, 0.1 milimoles de EDTA amortiguado a un pH de 7.2 (todos los componentes de Sigma, St. Louis, MO)). Las celulas fueron lisadas a una tasa de 1:20 de sangre de cordon a amortiguador lisis. La suspension celular resultante fue mezclada mediante vortex durante cinco segundos, e incubada por dos minutos a temperatura ambiente. El lisado fue centrifugado (10 minutos a 200 x g). El pellet celular fue re-suspendido en un medio esencial mlnimo completo (Gibco, Carlsbad CA) que contenla un 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan UT), 4 mmol de glutamina (Mediatech Herndon, VA), 100 unidades de penicilina por 100 ml y 100 pg de estreptomicina por 100 ml (Gibco, Carlsbad, CA). Las celulas re- suspendidas fueron centrifugadas (10 minutos a 200 x g), el material flotante fue aspirado, y el pellet de celulas fue lavado en el medio completo. Las celulas fueron sembradas directamente en las matraces T 75 (Corning, NY), ma trazas cubiertos con laminina T 75, o matraces cubiertas con fibronectina T 175 (ambas Becton Dickinson, Bedford, MA).

Aislamiento de las celulas usando diferentes combinaciones enzimaticas y condiciones de crecimiento. Para determinar si es que las poblaciones celulares podrlan ser aisladas bajo diferentes condiciones y expandidas bajo una variedad de condiciones inmediatamente despues del aislamiento, las celulas fueron digeridas en medios de crecimiento con o sin 0.001% (volumen/volumen) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), usando la combinacion enzimatica de C:D:H, de acuerdo a los procedimientos provistos anteriormente. Las celulas derivadas de la placenta fueron aisladas de esa forma bajo una variedad de condiciones. Todas las celulas fueron cultivadas con penicilina / estreptomicina. (Tabla 1-2).

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Tabla 1-2: aislamiento y expansion de cultivos de celulas derivadas de postparto bajo varias condiciones:

Condicion

Medio 15% FBS B M E Gelatina 20% O2 Factores de crecimiento

1

DMEM-Lg Y Y Y Y N

2

DMEM-Lg Y Y Y N (5%) N

3

DMEM-Lg Y Y N Y N

4

DMEM-Lg Y Y N N (5%) N

5

DMEM-Lg N (2%) Y N (Laminina) Y EGF/FGF (20 ng/mL)

6

DMEM-Lg N (2%) Y N (Laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/mL)

7

DMEM-Lg N (2%) Y N (Fibrone) Y PDGF/VEGF

8

DMEM-Lg N (2%) Y N (Fibrone) N (5%) PDGF/VEGF

9

DMEM-Lg Y N Y Y N

10

DMEM-Lg Y N Y N (5%) N

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DMEM-Lg Y N N Y N

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DMEM-Lg Y N N N (5%) N

13

DMEM-Lg N (2%) N N (Laminina) Y EGF/FGF (20 ng/mL)

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DMEM-Lg N (2%) N N (Laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/mL)

15

DMEM-Lg N (2%) N N (Fibrone) Y PDGF/VEGF

16

DMEM-Lg N (2%) N N (Fibrone) N (5%) PDGF/VEGF

Aislamiento de celulas utilizando diferentes combinaciones de enzimas y condiciones de crecimiento. En todas las condiciones las celulas se adhirieron y expandieron bien entre los pases 0 y 1 (Tabla 1-2). Se demostro que las celulas en condiciones 5 - 8 y 13 - 16 proliferaron bien hasta cuatro pases despues de la siembra, momento en el cual se conservaron criogenicamente y se almacenaron.

Resultados

Aislamiento de celulas utilizando diferentes combinaciones enzimaticas. La combinacion de C:D:H, suministro la mejor produccion de celulas despues del aislamiento, y las celulas generadas se expandieron por muchas generaciones mas en cultivos que las otras condiciones (Tabla 1). Una poblacion expandible de celulas no fue lograda utilizando exclusivamente colageno o hialuronidasa. No se hizo un intento de determinar si este resultado es especlfico al colageno que fue probado

Aislamiento de celulas utilizando diferentes combinaciones enzimaticas y condiciones de crecimiento. Las celulas se adhirieron y expandieron bien entre los pases 0 y 1 bajo todas las condiciones probadas de digestion enzimatica y crecimiento (Tabla 2). Las celulas en condiciones experimentales 5 - 8 y 13 - 16 proliferaron bien hasta 4 pases despues de la siembra, momento en el cual fueron conservadas criogenicamente. Todas las celulas fueron almacenadas para mayor investigacion.

Aislamiento de celulas de la sangre residual en los cordones. Las celulas nucleadas se adjuntaron y crecieron rapidamente. Estas celulas fueron analizadas con citometrla de flujo y fueron similares a las obtenidas por medio de digestion de enzimas.

Aislamiento de celulas de la sangre del cordon. La preparacion contenla celulas rojas de sangre y plaquetas. Ninguna celula nucleada se habla adherido y dividido durante las primeras tres semanas. El medio fue cambiado tres semanas despues de la siembra y no se observo que ninguna celula se haya adherido y crecido.

Resumen. Las poblaciones de celulas pueden derivarse del cordon umbilical y del tejido placentario eficientemente usando la combinacion de enzimas de colagenasa (una metaloproteasa matricial), dispasa (una proteasa neutra) hialuronidasa (una enzima mucolltica que se descompone en acido hialuronico). Tambien podrla usarse LIBERASE, que es una Blendzyme. Especlficamente Blendzyme 3, que es colagenasa (4 unidades deseadas

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/ g) y termolisina (1714 unidades de caselna / g) tambien se uso junto con hialuronidasa para aislar celulas. Estas celulas se expandieron rapidamente por muchos pases cuando se las cultivo en el medio de crecimiento en plastico cubierto con gelatina.

Las celulas tambien se aislaron de sangre residual en los cordones, pero no en la sangre del cordon. La presencia de celulas en los coagulos de sangre que se enjuagaron del tejido, que se adhiere y crece bajo las condiciones utilizadas, podrla deberse a que las celulas se liberan durante el proceso de disecion.

EJEMPLO 2

Caracterfsticas de crecimiento de las celulas derivadas de postparto

El potencial de expansion celular de las celulas derivadas de postparto (PPDCs) fue comparado a otras poblaciones de celulas madres aisladas. El proceso de expansion celular hasta la senectud es referido de acuerdo al llmite de Hayflick. (Hayflick L. 1974a, 1974b). Las celulas derivadas de postparto son altamente apropiadas para su uso terapeutico porque pueden expandirse facilmente en numeros suficientes.

Materiales y metodos

Matraces cubiertos de gelatina. Matraces de plastico para cultivos de tejidos fueron cubiertos al anadir 20 ml un 2% (masa / volumen) de gelatina porcina (tipo B: 225 Bloom; Sigma, St Louis, MO) a matraces T 75 (Corning, Corning, NY) durante 20 minutos a la temperatura del cuarto. Despues de remover la solucion gelatinosa, se agrego tampon fosfato salino (PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y despues se aspiro.

Comparacion del potencial de expansion de las PPDCs con otras poblaciones celulares. Para comparacion del potencial de expansion de crecimiento las siguientes poblaciones celulares fueron utilizadas: i) celulas madre mesenquima (MSC - Mesenchymal stem cells; Cambrex, Walkersville, MD); ii) celulas derivadas de adiposas (patente de Estados Unidos numero 6555374 B1; aplicacion de patente de Estados Unidos US20040058412); iii) fibroblastos de piel dermicos normales (cc-2509 lote # 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD); iv) celulas derivadas umbilicales; y v) celulas derivadas de la placenta. Las celulas fueron sembradas inicialmente a 5000 celulas / centlmetros cuadrados en matraces T 75 cubiertos de gelatina en medios de crecimiento con penicilina / estreptomicina / anfotericina B. Para pases subsiguientes, los cultivos celulares fueron tratados de la siguiente forma. Despues de su tripnizacion, se contaron las celulas viables despues de colorarlas con Tripano Azul. La suspension celular (50 pl) fue combinada con tripano azul (50 ml, Sigma, St. Louis MO). El numero de celulas viables se estimo usando un hemocitometro.

Despues del conteo, las celulas fueron sembradas a 5000 celulas / centlmetros cuadrados en matraces T 75 cubiertos de gelatina en 25 ml de medio de crecimiento. Las celulas fueron cultivadas bajo condiciones estandar a 37 °C. El medio de crecimiento fue cambiado dos veces a la semana. Cuando las celulas alcanzaron un 85% de confluencia fueron pasadas; este proceso fue repetido hasta que las celulas alcanzaron la senectud.

En cada pase, las celulas fueron tripnizadas y contadas. La production de celulas viables, doblajes de poblacion [en (celulas finales / celulas iniciales)/ en 2] y el tiempo de doblaje (tiempo en el cultivo (h) / doblajes de poblacion) fueron calculados. Con el fin de determinar la expansion celular optima, la produccion total de celulas por pase fue determinado al multiplicar la produccion total del pase anterior por el factor de expansion para cada pase (por ejemplo, factor de expansion = celulas finales / celulas iniciales).

El potencial de expansion de los bancos de celulas a poca densidad. La expansion potencial de las celulas almacenadas en el pase 10 tambien fue probado, usando un conjunto diferente de condiciones. Se probaron fibroblastos de piel dermica normal (cc-2509 lote # 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD), celulas derivadas umbilicales, y celulas derivadas de la placenta. Esta poblacion celular habla sido almacenada en el pase 10 previamente, y habla sido cultivada a 5000 celulas por centlmetro cuadrado hasta la confluencia en cada pase hasta ese punto. Se determino el efecto de la densidad celular en las poblaciones celulares despues de ser descongeladas en el pase 10. Las celulas fueron descongeladas bajo condiciones estandar y contadas usando la coloration de tripano azul. Las celulas descongeladas fueron entonces sembradas a 1000 celulas / centlmetro cuadrado en el medio de crecimiento DMEM: de baja glucosa con antibioticos / antimicoticos como se describio anteriormente. Las celulas fueron cultivadas bajo condiciones atmosfericas estandar a 37 °C. El medio de crecimiento fue cambiado dos veces a la semana y las celulas fueron pasadas cuando alcanzaron el 85% de confluencia. Las celulas fueron pasadas subsecuentemente hasta la senectud, en otras palabras, hasta que no podlan expandirse mas. Las celulas fueron tripnizadas y contadas en cada pase. La produccion celular, doblaje poblacional (en (celulas finales / celulas iniciales) / en 2) y el tiempo de doblaje (tiempo en el cultivo (h) / doblajes de poblacion). La produccion al por pase fue determinada al multiplicar la produccion total del pase anterior por el factor de expansion para cada pase (por ejemplo, factor de expansion = celulas finales / celulas iniciales).

Expansion de las PPDCs a baja densidad desde la siembra inicial. Se probo La expansion potencial de PPDCs aisladas frescas bajo condiciones de siembra celular baja. Las PPDCs fueron preparadas como se describio

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anteriormente. Las celulas fueron sembradas a 1000 celulas / centlmetro cuadrado y pasadas como se describio antes hasta la senectud. Las celulas fueron cultivadas bajo condiciones atmosfericas estandar a 37 °C. El medio de crecimiento fue cambiado dos veces a la semana. Las celulas fueron pasadas cuando alcanzaron el 85% de confluencia. En cada pase las celulas fueron tripnizadas y contadas por la coloracion de tripano azul. La production celular, los doblajes de poblacion (en (celulas finales / celulas iniciales)/ en dos) y tiempo de doblaje (tiempo en el cultivo (h) / doblaje poblacional) fueron calculados en cada pase. La produccion celular total por pase fue determinada al multiplicar la produccion total en el pase anterior por el factor de expansion en cada pase (en otras palabras, factor de expansion = celulas finales / celulas iniciales). Las celulas fueron cultivadas en matraces cubiertos de gelatina y en matraces sin cobertura de gelatina.

La expansion de celulas clonicas neonatales derivadas de la placenta. Se utilizo donation para expandir una poblacion de celulas neonatales de tejido placentario. Despues del aislamiento de tres poblaciones celulares diferenciales de la placenta (como se describe aqul), estas poblaciones celulares fueron expandidas bajo condiciones de crecimiento estandar y despues se analizaron los cariotipos para revelar la identidad de las poblaciones celulares aisladas. Puesto que las celulas fueron aisladas de una madre que tuvo un hijo, fue facil el distinguir entre los cromosomas masculinos y femeninos al realizar propagaciones de metafase. Estos experimentos demostraron que las celulas de aspecto fetal tuvieron cariotipos positivos para el fenotipo neonatal, las celulas de la capa media tuvieron cariotipos positivos de ambos fenotipos neonatal y materno y las celulas de aspecto maternal tuvieron cariotipos positivos para las celulas maternales.

Expansion de celulas en condiciones de cultivos con bajo oxfgeno. Se ha demostrado que condiciones de cultivos celulares de bajo oxlgeno pueden mejorar la expansion celular en ciertas circunstancias (US20040005704). Para determinar si la expansion celular de las PPDCs podrla mejorarse al alterar las condiciones de los cultivos celulares, los cultivos de las celulas derivadas umbilicales crecieron en condiciones de bajo oxlgeno. Las celulas fueron sembradas a 5000 celulas / centlmetro cuadrado en un medio de crecimiento en matraces cubiertos con gelatina. Las celulas se cultivaron inicialmente bajo condiciones atmosfericas estandar hasta el pase cinco. En el cual fueron transferidas a condiciones de cultivos de bajo oxlgeno (5% O2).

Otras condiciones de crecimiento. En otros protocolos, las celulas se expandieron en platos sin cobertura, con cobertura de colageno, con cobertura de fibronectina, con cobertura de laminina y con cobertura de protelna de una matriz celular. Los cultivos han demostrado expandirse bien en estas matrices.

Resultados

Comparacion del potencial de expansion de las PPDCs con otras poblaciones de celulas madre y celulas no madre. Ambas celulas derivadas umbilicales y derivadas de la placenta se expandieron por mas de 40 pases generando producciones celulares de > 1E17 celulas en 60 dlas. En contraste, las MSCs y los fibroblastos alcanzaron la senectud despues de < 25 dlas y < 60 dlas, respectivamente. Aunque las celulas derivadas de la adiposa se expandieron durante casi 60 dlas obtuvieron una produccion celular total de 4.5E12. Por lo tanto, cuando se sembraron a 5000 celulas / centlmetro cuadrado, bajo las condiciones experimentales utilizadas, las celulas derivadas de postparto se expandieron mucho mejor que los otros tipos de celulas cultivados bajo las mismas condiciones (Tabla 2 - 1).

Tabla 2 - 1: Caracterlsticas de crecimiento para diferentes poblaciones celulares cultivadas hasta la senectud.

Tipo de Celula

Senectud Doblajes de Poblacion Totales Produccion Celular Total

MSC

24 d 8 4.72 E7

Adiposa

57 d 24 4.5 E12

Fibroblastos

53 d 26 2.82 E13

Umbilical

65 d 42 6.15 E17

Placenta

80 d 46 2.49 E19

Potencial de expansion de bancos de celulas a una densidad baja. Las celulas derivadas umbilicales, de la placenta y fibroblastos se expandieron por mas de 10 pases generando producciones de celulas de > 1E11 celulas en 60 dlas (Tabla 2 - 2). Despues de 60 dlas bajo estas condiciones los fibroblastos alcanzaron la senectud mientras que las poblaciones de celulas derivadas umbilicales y de la placenta alcanzaron la senectud despues de 80 dlas, completando doblajes superiores a 50 y 40 respectivamente.

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Tabla 2 - 2: Caracterlsticas de crecimiento para diferentes poblaciones celulares usando expansion de crecimiento

de baja densidad desde el pase 10 hasta la senectud

Tipo de celula

Senectud Doblaies de poblacion totales Produccion celular total

Fibroblasto (P10)

80 d 43.68 2.59 E11

Umbilical (P10)

80 d 53.6 1.25 E14

Placenta (P10)

60 d 32.96 6.09 E12

Expansion de las PPDCs a baja densidad desde su siembra inicial. Las PPDCs se expandieron a baja densidad (1000 celulas por centlmetro cuadrado) en platos o matraces cubiertos con gelatina y sin cobertura de gelatina. El potencial de crecimiento de estas celulas bajo estas condiciones fue buena. Las celulas expandieron rapidamente en un crecimiento logarltmico por fases. La tasa de expansion celular fue similar a la observada cuando las celulas derivadas de la placenta fueron sembradas a 5000 celulas por centlmetro cuadrado en matraces cubiertos con gelatina en un medio de crecimiento. No existieron diferencias en la expansion potencial de celulas entre cultivos ya sea en matraces sin cobertura o matraces con cobertura de gelatina. Sin embargo, las celulas tuvieron una apariencia fenotlpica mas pequena en los matraces cubiertos con gelatina y fenotipos celulares muchos mas grandes fueron observados en los matraces sin cobertura.

Expansion de celulas neonatales o maternales clonicas o derivadas de la placenta. Una poblacion de celulas neonatales o maternales clonicas pueden expandirse de celulas derivadas de la placenta aisladas de un aspecto neonatal o de un aspecto maternal, respectivamente, de la placenta. Las celulas se diluyeron en serie y entonces se sembraron en platos cubiertos con gelatina en medios de crecimiento para su expansion a 1 celula por pozo en platos cubiertos de gelatina de 96 pozos. Desde este clonaje inicial, se identificaron, tripnizaron, y se re - sembraron en platos cubiertos de gelatina de 12 pozos en un medio de crecimiento y subsiguientemente se pasaron a matraces cubiertos de gelatina T 25 a 5000 celulas por centlmetro cuadrado en el medio de crecimiento. Se realizo un sub - clonaje para asegurar que una poblacion clonica de celulas se haya identificado. Para experimentos de sub - clonaje, las celulas se tripnizaron y se re - sembraron a 0.5 celulas por pozo. Los sub - clones que crecen bien se expanden en matraces T 25 cubiertos con gelatina a 5000 celulas por centlmetro cuadrado. Las celulas pasan a 5000 celulas por centlmetro cuadrado a matraces T 75. Las caracterlsticas de crecimiento de un clon pueden ser graficadas para demostrar la expansion celular. Un analisis de cariotipos puede confirmar que el clon es neonatal o maternal.

Expansion de las celulas en condiciones de cultivos de bajo oxfgeno. Las celulas se expandieron bien bajo las condiciones de oxlgeno reducido, sin embargo, el cultivar en condiciones de bajo oxlgeno no parecio tener un efecto significativo en la expansion de las celulas PPDCs con las condiciones utilizadas.

Resumen. Las condiciones de expansion celular que involucran el crecimiento aislado de celulas derivadas de postparto a densidades de alrededor de 5000 celulas por centlmetro cuadrado, en un medio de crecimiento en matraces cubiertos con gelatina o no cubiertos con gelatina, con un oxlgeno atmosferico estandar, son suficientes para generar un numero abundante de celulas en el pase 11. Aun mas, los datos sugieren que las celulas pueden ser expandidas facilmente usando condiciones de cultivos de baja densidad (por ejemplo, 1000 celulas por centlmetro cuadrado). La expansion de celulas derivadas de postparto en condiciones de bajo oxlgeno tambien facilita la expansion, aunque no se ha observado que exista una mejora incremental en la potencialidad de expansion cuando se utilizan estas condiciones de crecimiento. Actualmente, es preferible el cultivar las celulas derivadas de postparto bajo condiciones atmosfericas estandar para generar grandes reservas de celulas. Sin embargo, cuando las condiciones de cultivo se alteran, la expansion de celulas derivadas de postparto tambien puede alterarse. Esta estrategia podrla ser utilizada para impulsar la capacidad proliferativa y diferencial de estas poblaciones de celulas.

Bajo las condiciones utilizadas, aunque el potencial de expansion de las MSC y de las celulas derivadas de adiposa es limitado, las celulas derivadas de postparto se expanden facilmente en grandes numeros.

Referencias para el ejemplo 2

1) Hayflick L. 1974a. J Am Geriatr Soc. 22:1-12.

2) Hayflick L. 1974b. Gerontologist. 14:37-45.

3) Publicacion de patente de Estados Unidos US20040058412

4) Publicacion de patente de Estados Unidos US20040048372

5) Publicacion de patente de Estados Unidos US20040005704.

EJEMPLO 3

Evaluacion del medio de crecimiento para celulas derivadas de la placenta

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Se evaluaron algunos medios de cultivos de celulas debido a su habilidad para dar apoyo al crecimiento de las celulas derivadas de la placenta. El crecimiento de las celulas derivadas de la placenta con un nivel normal de oxlgeno (20%) y un nivel bajo (5%) fue evaluado durante 3 dlas usando ensayos colorimetricos MTS.

Metodos y materiales

Las celulas derivadas de la placenta en el pase ocho (P8) fueron sembradas a 1X 103 celulas por pozo 96 platos de pozos en medios de crecimiento con penicilina / estreptomicina. Despues de ocho horas el medio se cambio como se describe a continuation y las celulas se incubaron con niveles de oxlgeno normal (atmosferico) o bajo 5%, (volumen / volumen) a 37 °C, 5% de CO2 x 48 horas. Se agrego MTS al medio de cultivo (CellTiter 96 AQueous, una solution para Ensayos de proliferation celular, Promega, Madison, WI) durante tres horas y la absorcion midio 490 nanometros (Molecular Devices - Dispositivos Moleculares, Sunnyvale CA).

Tabla 3-1. Medio de cultivo

Medio de cultivo

Proveedor Suero bovino fetal agregado % (volumen / volumen)

DMEM de baja glucosa

Gibco Carlsbad CA 0.21

DMEM de alta glucosa

Gibco 0.21

RPMI 1640

Mediatech, Inc. Herndon, VA 0.21

Celula libre de gro (libre de sueros, libre de protelnas)

Mediatech, Inc.

F10 de Ham

Mediatech, Inc. 0.21

MSCGM (completa con suero)

Cambrex, Walkersville, MD 0.21

Suero completo libre de con albumina

Mediatech, Inc. -

Medio de crecimiento

NA -

F12 de Ham

Mediatech, Inc. 0.21

De Iscove

Mediatech, Inc. 0.21

Medio basal de Eagle

Mediatech, Inc.

DMEM / F12 (1:1)

Mediatech, Inc. 0.21

Resultados

Las curvas estandar de los ensayos MTS establecieron una correlation linear entre un incremento en absorcion y un incremento en numero celular. Los valores de absorcion obtenidos fueron convertidos en numeros de celulas estimados y el cambio (%) relativo a la siembra inicial fue calculado.

El efecto del suero. La adicion del suero al medio en condiciones de oxlgeno normales resulto en un incremento de dependencia de la dosis reproducible en la absorcion y por lo tanto del numero de celulas viables. La adicion del suero para completar el MSCGM resulto en una reduction de la dependencia de la dosis en la absorcion. En el medio sin agregar suero, las celulas solo crecieron apreciablemente en los medios Libre de CELLGRO, F10 de Ham y DMEM.

El efecto del oxlgeno. Niveles bajos de oxlgeno parecieron incrementar la tasa de crecimiento de las celulas en los medios de crecimiento, F10 de Ham y MSCGM. En orden descendiente de crecimiento, los medios que dieron los mejores resultados de crecimiento para las celulas fueron los medios de crecimiento >MSCGM> Iscove's+10% FBS = DMEM-H +10% FBS = F12 de Ham +10% FBS = RPMI 1640 +10% FBS.

Resumen. Las celulas derivadas de la placenta pueden ser producidas en varios medios de cultivos con niveles de oxlgeno normal y bajo. El crecimiento a corto plazo de las celulas derivadas de la placenta fue determinado en 12 medios basales con 0, 2 y 10% (volumen / volumen) de suero en un nivel de oxlgeno del 5% o a niveles atmosfericos. En general, las celulas que se derivan de la placenta no crecieron tan bien como en condiciones libres de suero con la exception de los medios F10 de Ham y Libre de CELLGRO, los cuales estan libres de protelnas. El crecimiento en estos medios libres de suero fue alrededor de 25 - 33% del maximo crecimiento observado en medios que contenlan un 15% de suero.

EJEMPLO 4

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Crecimiento de celulas derivadas de postparto en medios que contienen D - valina

Se ha reportado que los medios que contienen D-valina en vez de la isoforma de L-valina normal pueden ser usados selectivamente para inhibir el crecimiento de celulas similares a fibroblastos en cultivos (Hongpaisan, 2000; Sordillo et al., 1988). No se conocla previamente si las celulas derivadas de postparto podrlan crecer en medios que contienen D-valina.

Metodos y materiales

Las celulas derivadas de la placenta (P3), fibroblastos (P9) y celulas derivadas umbilicales (P5) fueron sembradas a 5 X 103 celulas por centlmetro cuadrado en matraces de 75 cubiertos de gelatina (Corning, Corning, NY). Despues de 24 horas el medio se removio y las celulas se lavaron con tampon de fosfato salino (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) para remover el medio residual. El medio se reemplazo con un medio de crecimiento modificado (DMEM con D-valina (orden especial de Gibco), 15% (volumen / volumen) de suero bovino fetal dializado (Hyclone, Logan, UT), 0.001% (volumen / volumen) de betamercaptoetanol (Sigma), penicilina / estreptomicina (Gibco)).

Resultados

Las celulas derivadas de la placenta, derivadas umbilicales, y fibroblastos que se sembraron en medios que contenlan D - valina no proliferaron, a diferencia de las celulas sembradas en medios de crecimiento que tenlan suero dializado. Las celulas fibroblastos cambiaron morfologicamente, incrementando su tamano y cambiando forma. Todas las celulas murieron y eventualmente se separaron de la superficie del matraz despues de cuatro semanas. Estos resultados indican que el medio que contiene D - valina no es apto guiado para el crecimiento selectivo de celulas derivadas de postparto.

Referencias para el ejemplo 4

1) Hongpaisan J. 2000. Cell Biol Int. 24:1-7.

2) Sordillo LM, Oliver SP, Akers RM. 1988). Cell Biol Int Rep. 12:355 - 64.

EJEMPLO 5

Medios de conservacion criogenica para celulas derivadas de la placenta

Los medios de conservacion criogenica para la preservacion de las celulas derivadas de placenta fueron evaluados.

Metodos y materiales

Las celulas derivadas de la placenta cultivadas en un medio de crecimiento en matraces T 75 cubiertos con gelatina fueron lavados con PBS y Tripsinizados usando 1 ml de tripsina / EDTA (Gibco). La tripsinizacion fue detenida al agregar 10 ml del medio de crecimiento. Las celulas fueron centrifugadas a 150 x g, se removieron los materiales flotantes, y el pellet de celulas fue re - suspendido en 1 ml de medio de crecimiento. Una parte de la suspension de celulas, 60 pl, fue removida y se anadio 60 pl de tripano azul (Sigma).El numero viable de celulas fue estimado usando un hemocitometro. La suspension de celulas se dividio en cuatro partes iguales que contenla cada una 88 x 104 celulas. La suspension de celulas fue centrifugado y re - suspendido en 1 ml de cada uno de los siguientes medios y transferido a crioviales (Nalgene).

1. Medio de crecimiento +10% (volumen / volumen) DMSO (Hybrimax, Sigma, St. Louis, MO)

2. Medio de congelacion de celulas con DMSO, con metilcelulosa sin suero (C6295, Sigma, St. Louis, MO)

3. Medio para congelacion de celulas libre de suero (C2639, Sigma, St. Louis, MO)

4. Medio para congelacion de celulas conglicerol (C6039, Sigma, St. Louis, MO)

Las celulas fueron enfriadas aproximadamente a -1 °C por minuto durante la noche en un congelador a -80° C utilizando un contenedor de congelacion “Mr. Frosty” de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Nalgene, Rochester, NY). Los viales de celulas fueron transferidos a nitrogeno llquido por dos dlas antes de descongelarlos rapidamente en un bano de agua a 37 °C. Se agregaron las celulas a 10 ml de medio de crecimiento y se centrifugaron antes de que el numero de celulas y la viabilidad se estimasen. Las celulas fueron sembradas en matraces cubiertos de gelatina a 5000 celulas por centlmetro cuadrado para determinar si las celulas se adherirlan y proliferarlan.

Resultados

La viabilidad inicial de las celulas a ser conservadas criogenicamente se evaluo con una coloracion de tripano azul al 100%. La viabilidad inicial de las celulas a ser conservadas criogenicamente se evaluo con una coloracion de tripano azul al 100%.

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Hubo una reduccion conmensurada en el numero de celulas con viabilidad para C6295 debido a lisado de celulas. Las celulas viables se conservaron criogenicamente en todas las cuatro soluciones adheridas, divididas y producidas en una monocapa confluente en tres dlas. No se observo ninguna diferencia distinguible en la tasa de crecimiento estimado.

Resumen. La conservacion criogenica de celulas es un procedimiento disponible para la preparacion de un banco de celulas o un producto de celulas. Cuatro mezclas de conservacion criogenica fueron comparadas por su habilidad de proteger a las celulas derivadas de placenta humana del dano del congelamiento. El medio modificado de Dulbecco de Eagle (DMEM) y el 10% (volumen / volumen) de dimetilsulfoxido (DMSO) es el medio preferido de aquellos comparados para la conservacion criogenica de las celulas derivadas de la placenta.

EJEMPLO 6

Analisis de cariotipos de las celulas derivadas de postparto

Las llneas celulares usadas en terapias celulares son preferiblemente homogeneas y libres de cualquier tipo de celula contaminante. Las celulas usadas en la terapia celular deberan tener numeros de cromosomas (46) y estructura normales. Para identificar las llneas celulares derivadas de la placenta e umbilicales que son homogeneas y que estan libres de celulas de origen no postparto, se hicieron analisis de cariotipos de muestras celulares.

Materiales y metodos

Las PPDCs de tejidos de postparto de neonato masculino fueron cultivados en medios de crecimiento que contenlan penicilina / estreptomicina. El tejido de postparto de neonato masculino (XY) fue seleccionado para permitir la distincion entre celulas derivadas neonatales y celulas derivadas maternas (XX). Las celulas fueron sembradas a 5000 celulas por centlmetro cuadrado en un medio de crecimiento en un matraz T 25 (Corning, Corning, NY) y se expandieron a un 80% de confluencia. Un matraz T 25 que contenla celulas fue llenado hasta el cuello con medio de crecimiento. Las muestras fueron entregadas a un laboratorio cllnico de citogenetica por correo (un transporte de laboratorio a laboratorio con un perlodo estimado de una hora). Las celulas fueron analizadas durante la metafase cuando los cromosomas se podlan visualizar mejor. De 20 celulas contadas en la metafase, cinco fueron analizadas para un numero de cariotipos homogeneos normales (dos). Una muestra celular se caracterizo como homogenea si dos cariotipos estaban presentes. Una muestra celular se caracterizaba como heterogenea si mas de dos cariotipos estaban presentes. Celulas de metafases adicionales fueron contadas y analizadas cuando un numero de cariotipo heterogeneo (cuatro) era identificado.

Resultados

Se interpreto que todas las muestras celulares enviadas para su analisis cromosomico exhiblan una apariencia normal. Tres de las 16 llneas de celulas analizadas mostraban un fenotipo heterogeneo (XX y XY) indicando la presencia de celulas derivadas de orlgenes neonatal y maternal (Tabla 6 - 1). Las celulas derivadas del tejido placenta-N fueron aisladas del aspecto neonatal de la placenta. En el pase cero, esta llnea celular parecla homogenea XY. Sin embargo, en el pase 9, la llnea celular era heterogenea (XX / XY), indicando una presencia previamente no detectada de celulas de origen maternal.

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Tabla 6-1. Resultados del analisis de cariotipos de las PPDCs

Teiido

Pase Celulas contadas en la metafase Celulas analizadas en la metafase Numero de cariotipos Cariotipo ISCN

Placenta

22 20 5 2 46, XX

Umbilical

23 20 5 2 46, XX

Umbilical

6 20 5 2 46, XY

Placenta

2 20 5 2 46, XX

Umbilical

3 20 5 2 46, XX

Placenta-N

0 20 5 2 46, XY

Placenta-V

0 20 5 2 46, XY

Placenta-M

0 21 5 4 46, XY [181 / 46, XX [31

Placenta-M

4 20 5 2 46, XX

Placenta-N

9 25 5 4 46, XY [51 / 46, XX [201

Placenta-N C1

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C3

1 20 6 4 46, XY [21 / 46, XX [181

Placenta-N C4

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C15

1 20 5 2 46, XY

Placenta-N C20

1 20 5 2 46, XY

Clave: N-aspecto neonatal; V-region con vellosidades; M-aspecto maternal; C-clon

Resumen. El analisis cromosomico identified celulas derivadas de la placenta y umbilicales cuyos cariotipos pareclan normales tal como se interpreto por un laboratorio cllnico citogenetico. El analisis de cariotipos tambien identifico llneas de celulas libres de celulas maternales, como se determino por cariotipos homogeneos.

EJEMPLO 7

Evaluacion de marcadores de superficie de celulas derivadas de postparto humanas por citometria de flujo

La caracterizacion de las protelnas o “marcadores” de la superficie de las celulas con citometria de flujo puede utilizarse para determinar la identidad de una llnea celular. La consistencia de expresion puede determinarse de donadores multiples, y en celulas expuestas a diferentes condiciones de proceso y de cultivo. Las llneas aisladas de celulas derivadas de postparto (PPDC) de la placenta y umbilicales se caracterizaron (por citometria de flujo), suministrando un perfil para la identificacion de estas llneas celulares.

Materiales y metodos

Medios y recipientes de cultivos. Las celulas fueron cultivadas en medios de crecimiento (Gibco Carlsbad, CA) con penicilina / estreptomicina. Las celulas se cultivaron en matraces de cultivos de tejidos T 75, T 150 y T 225 (Corning, Corning, NY) que fueron tratados con plasma hasta su confluencia. Las superficies de crecimiento de los matraces se cubrieron con gelatina al incubar el 2% (masa / volumen) de gelatina (Sigma, St. Louis, MO) durante 20 minutos a la temperatura del cuarto.

Analisis de coloracion de anticuerpos y citometria de flujo. Las celulas adherentes en los matraces fueron lavadas en PBS y separadas con tripsina / EDTA. Las celulas fueron cosechadas, centrifugadas y re - suspendidas en 3% (volumen / volumen) de FBS en PBS con una concentracion de celulas de 1x107 por mililitro. De acuerdo a las especificaciones del fabricante, se aumento un anticuerpo al marcador de la superficie de la celula de interes (ver mas adelante) a 100 pl de suspension de celulas y la mezcla fue incubada en la oscuridad durante 30 minutos a 4 °C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron con PBS y se centrifugaron para remover los anticuerpos que no estaban vinculados. Las celulas fueron re- suspendidas en 500 micro litros de PBS y se analizaron con una citometria de flujo. El analisis de citometria de flujo fue realizado con un citometro FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Se utilizaron los siguientes anticuerpos como marcadores de superficie de celulas.

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Anticuerpo

Fabricante

CD10

BD Pharmingen (San Diego, CA)

CD13

BD Pharmingen

CD31

BD Pharmingen

CD34

BD Pharmingen

CD44

BD Pharmingen

CD45RA

BD Pharmingen

CD73

BD Pharmingen

CD90

BD Pharmingen

CD117

BD Pharmingen

CD141

BD Pharmingen

PDGFr-alfa

BD Pharmingen

HLA-A, B, C

BD Pharmingen

HLA-DR, DP, DQ

BD Pharmingen

IgG-FITC

Sigma (St. Louis, MO)

IgG- PE

Sigma

Numero de Catalogo

555375

555394

555446

555821

555478

555489

550257

555596

340529

559781

556002

555553

555558

F-6522

P-4685

Comparacion entre la placenta y el cordon umbilical. Se compare las celulas derivadas de la placenta con las celulas derivadas umbilicales en el pase ocho.

Comparacion pase a pase. Se analizaron las celulas derivadas de la placenta y umbilicales en los pases 8, 15 y 20.

Comparacion donante a donante. Para comparar las diferencias entre donantes, se compararon entre si las celulas derivadas de la placenta de diferentes donantes, y las celulas derivadas umbilicales de diferentes donantes tambien se compararon entre si.

Comparacion de cobertura de la superficie. Los cultivos de celulas derivadas de la placenta en matraces cubiertos de gelatina fueron comparados a celulas derivadas de la placenta cultivadas en matraces sin cobertura. Cultivos de celulas derivadas umbilicales en matraces cubiertos con gelatina fueron comparados a celulas derivadas umbilicales cultivadas en matraces sin cobertura.

Comparacion de enzimas digestivas. Se utilizaron cuatro tratamientos para el aislamiento y preparacion de las celulas los cuales fueron comparados. Se compararon las celulas aisladas de la placenta con el tratamiento de 1) colagenasa; 2) colagenasa / dispasa; 3) colagenasa / hialuronidasa; y 4) colagenasa / hialuronidasa / dispasa.

Comparacion de capas placentarias. Las celulas derivadas del aspecto maternal del tejido placentario se compararon a las celulas derivadas de la region de vellosa del tejido placentario y a las celulas derivadas del aspecto neonatal de la placenta.

Resultados

Comparacion placenta versus cordon umbilical. Las celulas derivadas de la placenta y umbilicales fueron analizadas con citometrla de flujo y mostraron una expresion positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, indicado por el aumento en los valores de fluorescencia relativa al control IgG. Estas celulas fueron negativas para una expresion detectable de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ, indicado por los valores de fluorescencia comparables al control IgG. Las variaciones en los valores de fluorescencia de las curvas positivas fueron tomadas en cuenta. La media (en otras palabras CD13) y el rango (en otras palabras CD90) de las curvas positivas mostraron alguna variacion, pero las curvas parecieron normales, confirmando una poblacion homogenea. Ambas curvas exhibieron individualmente valores mayores que los del control IgG.

Comparacion pase a pase - celulas derivadas de la placenta. Se analizaron por citometrla de flujo a las celulas derivadas de la placenta en los pases 8, 15, y 20 y todos fueron positivos para la expresion de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, tal como se reflejo en un aumento en el valor de fluorescencia relativa a la del control IgG. Las celulas tuvieron una expresion negativa de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ teniendo valores de fluorescencia consistentes con los del control IgG.

Comparacion pase a pase - celulas derivadas umbilicales. Las celulas derivadas umbilicales en los pases 8, 15 y 20 fueron analizadas con citometrla de flujo y todas expresaron CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, indicado por un incremento en la fluorescencia en relacion al control IgG. Estas celulas fueron negativas para CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ, indicado por los valores de fluorescencia consistentes con el control IgG.

Comparacion donante a donante - celulas derivadas de la placenta. Las celulas derivadas de la placenta aisladas de donantes diferentes fueron analizadas con citometrla de flujo y cada una expreso CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, con valores incrementados de fluorescencia relativa a la del control

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IgG. Las celulas fueron negativas en la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ tal como se indico con un valor de fluorescencia consistente con el del control IgG.

Comparacion donante a donante - celulas derivadas umbilicales. Las celulas derivadas umbilicales aisladas de diferentes donantes fueron analizadas por citometrla de flujo y cada una mostro una expresion positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, reflejados en los valores incrementados de fluorescencia relativa en comparacion de la del control IgG. Estas celulas fueron negativas en expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ con valores de fluorescencia consistentes con los del control IgG.

El efecto de cubrir la superficie con gelatina en las celulas derivadas de la placenta. Las celulas derivadas de la placenta se expandieron ya sea en matraces cubiertos con gelatina o sin cobertura se analizaron con citometrla de flujo y todas expresaron cD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, reflejados en los valores incrementados de fluorescencia relativa a la del control IgG. Estas celulas fueron negativas en expresiones de CD31, CD34, CD45, CD 117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ tal como se indico por los valores de fluorescencia consistentes con los del control IgG.

El efecto de cubrir la superficie con gelatina en las celulas derivadas umbilicales. Las celulas derivadas umbilicales expandidas en matraces con gelatina y sin cobertura se analizaron con citometrla de flujo y todas mostraron expresiones positivas de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, con valores incrementados de fluorescencia relativa al control IgG. Estas celulas fueron negativas en cuanto a expresiones de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ, con valores de fluorescencia consistentes con los del control IgG.

Efectos del procedimiento de digestion enzimatica utilizada para la preparacion de las celulas para el perfil del marcador de superficie celular. Las celulas derivadas de la placenta aisladas utilizando varias enzimas digestivas analizadas por citometrla de flujo expresaron en su totalidad CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, como se indico por los valores incrementados de fluorescencia relativa en comparacion del control IgG. Estas celulas fueron negativas en expresiones de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HlA-DR, DP, DQ como se indico por los valores de fluorescencia consistentes con los del control IgG.

Comparacion de las capas placentarias. Las celulas aisladas de las capas maternal, vellida y neonatal de la placenta, respectivamente, analizadas por citometrla de flujo mostraron expresiones positivas de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, como se indica por los valores incrementados de fluorescencia relativa en comparacion con el control IgG. Estas celulas fueron negativas en la expresion de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, y HLA-DR, DP, DQ como se indico por los valores consistentes de fluorescencia en comparacion con el control IgG.

Resumen. Un analisis de las celulas derivadas de la placenta y umbilicales con citometrla de flujo ha establecido una identidad de estas llneas celulares. Las celulas derivadas de la placenta y umbilicales son positivas para CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, HLA-A,B,C y negativas para CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ. Esta identidad fue consistente entre algunas configuraciones de variables incluyendo al donante, el pase, la cobertura de la superficie del envase del cultivo, a las enzimas digestivas y la capa placentaria. Se observaron algunas variaciones en valores fluorescentes individuales de la curva del histograma, medias y rangos, pero todas las curvas positivas bajo todas las condiciones probadas fueron normales y los valores expresados de fluorescencia fueron mayores que en el control IgG, confirmando que las celulas tienen una poblacion homogenea que tiene una expresion positiva de los marcadores.

EJEMPLO 8

Caracterizacion e inmunohistoquimica de los fenotipos de tejidos de postparto

Los fenotipos de las celulas encontrados dentro de los tejidos de postparto humanos, especlficamente en el cordon umbilical y la placenta, fueron analizados por inmunohistoquimica.

Materiales y metodos

Preparacion de los tejidos. Los tejidos humanos del cordon umbilical y de la placenta fueron cultivados y se fijaron en una inmersion en un 4% (masa / volumen) de paraformaldehido durante la noche a 4 °C. Se realizo inmunohistoquimica usando anticuerpos dirigidos en contra de los siguientes epitopos: vimentina (1:500; Sigma, St. Louis, MO), desmina (1: 150, generado contra conejo; Sigma; o 1: 300, generado contra raton; Chemicon, Temecula, CA), actina de musculo liso alfa (SMA; 1: 400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1: 400; Sigma), factor de von Willebrand (vWF; 1: 200; Sigma), y CD34 (CD34 humano de Clase III; 1: 100; Dako, Carpinteria, CA). Ademas, se probaron los siguientes marcadores: GROalpha anti-humano - PE (1: 100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), anti-humana GCP-2 (1: 100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), receptor de LDL oxidada anti-humano 1 (ox-LDL R1; 1: 100; Santa Cruz Biotech), y NOGO-A anti-humana (1: 100; Santa Cruz Biotech). Muestras fijadas fueron recortadas con un bisturi y se colocaron dentro del compuesto de adhesion OCT (Tissue-Tek PTU; Sakura,

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Torrance, CA) en un bano de hielo seco que contenla etanol. Los bloques congelados fueron seccionados (10 micras de espesor) usando un criostato estandar (Leica Microsystems) y se coloco en portaobjetos de vidrio para su coloracion.

Inmunohistoqufmica. La inmunohistoqulmica se realizo similarmente a estudios previos (por ejemplo, Messina, et al., 2003, Exper. Neurol. 184: 816-829). Las realizaciones de tejidos fueron lavadas con tampon salino de fosfato (PBS) y expuestos a una solucion de bloqueo de protelnas que contenla PBS en un 4% (volumen / volumen) suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0.3 por ciento (volumen / volumen) de Triton (Triton X-100; Sigma) por una hora para acceder a antlgenos intracelulares. En instancias cuando el epitope de interes estuviese ubicado en la superficie celular (CD34, ox-LDL R1), se omitio el triton en todos los pasos del procedimiento para prevenir una perdida de epitope. Es mas, en instancias cuando el anticuerpo principal era generado en contra de la cabra (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), 3% (volumen / volumen) se utilizo suero de burro en vez del suero de cabra durante el procedimiento. Los anticuerpos primarios, diluidos en solucion de bloqueo, fueron aplicados en dosis a las realizaciones por un periodo de cuatro horas a la temperatura del cuarto. Estas soluciones de anticuerpos primarios fueron removidas, y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicacion de soluciones secundarias de anti cuerpos (una hora a la temperatura del cuarto) que contenla bloqueos. Con IgG de cabra anti raton - Texas Red (1:250; Molecular Probes (Sondas Moleculares), Eugene, OR) y / o IgG de cabra anti conejo - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes (Sondas Moleculares)) o IgG de burro anti cabra - FITC (1:150; Santa Cruz Biotech). Los cultivos fueron lavados, y se aplico 10 pmol DAPI (Molecular Probes - Sondas Moleculares) durante 10 minutos para visualizar el nucleo celular.

Despues de la inmunotincion, se visualizo la fluorescencia usando el filtro de fluorescencia apropiado en un microscopio epifluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). Una coloracion positiva era representada por una senal fluorescente sobre la coloracion del control. Se capturaron imagenes representativas usando una videocamara digital a color y el software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para muestras triplemente tinturadas, cada imagen fue tomada utilizando un solo filtro de emision a la vez. Montajes en capas fueron entonces preparados usando el software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Resultados

Caracterizacion del cordon umbilical. Los marcadores vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF, y CD34 se expresaron en un subconjunto de celulas encontrado dentro de un cordon umbilical. La expresion de vWF y CD34 en especlfico estuvieron restringidas a vasos de sangre contenida dentro del cordon. Celulas CD34+ estaban en la capa mas profunda (lado del lumen). Se encontro una expresion vimentina a lo largo de los compartimientos de la matriz y de sangre en el cordon. Los SMA se limitaron a la matriz y a las paredes externas de la arteria y la vena, pero no se encontraba en los vasos en si. Se encontraron CK18 y disemina dentro de los vasos exclusivamente, estando la disemina restringida a las capas medias y externas.

Caracterizacion de la placenta. Se observo vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF, y CD34 dentro de la placenta y especlficamente en ciertas regiones.

Expresiones de tejidos GROalfa, GCP-2, ox-LDL R1, y NOGO-A. Ninguno de estos marcadores se observaron dentro de los tejidos de cordon umbilical o de placenta.

Resumen. Vimentina, desmina, actina de musculo liso-alfa, citoqueratina 18, el factor von Willebrand, y CD 34 se encontraron en las celulas dentro del cordon umbilical y placenta humanos.

EJEMPLO 9

Analisis de celulas derivadas de tejido postparto utilizando ensayos de oligonucleotidos

Se utilizaron ensayos con GENECHIP (CHIP GENETICO) de Affymetrix para comparar Perfiles de expresion genetica de celulas derivadas umbilicales y de la placenta con fibroblastos, celulas madre mesenquimas humanas, y otras llneas celulares de medula osea humana. Este analisis suministro una caracterizacion de las celulas derivadas de postparto e identifico marcadores moleculares unicos para estas celulas.

Materiales y metodos

[0228] Aislamiento y cultivos celulares. Se obtuvieron cordones umbilicales y placentas humanas del National Disease Research Interchange (NDRI - Intercambio Nacional de Investigation de Enfermedades, Filadelfia, PA) de partos de embarazos a termino normal completo con el consentimiento de los pacientes. Los tejidos fueron recibidos y las celulas fueron aisladas tal como se describe en el Ejemplo 1. Las celulas se cultivaron en un medio de crecimiento (usando DMEM-LG) en matraces plasticos de cultivos de tejidos cubiertos con gelatina. Los cultivos se incubaron a 37° C con un 5% o de CO2.

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Se compraron fibroblastos dermicos humanos de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; Numero de Lote 9F0844) y ATcC CRL-1501 (CCD39SK). Estas dos llneas fueron cultivadas en el medio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con un 10% (volumen / volumen) de suero bovino fetal (Hyclone) y penicilina / estreptomicina (Invitrogen). Las celulas crecieron en plastico tratado para tejidos estandar.

Se compraron celulas madres mesenquimas humanas (hMSC - Human mesenchymal stem cells) de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; numeros de lote 2F1655, 2F1656 y 2F1657) y se cultivaron de acuerdo a las especificaciones del fabricante en el medio MSCGM (Cambrex). Las celulas crecieron en un plastico cultivado de tejidos estandar a 37 °C con un 5% de CO2.

Se recibio medula osea de cresta illaca humana de NDRI con el consentimiento del paciente. La medula fue procesada de acuerdo al metodo senalado por Ho, et al. (WO03/025149). La medula fue mezclada con un amortiguador lisis (155 mM NH4O, 10 mM KHCO3, y 0.1 mM eDtA, pH 7.2) a una taza de 1 parte de medula osea a 20 partes de amortiguador lisis. La suspension de celulas fue procesada con un agitador vortex, incubada por 2 minutos a temperatura ambiente, y centrifugada durante 10 minutos a 500 x g. Los materiales flotantes fueron descartados y el pellet de celulas fue re - suspendido en el Medio - alfa Esencial Mlnimo (Invitrogen) suplementado con un 10% (volumen / volumen) de suero bovino fetal y 4mM de glutamina. Las celulas se centrifugaron nuevamente y la pellet de celulas fue re - suspendida en un medio fresco. Las celulas viables mononucleares fueron contadas usando exclusion de tripano azul (Sigma, St. Louis, MO). Las celulas mononucleares fueron sembradas en matraces de plastico con cultivos de tejido a 5 x 104 celulas / cm2. Las celulas fueron incubadas a 37°C con 5% de CO2 ya sea a O2 atmosferico o a 5%. Las celulas fueron cultivadas durante 5 dlas sin un cambio de medio. El medio y las celulas no adheridas se removieron despues de 5 dlas del cultivo. Las celulas adherentes se mantuvieron en el cultivo.

Aislamiento de ARNm y Analisis con GENCHIP (CHIP GENETICO). Cultivos de celulas que crecen activamente fueron removidos de los matraces con un raspador de celulas en un PBS frio. Las celulas se centrifugaron durante 5 minutos a 300 x g. Los materiales flotantes fueron removidos y las celulas fueron re - suspendidas en PBS fresco y centrifugadas nuevamente. Se removieron los materiales flotantes y el pellet de celulas fue congelado inmediatamente y almacenado a -80 ° C. Se extrajo ARNm y se transcribio en al ADNc, que fue transcrito entonces a un ARNc y etiquetado como biotina. El ARNc etiquetado biotina fue hibridado con una agrupacion de oligonucleotidos HG-U133A GENECHIP (CHIP GENETICO) (Affymetrix, Santa Clara CA). La hibridacion y la recaudacion de datos fueron realizadas de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Los analisis fueron realizados usando el software informatico “Significance Analysis of Microarrays” (SAM - “Analisis de Importancia de Micro - Ensayos”) version 1.21 (Stanford University; Tusher, V.G. et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98: 5116-5121).

Resultados

Catorce poblaciones de celulas diferentes fueron analizadas. Las celulas junto con su informacion de pases, sub-estrato de cultivo, y medio de cultivo se muestran en la Tabla 9 - 1.

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Tabla 9 - 1. Las celulas analizadas por el estudio de micro ensayos. Las ilneas celulares se listan por codigo de identification junto con el pase en e; momento del analisis, crecimiento celular del sub - estrato y crecimiento del

medio.

Poblacion de Celulas

Pase Sub - Estrato Medio

Umbiical (022803)

2 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

Umbiical (042103)

3 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

Umbiical (071003)

4 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

Placenta (042203)

12 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

Placenta (042903)

4 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

Placenta (071003)

3 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME

ICBM (070203) (5% 02)

3 Plastico MEM, 10% FBS

ICBM (062703) (normal 02)

5 Plastico MEM, 10% FBS

ICBM (062703) (5% 02)

5 Plastico MEM, 10% FBS

hMSC (Lote 2F1655)

3 Plastico MSCGM

hMSC (Lote 2F1656)

3 Plastico MSCGM

hMSC (Lote 2F 1657)

3 Plastico MSCGM

hFibroblasto (9F0844)

9 Plastico DMEM-F12, 10% FBS

hFibroblasto (CCD39SK)

4 Plastico DMEM-F12, 10% FBS

La information evaluada por un Analisis de Componentes de Principios, analizando 290 genes que fueron diferencialmente expresados en las celulas. Este analisis permite una comparacion relativa de similitudes entre las poblaciones. La Tabla 9 - 2 muestra las distancias euclidianas que fueron calculadas para la comparacion de parejas de celulas. Las distancias Euclidianas se basaron en la comparacion de celulas basadas en 290 genes que fueron diferencialmente expresados en los varios tipos de celulas. La distancia Euclidiana es inversamente proporcional a la similitud entre la expresion de los 290 genes (en otras palabras, entre mas grande sea la distancia, existira menor similitud).

Tabla 9 - 2. Las distancias Euclidianas de parejas de celulas

Pareja de Celulas

Distancia Euclidiana

ICBM-hMSC

24.71

Placenta - Umbilical

25.52

ICBM - Fibroblasto

36.44

ICBM - Placenta

37.09

Fibroblasto - MSC

39.63

ICBM - Umbilical

40.15

Fibroblasto - Umbilical

41.59

MSC - Placenta

42.84

MSC - Umbilical

46.86

ICBM - Placenta

48.41

Las Tablas 9 - 3, 9 - 4 y 9 - 5 muestran que la expresion de genes se incremento en las celulas derivadas de la placenta (Tabla 9 - 3), se incremento en las celulas derivadas umbilicales (Tabla 9 - 4), y se redujo en celulas derivadas umbilicales y de la placenta (Tabla 9 - 5). La columna titulada “Identificacion del Conjunto de Sondas” se refiere al codigo de identificacion del fabricante para los conjuntos de sondas de oligonucleotidos ubicadas en un lugar en especlfico en el chip, que se hibridizan con el gen mencionado (columna “Nombre del Gen”), incluyendo una secuencia que puede encontrarse en la base de datos NCBI (GenBank - Banco Genetico) en el numero especlfico de acceso (columna “Numero de Acceso NCBI”).

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Tabla 9 - 3. Los genes demuestran haber incrementado especlficamente su expresion en las celulas derivadas de la placenta en comparacion a los otros ensayos de llneas celulares

Genes incrementados en las celulas derivadas de la placenta

IdentificacIon del Grupo de Sondas

Nombre del Gen Numero de Acceso NCBI

209732_at

Lectina tipo C (dominio de reconocimiento de carbohidratos dependientes del calcio), miembro 2 de la superfamilia (inducido a la activacion) AF070642

206067_s_at

Tumor Wilms 1 NM_024426

207016_s_at

Familia de aldehldo deshidrogenasa 1, miembro A2 AB015228

206367_at

Renina NM_000537

210004_at

Receptor 1 (tipo lectina) de lipoprotelna oxidada de baja densidad AF035776

214993_at

Cds parciales, ARNm, IMAGE:4179671 de clon, Homo sapiens, AF070642

202178_at

Proteina kinasa C, zeta NM_002744

209780_at

Proteina hipotetica DKFZp564F013 AL136883

204135_at

Reducido en cancer de ovario 1 NM_014890

213542_at

ARNm de homo sapiens; ADNc DKFZp547K1113 del clon DKFZp547K1113) Al246730

Tabla 9 - 4. Los que genes muestran haber incrementado especlficamente la expresion en las celulas derivadas umbilicales en comparacion con las llneas celulares de otros ensayos

Genes que se incrementaron en las celulas derivadas umbilicales

Identificacion del Grupo de Sondas

Nombre del Gen Numero de Acceso NCBI

202859_x_at

Interleucina 8 NM_000584

211506_s_at

Interleucina 8 AF043337

210222_s_at

Reticulon 1 BC000314

204470_at

Ligando 1 de quimioquina (motivo C-X-C) (actividad estimuladora del crecimiento de la melanoma) NM_001511

206336_at

Ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 6 (proteina quimiotactica de granulocitos 2) NM_002993

207850 at

Ligando de quimioquina (motivo NM 002090

C-X-C) 3

203485_at

Reticulon 1 NM_021136

202644_s_at

Factor de necrosis de tumores, proteina inducida por alfa 3 NM_006290

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Tabla 9 - 5. Los genes que mostraron una reduccion de expresion en las celulas derivadas umbilicales y placentarias

en comparacion con los ensayos de las otras lineas celulares

Genes Reducidos en las Celulas Derivadas Umbilicales y Placentarias

Identificacion del Grupo de Sondas

Nombre del gen Numero de Acceso NCBI

210135_s_at

Homeobox de corta estatura 2 AF022654.1

205824_at

Proteina 27kDa golpe de calor 2 NM_001541.1

209687_at

Ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 12 (factor derivado de celulas estromales 1) U19495.1

203666_at

Ligando de quimioquina (motivo C-X-C) 12 (factor derivado de celulas estromales 1) NM_000609.1

212670_at

Elastina (estenosis aortica supravalvular, sindrome Williams-Beuren) AA479278

213381_at

ARNm de homo sapiens; DKFZp586M2022 del ADNc (del clon DKFZp586M2022) N91149

206201_s_at

Homeo box de mesenquima 2 (homeo box especifico que detiene el crecimiento) NM_005924.1

205817_at

Homologo homeobox sine oculis 1 (Drosophila) NM_005982.1

209283_at

Cristalina, alfa B AF007162.1

212793_at

Activador asociado a morfogenesis no organizada 2 BF513244

213488_at

Proteina DKFZP586B2420 AL050143.1

209763_at

Similar a la neuralina 1 AL049176

205200_at

Tetranectina (proteina de vinculacion de plasminogeno NM_003278.1

205743_at

Homologia src 3 (SH3 - src homology three) y dominio rico en cisteina NM_003149.1

200921_s_at

Gen de translocacion de celulas B 1, anti- proliferativo NM_001731.1

206932_at

Hidroxilasa 25 de colesterol NM_003956.1

204198_s_at

Factor de transcripcion relacionado con enanismo 3 AA541630

219747_at

Proteina hipotetica FLJ23191 NM_024574.1

204773_at

Receptor de interleucina 11, alfa NM_004512.1

202465_at

Potenciador de endopeptidasa C de pro - colageno NM_002593.2

203706_s_at

Homologo enrollado 7 (Drosophila) NM_003507.1

212736_at

Gen hipotetico BC008967 BE299456

214587_at

Colageno, tipo VIII, alfa 1 BE877796

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Genes Reducidos en las Celulas Derivadas Umbilicales y Placentarias

Identificacion del Grupo de Sondas

Nombre del Gen Numero de Acceso NCBI

201645_at

Tenascina C (hexabrachion) NM_002160.1

210239_at

Protelna homeobox iroquois 5 U90304.1

203903_s_at

Hephaestina NM_014799.1

205816_at

Integrina, beta 8 NM_002214.1

203069_at

Glicoprotelna sinaptica de la veslcuia 2 NM_014849.1

213909_at

Fis FLJ12280 de ADNc de homo sapiens, cion MAMMA1001744 AU147799

206315_at

Factor similar al receptor de citoquina 1 NM_004750.1

204401_at

Canal activado por la conduction del calcio intermedia / pequena de potasio, subfamilia N, miembro 4 NM_002250.1

216331_at

Integrina, alfa 7 AK022548.1

209663_s_at

Integrina, alfa 7 AF072132.1

213125_at

Protelna DKFZP586L151 AW007573

202133_at

Coactivador transcripcional con el motivo de vinculacion a PDZ (TAZ) AA081084

206511_s_at

Homologo de homeobox de oculis sine 2 (Drosophila) NM_016932.1

213435_at

Protelna KIAA1034 AB028957.1

206115_at

Respuesta temprana de crecimiento 3 NM_004430.1

213707_s_at

Homeo box cercano 5 NM_005221.3

218181_s_at

Protelna hipotetica FLJ20373 NM_017792.1

209160_at

familia aldo-ceto reductasa 1, miembro C3 (hidroxiesteroide deshidrogenasa 3-alfa, tipo II) AB018580.1

213905_x_at

Biblicano AA845258

201261_x_at

Biblicano BC002416.1

202132_at

Co - activador transcripcional con motivo vinculante de PDZ (TAZ) AA081084

214701_s_at

Fibronectina 1 AJ276395.1

213791_at

Proencefalina NM_006211.1

205422_s_at

NM_004791.1

integrina, similar a beta-1 (con dominios que se repiten similares a EGF)

214927_at

ANDc de clon EUROIMAGE 1968422 insertado completamente en ARNm de homo sapiens AL359052.1

206070_s_at

EphA3 AF213459.1

212805_at

Protelna KIAA0367 AB002365.1

219789_at

Receptor de peptidos natriureticos / Ciclasa de guanalito C (receptor de peptidos antrionatriureticos C) AI628360

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Genes Reducidos en las Celulas Derivadas Umbilicales y Placentarias

Identificacion del Grupo de Sondas

Nombre del Gen Numero de Acceso NCBI

219054_at

Protelna hipotetica FLJ14054 NM_024563.1

213429_at

ARNm de homo sapiens, ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222) AW025579

204929_s_at

Protelna de membrana asociada a la veslcula 5 (myobrevin) NM_006634.1

201843_s_at

Protelna de matriz extracelular similar a la fibulina que contiene EGF 1 NM_004105.2

221478_at

Protelna similar a la 3 que interactua con BCL2 / adenovirus EB 19kDa AL132665.1

201792_at

Protelna vinculante de AE 1 NM_001129.2

204570_at

Polipeptido Vlla de oxidase c de citocromo 1 (musculo) NM_001864.1

201621_at

Neuroblastoma, supresion de tumorosidad 1 NM_005380.1

202718_at

Protelna vinculante del factor de crecimiento similar a la insulina 2, 36kDa NM_000597.1

Las Tablas 9 - 6, 9 - 7, y 9 - 8 muestran las expresiones de genes que se incrementaron en fibroblastos humanos (Tabla 9 - 6), celulas ICBM (Tabla 9 - 7), y MSCs (Tabla 9 - 8).

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Tabla 9-6. Genes que demostraron tener una expresion incrementada de fibroblastos cuando se compararon con otros ensayos de lineas de celulas.

Genes que se incrementaron en los Fibroblastos

Fosfatasa de especificidad dual 2 Protema KIAA0527

ADNc de homo sapiens: FLJ23224 fis, clon ADSU02206

dineina, citoplasmatica, polipeptido intermedio 1

ankyrina 3, nodo de Ranvier (ankyrina G)

inhibina, beta A (activina A, polipeptido alpha AB de actividad)

pirofosfatasa ectonucleotide / fosfodiesterasa 4 (funcion putativa)

Protema KIAA1053

Proteina asociada con microtubulos 1A Protema dedo zinc 41 Proteina HSPC019

ADNc de homo sapiens: FLJ23564 fis, clon LNG10773

ARNm de homo sapiens; DKFZp564A072 del ADNc (del clon DKFZp564A072)

Proteina LIM (similar a la proteina enigmatica de la rata quinasa C)

Inhibidor del potenciador de genes polipeptidos de luz kappa en celulas B, proteina asociada con complejo de quinasa

Proteina hipotetica FLJ22004

Secuencia ARNm de humano (clon CTG-A4)

ESTs, similares moderadamente al factor similar al receptor de citosina 2; precursor CRL2 del receptor de citosina [homo sapiens]

Factor de crecimiento transformante, beta 2

Proteina hipotetica MGC29643

Antigeno identificado por el anticuerpo monoclonal MRC OX-2 Proteina putativa de retinopatia ligada al cromosoma X

Tabla 9-7. Los genes que mostraron un incremento en la expresion en las celulas derivadas del ICBM en comparacion con ensayos de otras lineas celulares.

Genes incrementados en las celulas ICBM

• Proteina que se repite en la ankyrina cardiaca

• ORF de la region I clase MHC

• integrina, alfa 10

• proteina hipotetica FLJ22362

• galactosamina - D - alfa - acetil - N - UDP: acetilgalactosaminiltransferasa - N de polipeptidos 3 (GalNAc-T3)

• proteina inducida por interferon-44

•SRY (sex determining region Y - region de Y que determina el sexo)-box 9 (displasia campomelica, reversion sexual autosomica)

• proteina asociada con la queratina 1-1

• similar a hippocalcin 1

• dentado 1 (sindrome de Alagille)

•proteoglicano 1, granulo secretor

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Tabla 9 - 8. Genes que demostraron haber incrementado la expresion en celulas MSC cuando se compararon con

otros ensayos de llneas celulares.

Genes incrementados en celulas MSC

• Interleucina 26

• Maltasa-glucoamilasa (alfa-glucosidasa)

• Subfamilia de receptores nucleares 4, grupo A, miembro 2

• Homologo oncogenico viral de osteosarcoma murino v-fos FBJ

• Protelna hipotetica DC42

• Subfamilia 4 de receptores nucleares, grupo A, miembro 2

• Homologo B oncogenico viral de osteosarcoma murino FBJ

• Protelna 1 de la via de senalizacion inducible por WNT1

• Secuencia transformable derivada de la llnea celular MCF.2

• Canal de potasio, subfamilia K, miembro 15

• Homeo - protelna de clase emparejada del cartllago 1

• ADNc FLJ12232 fis de homo sapiens, clon MAMMA1001206

• ADNc FLJ34668 fis de homo sapiens, clon LIVER2000775

• Proto - oncogen jun B

• CLL de celulas B / linfoma 6 (protelna de dedo de cinc 51)

• Protelna 36 de dedo de cinc, tipo C3H, homologo (raton)

Resumen. Esta examinacion fue realizada para suministrar una caracterizacion molecular de las celulas de postparto derivadas del cordon umbilical y de la placenta. Este analisis incluyo celulas derivadas de tres cordones umbilicales y tres placentas diferentes. La examinacion tambien incluyo dos llneas diferentes de fibroblastos dermicos, tres llneas de celulas madre mesenquimas, y tres llneas celulares de medula osea de cresta illaca. La ARNm que fue expresada por estas celulas se analizo en un ensayo oligonucleotido que contenla sondas para 2200 genes. Los resultados mostraron que 290 genes se hablan expresado diferencialmente en estos cinco tipos diferentes de celulas. Estos genes incluyeron 10 genes que se incrementaron especlficamente en las celulas derivadas de la placenta y siete genes se incrementaron especlficamente en las celulas derivadas del cordon umbilical. Se encontraron 54 genes que tuvieron unos niveles de expresion especlficamente mas bajos en la placenta y el cordon umbilical, cuando se compararon con otros tipos de celula. La expresion de los genes seleccionados ha sido confirmada usando PCR (ver el ejemplo que sigue). Estos resultados demuestran que las celulas derivadas de postparto tienen un perfil de expresion genetico diferente, por ejemplo, si son comparadas con las celulas y fibroblastos derivados de la medula osea.

EJEMPLO 10

Marcadores de celulas en las celulas derivadas de postparto

En el ejemplo anterior, se evaluaron similitudes y diferencias en las celulas derivadas de la placenta humana y del cordon umbilical humano al comparar sus perfiles de expresion genetica con aquellas celulas derivadas de otras fuentes (usando un ensayo oligonucleotido). Seis genes “identificadores” fueron reconocidos: receptor LDL oxidado 1, interleucina-ocho, renina, reticulon, ligando de receptor de quimioquina 3 (ligando CXC 3), y protelna quimiotactica de granulocitos 2 (GCP-2). Estos genes “identificadores” se expresaron en altos niveles relativos en las celulas derivadas de postparto.

Los procedimientos descritos en este ejemplo fueron realizados para verificar la information de micro ensayos y encontrar concordancia / inconformidad entre los genes y las expresiones protelnicas, as! como para establecer una serie de ensayos confiables para la detection de identificadores unicos de las celulas derivadas de la placenta y umbilicales.

Metodos y Materiales

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Celulas. Celulas derivadas de la placenta (tres aislamientos, incluyendo uno predominantemente neonatal como se identified con el analisis de cariotipos), celulas derivadas umbilicales (cuatro aislamientos), y fibroblastos dermicos normales humanos (NHDF; neonatales y adultos) cultivados en medios de crecimiento con penicilina / estreptomicina en un matraz T 75 cubierto con gelatina. Celulas madres mesenquimas (MSCs) se cultivaron en un Medio de Crecimiento de Celulas Madres Mesenquimas de un equipo Bullet (MSCGM - Mesenchymal Stem Cell Growth Medium; Cambrex, Walkerville, MD).

Para el protocolo IL-8, las celulas fueron descongeladas del nitrogeno llquido y puestas en platos en matraces cubiertos con gelatina a 5000 celulas por centlmetro cuadrado, cultivadas durante 48 horas en el medio de crecimiento y entonces cultivadas durante ocho horas mas en 10 ml de medio de privacion de suero [DMEM -de baja glucosa (Gibco, Carlsbad, CA), penicilina / estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA) y 0.1% (masa / volumen) de albumina de suero bovino (BSA; Sigma, St. Louis, MO)]. Despues de este tratamiento el ARN fue extraldo y el material flotante fue centrifugado a 150 x g durante cinco minutos para remover los vestigios celulares. El material flotante fue congelado entonces a -80 °C para un analisis ELISA.

Cultivo de celulas para el ensayo ELISA. Las celulas de postparto derivadas de la placenta y umbilicales, as! como los fibroblastos humanos derivados de prepucios neonatales humanos se cultivaron en un medio de crecimiento en matraces T 75 cubiertos de gelatina. Las celulas se congelaron en el pase 11 en nitrogeno llquido. Las celulas se descongelaron y se transfirieron a tubos de centrifugacion de 15 ml. Despues de la centrifugacion a 150 x g durante cinco minutos, el material flotante fue descartado. Las celulas fueron re - suspendidas en un medio de cultivo de 4 ml y entonces contadas. Las celulas se cultivaron en un matraz de 75 cm2 que contenla 15 ml del medio de crecimiento a 375.000 celulas por frasco durante 24 horas. El medio fue cambiado a un medio de privacion de suero por ocho horas. El medio de privacion de suero fue recolectado al final de la incubacion, centrifugado a 14.000 x g durante cinco minutos (y almacenado a -20 °C).

Para estimar el numero de celulas en cada matraz, se agrego 2 ml de tripsina / EDTA (Gibco, Carlsbad, CA) a cada matraz. Despues de que las celulas se separaron del matraz, la actividad de la tripsina se neutralizo con 8 ml del medio de crecimiento. Las celulas se transfirieron a un tubo de centrifugacion de 15 ml 150 x g durante cinco minutos. El material flotante fue removido y se agrego 1 ml de medio de crecimiento a cada tubo para re - suspender las celulas. El numero de celulas se estimo usando un hemocitometro.

Ensayo ELISA. La cantidad de IL-8 secretado por las celulas al medio de privacion de suero fue analizado usando ensayos ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos fueron probados de acuerdo a las instrucciones provistas por el fabricante.

Aislamiento total ARN. Se extrajo el ARN de las celulas derivadas de postparto y fibroblastos que eran confluentes para la expresion IL-8 de las celulas tratadas como se describio anteriormente. Las celulas fueron lisadas con 350 pl de amortiguador RLT que contenlan mercaptoetanol beta (Sigma, St. Louis, MO) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit (botiquln); Qiagen, Valencia, CA). Se extrajo el RM de acuerdo a las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit (Botiquln); Qiagen, Valencia, CA) y sujeto al tratamiento DNase (2.7 unidades por muestra) (Sigma St. Louis, MO). El ARN fue eluido con 50 pl de agua tratada con DEPC y almacenada a -80 °C.

Transcripcion reversa. Tambien se extrajo ARN de placenta y tejido umbilical humano. El tejido (30 mg) fue suspendido en 700 pl de amortiguador RLT que contenlan 2- mercaptoetanol. Las muestras se homogenizaron mecanicamente y el ARN fue extraldo de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Se extrajo el ARN con 50 pl de agua tratada con DEPC y almacenada a -80° C. El ARN fue transcrito en reversa usando hexameros aleatorios con los reactivos de transcripcion en reversa de TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25 °C durante 10 minutos, 37 °C durante 60 minutos, y 95 °C durante 10 minutos. Las muestras fueron almacenadas a -20 °C.

Los genes identificados por los micro ensayos ADNc como regulados solamente en las celulas de postparto (genes de identificacion - incluyendo receptores LDL oxidados, interleucina - 8, renina y reticulon), fueron investigados en mayor detalle usando PCR en tiempo real y convencional.

PCR en tiempo real. Se realizaron PCRs de muestras ADNc usando productos de expresion genetica Assays-on-DemandTM (Ensayos-cuando estos sean Requeridos): se mezclo el receptor LDL oxidado (Hs00234028); renina (Hs00166915); reticulon (Hs00382515); ligando CXC 3 (Hs00171061); GPC-2(Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); y GAPDH (Applied Biosystems, Foster City, CA) con aDnc y la mezcla maestra TaqMan Universal PCR de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando un sistema de deteccion de secuencia 7000 con un software ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones termicas del ciclo fueron inicialmente 50° C durante dos minutos y 95° C durante 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95° C durante 15 segundos y 60° C durante un minuto. La informacion PCR fue analizada de acuerdo a las especificaciones del fabricante (boletln del usuario numero dos de Applied Biosystems para el sistema de deteccion de secuencias ABI Prism 7700).

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PCR convencional. Se realizo un PCR convencional usando un ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Massachusetts, EE.UU.) para confirmar los resultados del PCR en tiempo real. El PCR fue realizado usando 2 pl de solucion de ADNc, 1 x amortiguador de reaccion PCR mixta universal AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) y una desnaturalizacion inicial a 94° C durante cinco minutos. La amplification fue optimizada para cada conjunto inicializador. Para IL-8, ligando CXC 3, y el reticulon (94° C durante 15 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72° C durante 30 segundos durante los 30 ciclos); para la renina (94° C durante 15 segundos, 53 °C durante 15 segundos y 72° C durante 30 segundos para 38 ciclos); para el receptor LDL oxidado y GAPDH (94° C durante 15 segundos, 55° C durante 15 segundos y 72° C durante 30 segundos por 33 ciclos). Los inicializadores utilizados para la amplificacion se listan en la tabla 1. La concentration de inicializador en la reaccion PCR final fue 1 pmol excepto para GAPDH, que fue de 0.5 micro moles. Los inicializadores de GAPDH fueron los mismos que para la reaccion PCR en tiempo real, excepto que la sonda del fabricante de TaqMan no se agrego a la reaccion final PCR. Se corrieron muestras en [249] 2% (masa / volumen) de gel agarosa y tinturado con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MO). Las imagenes fueron capturadas utilizando un rollo de pellcula 667 Universal Twinpack (Paquete Gemelo Universal) (VWR International, South Plainfield, NJ) usando una camara Polaroid de longitud focal (VWR International, South Plainfield, NJ).

Tabla 10-1: Inicializadores utilizados

Nombre del Inicializador Inicializador

Receptor LDL oxidado

Renina

Reticulon

Interleucina - 8

Ligando de quimioquina (CXC) 3

S: 5'-GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3' A: 5'-AGAATGGAAAACTGGAATAGG-3'

S: 5'-TCTTCGATGCTTCGGATTCC-3'

A: 5'-GAATTCTCGGAATCTCTGTTG-3'

S: 5'- TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3'

A: 5'- AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3' S: 5'- TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3'

A: 5'-CTTCAAAAACTTCTCCACAACC- 3' S: 5'- CCCACGCCACGCTCTCC-3'

A: 5'-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC -3'

(NUM. DE ID DE SEQ.:1) (NUM. DE ID DE SEQ.:2) (NUM. DE ID DE SEQ.:3) (NUM. DE ID DE SEQ.:4) (NUM. DE ID DE SEQ.:5) (NUM. DE ID DE SEQ.:6) (NUM. DE ID DE SEQ.:7) (NUM. DE ID DE SEQ.:8) (NUM. DE ID DE SEQ.:9) (NUM. DE ID DE SEQ.:10)

Inmunofluorescencia. Las PPDCs fueron fijadas con un 4% (masa / volumen) de paraformaldehldo frlo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos a la temperatura del cuarto. Se utilizo un aislamiento de celulas derivadas umbilicales y otro de celulas derivadas de la placenta en el pase 0 (P0) (directamente despues de su aislamiento) y en el pase 11 (P 11) (dos aislamientos de celulas derivadas de la placenta y dos aislamientos de celulas derivadas umbilicales) y fibroblastos (P 11). La inmunocitoqulmica se realizo usando los anticuerpos dirigidos en contra de los siguientes epitopes: vimentina (1:500, Sigma, St. Louis, MO), desmina (1:150; Sigma - generado en contra del conejo; o 1:300; Chemicon, Temecula, CA -generado en contra del raton), actina de musculo liso alpha (SMA; 1:400; Sigma Citoqueratina 18 (CK18; 1:400; Sigma), factor von Willebrand (vWF; 1:200; Sigma), y cD34 (CD34 humano clase III; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, CA). Adicionalmente, se probaron los siguientes marcadores en las celulas postparto del pase 11: GRO alpha - PE anti humano (1:100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 anti humano (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), receptor LDL oxidado anti humano 1 (ox-LDL r1; 1:100; Santa Cruz Biotech), y NOGA-A anti humano (1:100; Santa Cruz, Biotech).

Los cultivos fueron lavados con tampon fosfato salino (PBS) y fueron expuestos a una solucion de bloqueo de protelnas que contenla PBS, 4% (volumen / volumen) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0.3 % (volumen / volumen) de Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, MO) durante 30 minutos para acceder a antlgenos intracelulares. En los lugares donde se ubicaba el epitope de interes en la superficie celular (CD34,ox-LDL R1) se omitia el Triton X-100 en todos los pasos del procedimiento para prevenir una perdida de epitope. Es mas, en instancias donde el anticuerpo principal fue generado en contra de la cabra (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), se utilizaba un 3% (volumen / volumen) de suero de burro en lugar del suero de cabra durante ese proceso. Los anticuerpos primarios, diluidos en la solucion de bloqueo, se aplicaron entonces a los cultivos por un periodo de una hora a la temperatura del cuarto. Las principales soluciones de anticuerpos se removieron y los cultivos fueron lavados con PBS antes de la creation de soluciones secundarias de anticuerpos (una hora a la temperatura del cuarto) que contenia bloqueos junto con IgG de cabra anti raton Texas Red (1:250; Molecular Probes (Sondas Moleculares), Eugene, OR) y / o IgG de cabra anti conejo - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes - Sondas Moleculares) o IgG burro anti cabra - FITC (1:150, Santa Cruz Biotech). Los cultivos fueron lavados y se aplico 10 pmol de DAPI (Molecular Probes - Sondas Moleculares) durante 10 minutos para visualizar el nucleo de la celula.

Despues de la inmunotincion, la fluorescencia se visualizo usando un filtro apropiado de fluorescencia en un microscopio fluorescente - epi invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, una coloration positiva representaba una senal de fluorescencia por sobre el tinte de control mientras se seguia completamente el procedimiento senalado anteriormente con exception de la aplicacion de una solucion primaria de anticuerpos. Se capturaron imagenes representativas usando una videocamara a color digital y por medio del software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para muestras con tres colores, cada imagen fue tomada usando solo un filtro

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de emision a la vez. Las capas de montajes fueron preparadas posteriormente usando el software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Preparacion de celulas para analisis FACS. Las celulas adheridas en los matraces fueron lavadas con tampon fosfato salino (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y separadas con tripsina / EDTA (Gibco, Carlsbad, CA). Las celulas fueron cosechadas, centrifugadas, y re - suspendidas con un 3% (volumen / volumen) de FBS en PBS a una concentracion celular de 1x107 por mililitro. Se entregaron dosis de 100 pl a tubos conicos. Las celulas tinturadas para antlgenos intracelulares fueron permeabilizadas con el tampon Perm / Wash (BD Pharmingen, San Diego, CA). Se agregaron anticuerpos a las dosis de acuerdo a las especificaciones de los fabricantes y las celulas fueron incubadas en la oscuridad durante 30 minutos a 4 °C. Despues de la incubacion, las celulas fueron lavadas con PBS y centrifugadas para remover los anticuerpos que estaban en exceso. Las celulas que requerlan un anticuerpo secundario fueron re - suspendidas en 100 pl de un 3% de FBS. Se anadio el anticuerpo secundario de acuerdo a las especificaciones de los fabricantes y las celulas fueron incubadas en la oscuridad durante 30 minutos a 4 °C. Despues de la incubacion, las celulas fueron lavadas con PBS y centrifugadas para remover el exceso de anticuerpos secundarios. Las celulas lavadas fueron re - suspendidas en 0.5 mililitros de PBS y analizadas por citometrla de flujo. Los siguientes fueron los anticuerpos utilizados: receptor LDL oxidado 1(sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, mA), IgG1 de raton kappa, (P-4685 y M-5284; Sigma), IgG burro contra cabra (sc-3743; Santa Cruz, Biotech.). Se realizo el analisis de citometrla de flujo con FACScalibur (Becton Dickinson San Jose, CA).

Resultados

Los resultados PCR en tiempo real para los genes “identificadores” seleccionados realizados en el ADNc de celulas derivadas de placenta humana, fibroblastos adultos y neonatales y las celulas madre mesenquimas (MSCs) indican que el receptor LDL oxidado y la renina fueron expresados a un nivel mas alto en las celulas derivadas de la placenta en comparacion con las otras celulas. La information obtenida del PCR en tiempo real fue analizada por el metodo AACT y se expreso en una escala logarltmica. Los niveles de expresion del reticulon y del receptor LDL oxidado fueron mas altos en celulas derivadas umbilicales cuando se compararon con otras celulas. No existla diferencia significativa en la expresion de los niveles de ligando CXC 3 y GPC-2 entre las celulas derivadas de postparto y los controles. Los resultados del PCR en tiempo real fueron confirmados por los PCR convencionales. La secuenciacion de productos PCR dieron mayor validez a estas observaciones. No se encontro diferencia significativa en el nivel de expresion de ligando CXC 3 entre las celulas derivadas de postparto y los controles usando los iniciadores ligando CXC 3 PCR listados anteriormente.

La production de citoquina, IL-8 en postparto o fue elevada en las celulas derivadas de postparto cultivadas en los medios de crecimiento y las que fueron privadas de sueros. Todos los datos PCR en tiempo real fueron validados con PCR convencionales y con secuenciacion de productos PCR.

Cuando los materiales flotantes de celulas que crecieron en el medio libre de sueros se examinaron para determinar la presencia de IL-8, las cantidades mas altas fueron detectados en medios derivados de celulas umbilicales y en algunos aislamientos de celulas placentarias (Tabla 10 - 1) no se detecto ningun IL-8 en medios derivados de fibroblastos dermicos humanos.

Tabla 10-1: Cantidades de la protelna IL-8 medidos por ELISA

Tipo de Celula

IL-8

hFibro

ND

Aislamiento de placenta 1

ND

Aislamiento umbilical 1

2058.42 ± 144.67

Aislamiento de placenta 2

ND

Aislamiento umbilical 2

2368.86 ± 22.73

Aislamiento de placenta 3 (normal O2)

17.27 ± 8.63

Aislamiento de placenta 3 (bajo O2, con O BME)

264.92 ± 9.88

Los resultados del ensayo ELISA para interleucina-8 (IL-8) realizado en las celulas derivadas de la placenta y umbilicales asf como en fibroblastos de piel humana. Los valores presentados aquf son picogramos / millones de celulas, n = 2, sem.

ND: No Detectado

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Las celulas derivadas de la placenta tambien se examinaron para detectar la produccion del receptor LDL oxidado, GCP-2 y GROalfa por medio de un analisis FACS. Las celulas fueron positivas para GCP-2. El receptor LDL oxidado y el GRO no fueron detectados por este metodo.

Las celulas derivadas de la placenta tambien fueron examinadas para detectar la produccion de ciertas protelnas por el analisis inmunocitoqulmico. Inmediatamente despues del aislamiento (pase cero), las celulas derivadas de la placenta humana fueron fijadas con 4% de paraformaldehldo y se expusieron a anticuerpos para analizar seis protelnas: el factor von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina de musculo liso alfa y vimentina. Las celulas marcaron positivo para actina de musculo liso alfa y vimentina. Esta tendencia se preservo hasta el pase 11. Solo unas pocas celulas (menos del 5%) en el pase cero marcaron positivo para citoqueratina 18

Las celulas derivadas del cordon umbilical humano en el pase cero fueron analizadas para detectar la produccion de ciertas protelnas con un analisis inmunocitoqulmico. Inmediatamente despues del aislamiento (pase cero), las celulas fueron fijadas con un 4% de paraformaldehldo y expuestas a anticuerpos para analizar seis protelnas: factor von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina de musculo liso alfa, y vimentina. Las celulas derivadas umbilicales fueron positivas para actina de musculo liso alpha y vimentina, con la tendencia de coloracion consistente hasta el pase 11.

Resumen. Se establecio concordancia entre los niveles de expresion genetica medidos por micro ensayos y PCR (ambas en tiempo real y convencional) para cuatro genes: receptor LDL oxidado 1, rennina, reticulon, y lL-8. La expresion de estos genes fue regulada diferencialmente a nivel de ARNm en los PPDCs, con IL-8 tambien regulado diferencialmente a nivel protelnico. La presencia del receptor LDL oxidado no fue detectada a nivel protelnico por el analisis FACS en las celulas derivadas de la placenta. La expresion diferencial de GCP-2 y del ligando CXC 3 no fue confirmada a nivel de ARNm, sin embargo se detecto GCP-2 a nivel protelnico por el analisis FACS en las celulas derivadas de la placenta. Aunque este resultado no se refleja por los datos obtenidos originalmente del experimento de micro ensayos, esto puede deberse a una diferencia en la sensibilidad de las metodologlas.

Inmediatamente despues del aislamiento (pase cero), las celulas derivadas de la placenta humana marcaron positivas para actina de musculo liso alfa y vimentina. Esta tendencia tambien se observo en las celulas en el pase 11. Estos resultados sugieren que la expresion de vimentina y de actina de musculo liso alfa pueden preservarse en celulas con pases, en el medio de crecimiento y bajo las condiciones utilizadas en estos procedimientos. Las celulas derivadas del cordon umbilical humano en el pase cero fueron sondeadas por expresiones de actina de musculo liso alfa y vimentina y ambas marcaron positivo. La tendencia de marcacion fue preservada hasta el pase 11.

EJEMPLO 11

Evaluation inmunologica in vitro de las celulas derivadas de postparto

Las celulas derivadas de postparto (PPDCs) fueron evaluadas in vitro por sus caracterlsticas inmunologicas como un esfuerzo para predecir la respuesta inmunologica, si existiese, que estas celulas provocarlan despues de un trasplante in vivo. Las PPDCs fueron ensayadas con simetrla de flujo por la presencia de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, y B7-H2. Estas protelnas se expresan por celulas que presentan antlgenos (APC) y son requeridas para la estimulacion directa a de celulas naive CD4*T (Abbas & Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY (INMUNOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR), 5ta Ed. (2003) Saunders, Filadelfia, pg. 171). Las llneas celulares tambien fueron analizadas por citometrla de flujo para la expresion de HLA-G (Abbas & Lichtman, 2003, supra), CD 178 (Coumans, et al., (1999) Journal of Immunological Methods (Revista de Metodos Inmunologicos) 224, 185-196), y PD-L2 (Abbas & Lichtman, 2003, supra; Brown, et. al. (2003) The Journal of Immunology (La Revista de Inmunologla) 170, 1257-1266). Se piensa que la expresion de estas protelnas por las celulas que residen en los tejidos placentarios regulan el estatus inmunoprivilegiado de los tejidos en los radios en el utero. Para predecir la medida en la cual las llneas celulares derivadas de la placenta y umbilicales provocan una respuesta in vivo, las llneas celulares fueron probadas en una reaccion en una sola reaccion mixta de linfocitos (MLR).

Materiales y Metodos

Cultivo celular. Las celulas fueron cultivadas hasta la confluencia en medios de crecimiento con penicilina / estreptomicina en matraces T 75 (Corning, Corning, NY) cubiertos con 2% de gelatina (Sigma, St. Louis, MO).

Tincion de cuerpos. Las celulas fueron lavadas en tampon fosfato salino (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y fueron separados con tripsina / EDTA (Gibco, Carlsbad, MO). Las celulas fueron cultivadas, centrifugadas y re- suspendidas en un 3% (volumen / volumen) de FBS en PBS a una concentration celular de 1x107 por mililitro. Se anadieron anticuerpos (Tabla 11 - 1) a 100 pl de suspension celular de acuerdo a las especificaciones del fabricante y se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a 4° C. Despues de la incubation, las celulas se lavaron con PBS

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y se centrifugaron para remover anticuerpos no unidos. Las celulas fueron re-suspendidas en 500 pi de PBS y analizadas con citometrla de flujo usando un instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Tabla 11-1. Anticuerpos

Anticuerpo

Fabricante Numero de Catalogo

HLA-DRDPDQ BD Pharmingen (San Diego, CA) 555558

CD80

BD Pharmingen (San Diego, CA) 557227

CD86

BD Pharmingen (San Diego, CA) 555665

B7-H2

BD Pharmingen (San Diego, CA) 552502

HLA-G Abcam (Cambridgeshire, UK) ab 7904-100

CD 178

Santa Cruz (San Cruz, CA) sc-19681

PD-L2

BD Pharmingen (San Diego, CA) 557846

IgG2a de Raton

Sigma (St. Louis, MO) F-6522

IgG1kappa de Raton

Sigma (St. Louis, MO) P-4685

Reaccion Mixta de Linfocitos. Matraces conservados criogenicamente en el pase 10 de celulas derivadas umbilicales marcadas como llnea celular A y de pase 11 de celulas derivadas de la placenta marcadas como llnea celular B fueron enviadas en hielo seco a CTBR (Senneville, Quebec) para realizar una reaccion mixta de linfocitos usando CTBR SOP No. CAC-031. Las celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells) fueron recolectadas de varios donantes masculinos y femeninos. Los estimuladores (donadores) alogenicos PBMC, autologos PBMC, y llneas celulares de postparto fueron tratadas con mitomicina C. Las celulas autologas y estimuladoras tratadas con mitomicina C fueron agregadas las PBMCs respondedoras (recipientes) y cultivadas durante 4 dlas. Despues de la incubacion se agrego [3H]timidina a cada muestra y se cultivaron por 18 horas. Despues de cosechar las celulas, ADN radiomarcado fue extraldo, y se midio la incorporacion de [3H]-timidina usando un contador de tincion.

El Indice de estimulacion de los donantes alogenicos (SIAD - stimulation index for the allogeneic donor) se calculo como la proliferacion media del destinatario mas el donante alogenico tratado con mitomicina C dividido para la proliferacion de la llnea base del destinatario. El Indice de estimulacion de las PPDCs se calculo como la proliferacion media del destinatario mas la llnea celular de postparto tratada con mitomicina C dividida para la proliferacion de la llnea base del receptor.

Resultados

Reaccion mixta de linfocitos - celulas derivadas de la placenta. Siete donantes humanos de sangre voluntarios fueron estudiados para identificar a un solo donante alogenico que exhibiese una respuesta robusta de proliferacion en una reaccion mixta de linfocitos con los otros seis donantes. Este donante fue seleccionado como el donante alogenico positivo de control. Los otros seis donadores de sangre fueron seleccionados como destinatarios. El donante alogenico positivo de control y las llneas celulares derivadas de la placenta fueron tratados con mitomicina C y cultivados en una reaccion mixta de linfocitos con los seis receptores alogenicos individuales. Las reacciones fueron realizadas por triplicado usando dos platos de cultivos celulares con tres receptores por plato (Tabla 11-2). El Indice de estimulacion promedio vario desde 1.3 (plato 2) hasta 3 (plato 1) y los controles alogenicos del donante positivo variaron desde 46.25 (plato 2) hasta 279 (plato 1) (Tabla 11-3).

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Tabla 11-2. Datos de la reaccion mixta de linfocitos - ilnea celular B (placenta)

DPM para ensayo de proliferacion

Identificacion del Plato: Plato 1

Analltico

Cultivo Replicas

Numero

Sistema 1 2 3 Media SD cv

IM03-7769

Proliferacion de la linea base del receptor 79 119 138 112 30.12 26.9

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C)

241 272 175 229.3 49.54 21.6

Donante alogenico MLR IM03-7768 (tratado con mitomicina C)

23971 22352 20921 22414.7 1525.97 6.8

MLR con linea celular (celula tipo B tratada con mitomicina C)

664 559 1090 771 281.21 36.5

SI (donante)

200

SI (linea celular)

7

IM03-7770

Proliferacion de la linea base del receptor 206 134 262 200.7 64.17 32

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C)

1091 602 524 739 307.33 41.6

Donante alogenico MLR IM03-7768 (tratado con mitomicina C)

45005 43729 44071 44268.3 660.49 1.5

MLR con linea celular (celula tipo B tratada con mitomicina C)

533 2582 2376 1830.3 1128.24 61.6

SI (donante)

221

SI (linea celular)

9

IM03-7771

Proliferacion de la linea base del receptor 157 87 128 124 35.17 28.4

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C)

293 138 508 313 185.81 59.4

Donante alogenico MLR IM03-7768 (tratado con mitomicina C)

24497 34348 31388 30077.7 5054.53 16.8

MLR con linea celular (celula tipo B tratada con mitomicina C)

601 643 a 622 29.7 4.8

SI(donante)

243

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Analltico

Cultivo Replicas

Numero

Sistema 1 2 3 Media SD cv

SI (llnea celular)

5

IM03-7772

Proliferation de la llnea base del receptor 56 98 51 68.3 25.81 37.8

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C)

133 120 213 155.3 50.36 32.4

Donante alogenico MLR IM03-7768 (tratado con mitomicina C)

14222 20076 22168 18822 4118.75 21.9

MLR con llnea celular (celula tipo B tratada con mitomicina C)

a a a a a a

SI(donante)

275

SI (llnea celular)

a

IM03-7768 (Donante alogenico)

Proliferacion de la llnea base del receptor 84 242 208 178 83.16 46.7

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C)

361 617 304 427.3 166.71 39

Llnea celular tipo B

Proliferacion de la llnea base del receptor 126 124 143 131 10.44 8

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C) 822 1075 487 794.7 294.95 37.1

Identification del Plato: Plato 2

Numero analltico

Sistema de Cultivo Replicas 1 2 3 Media SD CV

IM03-7774

Proliferacion de la llnea base del receptor Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C) Donante alogenico MLR IM03-7768 (tratadocon mitomicina C) MLR con llnea celular (celula tipo B tratada con mitomicina C) 908 181 330 269 405 572 29151 28691 28315 567 732 905 473 415.3 28719 734.7 384.02 151.76 418.7 169.02 81.2 36.5 1.5 23

SI(donante)

61

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1

SI (linea celular)

2

Proliferacion de la linea base del receptor 893 1376

IM03-7774

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C) 261 381

Donante alogenico MLR IM03- 7768 IM03-7768 (tratado con mitomicina C) 53101 42839

MLR con linea celular (celula tipo B tratada con mitomicina C) 515 789

SI (donante)

SI (linea celular)

Proliferacion de la linea base del receptor

1272

300

IM03-7775

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C)

Donante alogenico MLR IM03- 7768 IM03-7768 (tratado con mitomicina C)

MLR con linea celular (celula tipo B tratada con mitomicina C)

SI (donante)

SI (linea celular)

232

23554

768

199

10523

924

IM03-7776

Proliferacion de la linea base del receptor

1530 137

Control de autoestimulacion (celulas autologas tratadas con mitomicina C)

420 218

Donante alogenico MLR IM03- 7768 IM03-7768 (tratado con mitomicina C)

28893 32493

MLR con linea celular (celula tipo B tratada con mitomicina C)

a a

SI (donante)

SI (linea celular)

Media

3

185

568

48283

294

544

484

28965

563

1046

394

34746

2

818.0

403.3

48074.3

532.7

59

1

705.3

305.0

21014.0

751.7

30

1

904.3

344.0

32044.0

a a

35

a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 11-3. indice de estimulacion promedio de las celulas de la placenta y de un donante alogenico en una reaccion mixta de linfocitos con seis receptores alogenicos

Indice promedio de estimulacion

Receptor Placenta

Plato 1 (Receptores 1 - 3)

279 3

Plato 2 (Receptores 4 - 6)

46.25 1.3

Reaccion mixta de linfocitos - celulas derivadas umbilicales. Se examinaron a seis donantes de sangre humanos para identificar a un solo donante alogenico que exhibiese una respuesta robusta de proliferacion en una reaccion mixta de linfocitos en comparacion de los otros cinco donadores de sangre. Este donador fue seleccionado como el donante alogenico positivo de control. Los otros cinco donantes de sangre fueron seleccionados como receptores. El donante alogenico positivo de control y las llneas celulares de placenta fueron tratadas con mitomicina C y cultivadas en una reaccion mixta de linfocitos con los cinco receptores alogenicos. Las reacciones fueron realizadas en triplicado usando dos platos de cultivos celulares con tres receptores por plato (Tabla 11 - 4). El Indice de estimulacion promedio vario entre 6.5 (plato 1) a 9 (plato 2) y los controles alogenicos del donante positivo variaron de 42.75 (plato 1) a 70 (plato 2) (Tabla 11 - 5).

Tabla 11 - 4. Datos de la Reaccion Mixta de Linfocitos - Llnea Celular A (Umbilical)

DPM para el Ensayo de Proliferacion

Identificacion del Plato:

Plato 1

Numero Analltico

Sistema de Cultivo Replicas

1 2 3 Media SD CV

Proliferacion de la llnea base del receptor Control de autoestimulacion 1074 406 391 623.7 390.7 62.5

(celulas autologas tratadas con mitomicina C) 672 510 1402 861.3 475.19 55.2

IM04-2478

Donante alogenico MLR IM04-2477 (tratado con mitomicina C) 43777 48391 38231 43466.3 5087.12 11.7

MLR con llnea celular

(celula tipo A tratada con mitomicina C) 2914 5622 6109 4881.7 1721.36 35.3

SI (donante)

70

SI (llnea celular)

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2

IM04-2479

Proliferacion de la llnea base del receptor

Control de

autoestimulacion (celulas autologas

tratadas con mitomicina C)

Donante alogenico MLR

IM04-2477 (tratado con mitomicina C)

MLR con llnea celular

(celula tipo A tratada con mitomicina C)______

530 508 527

701 567 1111

25593 24732 22707

5086 3932 1497

521.7

793

24344

3505

SI (donante)

SI (llnea celular)

47

7

Numero Analltico Sistema de Cultivo

Replicas

1 2 3

Media

IM04-2480

Proliferacion de la llnea base del receptor Control de

autoestimulacion

(celulas autologas

tratadas con mitomicina C)

Donante alogenico MLR IM04-2477 (tratado con mitomicina C)

MLR con llnea celular

(celula tipo A tratada con mitomicina C)_________

1192 854 1330

2963 993 2197

25416 29721 23757

2596 5076 3426

1125.3

2051

26298

3699.3

SI (donante)

SI (llnea celular)

23

3

IM04-2481

Proliferacion de la llnea base del receptor Control de

autoestimulacion (celulas autologas

tratadas con mitomicina C)

Donante alogenico MLR

IM04-2477 (tratado con mitomicina C)

MLR con llnea celular

(celula tipo A tratada con mitomicina C)

695 451 555

738 1252 464

13177 24885 15444

4495 3671 4674

567

818

17835.3

4280

SI (donante)

SI (llnea celular)

31

8

1

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Replicas

1 2 3

Media

IM04-2482

Proliferacion de la llnea base del receptor

Control de

autoestimulacion

(celulas autologas tratadas con

mitomicina C)

Donante alogenico MLR

IM04-2477 (tratado con mitomicina C)

MLR con llnea celular

(celula tipo A tratada con

mitomicina C)

432 533 274

1459 633 598

24286 30823 31346

2762 1502 6723

413

896.7

28818.3

3662.3

SI (donante)

SI (llnea celular)

70

9

Numero Analltico

Sistema de Cultivo

Replicas

1 2 3

Media

IM04-2477

(Donador alogenico)

Proliferacion de la llnea base del receptor

Control de

autoestimulacion

(celulas autologas tratadas con

mitomicina C)

312 419 349

567 604 374

360

515

Llnea celular tipo A

Proliferacion de la llnea base del receptor

Control de

autoestimulacion

(celulas autologas tratadas con

mitomicina C)

5101 3735 2973

1924 4570 2153

3936.3

2882.3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 11-5. indice de estimulacion promedio de las celulas derivadas umbilicales y un donante alogenico en una reaccion mixta de linfocitos con cinco receptores individuales alogenicos

Indice Promedio de Estimulacion

Receptor Umbilical

Plato 1 (receptores 1 - 4)

42.75 6.5

Plato 2 (receptor 5)

70 9

Antigenos que presentan marcadores celulares - celulas derivadas de la placenta. Histogramas de las celulas derivadas de la placenta analizados por citometrla de flujo muestran una expresion negativa de HLA-DR, DP,

DQ, CD80, CD86, y B7-H2, como se nota por el valor de fluorescencia consistente con el IgG de control, indicando que las llneas celulares placentarias no tenlan las moleculas de superficie celular requeridas para estimular directamente las celulas cD4+ T.

Marcadores inmunomoduladores - celulas derivadas de la placenta. Los histogramas de las celulas derivadas de la placenta analizados por citometrla de flujo muestran una expresion positiva de PD-L2, como se noto por el valor incrementado de fluorescencia relativo al IgG de control, y expresion negativa de CD 178 y HLA-G, como se nota con los valores de fluorescencia consistentes con el control IgG.

Antigenos que presentan marcadores celulares - celulas derivadas umbilicales. Los histogramas de celulas derivadas umbilicales que fueron analizados por citometrla de flujo muestran expresiones negativas de HLA-

DR, DP, DQ, CD80, CD86, y B7-H2, como se noto por el valor de fluorescencia consistente con el del control IgG, indicando que las llneas celulares umbilicales no tienen las moleculas de superficie celular requeridas para estimular directamente las celulas CD4+ T.

Marcadores celulares inmunomoduladores - celulas derivadas umbilicales. Los histogramas de las celulas derivadas umbilicales analizados por citometrla de flujo muestran una expresion positiva de PD-L2, tal como se nota por el valor incrementado de la fluorescencia relativa a la del control IgG, y una expresion negativa de CD 178 y hLA-G, como se nota por el valor de fluorescencia consistente con el control IgG.

Resumen. Para las reacciones mixtas de linfocitos conducidas con las llneas celulares derivadas de placentas, el Indice promedio de estimulacion vario desde 1.3 a 3, y aquel de los controles alogenico positivos variaron desde 46.25 hasta 279. En las reacciones mixtas de linfocitos conducidas con las llneas celulares derivadas umbilicales el Indice promedio de estimulacion vario desde 6.5 hasta 9, y aquel del control alogenico positivo vario desde 42.75 hasta 70. Las llneas derivadas de la placenta y umbilicales fueron negativas para la expresion de las protelnas estimuladoras HLA-DR, HLA-DP, HLA-dQ, CD80, Cd86, y B7-H2, como se midio por la citometrla de flujo. Las llneas celulares derivadas de la placenta y umbilicales fueron negativas para la expresion de protelnas inmunomoduladoras HLA-G y CD 178 y positivas para la expresion de PD-L2, como se midio por la citometrla de flujo. PBMCs donantes alogenicas contienen celulas con antigenos que expresan HLA-DR, DQ, CD8, CD86, y B7- H2, permitiendo por lo tanto la estimulacion de celulas naive CD4+ T. Las lineas celulares derivadas de la placenta y umbilicales fueron negativas para la expresion de proteinas inmunomoduladores HLA-G y CD 178 y positivas para la expresion de PD-L2, como se midio por la citometria de flujo. Las PBMCs del donante alogenico, contenian celulas antigenas que presentaban expresiones de HLA-DR, DQ, CD8, CD86, y B7-H2, por lo tanto permitiendo la estimulacion de celulas CD4+ T. La ausencia de moleculas de superficie celular que tengan antigenos en las celulas derivadas de la placenta y umbilicales requeridas para una estimulacion directa de las celulas naive CD4+ T y la presencia de PD-L2, una proteina inmunomoduladora, podria explicar el bajo indice de estimulacion exhibido por estas celulas en un MLR en comparacion de los controles alogenicos.

EJEMPLO 12

Secrecion de factores troficos por las celulas derivadas de postparto

Se midio la secrecion de factores troficos seleccionados de celulas derivadas de la placenta y umbilicales. Los factores seleccionados a detectarse incluyeron: (1) aquellos que se sabe que tienen actividad angiogenica, tal como el factor de crecimiento hepatocito (hGf) (Rosen et al. (1997) Ciba Found. Symp. 212:215-26), proteina quimiotactica de monocitos 1 (MCP-1 - monocyte chemotactic protein) (Salcedo et al. (2000) Blood 96;34-40), interleucina-8 (IL-8) (Li et al. (2003) J. Immunol. 170:3369-76), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF - keratinocyte growth factor), factor de crecimiento de fibroblastos basicos (bFGF - basic fibroblast growth factor), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF - vascular endothelial growth factor) (Hughes et al. (2004) Ann. Thorac. Surg. 77:812-8), metaloproteinasas matriciales 1 (TIMP1), angiopoyetina 2 (ANG2), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB - platelet derived growth factor), trombo - poietin (TPO), el factor de crecimiento epidermico de vinculacion a heparina (HB-EGF - heparin-binding epidermal growth factor), factor derivado estromal-1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

alfa (SDF-1 alfa - stromal-derived factor 1 alpha); (2) aquellos conocidos por tener actividad neurotrofica / neuroprotectora, tal como el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF - brain-derived neurotrophic factor) (Cheng et al (2003) Dev Biol 258;... 319-33), la interleucina-6 (IL-6), protelna quimiotactica de granulocitos -2 (GCP-2 - granulocyte chemotactic protein-2), factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFbeta2 - transforming growth factor beta2); y (3) aquellos conocidos por tener actividad de quimioquinas, tales como la protelna inflamatoria de macrofagos 1 alfa (MIP1a - macrophage inflammatory protein 1 alpha), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b - macrophage inflammatory protein 1beta), monocitos quimioatrayentes-1 (MCP-1 - monocyte chemoattractant-1), Rantes (reguladas en la activacion, celulas T normales expresadas y secretadas), 1309, el timo y la quimioquina regulada en su activacion (TARC - thymus and activation-regulated chemokine), eotaxina, quimioquina derivada de macrofagos (MDC - macrophage-derived chemokine), IL-8).

Metodos y Materiales

Cultivo celular. Las PPDCs de la placenta y umbilicales as! como fibroblastos humanos derivados de prepucio neonatal humano fueron cultivados en un medio de Crecimiento con penicilina / estreptomicina en matraces T75 cubiertos de gelatina. Las celulas fueron crio - conservadas en el pase 11 y almacenadas en nitrogeno llquido. Despues de descongelar las celulas, se agrego un medio de crecimiento a las celulas seguido de su transferencia a un tubo centrlfugo de 15 ml donde se procesaron las celulas a 150 x g durante cinco minutos. Los elementos flotantes fueron descartados, el pellet de celulas fue re - suspendido en 4 ml de medio de crecimiento, y las celulas fueron contadas. Las celulas se sembraron a 375.000 celulas por cada Matraza de 75 cm2 que contenlan 15 ml de medio de crecimiento y fueron cultivados durante 24 horas. El medio fue cambiado a un medio libre de sueros (DMEM - de baja glucocosa (Gibco), 0.1% (masa / volumen) de albumina de suero bovino (Sigma), penicilina / estreptomicina (Gibco)) durante ocho horas. El medio acondicionado sin sueros fue recolectado al final de la incubacion por medio de centrifugacion a 14.000 x g durante cinco minutos y almacenado a -20 grados centlgrados. Para estimar el numero de celulas en cada matraza, las celulas fueron lavadas con PBS y separadas usando 2 ml de tripsina / EDTA. La actividad de la tripsina fue inhibida al aumentar 8 ml de medio de crecimiento. Las celulas fueron centrifugadas a 150 x g durante cinco minutos. El material flotante fue removido, y las celulas fueron re - suspendidas en 1 ml de medio de crecimiento. El numero de celulas se estimo utilizando un hemocitometro.

Ensayo ELISA. Las celulas fueron producidas a 37° C en 5% de dioxido de carbono y oxlgeno atmosferico. Las celulas derivadas de la placenta (lote 101503) tambien crecieron con 5% de oxlgeno o beta-mercaptoetanol (BME). La cantidad de MCP-1, IL-6, vEgF, SDF-1alfa, GCP-2 , IL-8, y TGF-beta 2 producido por cada muestra de celulas fue medido por un ensayo ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos se realizaron de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes.

Ensayo ELISA multiple de SearchLight. Se midieron quimioquinas (MIP1a, MIP1b, MCP-1, Rantes, 1309, TARC, Eotaxin, MDC, IL8), BDNF, y factores angiogenicos (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGF-bb, TPO, HB-EGF fueron medidos utilizando los ensayos Proteomas de SearchLight (Pierce Biotechnology Inc.). Los ensayos de Proteomas son emparedados multiples de ELISA para la medida cuantitativa de 2 a 16 protelnas por pozo. Los ensayos se producen al colocar un patron de 2 x 2, 3 x 3, o 4 x 4 de cuatro a 16 diferentes anticuerpos capturados en cada uno de los pozos de un plato de 96 pozos. Despues del procedimiento de emparedado de ELISA, se captura una imagen de todo el plato para captar una senal qulmico luminista ente generada en cada lugar dentro de cada pozo del plato. La cantidad que se genera de senal en cada lugar es proporcional a la cantidad de la protelna objetivo en el estandar o muestra original.

Resultados

Ensayos ELISA. Las celulas derivadas de la placenta y umbilicales y los fibroblastos dermicos secretaron MCP-1 e IL-6 (Tabla 12-1). SDF-1alfa fue secretado por celulas derivadas de la placenta cultivadas en un 5 % de O2 y fibroblastos. GCP-2 e IL- 8 fueron secretados por celulas derivadas umbilicales y por celulas derivadas de la placenta cultivadas en la presencia de BME o 5% O2. Tambien se secreto GCP-2 por fibroblastos humanos. TGF- beta2 no fue detectable por el ensayo de ELISA.

5

10

15

20

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65

Tabla 12-1. Resultados del ensayo de ELISA

(valores presentados en picogramos / mililitros / millones de celulas (n=2, sem)

MCP-1 IL-6 VEGF SDF-1a GCP-2 IL-8 TGF-B2

Fibroblastos

17±1 61 ±3 29±2 19±1 21 ±1 ND ND

Placenta (042303)

60±3 41 ±2 ND ND ND ND ND

Umbilical (022803)

1150±74 4234±289 ND ND 160±11 2058±145 ND

Placenta (071003)

125±16 10±1 ND ND ND ND ND

Umbilical (071003)

2794±84 1356±43 ND ND 2184±98 2369±23 ND

Placenta (101503) BME

21 ±10 67±3 ND ND 44±9 17±9 ND

Placenta (101503) 5% O2, con O BME

77±16 339±21 ND 1149±137 54±2 265±10 ND

Clave: ND: No Detectado.

Ensayo ELISA multiple de SearchLight. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1, RANTES, 1309, TARC, MDC, e IL-8 fueron secretadas de celulas derivadas umbilicales (Tablas 12 - 2 y 12 - 3). TIMP1, TPO, KGF, HGF, HBEGF, BDNF, MIP1a, MCP-1, RANTES, TARC, Eotaxin, e IL-8 fueron secretados de las celulas derivadas de la placenta (Tablas 12 - 2 y 12 - 3). No se detectaron Ang2, VEGF, o PDGF-bb.

Tabla 12 - 2. Resultados del ensayo ELISA multiple de SearchLight

TIMP1 ANG2 PDGFbb TPO KGF HGF FGF VEGF HBEGF BDNF

hFB

19306.3 ND ND 230.5 5.0 ND ND 27.9 1.3 ND

P1

24299.5 ND ND 546.6 8.8 16.4 ND ND 3.81.3 ND

U1

57718.4 ND ND 1240.0 5.8 559.3 148.7 ND 9.3 165.7

P3

14176.8 ND ND 568.7 5.2 10.2 ND ND 1.9 33.6

U3

21850.0 ND ND 1134.5 9.0 195.6 30.8 ND 5.4 388.6

Clave: hfB (fibroblastos humanos), P1 (celulas derivadas de la placenta (042303)), U1 (celulas derivadas umbilicales (022803)), P3 (celulas derivadas de la placenta (071003)), U3 (celulas derivadas umbilicales (071003)). ND: No Detectado.

Tabla 12-3. Resultados del ensayo ELISA multiple de SearchLight

MIP1a MIP1 b MCP1 RANTES 1309 TARC Eotaxin MDC IL8

hFB

ND ND 39.6 ND ND 0.1 ND ND 204.9

P1

79.5 ND 228.4 4.1 ND 3.8 12.2 ND 413.5

U1

ND 8.0 1694.2 ND 22.4 37.6 ND 18.9 51930.1

P3

ND ND 102.7 ND ND 0.4 ND ND 63.8

U3

ND 5.2 2018.7 41.5 11.6 21.4 ND 4.8 10515.9

Clave: hFB (fibroblastos humanos), P1 (PPDC derivada de la placenta (042303)), U1 (PPDC derivada umbilical (022803)), P3 (PPDC derivada de la placenta (071003)), U3 (PPDC derivada umbilical (071003)). ND: No Detectado.

Resumen. Las celulas derivadas umbilicales y de la placenta secretaron varios factores troficos. Algunos de estos factores, tales como HGF, bFGF, MCP-1 e IL-8, juegan roles importantes en la angiogenesis. Otros factores troficos, tales como BDNF e IL-6, tienen importantes roles en la regeneration neural.

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EJEMPLO 13

Diferenciacion neural a corto plazo de las Celulas Derivadas de Postparto

Se examino la habilidad de las celulas derivadas de la placenta y umbilicales (colectivamente de celulas derivadas de postparto o PPDCs - postpartum-derived cells) para diferenciarse en celulas de linaje neural.

Materiales y metodos

Aislamiento y expansion de las celulas de postparto. Las PPDCs de tejidos placentarios y umbilicales se aislaron y se expandieron de acuerdo a como se describio en el Ejemplo 1.

Protocolo modificado de Woodbury-Black. (A) Este ensayo fue adaptado de otro que fue originalmente realizado para probar la sesion neural potencial de las celulas estromales de medula osea (1). Las celulas derivadas umbilicales (022803) P4 y las celulas derivadas de la placenta (042203) P3 fueron descongeladas y expandidas en cultivos en medios de crecimiento a 5000 celulas por centlmetro cuadrado hasta alcanzar su sub - confluencia (75%). Despues las celulas fueron tripnizadas y sembradas a 6000 celulas por pozo en un porta objetos de vidrio Titretek II (VWR International, Bristol, CT). Como controles, se sembraron bajo las mismas condiciones celulas madres mesenquimas (P3; 1F2155; Cambrex, Walkersville, MD), osteoblastos (P5; CC2538; Cambrex), celulas derivadas de adiposas (Artecel, US6555374 B1) (P6; donador 2) y fibroblastos dermicos humanos neonatales (P6; CC2509; Cambrex).

Todas las celulas fueron expandidas inicialmente durante cuatro dlas en un medio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 15% (volumen / volumen) de suero bovino fetal (FBS; Hyclone, Logan, UT), factor de crecimiento de fibroblastos basicos (bFGF; 20 nano gramos / mililitros; Pepro-tech, Rocky Hill, NJ), factor de crecimiento epidermico (EGF; 20 nano gramos / mililitros; Peprotech) y penicilina / estreptomicina (Invitrogen). Despues de cuatro dlas, las celulas fueron enjuagadas en tampon fosfato salino (PBS; Invitrogen) y fueron cultivadas subsiguientemente en un medio DMEM/F12 + 20% (volumen / volumen) FBS + penicilina / estreptomicina durante 24 horas. Despues de 24 horas, las celulas fueron enjuagadas con PBS. Las celulas fueron cultivadas entonces durante una a seis horas en un medio de induccion que contenla DMEM/F12 (sin suero) con 200 mM de hidroxianisol butilado, 10 pM de cloruro de potasio, 5 miligramos / mililitro de insulina, 10 pM de forskolina, 4 pM de acido valproico, y 2 pM de hidrocortisona (todos los productos qulmicos de Sigma, St. Louis, MO). Las celulas fueron fijadas en 100% de metanol enfriado con hielo y se realizo inmunocitoqulmica (referirse a los metodos a continuacion) para evaluar la expresion de la protelna nestina humana.

(B) las PPDCs (umbilicales (022803) P11; placentarias (042203) P11) y fibroblastos dermicos humanos adultos (1F1853, P11) fueron descongelados y los cultivos fueron expandidos en medios de crecimiento a 5000 celulas por centlmetro cuadrado hasta que se alcanzo la sub - confluencia (75%). Las celulas fueron entonces tripnizadas y sembradas a una densidad similar como en (a), pero en (1) en platos de 24 pozos de tejido de cultivo tratado (TCP, Falcon brand, VWR International), (2) posos TCP + 2% (masa / volumen) de gelatina absorbida durante una hora a la temperatura del cuarto, o (3) posos TCP + 20 pg / mililitro absorbidos de laminina de raton (absorbidos durante un mlnimo de dos horas a 37 °C; Invitrogen).

Exactamente como en (A), las celulas se expandieron inicialmente y se cambio el medio de acuerdo a los tiempos antes mencionados. Un conjunto de cultivos se mantuvo fijo, como antes, durante cinco dlas y seis horas, este tiempo con 4% (masa / volumen) de paraformaldehldo helado (Sigma) durante 10 minutos a la temperatura del cuarto. En el segundo conjunto de cultivos, el medio se removio y se cambio un medio de Expansion Progenitora Neural (NPE - Neural Progenitor Expansion) que consistio de un medio neurobasal-A (Invitrogen) que contenla B27 (suplemento B27; Invitrogen), L-glutamina (4 mM), y penicilina / estreptomicina (Invitrogen). El medio NPE fue suplementado adicionalmente con acido retinoico (RA - retinoic acid; 1 pM; Sigma). Este medio fue removido cuatro dlas despues y se fijaron los cultivos con un 4% (masa / volumen) de paraformaldehldo helado (Sigma) durante 10 minutos a la temperatura del cuarto, y se coloreo para detectar la expresion de las protelnas de nestina, GFAP, y TuJ1 (ver la Tabla N1-1).

Tabla 13 - 1. Resumen de los anticuerpos primarios usados

Anticuerpo

Rata 401 (destina)

Destina humana TuJ1 (BIII Tubulina)

GFAP

Tirosina hidroxilasa (TH GABA

Desmina (raton)

Actina de musculo liso-alfa-alfa Protelna nuclear humana (hNuc)

■ Tyrosine hydroxylase)

Concentracion

Proveedor

1:200

Chemicon, Temecula, CA

1:100

Chemicon

1:500

Sigma, St. Louis, MO

1:2000

DakoCytomation, Carpinteria, CA

1:1000

Chemicon

1:400

Chemicon

1:300

Chemicon

1:400

Sigma

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Chemicon

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Protocolo de diferenciacion de dos etapas. Las PPDCs (umbilicales (042203) P11, placentarias (022803) P11), fibroblastos dermicos humanos adultos (P11; 1F1853; Cambrex) fueron descongelados y los cultivos fueron expandidos en un medio de crecimiento a 5000 celulas por centlmetro cuadrado hasta alcanzar su sub - confluencia (75%). Las celulas fueron tripnizadas y sembradas a 2000 celulas por centlmetro cuadrado, pero en platos de 24 posos cubiertos con laminina (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en la presencia de un medio NPE suplementado con bFGF (20 nano gramos / mililitros; Peprotech, Rocky Hill, NJ) y EGF (20 nano gramos / mililitro; Peprotech) [toda la composicion del medio referida a continuacion como NPE + F + E]. Al mismo tiempo, se aislaron del hipocampo progenitores neurales de rata adulta (P4; (0626030 tambien se pusieron en platos de 24 posos cubiertos con laminina en un medio NPE + F + E. Todos los cultivos se mantuvieron en esas condiciones por un perlodo de seis dlas (las celulas fueron alimentadas una vez durante ese tiempo) en donde se cambio el medio a las condiciones de diferenciacion listadas en la Tabla N1-2 por un perlodo adicional de siete dlas. Los cultivos se fijaron con un 4% (masa / volumen) de paraformaldehldo helado (Sigma) durante 10 minutos a la temperatura del cuarto, y se colored para detectar expresiones protelnicas de Nestina, GFAP, y TuJ1 de rata.

Tabla 13-2. Resumen de las condiciones para el protocolo de diferenciacion de dos etapas

A B

# DE COND.

PRE-DIFERENCIACION DIFERENCIA DE LA 2da ETAPA

1

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) NPE + SHH (200 ng / ml) + F8 (100 ng / ml)

2

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) NPE + SHH (200 ng / ml) + F8 (100 ng / ml) + RA (1 microM)

3

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) NPE + RA (1 microM)

4

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml)

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NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Medio de Crecimiento

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NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 1B + MP52 (20 ng / ml)

7

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 1B + BMP7 (20 ng / ml)

8

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 1B + GDNF (20 ng / ml)

9

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 2B + MP52 (20 ng / ml)

10

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 2B + BMP7 (20 ng / ml)

11

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 2B + GDNF (20 ng / ml)

12

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 3B + MP52 (20 ng / ml)

13

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 3B + BMP7 (20 ng / ml)

14

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) Condicion 3B + GDNF (20 ng/ml)

15

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) NPE + MP52 (20 ng / ml)

16

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) NPE + BMP7 (20 ng / ml)

17

NPE + F (20 ng / ml) + E (20 ng / ml) NPE + GDNF (20 ng / ml)

Protocolo de multiples factores de crecimiento. Las celulas derivadas umbilicales (P11; (042203)) fueron descongeladas y expandidas en cultivos en un medio de crecimiento a 5000 celulas por centlmetro cuadrado hasta alcanzar la sub - confluencia (75%). Las celulas fueron entonces tripnizadas y sembradas a 2000 celulas por centlmetro cuadrado en platos cubiertos con laminina de 24 posos (BD Biosciences) en la presencia de NPE + F (20 nano gramos / mililitro) + E (20 nano gramos / mililitro). Adicionalmente, algunos pozos tuvieron NPE + F + E + 2% FBS o 10% FBS. Despues de cuatro dlas de condiciones de “pre-diferenciacion”, se removio todo el medio y las muestras fueron colocadas en un medio NPE suplementado con Sonic hedgehog (SHH; 200 nano gramos / mililitro; Sigma, St. Louis, MO), FGF8 (100 nano gramos / mililitro; Peprotech), BDNF (40 nano gramos / mililitro; Sigma), GDNF (20 nano gramos / mililitro; Sigma), y acido retinoico (1pM; Sigma). Siete dlas despues del cambio del medio, se fijaron los cultivos con un 4% (masa / volumen) de paraformaldehldo (Sigma) durante 10 minutos a la temperatura del cuarto, y se colored para detectar expresiones de nestina, GFAP, TuJ1, desmina y actina de musculo esqueletico alfa humanas.

Protocolo de co-cultivo progenitor neural. Se plantaron como neuroesferas o como celulas individuales (10.000 celulas por pozo) a progenitores de hipocampo de rata adulta (062603) a discos de 24 posos cubiertos con laminina (BD Biosciences) en NPE + F (20 nano gramos / mililitro) + E (20 nano gramos / mililitro).

Se descongelaron por separado celulas derivadas umbilicales (042203) P11 y celulas derivadas de la placenta (022803) P11 y se expandieron en cultivos NPE + F (20 nano gramos / mililitro) + E (20 nano gramos / mililitro) a 5000 celulas por centlmetro cuadrado durante un perlodo de 48 horas. Las celulas fueron entonces

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tripnizadas y sembradas a 2500 celulas por pozo en cultivos existentes de progenitores neurales. En ese momento, el medio existente fue cambiado por un medio fresco. Despues de cuatro dlas, los cultivos se fijaron con un 4% (masa / volumen) de paraformaldehldo helado (Sigma) durante 10 minutos a la temperatura del cuarto, y se colored para detectar protelnas nucleares humanas (hNuc - human nuclear; Chemicon) (Tabla NU1-1 mostrada anteriormente) para identificar a las PPDCs.

Inmunocitoqufmica. Se realizo inmunocitoqulmica usando los anticuerpos listados en la Tabla NU1-1. Los cultivos fueron lavados con tampon fosfato salino (PBS) y expuestos a una solucion de bloqueo de protelnas que contenla PBS, 4% (volumen / volumen) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0.3 por ciento (volumen / volumen) de Triton (Triton X-100; Sigma) durante 30 minutos para ganar acceso a antlgenos intracelulares. Anticuerpos primarios, que fueron diluidos en la solucion de bloqueo, se aplicaron entonces a los cultivos durante un perlodo de una hora a la temperatura del cuarto. Despues, las soluciones de anticuerpos primarios fueron removidas y los cultivos fueron lavados con PBS antes de la aplicacion de soluciones de anticuerpos secundarios (una hora a la temperatura del cuarto) que contenlan soluciones de bloqueo junto con IgG de cabra anti raton - Texas Red (1:250; Molecular Probes (Sondas Moleculares), Eugene, OR) e IgG de cabra anti conejo - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes (Sondas Moleculares)). Los cultivos se lavaron entonces y se aplicaron 10 pmol DAPI (Molecular Probes - Sondas Moleculares) durante 10 minutos para visualizar el nucleo de la celula.

Despues de inmunotinturar, se visualizo la fluorescencia usando el filtro de fluorescencia apropiado en un microscopio fluorescente - epi invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, una mancha positiva represento una senal de fluorescencia superior a la mancha de control donde todo el procedimiento senalado anteriormente fue seguido con la exception de la aplicacion de una solucion de anticuerpos primarios. Imagenes representativas fueron capturadas usando una video camara digital a color y el software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para muestras que fueron tinturadas en forma triple, cada imagen fue tomada usando solo un filtro de emision a la vez. Los montajes en capas fueron preparados utilizando el software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Resultados

Protocolo Woodbury-Black. (A) En el momento de la incubation en esta composition de induction neural, todos los tipos de celulas se transformaron en celulas con morfologlas bipolares y procesos extendidos. Tambien se observaron otras morfologlas importantes no bipolares. Es mas, las poblaciones celulares lucidas tuvieron coloration positiva en lo que se refiere a nestina, un marcador de celulas madre neurales multipotentes y de celulas progenitoras.

(B) Cuando esto se repitio en platos plasticos de cultivos de tejido (TCP), la expresion de nestina no se observo a menos que laminina haya sido pre - absorbida en la superficie del cultivo. Para evaluar en una mayor forma si las celulas que expresan nestina podrian ir entonces a generar neuronas maduras, las PPDCs y fibroblastos fueron expuestos a NPE + RA (1pM), una composicion de medio conocido por inducir la diferenciacion de celulas madre neurales y celulas progenitoras en aquellas celulas (2, 3, 4). Las celulas fueron tinturadas para detectar TuJ1, un marcador de neuronas inmaduras y maduras, GFAP, un marcador de astrocitos, y nestina. Bajo ninguna condition se detecto a TuJ1 ni se observaron celulas con morfologia neural, sugiriendo que ninguna neurona fue generada en el corto plazo. Mas aun, la nestina y GFAP ya no estaban expresadas en las PPDCs tal como se determino por la inmunocitoqulmica.

Diferenciacion de dos etapas. Los aislamientos PPDC umbilicales y placentarios (asi como fibroblastos humanos y progenitores neurales de roedores como tipos de celula de control negativo y positivo, respectivamente) fueron colocados en platos con laminina (promotion neural) y expuestos a 13 condiciones de crecimiento diferentes (y dos condiciones de control) conocidas por promover la diferenciacion de progenitores neurales a neuronas y astrocitos. Adicionalmente, dos condiciones fueron anadidas para examinar la influencia de GDF5, y BMP7 en la diferenciacion PPDC. Generalmente, se tomo un metodo de diferenciacion de dos pasos, en el cual las celulas primero se colocaban en condiciones de expansion progenitora neural durante un periodo de seis dias, seguido por condiciones completas de diferenciacion durante siete dias. Desde el punto de vista morfologico, ambas celulas derivadas umbilicales y de la placenta exhibieron cambios fundamentales en su morfologia celular al pasar del tiempo de este procedimiento. Sin embargo, no se observaron celulas con forma neural o de astrocitos a excepcion de las que estaban en el grupo de control, bajo condiciones en platos para progenitores neurales. Una inmunocitoqulmica negativa de nestina humana, TuJ1, y GFAP confirmo las observaciones morfologicas.

Factores de crecimiento multiple. Despues de una semana de la exposition a varios agentes de diferenciacion neural, las celulas fueron tinturadas para identificar marcadores indicativos de progenitores neurales (nestina humana), neuronas (TuJ1), y astrocitos (GFAP). Las celulas que crecieron en la primera etapa en un medio que no contenla ningun suero tenian morfologlas diferente es que aquellas celulas en un medio que contenia suero (2% o 10%), indicando una diferenciacion neural potencial. Especificamente, siguiendo un procedimiento de dos pasos para exponer las celulas derivadas umbilicales a EGF y bFGF seguido de SHH, FGF8, GDNF, BDNF, y acido retinoico, las celulas mostraron procesos largos similares a la morfologia de astrocitos cultivados. Cuando se incluyo FBS en un 2% y en un 10% en la primera etapa de diferenciacion, el numero de celulas se incremento y la

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morfologla celular no cambio en comparacion con los cultivos de control a alta densidad. No se evidencio ninguna diferenciacion neural esencial con el analisis inmuno citoqulmico para nestina humana, TuJ1, o GFAP.

Progenitor neural y co - cultivos PPDC. Las PPDCs fueron chapadas en otros cultivos de progenitores neurales de rata sembradas dos dlas antes en condiciones de expansion neural (NPE + F + E). Mientras una confirmacion visual de las PPDCs chapadas probaron que estas celulas fueron chapadas como celulas individuales, una tincion nuclear especlfica humana (hNuc) cuatro dlas despues del chapeo (seis dlas en total) mostro que estas tendlan a acumularse y evitar contacto con los progenitores neurales. Es mas, en los lugares en los que las PPDCs se adherlan, estas celulas se dispersaban y pareclan inervadas por las neuronas diferenciadas de origen de rata, sugiriendo que las PPDCs pueden haberse diferenciado en celulas de musculo. Esta observacion se baso en la morfologla bajo la fase de contraste con un microscopio. Otra observacion fue que cuerpos celulares tlpicamente grandes (mas grandes que los progenitores neurales) tenlan morfologlas similares a progenitores neurales, con procesos delgados que se extendlan en multiples direcciones. La tincion HNuc (encontrada en la mitad de los nucleos de las celulas) sugirio que en algunos casos estas celulas humanas pueden haberse fusionado con las progenitoras de rata y pueden haber asumido su fenotipo. Pozos de control que contenlan solamente progenitores neurales tenlan menos progenitores en total y menos celulas diferenciadas que las que tenlan los pozos co - cultivados correspondientes a las PPDCs umbilicales o de placenta, indicando que ambas celulas derivadas umbilicales y de la placenta influenciaron la diferenciacion y el comportamiento de los progenitores neurales, ya sea por la liberacion de quimioquinas y citoquinas, o por efectos del contacto mantenido en el medio.

Resumen. Se realizaron varios protocolos para determinar el potencial a corto plazo de las PPDCs para diferenciarse en celulas de linaje neural. Estos incluyeron contraste de imagenes por fases de la morfologla en combinacion con inmunocitoqulmica para nestina, TuJl, y GFAP, protelnas asociadas con celulas madre neurales multipotentes y progenitoras, neuronas inmaduras y maduras, y astrocitos, respectivamente. Se observo evidencia que sugiere que la diferenciacion neural ocurrio en ciertas instancias en estos protocolos a corto plazo.

Algunas observaciones notables se hicieron en co - cultivos de PPDCs con progenitores neurales. Este metodo, usando PPDCs humanas con tipos de celula xenogeneicas permitio una determinacion absoluta del origen de cada celula en estos cultivos. Primero, algunas de las celulas en estos cultivos mostraron un citoplasma celular agrandado, con procesos similares a neuritas alejandose del cuerpo celular, sin embargo solo la mitad del cuerpo estaba marcado con protelna hNuc. Aquellas celulas pudieron haber sido PPDCs humanas que se diferenciaron en celulas de linaje neural o pueden haber sido PPDCs que se fusionaron con progenitores neurales. Segundo, aparentemente los progenitores neurales extendieron neuritas a las PPDCs en una forma que indica que los progenitores se diferenciaron en neuronas e inervaron las PPDCs. Tercero, cultivos de progenitores neurales y PPDCs tenlan mas celulas de origen de rata y cantidades mas grandes de diferenciacion que los cultivos de control que contenlan solo progenitoras neurales, indicando en mayor forma que las PPDCs chapeadas suministraron factores solubles y / o mecanismos que dependen del contacto que estimularon la supervivencia, proliferacion, y / o diferenciacion de los progenitores neurales.

Referencias para el Ejemplo 13

(1) Woodbury, D. et al. (2000). J Neurosci. Research. (Investigacion) 61(4): 364-70.

(2) Jang, Y.K. et al. (2004). J. Neurosci. Research. (Investigacion) 75(4): 573-84.

(3) Jones-Villeneuve, E.M. et al. (1983). Mol Cel Biol. 3(12): 2271-9.

(4) Mayer-Proschel, M. et al. (1997). Neuron (Neurona). 19(4): 773-85.

EJEMPLO 14

Diferenciacion neural a largo plazo de celulas derivadas de postparto

Se evaluo la habilidad de las celulas derivadas umbilicales y de la placenta (colectivamente celulas derivadas de postparto o PPDCs) para experimentar diferenciacion a largo plazo a celulas de linaje neural.

Materiales y metodos

Aislamiento y expansion de las PPDCs. Las PPDCs fueron aisladas y expandidas tal como se describio en los ejemplos anteriores.

Descongelamiento y chapado de las celulas PPDC. Porciones congeladas de las PPDCs (umbilical (022803) P11; (042203) P11; (071003) P12; placentario (101503) P7) que hablan crecido previamente en medios de crecimiento fueron descongeladas y chapadas a 5000 celulas por centlmetro cuadrado en matraces T-75 cubiertos con laminina (BD, Franklin Lakes, NJ) en un medio neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene B27 (suplemento B27, Invitrogen), L-glutamina (4 mM), y penicilina / estreptomicina (10 mililitros), la combinacion a la cual se denomina aqul como Medio de Expansion de Progenitores Neurales (NPE - Neural Progenitor Expansion). El medio NPE fue suplementado adicionalmente con bFGF (20 nano gramos / mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ) y EGF (20 nano gramos / mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ), aqul referido como NPE + bFGF + EGF.

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Chapeo de las celulas de control. Adicionalmente, los fibroblastos dermicos humanos adultos (P11, Cambrex, Walkersville, MD) y las celulas madres mesenquimas (P5, Cambrex) fueron descongeladas y chapadas a la misma densidad de siembra celular en matraces T-75 cubiertos con laminina en NPE + bFGF + EGF. Para incrementar el control, las PPDCs fibroblastos, umbilicales y de placenta fueron cultivados en un medio de crecimiento durante el perlodo especificado para todos los cultivos.

Expansion celular. Los medios de todos los cultivos se reemplazaron con medios frescos una vez a la semana y se observaba a las celulas para ver si presentaban expansion. En general, cada cultivo se pasaba una vez durante un perlodo de un mes por el crecimiento limitado en NPE + bFGF + EGF.

Inmunocitoqufmica. Despues de un periodo de un mes, todos los matraces se fijaban con un 4% (masa / volumen) de paraformaldehldo frlo (Sigma) durante 10 minutos a la temperatura del cuarto. La inmunocitoqulmica se realizaba usando anticuerpos dirigidos en contra de TuJ1 (BIII Tubulina; 1:500; Sigma, St. Louis, MO) y GFAP (protelna acida glial fibrilar; 1:2000; DakoCytomation, Carpinteria, CA). Brevemente, los cultivos se lavaban con tampon fosfato salino (PBS) y se exponlan a una solucion de bloqueo de protelnas que contenla PBS, 4% (volumen / volumen) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0.3 por ciento (volumen / volumen) de Triton (Triton X- 100; Sigma) durante 30 minutos para ganar acceso a antlgenos intracelulares. Anticuerpos primarios, diluidos en la solucion de bloqueo, fueron aplicados entonces a los cultivos durante un perlodo de una hora a la temperatura del cuarto. Despues, las soluciones de anticuerpos primarios fueron removidas y los cultivos se lavaron con PBS antes de aplicar las soluciones de anticuerpos secundarios (una hora a la temperatura del cuarto) que contenlan bloqueos junto con el IgG de cabra anti raton - Texas Red (1:250; Molecular Probes (Sondas Moleculares), Eugene, OR) e IgG de cabra anti conejo - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes - Sondas Moleculares). Los cultivos fueron lavados entonces y se aplicaron 10 pmol DAPI (Sondas Moleculares) durante 10 minutos para visualizar el nucleo de la celula.

Despues de la inmunotincion, se visualizo la fluorescencia utilizando el filtro de fluorescencia apropiado en un microscopio fluorescente - epi invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, una tincion positiva representaba una senal de fosforescencia por sobre la tincion del control donde todo el procedimiento que se senalo anteriormente fue seguido a excepcion de la aplicacion de la solucion de anticuerpos primarios. Capturadas utilizando una videocamara digital a color y el software ImagePro software (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para muestras que tenlan tres coloraciones, cada imagen fue tomada usando un solo filtro de emision a la vez. Montajes de capas se prepararon entonces usando el software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Tabla 14-1. Resumen de los anticuerpos primarios utilizados Concentracion Proveedor

1:500 Sigma, St. Louis, MO

1:2000 DakoCytomation, Carpinteria, CA

Resultados

Anticuerpo

TuJ1 (BIII Tubulina) GFAP

El medio NPE + bFGF + EGF retarda la proliferacion de las PPDCs y altera su morfologfa.

Inmediatamente despues del chapado, un subconjunto de PPDCs se adjunto a los Matraces de cultivos cubiertos con laminina. Esto pudo deberse a la muerte celular como una funcion del proceso de congelamiento / descongelamiento o por las nuevas condiciones de crecimiento. Las celulas que se adhirieron adquirieron morfologlas diferentes a aquellas observadas en el medio de crecimiento.

En el momento de confluencia, los cultivos fueron pasados y observados para determinar su crecimiento. Muy poca expansion ocurrio de aquellas celulas que sobrevivieron el pase. En este punto, celulas muy pequenas sin ninguna propagacion morfologica y con caracterlsticas de fase brillante empezaron a aparecer en los cultivos de las celulas derivadas umbilicales. Estas areas de los matraces fueron observadas durante algun tiempo. De estas celulas pequenas, procesos bifurcantes emergieron con varicosidades en todo su largo, caracterlsticas muy similares a lo descrito previamente de los progenitores neurales PSA-NCAM+ y neuronas progenitoras y TuJ1 + neuronas inmaduras derivadas del cerebro y de la medula espinal (1, 2). Con el tiempo, estas celulas se volvieron mas numerosas, pero solo se encontraron en clones.

Clones de celulas derivadas umbilicales expresan protelnas neurales. Los cultivos se fijaron un mes despues de su descongelamiento / chapado y tinturado para detectar la protelna neural TuJ1 y GFAP, filamento intermedio encontrado en astrocitos. Mientras todos los cultivos de control cultivados en medios de crecimiento y fibroblastos humanos y MSCs cultivados en medios NPE + bFGF + EGF, TuJ1-/GFAP-, se detecto TuJ1 en las PPDCs umbilicales y de la placenta. Se observo esa expresion en celulas con y sin morfologlas tipo neural. No se observo ninguna expresion GFAP en ningun cultivo. El porcentaje de celulas que expresaron TuJ1, morfologlas similares a las neurales fue menos o igual al 1% to de la poblacion total (n = 3 aislamientos de celulas derivadas umbilicales probadas) aunque no fue cuantificado, el porcentaje de celulas TuJ1+ sin morfologlas neurales fue mas alto en los cultivos celulares derivados umbilicales que en los cultivos celulares derivados de la placenta. Estos

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resultados pareclan especlficos en relacion a los controles que emparejan la edad en medios de crecimiento que no expresaban TuJ1.

Resumen. Se desarrollaron metodos para generar neuronas diferenciadas (basandose en la expresion TuJ1 y la morfologla neuronal) de celulas derivadas umbilicales. Aunque las expresiones de TuJ1 no fueron examinadas antes de un mes in vitro, es claro que por lo menos una poblacion pequena de las celulas derivadas umbilicales pueden dar paso a neuronas ya sea por medio de una diferenciacion estandar o por medio de una induccion a largo plazo despues de un mes de exposition a medios mlnimos suplementados con L- glutamina, FGF basica, y EGF.

Referencias para el ejemplo 14

(1) Mayer-Proschel, M. et al. (1997). Neuron (Neurona). 19(4): 773-85.

(2) Yang, H. et al. (2000). PNAS. 97(24): 13366-71.

EJEMPLO 15

Factores troficos PPDC para el soporte de progenitores neurales

Se examino la influencia de celulas derivadas umbilicales y de la placenta (en conjunto celulas derivadas de postparto o PPDCs) en la supervivencia y diferenciacion de celulas madres y progenitoras neurales adultas por medio de mecanismos dependientes (troficos) sin contacto.

Materiales y metodos

Aislamiento de celulas madre y progenitoras neurales adultas. Ratas adultas Fisher 344 fueron sacrificadas mediante asfixia usando CO2 seguido por una dislocation cervical. Todo el cerebro fue removido intacto usando pinzas oseas y tejido hipocampo diseccionado basandose en incisiones coronales posteriores a las regiones motrices y somatosensoriales del cerebro (Paxinos, G. & Watson, C. 1997. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates - El Cerebro de la Rata en Coordenadas Estereotaxicas). El tejido se lavo en un medio Neurobasal - A (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contenla B27 (suplemento B27; Invitrogen), L- glutamina (4mM; Invitrogen), y penicilina / estreptomicina (Invitrogen), la combination a la cual se denomina aqul como medio de expansion progenitor neural (NPE). El medio NPE fue suplementado adicionalmente con bFGF (20 nano gramos / mililitros, Peprotech, Rocky Hill, NJ) y EGF (20 nano gramos / mililitros, Pepro-tech, Rocky Hill, NJ), denominados aqul como NPE + bFGF + EGF.

Despues de lavado, se retiraron las meninges superpuestas, y se desmenuzo el tejido con un bisturl. El tejido desmenuzado fue recolectado y se agrego tripsina / EDTA (Invitrogen) como el 75% del volumen total. Tambien se agrego seADN (100 pl por 8 ml del volumen total, Sigma, St. Louis, MO). Despues, el tejido / medio fue pasado secuencialmente de a traves de una aguja de medicion 18, una aguja de medicion 20 y finalmente una aguja de medicion 25 una vez por cada una (todas las agujas de Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). La mezcla fue centrifugada durante tres minutos a 250 g. El material flotante fue removido, se agrego NPE + bFGF + EGF fresco y el pellet fue re - suspendido. La suspension celular resultante fue pasada a traves de un filtro celular de 40 pm (Becton Dickinson), chapados en matraces T-75 cubiertos con laminina (Becton Dickinson) o platos de 24 pozos de bajas agrupaciones (Becton Dickinson), y cultivados en medios NPE + bFGF + EGF hasta obtenerse suficientes numeros celulares para los estudios senalados.

Chapado de PPDCs. Las celulas derivadas de postparto (umbilicales (022803) P12, (042103) P12, (071003) P12; placenta (042203) P12) previamente cultivadas en medios de crecimiento fueron chapadas a 5000 celulas por insertion Transwell (tamano disenado para un plato de 20:04 pozos) y cultivado durante un perlodo de una semana en medios de crecimiento en inserciones para lograr su confluencia.

[0317] Chapado de progenitores neurales adultos. Los progenitores neurales cultivados como neuroesferas o como celulas individuales, se sembraron en platos de 24 pozos cubiertos con laminina a una densidad aproximada de 2000 celulas por pozo en NPE + bFGF + EGF durante un perlodo de un dla para promover su adherencia celular. Un dla despues, inserciones transwell que contenlan celulas postparto fueron anadidas de acuerdo al siguiente esquema:

(1) Transwell (celulas derivadas umbilicales en medio de crecimiento, 200 pl) + progenitores neurales (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro)

(2) Transwell (celulas derivadas de la placenta en medio de crecimiento, 200 pl) + progenitores neurales (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro)

(3) Transwell (fibroblastos dermicos humanos adultos [1F1853; Cambrex, Walkersville, MD] P12 en medio de crecimiento, 200 pl) + progenitores neurales (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro)

(4) Control: progenitores neurales individuales (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro)

(5) Control: progenitores neurales individuales (solamente NPE, 1 ml)

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Inmunocitoqufmica. Despues de siete dlas en co - cultivo, todas las condiciones se fijaron con un 4% (masa / volumen) de paraformaldehldo (Sigma) durante un perlodo de 10 minutos en temperatura del cuarto. Se realizo la inmunocitoqulmica usando anticuerpos dirigidos en contra de los epitopes listados en la Tabla 15 - 1. Brevemente, se lavaron los cultivos con tampon fosfato salino (PBS) y se los expuso a una solucion de bloqueo de protelnas que contenla PBS, 4% (volumen / volumen) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA), y 0.3 por ciento (volumen / volumen) de Triton (Triton X-100; Sigma) durante 30 minutos para ganar acceso a antlgenos intracelulares. Entonces se aplicaron anticuerpos primarios, diluidos en solucion de bloqueo, a los cultivos durante un perlodo de una hora a la temperatura del cuarto. Despues, se removieron los anticuerpos primarios y se lavaron los cultivos con PBS antes de la aplicacion de soluciones de anticuerpos secundarios (una hora a la temperatura del cuarto) que contenlan una solucion de bloqueo junto con IgG de cabra anti raton - Texas Red (1:250; Molecular Probes, (Sondas Moleculares) Eugene, OR) e IgG de cabra anti conejo - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes - Sondas Moleculares). Los cultivos fueron lavados entonces y se aplicaron 10 pmol de DAPI (Sondas Moleculares) durante 10 minutos para visualizar el nucleo celular.

Despues de la inmunotincion, se visualizo fluorescencia utilizando el filtro de fluorescencia apropiado en un microscopio fluorescente - epi invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, una tincion positiva representaba una senal de fluorescencia por sobre la tincion de control donde todo el procedimiento senalado anteriormente fue seguido con la excepcion de la aplicacion de una solucion de anticuerpos primaria. Las imagenes representativas fueron capturadas utilizando una videocamara a color digital y software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para muestras con tres tinciones, cada imagen era tomada usando solamente un filtro de emision a la vez. Montajes en capas fueron preparados entonces utilizando el software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Tabla 15 - 1. Resumen de los anticuerpos primarios utilizados Anticuerpo Concentracion Proveedor

Rata 401 (nestina) 1:200 Chemicon, Temecula, CA

TuJ1 (BIII Tubulina) 1:500 Sigma, St. Louis, MO

Tirosina hidroxilas (TH) 1:1000 Chemicon

GABA 1:400 Chemicon

GFAP 1:2000 DakoCytomation, Carpinteria, CA

Protelna basica mielina (MBP) 1:400 Chemicon

Analisis cuantitativo de diferenciacion progenitora neural. Se examino la cuantificacion de la diferenciacion progenitora neural de hipocampos. Se contaron un mlnimo de 1000 celulas por condicion o menos. Se evaluo el porcentaje de celulas positivas de una tincion especlfica al dividir el numero de celulas positivas para el numero total de celulas como se determino por la tincion DAPI (nuclear).

Analisis de espectrometrfa de masa y electroforesis con gel 2D. Para identificar factores unicos secretados como resultado de co - cultivo, se tomaron muestras de medios acondicionados antes de que la fijacion de los cultivos fuese congelada a -80 °C durante la noche. Las muestras fueron aplicadas entonces a dispositivos de ultrafiltracion por medio de centrifugacion (MW cutoff 30 kD). Se aplico lo retenido a cromatografla de inmunoafinidad (albumina - anti - Hu: IgY) (la inmunoafinidad no removio la albumina de las muestras). El filtrado fue analizado por MALDI. Lo que paso fue aplicado a la cromatografla de inmunoafinidad Cibachron Blue. Las muestras fueron analizadas por sDS-PAGE y electroforesis con gel 2D.

Resultados

El co-cultivo PPDC estimula la diferenciacion progenitora neural. Despues del cultivo con celulas derivadas umbilicales o de la placenta, las celulas progenitoras neurales co - cultivadas de hipocampo de rata adulta exhibieron una diferenciacion significativa en los tres linajes importantes en el sistema nervioso central. Este efecto fue observado claramente despues de cinco dias en co - cultivo, con numerosas celulas que elaboraban procesos complejos y perdian sus propiedades caracteristicas brillantes de la fase de dividirse en celulas progenitoras. Por otro lado, las progenitoras neurales que se cultivaron solas en la ausencia de bFGF y EGF no parecian saludables y su supervivencia fue limitada.

Despues de completar el procedimiento, los cultivos fueron tintados para detectar marcadores indicativos de celulas madres y progenitoras no diferenciadas (nestina), neuronas inmaduras y maduras (TuJ1), astrocitos (GFAP), y oligodendrocitos maduros (MBP). Se confirmo la diferenciacion en los tres linajes mientras que las condiciones de control no mostraron una diferenciacion significativa tal como se evidencio por la retencion de la tincion positiva de nestina en la mayoria de celulas. Aunque las celulas derivadas umbilicales y de la placenta indujeron diferenciacion de celulas, el grado de diferenciacion para los tres linajes fue menos en co - cultivos con celulas derivadas de la placenta que en los co - cultivos de celulas derivadas umbilicales.

El porcentaje de progenitores neurales diferenciados despues de un co - cultivo con celulas derivadas umbilicales se cuantifico (Tabla 15 - 2). Las celulas derivadas umbilicales impulsaron significativamente el numero de

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oligodendrocitos maduros (MBP) (24.0% vs 0% en ambas condiciones). Adicionalmente, el co - cultivo incremento el numero de astrocitos GFAP+ y neuronas TuJ1+ en el cultivo (47.2% y 8.7% respectivamente). Estos resultados fueron confirmados por la tincion de nestina indicando que el estado progenitor fue perdido despues del co - cultivo (13.4% vs 71.4% bajo la condicion de control 4).

Aunque la diferenciacion tambien parecio ser influenciada por fibroblastos humanos adultos, aquellas celulas no pudieron promover la diferenciacion de oligodendrocitos maduros ni pudieron generar una cantidad apreciable de neuronas. Aunque no fue cuantificado, los fibroblastos, sin embargo, parecieron mejorar la supervivencia de los progenitores neurales.

Tabla 15 - 2. Cuantificacion de la diferenciacion progenitora en co - cultivos de control vs. transwell con celulas

derivadas umbilicales. (E=EGF, F=bFGF)

Anticuerpo

TuJ1

GFAP

MBP

Nestina

F+E / Umb [Cond.1]

8.7 %

47.2 %

23.0 %

13.4 %

F+E/F+E [Cond. 4] F+E/removido [Cond. 5]

2.3 % 3.6 %

30.2 % 10.9 %

0 % 0 %

71.4 % 39.4 %

Identificacion de compuestos unicos. Medios acondicionados de co - cultivos derivados umbilicales y de la placenta, junto con los controles apropiados (medio NPE ± 1.7 % de suero, medio de co - cultivos con fibroblastos), fueron examinados para detectar diferencias. Componentes potencialmente unicos fueron identificados y extirpados de sus geles 2D respectivos.

Resumen. Co-cultivos de celulas progenitoras neurales adultas con PPDCs umbilicales o de placenta resultaron en la diferenciacion de aquellas celulas. Los resultados presentados en este ejemplo indican que la diferenciacion de celulas progenitoras neurales adultas despues de su co - cultivo con celulas derivadas umbilicales es particularmente efectivo. Especlficamente, un porcentaje significativo de oligodendrocitos maduros fue generado en co - cultivos de celulas derivadas umbilicales. En vista de la falta de contacto entre las celulas derivadas umbilicales y los progenitores neurales, este resultado parece estar en funcion de factores solubles liberados de las celulas derivadas umbilicales (efecto trofico).

Tambien se realizaron otras observaciones. Primero, hubieron muy pocas celulas en la condicion de control donde EGF y bFGF fueron removidos. La mayorla de celulas murieron y en promedio, hubieron alrededor de 100 celulas o menos por pozo. Segundo, se espera que exista muy poca diferenciacion en la condicion de control donde se retenga a EGF y bFGF en el medio, puesto que normalmente es un medio de expansion. Aunque aproximadamente el 70% de las celulas retuvo su estado progenitor (nestina+), alrededor del 30% fueron GFAP+ (indicativo de astrocitos). Esto puede deberse al hecho de que aquella expansion significativa ocurrio durante el procedimiento en el cual el contacto entre progenitores indujo esta diferenciacion (Song, H. et al. 2002. Nature (Naturaleza) 417: 29-32).

EJEMPLO 16

Transplante de celulas derivadas de postparto

Las celulas derivadas umbilicales y de placenta de postparto son utiles para terapias regenerativas. Se evaluo el tejido producido por las celulas derivadas de postparto (PPDCs) trasplantadas en ratones SCID con un material biodegradable. Los materiales evaluados fueron poliglactina no tejida, espuma 35/65 PCL/PGA hidrogel peptido auto ensamblable RAD16.

Metodos y materiales

Cultivo celular. Las celulas derivadas de la placenta y umbilicales fueron cultivadas en un medio de crecimiento (DMEM - de baja glucosa (Gibco, Carlsbad CA), 15% (volumen / volumen) de suero bovino fetal (Cat. #SH30070.03; Hyclone, Logan, UT), 0.001% (volumen / volumen) de betamercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), penicilina / estreptomicina (Gibco)) en matraces cubiertos de gelatina.

Preparacion de la muestra. Se sembro 1 millon de celulas viables en 15 pl de Medio de Crecimiento en un diametro de 5 mm en supercontigos no tejidos Vicryl de 2.25 mm de grueso (64.33 miligramos /cc; Lote#3547-47-1) o una espuma 35/65 PCL/PGA con un diametro de 5 mm (Lote# 3415-53). Se les permitio a las celulas adherirse durante dos horas antes de agregar mas medio de crecimiento para cubrir los supercontigos. Las celulas se cultivaron en los supercontigos durante la noche. Tambien se incubaron en el medio celulas sin supercontigos.

Se obtuvieron peptidos auto ensamblables RAD16 (3D Matrix, Cambridge, MA bajo un acuerdo de transferencia de materiales) como un 1% (masa / volumen) de solucion esteril en agua, que fue mezclada 1:1 con 1 x 106 celulas en un 10% (masa / volumen) de sacarosa (Sigma, St Louis, MO), 10mM de HEPES en un medio

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modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco) justo antes de usarse. La concentracion final de celulas en el hidrogel RAD16 fue de 1 x 106 celulas por cada 100 pl.

MATERIAL DE PRUEBAS (N=4/Rx)

[0333]

1. Poliglactina no tejida + 1 x 106 de celulas derivadas umbilicales

2. Espuma 35/65 PCL/PGA + 1 x 106 celulas derivadas umbilicales

3. Peptido auto - ensamblable RAD 16 + 1 x 106 celulas derivadas umbilicales

4. Poliglactina no tejida + 1 x 106 celulas derivadas de la placenta

5. Espuma 35/65 pCl/PGA + 1 x 106 celulas derivadas de la placenta

6. Peptidos auto - ensamblable RAD 16 + 1 x 106 celulas derivadas de la placenta

7. Espuma 35/65 PCL/PGA

8. Poliglactina no tejida

Preparacion animal. Los animales fueron manejados y mantenidos de cuerdo a los requerimientos actuales de la ley del bienestar animal. Se cumplio con las leyes publicas que se acaban de mencionar al adherirse a las regulaciones de bienestar animal (9 CFR) y conforme a los estandares promulgados en la Gula para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, 7ma edicion.

Ratones (Mus Musculus) / Fox Chase SCID / masculino (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana), cinco semanas de edad. Todas las personas manejaban los ratones SCID bajo una cubierta. Los ratones fueron pesados individualmente y anestesiados con una inyeccion intraperitoneal con una mezcla de 60 mg por kilogramo de KETASET (clorhidrato de ketamina, Aveco Co., Inc., Fort Dodge, Iowa) y 10 mg por kilogramo de ROMPUN (Xilacina, Mobay Corp., Shawnee, Kansas) y solucion salina. Despues de la induccion de la anestesia, toda la espalda del animal desde el area cervical dorsal hasta el area lumbosacra dorsal se afeitaba removiendo todo el pelo usando maquinas afeitadoras electricas para animal. Despues de eso, esa area era refregada con diacetato de clorhexidina, enjuagado con alcohol, secado, y pintado con una solucion de yodo acuoso de 1% de yodo disponible. Se aplico unguento oftalmico a los ojos para prevenir que se seque el tejido durante el perlodo anestesico.

Tecnica de implantacion subcutanea. Se realizaron cuatro incisiones en la piel, cada una de aproximadamente 1 cm de largo, en el dorso de los ratones. Dos lugares craneales fueron ubicados transversalmente sobre la region toracica lateral dorsal, alrededor de 5 mm de caudal al filo interior palpado de la escapula, con uno a la izquierda y otro a la derecha de la columna vertebral. Otros dos fueron ubicados transversalmente sobre el area del musculo gluteo al nivel lumbar - sacro caudal, alrededor de 5 mm de caudal a la cresta illaca palpada, con uno en cada lado de la llnea media. Los implantes fueron colocados aleatoriamente en estos lugares de acuerdo al diseno experimental. La piel fue separada del tejido conectivo subyacente para hacer un pequeno bolsillo y colocar el implante (o inyectar el RAD16) alrededor de 1 cm de caudal a la incision. El material de pruebas apropiado fue implantado en el espacio subcutaneo. La incision en la piel fue cerrada con broches metalicos.

Alojamiento de los animales. Los ratones fueron albergados individualmente en jaulas micro aislantes mientras duro el estudio a una temperatura que variaba entre 64° F a 79° F y una humedad relativa del 30% al 70%, y se mantenla un ciclo aproximado de 12 horas de luz / 12 horas de oscuridad. La temperatura y humedad relativa fueron mantenidas dentro de los rangos declarados en la mayor medida de lo posible. La dieta consistla de Chow 5058 irradiado para hocico de raton (Purina Co.) y agua fue administrada ad libitum.

Los ratones fueron sacrificados a sus intervalos de diseno con inhalacion de dioxido de carbono. Los lugares de Los implantes subcutaneos con su respectiva piel fueron extirpados y congelados para histologla.

Histologfa. La piel e implantes extirpados fueron fijados con un 10% de formalina tamponada neutral (Richard-Allan Kalamazoo, MI). Muestras con tejidos supra yacentes y adyacentes fueron atravesados, procesados con parafinas, y pegados a la superficie del corte utilizando metodos de rutina. Las realizaciones de tejido de cinco micrones fueron obtenidas por micro tomos y pintadas con hematoxilina y eosina (Poly Scientific Bay Shore, NY) usando metodos de rutina.

Resultados

Hubo un crecimiento interno mlnimo de tejidos en las espumas (sin celulas) implantadas subcutaneamente en los ratones SCID despues de 30 dlas. En contraste, habla bastante tejido lleno en las espumas implantadas con celulas derivadas umbilicales o celulas derivadas de la placenta. Se observo algo de tejido que crecio internamente en los supercontigos no tejidos de poliglaticina. Los supercontigos no tejidos sembrados con celulas derivadas

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umbilicales o de la placenta mostraron una deposicion matricial incrementada y un mayor numero de vasos sangulneos maduros.

Resumen. Se sembraron discos no tejidos / de espuma absorbibles sinteticos (5.0 millmetros de diametro por 1.0 millmetros de grosor) o hidrogel peptido auto - ensamblable ya sea con celulas derivadas umbilicales o de la placenta humanas e implantadas subcutaneamente bilateralmente en la region de la espina dorsal de los ratones SCID. Los resultados demostraron que las celulas derivadas de postparto pueden incrementar dramaticamente la formacion de tejidos de buena calidad en supercontigos biodegradables.

EJEMPLO 17

El uso de celulas derivadas de postparto para la reparation de nervios

Las lesiones de celulas ganglionares de la retina (RGC - Retinal ganglion cell) han sido usadas extensivamente como modelos para varias estrategias de reparation en mamlferos adultos CNS. Se ha demostrado que una division de los axones RGC de roedores adultos resultan en brotes abortivos (Zeng et al., 1995) y muerte progresiva de la poblacion de celulas padre (Villegas-Perez et al., 1993). Muchos estudios han demostrado los efectos simuladores de varios factores exogenos y endogenos en la supervivencia de RGCs donde se corto los axones y su regeneration (Yip y So, 2000; Fischer et al., 2001). Adicionalmente, otros estudios han demostrado que los trasplantes celulares pueden ser utilizados para promover la regeneracion de varios axones de nervios separados (Li et al., 2003; Ramon-Cueto et al., 2000). Por lo tanto, estos y otros estudios han demostrado que la terapia que se basan en celulas puede ser utilizada para el tratamiento de desordenes neurales que afectan la medula espinal, los nervios perifericos, los nervios de los pudendos, nervios opticos u otras enfermedades / traumas debido a lesiones en los que haya ocurrido un dano nervioso.

Se han desarrollado peptidos auto - ensamblables (PuraMatrixTM, patentes de Estados Unidos 5'670.483, 5'955.343, US/PCT aplicaciones US2002/0160471, WO02/062969) para actuar como supercontigos para la adjunta action de celulas A celulas encapsuladas en 3-D, celulas tapadas en coberturas 2-D, o como micro portadores en cultivos de suspension. Los cultivos celulares tridimensionales han requerido ya sea materiales derivados de animales (extracto de sarcoma de raton), con su reproducibilidad inherente y tejidos de serialization celular, o supercontigos sinteticos mucho mas grandes, que no pueden aproximar la escala flsica nanometrica y atributos qulmicos del ECM. RAD 16 (NH2-(RADA)3-COOH) y KLD (NH2-(KLDL)3-COOH) nativos son sintetizados en pequenos (RAD16 es de 5 nanometros) fragmentos de oligopeptidos que se auto ensamblan en nanofibras en una escala similar a la de la matriz extracelular in vivo (ECM) (3D Matrix, Inc Cambridge, MA). El auto ensamblaje es iniciado por cationes mono o divalentes encontrados en el medio de cultivo o el entorno fisiologico. En los protocolos descritos en este ejemplo, se utilizo RAD 16 como un micro portador de los implantes de celulas postparto al defecto ocular. En este ejemplo, se demuestra que los trasplantes de las celulas derivadas de postparto (PPDCs) pueden suministrar eficacia en un modelo de regeneracion axonal del nervio optico de rata adulta.

Metodos y materiales

Celulas. Cultivos de PPDCs (umbilicales y placentarias) de humano adulto y celulas de fibroblastos (pase 10) fueron expandidos durante un pase. Todas las celulas se sembraron inicialmente a 5000 celulas por centlmetro cuadrado en matraces T 75 cubiertos con gelatina en un medio de crecimiento con 100 unidades por mililitro de penicilina, 100 pg por mililitro de estreptomicina, 0.25 microgramos por mililitro de anfotericina B (Invitrogen, Carlsbad, CA). En el pase 11 las celulas fueron tripnizadas y se determino la viabilidad usando tincion de tripano azul. Brevemente, 50 pl de suspension celular fueron combinados con 50 pl de 0.0 4% (masa / volumen) de tripano azul (Sigma, St. Louis MO) y el numero de celulas viables, se estimo usando un hemocitometro. Las celulas fueron lavadas tres veces en un medio suplementario L15 libre de Leibovitz (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las celulas fueron suspendidas entonces a una concentration de 200.000 celulas en 25 pl de RAD-16 (3DM Inc., Cambridge, MA) que fue taponado y hecho isotonico de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Se agrego 100 pl del medio suplementario libre de L-15 de Leibovitz sobre la suspension celular / matricial para mantenerla mojada hasta su uso. Estos cultivos celulares / matriciales fueron mantenidos bajo condiciones atmosfericas estandar hasta que ocurrio el trasplante. En el momento del trasplante el medio que estaba en exceso fue removido.

Animales y cirugfa. Se utilizaron ratas hembras Long Evans (220 - 240 g de peso corporal). Bajo anestesia de tribromoetanol intraperitoneal (20 miligramos / 100 gramos de peso corporal), se expuso el nervio optico, y se hizo una incision en la envoltura optica intraorbitalmente a aproximadamente 2 mm del disco optico, el nervio fue levantado de la envoltura para permitir completar un corte transversal con tijeras finas (Li et al., 2003). La totalidad del corte transversal fue confirmado visualmente al ver la separation completa de los troncos proximal y distal. El grupo de control consistio de ratas lesionadas sin trasplantes. En las ratas con trasplantes se sembraron celulas entre los tocones proximal y distal celulas de postparto cultivadas sembradas en RAD-16 usando un par de micro pinzas. Aproximadamente 75.000 celulas en RAD-16 fueron implantadas en el nervio optico separado. Las celulas / matriz fueron untadas en el corte de separacion usando un par de micropinzas finas. La envoltura dividida del nervio optico fue cerrada con un monofilamento de nylon negro 10/0 (Ethicon, Inc., Edinburgh, UK). Por lo tanto, la apertura

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fue cerrada empatando los extremos proximal y distal del corte del nervio poniendolos en proximidad el uno con el otro.

Despues que se realizaron las inyecciones de celulas, se les inyecto a los animales dexametasona (2 mg por kilogramo) durante 10 dlas despues del trasplante. Durante el estudio, se administro a los animales ciclosporina A oral (210 mg por litro de agua bebida; resultando en una concentracion sangulnea: de 250 a 300 pg por litro) (Bedford Labs, Bedford, Ohio) desde dos dlas antes del trasplante hasta el final del estudio. La comida y el agua estuvieron disponible ad libitum. Los animales fueron sacrificados de 30 a 60 dlas despues del trasplante.

Aplicacion CTB. Tres dlas antes de que los animales fuesen sacrificados, con anestesia, una micro pipeta de vidrio con una punta de 30 a 50 mm fue insertada tangencialmente a traves de la esclera atras de los lentes, y dos porciones de cuatro a 5 pl de una solucion acuosa con 1% de toxina rastreadora de colera retrograda de (CTB - cholera toxin B) (List Biologic, Campbell, CA) se inyecto al vitreo. Los animales fueron perfundidos con fijadores y los nervios opticos fueron recolectados con el mismo fijador durante una hora. Los nervios opticos fueron transferidos a sacarosa durante la noche. Se incubaron realizaciones de criostato de 20 pm en 0.1 molar de glicina durante 30 minutos y se bloqueo en una solucion PBS que contenla 2.5 por ciento de albumina de suero bovino (BSA) (Boeringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y 0.5 por ciento de triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO), seguido de una solucion que contenla anticuerpos de cabra anti - CTB (List Biologic, Campbell, CA) diluidos 1:4000 en un PBS que tenia un 2% de suero de conejo normal (NRS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), un 2.5 por ciento de BSA, y un 2% de triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO) en PBS, incubado en anticuerpos IgG biotinilados de conejo anti cabra (Vector Laboratories, Burlinghame, CA) diluidos 1:200 en un 2% de triton X100 en PBS durante dos horas a la temperatura del cuarto. Esto fue seguido por una tincion en 1:200 de estreptadivina verde (Alexa Flour 438;Molecular Probes - Sondas Moleculares, Eugene, OR) en PBS durante dos horas a la temperatura del cuarto. Las realizaciones pintadas fueron lavadas entonces en PBS y contra tintadas con yoduro de propidio para microscopla confocal

Preparacion histologica. Brevemente, cinco dlas despues de la inyeccion CTB, las ratas fueron perfundidas con un 4% de paraformaldehldo. Se les dio a las ratas 4 cm3 de uretano y despues fueron perfundidas con PBS (0.1 mol) y entonces con un 4% de paraformaldehldo. La medula espinal fue cortada y el hueso fue removido de la cabeza para exponer el collculo. El collculo fue entonces removido y colocado en un 4% de paraformaldehldo. El ojo fue removido al cortar alrededor de la parte exterior del ojo yendo hacia atras lo mas posible. Se tomo cuidado de no cortar el nervio optico que esta en la parte inferior del ojo. El ojo fue removido y los musculos fueron cortados exponiendo el nervio optico el cual fue colocado entonces en un 4% de para formaldehldo.

Resultados

Lesiones individuales. Un mes despues de la segmentacion retrotubular del nervio optico, se identificaron varios axones marcados como CTB en el segmento del nervio junto a la retina. En los 200 micrometres mas cercanos al corte, se observo que axones emitieron varios colaterales en angulos rectos al eje principal y terminaban como un enredo de neuromas en la superficie del corte. En este corte entre los troncos proximos y distales, se observo que el vaclo se conecto progresivamente a un segmento de tejido conectivo vascularizado de 2 - 3 millmetros; sin embargo, no se observo que avance ningun axon en esta area de conexion. Por lo tanto, en los animales que solo recibieron una lesion no se observo que ningun crecimiento axonal alcance el tronco distal.

Transplante RAD-16. Despues del trasplante de RAD-16 al corte, se observo un crecimiento interno de tejido conectivo vascularizado. Sin embargo, no se observo ningun crecimiento axonal entre los troncos proximales y distales. Los resultados demuestran que la aplicacion de RAD-16 por si sola no es suficiente para inducir una regeneracion axonal en esta situacion.

Transplante de celulas derivadas de postparto. El trasplante de celulas derivadas de postparto en nervio optico seccionado estimulo el nuevo crecimiento del nervio optico. Parte del nuevo crecimiento tambien fue observado en condiciones donde celulas fibroblastos fueron implantadas, aun cuando esto fue mlnimo en comparacion con el nuevo crecimiento observado con el trasplante de celulas derivadas de placenta. El nuevo crecimiento de nervio optico fue observado en 4 de 5 de animales trasplantados con celulas derivadas de placenta, 3 de 6 de animales trasplantados con fibroblastos dermales adultos y en 1 de 4 de animales trasplantados con celulas derivadas de cordon umbilical. En las situaciones en las que se observo el nuevo crecimiento, el etiquetado por CTB confirmo la regeneracion de axones en celulas ganglionares de la retina, lo que se demostro al penetrar a traves de la zona de trasplante. Tambien se realizo un proceso de etiquetado por GFAP para determinar el nivel de gliosis. La expresion GFAp se intensifico en el tronco proximal (final de la neurona afectada) observandose cierto nivel de inmunocoloracion a traves del injerto reinervado.

Resumen. Estos resultados demuestran que las celulas humanas adultas derivadas de postparto transplantadas son capaces de estimular y guiar la regeneracion de axones cortados en celulas ganglionares de la retina.

Referencias para Ejemplo 17

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1) Zeng BY, Anderson PN, Campbell G, Lieberman AR. 1995. J. Anat. (Revista de Anatomla) 186:495-508.

2) Villegas-Perez MP, Vidal-Sanz M, Bray GM, Aguayo AJ. 1988. J Neurosci. (Revista de Neurociencia)

8:265-80.

3) Yip HK, So KF. 2000. Prog Retin Eye Res. (Progreso en la Investigacion del Ojo y la Retina), 19: 559-75.

4) Fischer D, Heiduschka P, Thanos S. 2001. Exp Neurol. 172: 257-72.

5) Ramon-Cueto A, Cordero MI, Santos-Benito FF, Avila J. 2000. Neuron (Neurona) 25: 425-35.

EJEMPLO 18

Uso de celulas postparto en el tratamiento de retinitis oiamentaria

Actualmente no existe ningun tratamiento real para desordenes que causen la ceguera que se deriven de la degeneracion en la retina. La perdida de foto receptores es un resultado de apoptosis o degeneracion secundaria que conlleva a una deterioracion progresiva de la vista, y finalmente a la ceguera. Las enfermedades en las que esto ocurre incluyen degeneracion macular relacionada con la edad (AMD - age-related macular degeneration) y retinitis pigmentarla (RP). Se asocia mas comunmente a RP con una mutacion genetica, que contribuye a la muerte celular de los foto receptores.

Los foto receptores de la retina y el epitelio de los pigmentos de la retina adyacentes forman una unidad funcional. El modelo de rata del Royal College of Surgeons (RCS - Universidad Real de Cirujanos) presenta un defecto de la quinasa receptora de tirosina (Merkt) que afecta el segmento exterior de la fagocitosis, lo que conlleva a la muerte celular de los foto receptores. (1). El trasplante de celulas epiteliales del pigmento de la retina (RPE - retinal pigment epitelial) al espacio sub retinal de las ratas RCS limito el progreso de la perdida de fotosreceptores y preservo la funcion visual (2). En este ejemplo, se demuestra que las celulas derivadas de postparto pueden ser utilizadas para promover el rescate de foto receptores y por lo tanto preservarlos en un modelo RCS.

Metodos y Materiales

Trasplantes celulares. Cultivos de celulas umbilicales, placentarias y fibroblastos adultas (pase 10) fueron expandidas durante un pase. Todas las celulas se sembraron inicialmente a 5000 celulas por centlmetro cuadrado en matraces T 75 cubiertos con gelatina en medios de crecimiento. Para pases subsiguientes, todas las celulas fueron tratadas de la siguiente manera. Despues de la tripnizacion, las celulas viables fueron contadas despues de colorearlas con tripano azul. Brevemente, se combinaron 50 pl de suspension celular con 50 pl de 0.04% peso/volumen de tripano azul (Sigma, St. Louis MO) y se estimo el numero de celulas viables usando un hemocitometro. Las celulas fueron tripnizadas y lavadas tres veces en un suplemento gratuito de medio DMEM: de baja glucosa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los cultivos de celulas humanas umbilicales, placentarias y fibroblastos en el pase 11 fueron tripnizadas y lavadas dos veces en un medio L-15 de Leibovitz (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para el procedimiento de trasplante, ratas RCS distroficas fueron anestesiadas con xilacina - ketamina (1 mg por kilogramo i.p. De la siguiente mezcla 2.25 ml de xilacina a 20 mg por mililitro, 5 ml de ketamina a 100 mg por mililitro, y 0.5 mililitros de agua destilada) y sus cabezas aseguradas mediante una barra de nariz. Las celulas desprovistas de suero fueron re - suspendidas (2 X 105 celulas por inyeccion) en 2 pl de Leibovitz, medio L-15 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y trasplantadas usando una pipeta fina de vidrio (diametro en yerno de 75 a 150 micrometros). Las celulas se colocaron en el espacio sub retinal dorso temporal de ratas RCS distrofico - pigmentadas de tres semanas de edad bajo efectos de anestesia (total N = 10/tipo celular).

Las celulas se inyectaron unilateralmente en el ojo derecho, mientras que el ojo izquierdo fue inyectado solo con un medio portador (control falso; medio L-15 de Leibovitz). La viabilidad de las celulas residuales de trasplante se mantuvo sobre el 95% tal como se evaluo por la exclusion de tripano azul al final de la sesion de trasplante. Despues de que se realizaron las inyecciones celulares, se les inyecto a los animales dexametasona (2 mg por kilogramo) durante 10 dlas despues del trasplante. Mientras duro el estudio, se mantuvo a los animales con ciclosporina A oral (210 mg por litro de agua bebida; lo que resulto en una concentracion sangulnea: de 250 a 300 pg por litro) (Bedford Labs, Bedford, Ohio) desde dos dlas antes del trasplante hasta el final del estudio. La comida y el agua estuvieron disponibles ad libitum. Los animales fueron sacrificados despues de 60 o 90 dlas despues de la operacion, siendo algunos animales sacrificados antes para su evaluacion histologica de cambios al corto plazo asociados con el trasplante celular.

Registros ERG. Despues de la adaptation de la oscuridad durante la noche, los animales fueron preparados para los registros ERG bajo una luz leve roja, como se describio previamente (3). Brevemente, bajo anestesia (con una mezcla de 150 miligramos por kilogramo i.p. de ketamina, y 10 mg por kilogramo i.p. de xilacina) la cabeza fue asegurada con un sostenedor estereotaxico de la cabeza y se monitoreo la temperatura del cuerpo por medio de un termometro rectal el cual se mantuvo a 38° C usando una manta homeotermica. Las pupilas se dilataron usando partes iguales 2.5% de Fenilefrina y 1% de tropicamida superficiales. Se utilizo anestesia superficial con 0.75 por ciento de Bupivacalna para prevenir cualquier reflejo corneo y una gota de 0.9 por ciento de sustancia salina se aplicaba frecuentemente a la cornea para prevenir su deshidratacion y permitir un contacto electrico con el electrodo grabador (bucle de alambre dorado). Una aguja medidora de 25 insertada bajo el cuero cabelludo, entre los dos ojos, sirvio como el electrodo de referencia. El sistema UTAS-3000 de LKC Technologies (Gaithersburg, MD)

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suministro la amplificacion (a una frecuencia de 1-1000 Hz, sin filtracion de sonidos), presentacion de estlmuios, y la adquisicion de datos. Los ERGs fueron grabados a los 60 y 90 dlas de edad de los grupos celulares umbilicales y solamente a los 60 dlas de edad de los grupos placentarios y de fibroblastos.

Grabaciones mixtas de ondas a y b. Para la cuantificacion de ondas B grabadas en la oscuridad, grabaciones que consistlan de presentaciones de un destello (con una duracion de 10 ps), repetidos de tres a cinco veces para verificar la confiabilidad de la respuesta y mejorar la tasa de senal - a - sonido, si fuese necesario. Los estlmulos fueron presentados a seis intensidades crecientes en pasos de una unidad logarltmicas que variaban desde - 3.6 hasta 1.4 Candela logarltmica por metro cuadrado en luminancia. Para minimizar el potencial de manchar las varillas la luminancia se elevo de 10 segundos hasta la intensidad mas baja de estlmulo a dos minutos como la intensidad mas alta de estlmulo. La amplitud maxima de la onda B se definio como aquella obtenida de las series de la intensidad del destello, sin importar la intensidad del estlmulo. El verdadero Vmax proveniente del adaptar los datos con una curva Naka - Rushton no fue utilizada porque las respuestas ERG fueron a menudo erraticas a niveles mas altos de luminancia en animales distroficos y mostraron tendencias a respuestas deprimidas alrededor de 0.4 y 1.4 candela logarltmica por metro cuadrado. Para determinar la edad a la cual los componentes ERG fueron obtenidos o perdidos, se utilizaron los criterios de amplitud: 20 microV para bandas a y b, y 10 microV para respuestas similares a STR. La amplitud de la onda b fue medida de un pico negativo de banda a hasta la cima positiva de la banda b, y no hasta el pico de las oscilaciones, que podlan exceder la cima de la onda b (4).

Aislamiento de las respuestas de varillas y de conos. El protocolo de doble destello fue utilizado para determinar el aislamiento de respuestas de varillas y de conos (5). Una sonda de destellos fue presentada un segundo despues de acondicionar el destello, utilizando una caracterlstica especlfica del sistema UTAS-3000 (LKC Technologies) con una calibracion Ganzfeld; que aseguraba una recarga completa del estimulador bajo las condiciones utilizadas. El rol del acondicionamiento del destello en el procedimiento era el saturar momentaneamente a las varillas para que estas no fuesen responsivas al destello de la sonda. Se tomo en cuenta como una respuesta a la sonda de destellos como un reflejo conducido por la actividad del cono. Una onda b manejada por la varilla se obtuvo al sustraer la respuesta manejada por el cono de la respuesta mixta (obtenida despues de la presentacion individual de un destello de la sonda, en otras palabras, aquellas no precedidas por ningun destello de acondicionamiento).

Evaluacion operativa. Las pruebas de la sensibilidad fisiologica de la retina fueron realizadas para demostrar una respuesta de la retina a luces ligeras. Los animales fueron anestesiados con una dosis de recuperacion de uretano a 1.25 gramos por kilogramo i.p. La evaluacion fisiologica en los animales fue probada despues del injerto en animales a los 90 dlas al registrar actividad extracelular de multiples unidades en el collculo superior a la iluminacion de los campos receptores visuales respectivos (6). Este procedimiento se repitio para los 20 puntos independientes (que tenlan un alejamiento de 200 mm, con cada paso correspondiendo aproximadamente a 10 - 150 desplazamientos en el campo visual), cubriendo el campo visual. Los umbrales visuales fueron medidos como el incremento de intensidad en el fondo y cuando se mantenlan a 0.02 candela logarltmica por metro cuadrado (unidad de luminiscencia) [por lo menos 2.6 unidades logarltmicas por debajo de la saturacion de la varilla (7)], requeridos para la activacion de las unidades en los 200 pm superficiales del collculo superior. Los parametros de respuesta fueron comparados entre los ojos trasplantados y los de control que solo recibieron unicamente el transportador.

Histologfa. Los animales fueron sacrificados con una sobredosis de uretano (12.5 gramos por kilogramo). La orientacion del ojo se mantuvo al colocar una estructura 6.0 a traves del musculo recto superior antes de la enucleacion. Despues de hacer una incision en la cornea, los ojos fueron fijados con 2.5 por ciento de paraformaldehldo: 2.5% de glutaraldehldo, 0.01% de acido plcrico y 0.1 M de amortiguador cacodilato (pH 7.4) (Sigma, St. Louis, MO). Despues de la fijacion, la cornea y los lentes fueron removidos al cortar alrededor del cuerpo ciliar. Un corte pequeno se realizo en la periferia de la retina dorsal antes de la remocion del recto superior para asistir a mantener la orientacion. Las retinas fueron pos - fijadas entonces en un 1% de tetroxido de osmio durante una hora. Despues de la deshidratacion por medio de una serie de alcoholes al epoxipropano, las retinas fueron adheridas a una resina de adherencia TAAB (TAAB Laboratories, Aldemarston, UK). Las realizaciones semi delgadas fueron tinturadas con un 1% de toltuidina azul en un 1% de amortiguadora de borato y las realizaciones ultra delgadas fueron contrastadas con un acetato de pura Nilo y un citrato de plomo.

Para tinciones Nissl, las realizaciones fueron tinturadas con un 0.75 por ciento de violeta de cresilo (cresyl violet) (Sigma, St. Louis, MO) despues de lo cual fueron deshidratadas dos veces por medio de alcoholes con un grado de 70, 95 y 100%. Luego fueron colocados en xileno (Sigma, St. Louis, MO), enjuagados con PBS (pH 7.4) (Invitrogen, Carlsbad, CA), cubiertos e implementados con montaje DPX (Sigma, St. Louis, MO).

Resultados

Grabaciones ERG. Los animales que recibieron las inyecciones celulares umbilicales exhibieron una preservacion relativa de las propiedades visuales de respuesta en los 60 y 90 dlas despues de la operacion (Tabla 18 - 1). La respuesta observada en estos animales fue mayor que la vista en los animales tratados con placenta, fibroblastos o sustancia falsa. Los trasplantes de celulas placentarias (n = 4) a 60 dlas no mostraron ninguna mejora

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en ondas a (20 ± 20) vs. los controles falsos (0), pero mostraron algo de mejoras en las ondas mixtas b (81 ± 72) versus los controles falsos (1.5 ± 2), y una buena mejora en las ondas b conicas (50 ± 19) versus los controles falsos (7 ± 7), y la contribucion de varillas (30%) versus los controles falsos (0). Estos resultados indicaron alguna mejora en la respuesta visual cuando se los comparaba con los controles falsos.

Los animales a los que se les trasplanto celulas umbilicales (n = 6) demostraron una buena mejora en todas las medidas probadas de resultados a los 60 dlas (Tabla N5-1), onda a (27 ± 11) versus los controles falsos (0), onda mixta b (117 ± 67) versus los controles falsos (18 ± 13), onda b conica (55 ± 25) versus los controles falsos (28 ± 11), y contribucion de varillas (49 ± 16 %) versus controles falsos (6 ± 7 %). Adicionalmente, a los 90 dlas, respuestas mejoradas fueron medidas en dos animales examinados, con medidas incluyendo: onda a (15 ± 7) versus los controles falsos (0), ondas mixtas b (37 ± 15) versus controles falsos (0), ondas conicas b (16 ± 11) versus controles falsos (7 ± 5), y contribucion de varillas (58 ± 39 %) versus controles falsos (0%). Estos resultados indican que las respuestas visuales fueron mejoradas en los animales a los que se les trasplanto celulas umbilicales con evidencia de preservacion de fotoreceptores en el modelo RCS. Aunque se observo una disminucion de respuesta a ERG en el dla 90, su preservacion de la funcion visual en comparacion con los animales tratados con la sustancia falsa fue buena.

En contraste con las celulas umbilicales o placenta varias, los trasplantes de fibroblastos no mostraron ninguna mejora en los parametros probados, con valores menores o iguales a los animales tratados con la sustancia falsa.

Tabla 18-1: datos ERG

Grupo

Onda - a Onda mixta b Onda conica b % de contribucion de varillas

Sin Tratamiento Con Tratamiento Sin Tratamiento Con Tratamiento Sin Tratamiento Con Tratamiento Sin Tratamiento Con Tratamiento

Falsa 60d

0 0 7 ± 9 0 23 + 5 12 ± 16 N/A N/A

1 (n=4) 60d

0 20 ± 20 1.5 ± 2 81 ± 72 7 ± 7 50 ± 19 N/A 30

3 (n=6) 60d

0 27 ± 11 18 ± 13 117 ± 67 28 ± 11 55 ± 25 6 ± 7 49 ± 16

3 (n=6) 90d

0 15 ± 7 0 37 ± 15 7 ± 5 16 ± 11 0 58 ± 39

N.B. Falsa = control (solamente medio), 1 = trasplante celular placentario, 3 = trasplante celular umbilical

Histologfa. Despues de los trasplantes, no se obtuvo evidencia histologica de una reaccion inflamatoria ni tampoco se observaron celulas inmunologicas que se hayan infiltrado en las realizaciones tinturadas de Nissl en los grupos celulares de postparto. Sin embargo, los implantes de fibroblastos resultaron en muertes de animales (n = 7) y hubieron indicaciones de etapas tempranas de respuestas inflamatorias. Histologicamente en el dla 90 se demostro el rescate anatomico de los fotoreceptores en los animales que se les trasplanto celulas umbilicales. Los fotoreceptores formaron una capa gruesa separada por un vaclo desde la capa nuclear interna, hecha de celulas de la retina. En comparacion, el ancho de la capa exterior en el control de llquido falso fue, en el mejor de los casos, una capa no continua al contrario de un grosor de alrededor de cinco celulas en el ojo injertado. En comparacion a un animal normal esta es marginalmente mas de la mitad del grosor de capas celulares fotoreceptoras que se observan normalmente.

Evaluacion Funcional. Se monitoreo la eficacia de los trasplantes para prevenir la perdida visual al evaluar las respuestas electro fisiologicas en dos animales. El umbral de la respuesta de sensibilidad a la luz fue usado para definir el area del rescate del campo visual en los ojos a los que se les inyecto la sustancia falsa de control vs. los ojos a los que se les trasplanto las celulas umbilicales. En ratas no distroficas, los umbrales visuales nunca excedieron 0.5 candela logarltmica por metro cuadrado sobre el fondo. En ratas distroficas no operadas, los umbrales tienen usualmente una magnitud de 4 unidades de candela logarltmica por metro cuadrado (8). En contraste, en ratas distroficas inyectadas con suero falso que no fueron operadas, los umbrales estuvieron alrededor de 2.9 - 4.9 unidades logarltmicas de candela por metro cuadrado con un umbral promedio de 4.0 unidades logarltmicas de candela por metro cuadrado, en algunos casos no se pudo obtener ningun registro. Por lo tanto, las ratas a las que se les inyecto la sustancia falsa mostraron un rescate funcional altamente localizado en la retina temporal. Sin embargo, a las ratas a las que se les trasplanto el material umbilical humano mostraron, sustancialmente, niveles mas altos de preservacion visual con umbrales que variaban desde 0.8 hasta 2.1 unidades logarltmicas de candela por m cuadrado con un promedio de umbrales de 1.3 unidades logarltmicas de candela por metro cuadrado.

Resumen. El trasplante de celulas umbilicales en ratas RCS distroficas demostro preservar los fotoreceptores. En un menor grado esta respuesta tambien fue vista despues de los trasplantes con las celulas placentarias aunque una mejora en ondas A no fue vista. En este modelo degenerativo, uno esperarla que la onda A desapareciese en los primeros 30 a 60 dlas y que la onda B desaparezca en los primeros tres meses. Por lo tanto, las ondas a retenidas indican que la funcion real y normal de la varilla se preservo. La contribucion de la varilla a las

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   Reivindicaciones

   1. Celulas multipotentes o pluripotentes aisladas del cordon umbilical humano para su uso en el tratamiento de una condition degenerativa ocular en un pacient, donde las celulas se pueden obtener del tejido del cordon umbilical humano sustancialmente libre de sangre y donde las celulas tienen las siguientes caracterlsticas:

   a. potencial de experimentar al menos 40 duplicaciones en cultivo;

   b. union y expansion en un recipiente de cultivo de tejido recubierto o sin recubrir, en donde el recipiente de cultivo de tejido recubierto comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colageno, poliornitina, vitronectina o fibronectina;

   c. production de vimentina y actina del musculo liso alfa;

   d. produccion de cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, HLA-A,B,C, PDGFr-alfa y CD90 como se detectan por citometrla de flujo;

   e. expresion aumentada de genes endogenos que codifican interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X- C) y protelna 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa en relation a la expresion endogena de interleucina 8, reticulon 1, ligando 1 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 3 de quimiocinas (motivo C-X-C); ligando 6 de quimiocinas (motivo C-X-C) y protelna 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa en una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de la medula osea de las crestas illacas, como se caracterizan por matriz de oligonucleotidos;

   f. falta de produccion de CD31, CD34, CD45, CD 117 y CD141 como se detectan por citometrla de flujo;

   g. son capaces de auto-renovarse y expandirse;

   h. crecimiento en alrededor del 5% a alrededor del 20% de oxlgeno;

   i. requieren L-valina para el crecimiento;

   j. carecen de expresion de HLA-DR, HlA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, B7-H2, HLA-G y CD 178 como se detectan por citometrla de flujo;

   k. expresion de PD-L2 como se detecta por citometrla de flujo;

   l. secretion de MCP-1, IL-6, GCP-2, IL-8, TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF y BDNF como se detectan por ELISA;

   m. falta de secrecion de SDF-1 alfa, VEGF, TGF-beta2, ANG2 y PDGFbb como se detectan por ELISA; y

   n. una disminucion en la expresion de los genes siguientes en relacion a una celula humana que es un fibroblasto, una celula madre mesenquimal, o una celula de de la medula osea de las crestas illacas como se ensayan por micromatriz: caja homeotica 2 de la baja estatura; protelna 2 de choque termico de 27 kDa; ligando 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de celulas del estroma); elastina; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); caja homeotica 2 de mesenquima; homologo 1 de caja homeotica de “sine oculis”; cristalina, alfa B; activador de morfogenesis 2 asociado a “dishevelled”; protelna DKFZP586B2420; similar a neuralin 1; tetranectina; dominio tres de homologla con src (SH3) y rico en cistelnas; gen 1 de translocation de linfocitos B, antiproliferativa; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcription 3 relacionado con el enanismo; protelna hipotetica FLJ23191; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador de procolageno C-endopeptidasa; homologo 7 de “frizzled”; gen hipotetico BC008967; colageno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C; protelna de caja homeotica iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoprotelna 2 de veslcula sinaptica; ADNc FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 similar al receptor de citocinas; canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia/baja, subfamilia N, miembro 4; protelna DKFZP586L151; coactivador de la transcripcion con motivo de union a PDZ (TAZ); homologo 2 de caja homeotica de “sine oculis”; protelna KIAA1034; respuesta de crecimiento precoz 3; caja homeotica de “distal less” 5; protelna hipotetica FLJ20373; familia 1 de aldo-ceto reductasas, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; fibronectina 1; proencefalina; integrina, tipo beta 1 (con dominios de repetition similares a EGF); clon de ADNc EUROIMAGE 1968422; EphA3; protelna KIAA0367; receptor de peptido natriuretico C/guanilato ciclasa C (receptor del peptido atrial natriuretico C); protelna hipotetica FLJ14054; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); protelna de membrana asociada a veslcula 5; protelna 1 de la matriz extracelular tipo fibulina que contiene EGF; similar a protelna 3 de interaction con BCL2/adenovirus E1B de 19 kDa; protelna 1 de union a AE; polipeptido 1 de la subunidad VII a de la citocromo c oxidasa (musculo); neuroblastoma, supresion de tumorigenicidad 1; y protelna 2 de union al factor de crecimiento insulinoide, 36 kDa.
2. 2. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en donde la celula mantien un cariotipo normal con los pases.
3. 3. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en donde la condicion degenerativa ocular es una condicion degenerativa ocular aguda.
4. 4. Las celulas para el uso de la reivindicacion 3, en donde la condicion degenerativa ocular aguda es un trauma cerebral, trauma del nervio optico o lesion ocular.
5. 5. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en donde la condicion degenerativa ocular es una condicion degenerativa o cronica.

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6. 6. Las celulas para el uso de la reivindicacion 5, en donde la condicion degenerativa ocular cronica o progresiva es degeneracion macular, retinitis pigmentosa, retinopatia diabetica, glaucoma o deficiencia de celulas epiteliales limbares.
7. 7. Las celulas para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las celulas se pueden obtener por digestion enzimatica de tejido del cordon umbilical humano sustancialmente libre de sangre con colagenasa, dispasa y hialuronidasa.
8. 8. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en donde el tratamiento comprende administrar las celulas con al menos otro tipo de celula.
9. 9. Las celulas para el uso de la reivindicacion 8, en donde el otro tipo de celula es un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitora neuronal, celula madre neural, celula madre epitelial de la retina, celula madre epitelial de la cornea, u otro tipo de celula madre multipotente.
10. 10. Las celulas para el uso de la reivindicacion 8, en donde el tratamiento comprende administrar las celulas con al menos otro tipo de celulas simultaneamente con, o antes, o despues de las celulas.
11. 11. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en donde el tratamiento comprende administrar las celulas con al menos otro agente.
12. 12. Las celulas para el uso de la reivindicacion 11, en donde el tratamiento comprende adeministrar las celulas con al menos otro agente simultaneamente con, o antes, o despues de las celulas.
13. 13. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en donde el tratamiento comprende adminsitrar las celulas al interior de un ojo.
14. 14. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en donde el tratamiento comprende administrar las celulas a traves de una canula o desde un dispositivo implantado en el cuerpo del paciente dentro o en proximidad del ojo.
15. 15. Las celulas para el uso de la reivindicacion 13, en donde el tratamiento comprende administrar las celulas por implantacion de una matriz o supercontigo que contiene las celulas.
16. 16. El uso de las celulas como se expone en la reivindicacion 1 en la fabricacion de un medicamento para tratar una condicion degenerativa ocular en un paciente.
17. 17. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de una condicion degenerativa ocular, que comprende un portador farmaceuticamente aceptable y una cantidad efectiva para tratar la condicion degenerativa ocular de celulas multipotentes o pluripotentes de acuerdo con la reivindicacion 1.
18. 18. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 17, en donde la condicion degenerativa ocular es una condicion degenerativa ocular aguda.
19. 19. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 17, en donde la condicion degenerativa ocular es una condicion degenerativa cronica o progresiva.
20. 20. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 19, en donde dicha condicion degenerativa ocular es trauma cerebral, trauma del nervio optico, lesion ocular, degeneracion macular, retinitis pigmentosa, retinopatia diabetica, glaucoma o deficiencia de celulas epiteliales limbares.
21. 21. La composicion farmaceutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que comprende al menos otro tipo de celula.
22. 22. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 21, en donde el otro tipo de celula es un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitora neuronal, celula madre neural, celula madre epitelial de la retina, celula madre epitelial de la cornea, u otro tipo de celula madre multipotente.
23. 23. La composicion farmaceutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que comprende al menos otro agente.
24. 24. La composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 23, en donde el otro agente es un farmaco para tratar el trastorno degenerativo ocular.
25. 25. La composicion farmaceutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, formulada para su administracion al interior de un ojo.

    5

    10

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    55

    60

    65
26. 26. La composicion farmaceutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, formulada como una matriz o supercontigo que contiene las celulas.