CN115068438B - 破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用 - Google Patents

破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用，本发明解决了现有材料无法选择性抑制破骨细胞谱系中特定细胞阶段的技术难点。本发明所述方法采用对破骨前体细胞低渗裂解及匀浆处理得到破骨前体细胞膜，再挤压纳米化后获得破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡。本发明的细胞膜纳米囊泡含有破骨前体细胞膜表面的蛋白，具有靶向识别及融合能力，赋予靶向破骨前体细胞的功能。本发明首次提出了一种多核细胞分化谱系中特定分化阶段的细胞膜纳米囊泡，其制备工艺简单，且具有稳定性好，生物相容性好及免疫原性低的特点，说明有利于推广到各类多核细胞的特定分化阶段细胞膜纳米材料用于对应细胞分化谱系的制备领域。

Description

破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物材料及其应用，具体涉及一种破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用。
背景技术
细胞过度多核化激活是各种疾病病理过程中重要的因素，包括溶骨性疾病，慢性感染中的肉芽组织破坏，多核巨细胞的过度炎症反应等。骨质疏松症是临床常见慢性骨骼疾病，其低骨量和严重的骨微组织结构破坏特点，往往会增加骨骼的脆性和易断裂性。作为独特的骨吸收细胞，成熟的多核破骨细胞由于其高转录活性，分泌大量酶和酸发挥骨吸收的功能。然而，破骨细胞的过度多核化会导致骨稳态失衡，从而是引起骨质疏松症的主要因素。目前，对溶骨性疾病的一线治疗，如双膦酸盐，其不加选择地抑制破骨细胞谱系，导致所有骨吸收细胞凋亡，从而破坏必要的骨转换。因此，亟需开发一种材料来选择性靶向破骨细胞谱系中疾病相关特定阶段的破骨前体细胞。
细胞膜工程化技术已广泛应用于从药物输送、成像到光活化治疗等各种领域。用细胞膜伪装的仿生纳米粒子赋予了类似细胞的功能，从而延长了纳米颗粒在血液中的循环，使它们能够逃脱免疫系统的清除。此外，在癌症治疗中，由于它们从细胞中继承了必要的融合蛋白和粘附分子，癌细胞膜包被的纳米颗粒可以特异性地靶向同源细胞。因此，这些细胞膜材料的同型靶向递送是未来疾病治疗的可用策略。
然而，尽管细胞膜工程化技术已用于各个领域，但尚未实现在细胞多核化过程中具有特定阶段细胞的选择性靶向递送。破骨前体细胞源自RANKL诱导3天的巨噬细胞，具有参与破骨细胞循环、募集、细胞间识别和融合的特定蛋白质，参与迁移和靶向的蛋白质，如CXCR4、CDC42和RAC2，融合相关蛋白质如CD44和OSCAR。因此，具有特定阶段标记蛋白的细胞膜有助于破骨前体细胞的选择性靶向递送的作用。
本发明中破骨前体细胞膜纳米囊泡，可特异性靶向破骨前体细胞。目前没有这种破骨前体细胞膜材料制备方法及应用的报道。
发明内容
本发明是为了解决现有材料不具有高效、特异靶向破骨细胞谱系中特定阶段细胞的技术问题，提供一种具有靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡及其应用。
为此，本发明提供一种靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡，其制备方法如下：
(1)提取哺乳动物单核细胞，15～30ng/mL M-CSF诱导3-5天得到巨噬细胞，再用30～80ng/mL RANKL诱导3天，获得破骨前体细胞；
(2)洗涤，胰酶消化后，用4℃的TM缓冲液重悬，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mMTris加水混合，并将PH调至7.4；重悬后利用微型注射器挤出30～40次以破坏细胞，得到细胞匀浆；
(3)加入1M蔗糖与细胞匀浆混合，达到0.25M蔗糖终浓度；
(4)将所述步骤(3)中得到的混合物4℃、2000xg条件下离心10min，收集上清液，4℃、3000xg条件下离心30～35min，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30～35min，得到细胞膜；
(5)将得到的细胞膜用Avanti mini挤出器挤过聚碳酸酯滤膜5～10次，获得可靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡。
作为优选，所述的哺乳动物单核细胞为6～8周C57BL/6J小鼠胫骨及股骨单核细胞。
作为优选，所述的胰酶消化后，具体为胰酶消化3～5min后，终止消化并1000rpm，5min离心。
作为优选，所述的微型注射器为1ml胰岛素注射器。
作为优选，所述的聚碳酸酯的孔径为100～400nm，进一步优选为100～200nm。
作为优选，所述的M-CSF浓度为25ng/mL。
作为优选，RANKL浓度为50ng/mL。
破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡在体内外靶向破骨细胞谱系中破骨前体细胞的应用。
本发明的有益效果：
本发明的破骨前体细胞膜纳米囊泡材料相比现有骨质疏松药物治疗，本发明显著的进步在于：
1)以破骨前体细胞为原材料，提取的破骨前体细胞膜纳米囊泡具有稳定性好，生物相容性好和免疫原性低的特点，为靶向破骨前体细胞提供了一种有效手段。
2)破骨前体细胞膜纳米囊泡材料能够保留破骨前体细胞中靶向识别及融合等相关蛋白，具有明显的体内外破骨前体细胞靶向作用，解决了传统药物无选择性破坏破骨细胞谱系问题，从而具有成为骨质疏松治疗的一种高效靶向纳米递送系统前景。
3)本发明的细胞膜纳米递送材料的制备方法操作简单，不会对环境造成污染，安全性好，作为一种高效低毒且具有靶向作用的纳米级递送材料，有望大规模应用于研究和治疗领域。
4)本发明提供的一种多核细胞特定分化阶段的细胞膜纳米材料用于靶向该细胞谱系中特定分化阶段的细胞，为各类多核细胞的药物递送提供研究新思路。
附图说明
图1是破骨前体细胞膜的Western Blot鉴定图。
图2是提取的破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡冷冻电镜及粒径分布图。
图3是通过GO富集分析对比破骨前体细胞膜和巨噬细胞膜蛋白质组学特征。
图4是破骨前体细胞膜纳米囊泡与破骨前体细胞融合的激光共聚焦共定位结果图。
图5是破骨前体细胞膜纳米囊泡在小鼠活体成像实验各组织荧光分布及统计图。
图6是破骨前体细胞膜纳米囊泡在小鼠的股骨组织内与破骨细胞谱系激光共聚焦荧光共定位图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明提供的一种破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡材料及其制备方法进行进一步描述，但是不能把以下实施例视为对本发明保护范围的限定。
本发明是为了解决现有药物的非特异性破骨细胞谱系靶向问题，提供了一种破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡的制备方法和应用。
实施例1破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡的制备
破骨前体细胞的收集：取6～8周C57BL/6J老鼠股骨和胫骨，用α-MEM+10％FBS+1％青霉素G和链霉素(完全α-MEM培养基)冲洗骨髓腔，将冲洗后的细胞在含25ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基中培养5天，期间换液一次，获得巨噬细胞。将所得巨噬细胞在含25ng/mLM-CSF及50ng/mL RANKL的完全α-MEM培养基中培养3天得到破骨前体细胞。
破骨前体细胞膜的制备：将破骨前体细胞洗涤，胰酶消化3min后，终止消化并1000rpm，5min离心；重悬在4℃的TM缓冲溶液中，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4。重悬后通过1ml胰岛素注射器挤出30次以破坏细胞。随后将细胞匀浆与1M蔗糖混合，使达到0.25M的蔗糖浓度，并将混合物在4℃，2000xg下离心10分钟。收集所得上清液，再以4℃，3000xg进一步离心30分钟，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30min，得到细胞膜。
破骨前体细胞膜纳米囊泡的制备：将获得的细胞膜挤过200nm的聚碳酸酯滤膜，反复挤压5次得到破骨前体细胞膜纳米囊泡。
实施例2破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡的制备
破骨前体细胞的收集：取6～8周C57BL/6J老鼠股骨和胫骨，用α-MEM+10％FBS+1％青霉素G和链霉素(完全α-MEM培养基)冲洗骨髓腔，将冲洗后的细胞在含25ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基中培养5天，期间换液一次，获得巨噬细胞。将所得巨噬细胞在含25ng/mLM-CSF及50ng/mL RANKL的完全α-MEM培养基中培养3天得到破骨前体细胞。
破骨前体细胞膜的制备：将破骨前体细胞洗涤，胰酶消化5min后，终止消化并1000rpm，5min离心；重悬在4℃的TM缓冲溶液中，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4。重悬后通过1ml胰岛素注射器挤出30次以破坏细胞。随后将细胞匀浆与1M蔗糖混合，使达到0.25M的蔗糖浓度，并将混合物在4℃，2000xg下离心10分钟。收集所得上清液，再以4℃，3000xg进一步离心30分钟，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30min，得到细胞膜。
破骨前体细胞膜纳米囊泡的制备：将获得的细胞膜挤过200nm的聚碳酸酯滤膜，反复挤压10次得到破骨前体细胞膜纳米囊泡。
实施例3破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡的制备
破骨前体细胞的收集：取6～8周C57BL/6J老鼠股骨和胫骨，用α-MEM+10％FBS+1％青霉素G和链霉素(完全α-MEM培养基)冲洗骨髓腔，将冲洗后的细胞在含25ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基中培养5天，期间换液一次，获得巨噬细胞。将所得巨噬细胞在含25ng/mLM-CSF及50ng/mL RANKL的完全α-MEM培养基中培养3天得到破骨前体细胞。
破骨前体细胞膜的制备：将破骨前体细胞洗涤、胰酶消化离心后，重悬在4℃的TM缓冲溶液中，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4。重悬后通过1ml胰岛素注射器挤出40次以破坏细胞。随后将细胞匀浆与1M蔗糖混合，使达到0.25M的蔗糖浓度，并将混合物在4℃，2000xg下离心10分钟。收集所得上清液，再以4℃，3000xg进一步离心30分钟，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30min，得到细胞膜。
破骨前体细胞膜纳米囊泡的制备：将获得的细胞膜挤过200nm的聚碳酸酯滤膜，反复挤压5次得到破骨前体细胞膜纳米囊泡。
实施例4破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡的制备
破骨前体细胞的收集：取6～8周C57BL/6J老鼠股骨和胫骨，用α-MEM+10％FBS+1％青霉素G和链霉素(完全α-MEM培养基)冲洗骨髓腔，将冲洗后的细胞在含25ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基中培养5天，期间换液一次，获得巨噬细胞。将所得巨噬细胞在含25ng/mLM-CSF及50ng/mL RANKL的完全α-MEM培养基中培养3天得到破骨前体细胞。
破骨前体细胞膜的制备：将破骨前体细胞洗涤、胰酶消化离心后，重悬在4℃的TM缓冲溶液中，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4。重悬后通过1ml胰岛素注射器挤出40次以破坏细胞。随后将细胞匀浆与1M蔗糖混合，使达到0.25M的蔗糖浓度，并将混合物在4℃，2000xg下离心10分钟。收集所得上清液，再以4℃，3000xg进一步离心30分钟，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30min，得到细胞膜。
破骨前体细胞膜纳米囊泡的制备：将获得的细胞膜挤过200nm的聚碳酸酯滤膜，反复挤压10次得到破骨前体细胞膜纳米囊泡。
实施例5破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡的制备
破骨前体细胞的收集：取6～8周C57BL/6J老鼠股骨和胫骨，用α-MEM+10％FBS+1％青霉素G和链霉素(完全α-MEM培养基)冲洗骨髓腔，将冲洗后的细胞在含15ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基中培养3天，期间换液一次，获得巨噬细胞。将所得巨噬细胞在含15ng/mLM-CSF及30ng/mL RANKL的完全α-MEM培养基中培养4天得到破骨前体细胞。
破骨前体细胞膜的制备：将破骨前体细胞洗涤，胰酶消化3min后，终止消化并1000rpm，5min离心；重悬在4℃的TM缓冲溶液中，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4。重悬后通过1ml胰岛素注射器挤出30次以破坏细胞。随后将细胞匀浆与1M蔗糖混合，使达到0.25M的蔗糖浓度，并将混合物在4℃，2000xg下离心10分钟。收集所得上清液，再以4℃，3000xg进一步离心30分钟，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30min，得到细胞膜。
破骨前体细胞膜纳米囊泡的制备：将获得的细胞膜挤过100nm的聚碳酸酯滤膜，反复挤压5次得到破骨前体细胞膜纳米囊泡。
实施例6破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡的制备
破骨前体细胞的收集：取6～8周C57BL/6J老鼠股骨和胫骨，用α-MEM+10％FBS+1％青霉素G和链霉素(完全α-MEM培养基)冲洗骨髓腔，将冲洗后的细胞在含30ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基中培养4天，期间换液一次，获得巨噬细胞。将所得巨噬细胞在含30ng/mLM-CSF及80ng/mL RANKL的完全α-MEM培养基中培养5天得到破骨前体细胞。
破骨前体细胞膜的制备：将破骨前体细胞洗涤，胰酶消化3min后，终止消化并1000rpm，5min离心；重悬在4℃的TM缓冲溶液中，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4。重悬后通过1ml胰岛素注射器挤出30次以破坏细胞。随后将细胞匀浆与1M蔗糖混合，使达到0.25M的蔗糖浓度，并将混合物在4℃，2000xg下离心10分钟。收集所得上清液，再以4℃，3000xg进一步离心30分钟，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30min，得到细胞膜。
破骨前体细胞膜纳米囊泡的制备：将获得的细胞膜挤过100nm的聚碳酸酯滤膜，反复挤压5次得到破骨前体细胞膜纳米囊泡。
上述方法制备的破骨前体细胞膜纳米囊泡在制备基于细胞膜纳米囊泡破骨细胞谱系靶向药物中的应用，本发明中提取破骨前体细胞膜，制成破骨前体细胞膜纳米囊泡递送系统。本发明制备方法稳定可行，原材料制备简单。经体内外实验表明，制得的破骨前体细胞膜纳米囊泡可特异靶向破骨前体细胞，同时具有稳定性好，免疫原性低的特点，为临床骨质疏松治疗提供新策略，有关试验资料如下：
试验例1破骨前体细胞膜提取验证分析
如实施例1得到破骨前体细胞膜纳米囊泡，通过Western Blot检测，如图1所示，破骨前体细胞膜纳米囊泡对比细胞质和全细胞裂解溶液，破骨前体细胞膜纳米囊泡组含有膜蛋白Na-K-Atpase，而不含有胞质蛋白GAPDH，证明成功分离提取了破骨前体细胞的细胞膜。
试验例2破骨前体细胞膜纳米囊泡粒径电位及冷冻透射电镜测定试验
如实施例1得到破骨前体细胞膜纳米囊泡，将本实施例制备的破骨前体细胞膜纳米囊泡进行冷冻投射电镜检测，激光粒径仪进行粒径检测，如图2所示，提示破骨前体细胞膜纳米囊泡为球形结构的脂质双分子层。且破骨前体细胞膜纳米囊泡的粒径大约在141.9nm左右，电位大约在-26.2mV。
试验例3：破骨前体细胞膜蛋白质组学分析
如实施例1得到破骨前体细胞膜纳米囊泡，图3是与用相同方法制备的巨噬细胞膜进行蛋白质组学对比，A和B图利用GO富集分析表示破骨前体细胞膜与巨噬细胞膜在细胞黏附、识别及破骨分化蛋白上的功能不同，破骨前体细胞膜纳米囊泡具有表达更高的细胞间黏附识别能力，且破骨分化指标更高。C和D图表示关于功能方面，参与迁移和靶向的蛋白质，如CXCR4、CDC42和RAC2，在破骨前体细胞膜纳米囊泡中明显高表达，融合相关蛋白质如CD44和OSCAR也是如此。表明破骨前体细胞膜纳米囊泡具有破骨细胞谱系靶向的潜能。
试验例4：破骨前体细胞膜纳米囊泡体外靶向融合能力评估
将实施例1得到的破骨前体细胞膜纳米囊泡用DiI在37℃标记15分钟。在10,000xg下离心5分钟以分离DiI标记的破骨前体细胞膜纳米囊泡，用PBS洗涤两次，并以1mg/mL重新悬浮在PBS中备用。按上述细胞培养方法在玻璃底培养皿中以每皿50,000个细胞的密度培养破骨前体细胞。破骨前体细胞用DiO在37℃标记15分钟。用PBS洗涤两次。然后，将DiI标记的破骨前体细胞膜纳米囊泡溶液加到培养基中，并将混合物37℃孵育1小时。孵育完毕后，用PBS洗涤2次，再用hoechst33342，37℃孵育15分钟染色细胞核，用激光共聚焦拍摄共定位结果图。如图4所示，破骨前体细胞膜纳米囊泡以膜融合的方式成功与破骨前体细胞结合。
试验例5：骨前体细胞膜纳米囊泡体内靶向能力评估
建立小鼠骨质疏松动物模型：取C57BL/6J小鼠(雌性，11周)在4％水合氯醛麻醉，皮肤消毒后进行双侧卵巢切除术诱导骨质疏松。8周后microCT检测骨量指标减少提示造模成功。
骨前体细胞膜纳米囊泡体内靶向能力检测：如实施例1所得破骨前体细胞膜1mg/mL，与吲哚菁绿(ICG)2.5mg/mL等体积混合，超声处理5分钟，然后依次挤过400nm和200nm的聚碳酸酯滤膜5-10次。单纯ICG以及巨噬细胞膜组为对照组。骨质疏松小鼠造模成功后，将破骨前体细胞膜包裹的ICG予尾静脉注射，在6小时，1天，3天后，用小动物活体成像仪检测心肝脾肾，双下肢及脊柱的荧光强度，采用激发波长710nm，发射波长为785nm。结果如图5所示，在各个时间段，小鼠的双下肢和脊柱荧光强度，破骨前体细胞膜组均明显高于对照组，提示破骨前体细胞膜纳米囊泡具有体内靶向的作用。
进一步验证体内靶向能力，将破骨前体细胞膜纳米囊泡用上述方法标记DiO，将DiO标记的破骨前体细胞膜纳米囊泡予尾静脉注射骨质疏松小鼠模型，1天后取股骨组织，4％多聚甲醛固定，14％EDTA，37℃，脱钙12小时后石蜡包埋。切片后予DC-STAMP(标记破骨前体细胞)一抗4℃孵育过夜，PBST洗4次，每次5分钟，然后用Alexa Fluor 594二抗染色，PBST洗4次，每次5分钟，含DAPI的抗荧光猝灭剂封片，用激光共聚焦拍摄结果图。如图6所示，在骨表面和骨髓中，绿色斑点(DiO)与红色斑点(DC-STAMP)重叠，提示破骨前体细胞膜纳米囊泡的破骨前体细胞靶向。
由上述实施例可知，本发明提供的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡材料制备方法，操作简便，成本低等特点。该材料可以主动特异性靶向破骨细胞谱系中破骨前体细胞，有针对破骨细胞谱系中不同阶段细胞特点进行精准靶向给药的治疗前景。是一种很有潜力的细胞膜靶向材料。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法，其特征在于,该方法具体包括以下步骤：
(1)提取哺乳动物胫骨及股骨单核细胞，15～30ng/mL M-CSF诱导3-5天得到巨噬细胞，再用30～80ng/mL RANKL诱导3-5天，获得破骨前体细胞；
(2)洗涤，胰酶消化后，用4℃的TM缓冲液重悬，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4；重悬后利用微型注射器挤出30～40次以破坏细胞，得到细胞匀浆；
(3)加入1M蔗糖与细胞匀浆混合，达到0.25M蔗糖终浓度；
(4)将所述步骤(3)中得到的混合物4℃、2000xg条件下离心10min，收集上清液，4℃、3000xg条件下离心30～35min，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30～35min，得到细胞膜；
(5)将得到的细胞膜用挤出器依次挤过400nm及200nm聚碳酸酯滤膜5～10次，获得可靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡。
2.根据权利要求1所述的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法，其特征在于：所述的哺乳动物胫骨及股骨单核细胞为6～8周C57BL/6J小鼠胫骨及股骨单核细胞。
3.根据权利要求1所述的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法，其特征在于：所述的胰酶消化后，具体为胰酶消化3～5min后，终止消化并1000rpm，5min离心。
4.根据权利要求1所述的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法，其特征在于：所述的微型注射器为1ml胰岛素注射器。
5.根据权利要求1所述的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法，其特征在于：所述的挤出器为Avanti mini。
6.根据权利要求1所述的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法，其特征在于：所述的M-CSF浓度为25ng/mL。
7.根据权利要求1所述的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法，其特征在于：RANKL浓度为50ng/mL。
8.破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡在制备靶向纳米递送系统中的应用，其特征在于：根据权利要求1～7任一所述的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法制备得到的破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡在体内外靶向破骨细胞谱系中破骨前体细胞的应用。
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