CN115960838A - 一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及外泌体制备技术领域,公开了一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用。该内外工程化外泌体为CRV‑293T外泌体负载NLS‑PBAE/dCas9‑KRAB‑sgPI3Kγ;所述CRV‑293T外泌体通过修饰M2型肿瘤相关细胞靶向肽CRV到HEK 293T细胞中离心获得。(1)本发明利用基因工程的方法使内外工程化外泌体修饰M2型TAM靶向肽CRV,从而提高内外工程化外泌体靶向M2型TAM的能力。(2)本发明以NLS‑PBAE作为内外工程化外泌体的内核,从而提高了内外工程化外泌体的负载效率,NLE‑PBAE携带dCas9‑KRAB‑sgPI3Kγ进入细胞核,从而提高转染效率,进一步提高PI3Kγ抑制效率,从而使M2型TAM表观重编程为M1型TAM,进而有效抑制肿瘤生长。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体制备技术领域,具体涉及一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用。
背景技术
近年来,肿瘤免疫微环境中的肿瘤相关巨噬细胞逐渐成为癌症治疗的新靶标。肿瘤免疫微环境是指肿瘤细胞的周围微环境,包括免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性抑制细胞、及细胞外成分,其中肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages,TAM)约占50%,与肿瘤进展密切相关。小鼠模型研究发现TAM由卵黄囊和脾脏的巨噬细胞在趋化因子作用下募集到肿瘤部位形成的。且在不同因子的刺激下可极化成即M1(经典活化的巨噬细胞)和M2型(交替活化的巨噬细胞)。干扰素γ、脂多糖、TNFα等可诱导M1型巨噬细胞高表达iNOS、CD80等,产生多种一氧化氮、活性氧等杀伤分子,调节并促进Th1型细胞免疫应答,有效清除肿瘤细胞。肿瘤微环境中的其他细胞分泌的CSF-1、IL1β、IL4、IL10等促进巨噬细胞M2型极化。M2型TAM促进肿瘤生长、浸润、侵袭迁移、血管形成,抑制抗肿瘤免疫反应,促进肿瘤恶化。在肿瘤早期M1型TAM比较多,随着肿瘤的进程逐渐以M2型为主。
目前成簇的规律间隔性短回文重复序列(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats,CRISPR)干扰是有效选择性抑制基因表达的方法,其主要通过CRISPR/dCas9系统实现。CRISPR/dCas9系统主要由single guide RNA(sgRNA)及dCas9两部分组成,dCas9在sgRNA的引导下特异性的结合到目的位点,与靶位点结合干扰转录酶的结合,在表观遗传方面抑制基因转录。但CRISPR/dCas9系统自身体系庞大、细胞内化效率低、且极易被生理环境中的各种酶降解而失效,无法直接进入细胞,需要有效的基因载体。而外泌体是直径为40-160nm的具有脂质双层结构的细胞外囊泡,主要由蛋白质和脂质组成。与其他基因递送系统相比,外泌体有着以下优点。首先,外泌体是多功能载体,可以包裹并递送siRNA、mRNA和蛋白质等多种生物药物。其次,外泌体具有生物相容性,体内消除慢,在达到靶部位后可存留较长一段时间。另外外泌体有增强内吞作用的跨膜蛋白和脂锚定蛋白,更易被靶细胞摄取。再者,一个重要原因是外泌体的改造性强。然而,天然外泌体对于分子量较大的CRISPR-dCas9系统负载效率低,远远达不到负载要求。因此需要对外泌体进行人工改造得到人工外泌体,将M2型肿瘤相关巨噬细胞高效重编程为M1型肿瘤相关巨噬细胞,从而激活其免疫治疗效应,以期为非小细胞肺癌的治疗提供帮助。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用。
本发明的第一方面提供一种内外工程化外泌体。
具体的,所述内外工程化外泌体为CRV-293T外泌体负载NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(NPC);所述CRV-293T外泌体通过修饰M2型肿瘤相关细胞(M2型TAM)靶向肽CRV到HEK-293T细胞中离心获得。
优选的,所述内外工程化外泌体的粒径为80-150nm。
本发明的第二方面提供一种内外工程化外泌体的制备方法。
具体的,所述方法包括以下步骤:
(1)将Lamp2b-CRV质粒和PX458-AAVS1质粒混合转染HEK 293T细胞,制得CRV-293T细胞;所述Lmp2b-CRV质粒为Lamp2b克隆到载体中,使靶向肽CRV在Lamp2b之后表达;所述靶向肽CRV为CRVLRSGSC;
(2)将所述CRV-293T细胞进行离心,制得CRV-293T外泌体;
(3)将核定位信号与聚β氨基酯混合,制得核定位信号-聚β氨基脂;
(4)将所述核定位信号-聚β氨基脂(NLS-PBAE)与dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒分别稀释后再混合、静置,制得NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ;所述dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒由靶向小鼠PI3Kγ基因座的sgRNA插入载体生成;
(5)将所述CRV-293T外泌体重悬、冷冻、离心,制得CRV-293T外泌体膜;
(6)将所述NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ与所述CRV-293T外泌体膜混合,制得内外工程化外泌体。
PX458-AAVS1质粒购于Addgene plasmid:113194。
优选的,步骤(1)中,所述Lamp2b-CRV质粒和PX458-AAVS1质粒混合的比例为1-10:1。
进一步优选的,步骤(1)中,所述Lamp2b-CRV质粒和PX458-AAVS1质粒混合的比例为1:1。
优选的,步骤(2)中,所述离心为1000-5000g离心5-25min后80000-150000g离心30-100min。
进一步优选的,步骤(2)中,所述离心为2500-3500g离心10-20min后95000-105000g离心60-80min。
优选的,步骤(4)中,所述NLS-PBAE与dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒分别稀释在pH为4-8的缓冲溶液中。
进一步优选的,步骤(4)中,所述NLS-PBAE与dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒分别稀释在pH为5-6的缓冲溶液中。
优选的,所述缓冲溶液为醋酸钠缓冲溶液。
优选的,步骤(4)中,所述NLS-PBAE与dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒稀释后按质量比1-50:1混合;例如1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1。
优选的,步骤(4)中,所述混合的时间为10-60s;所述静置的时间为10-60min。
进一步优选的,步骤(4)中,所述混合的时间为10-35s;所述静置的时间为10-35min。
优选的,步骤(5)中,提取所述CRV-293T外泌体膜(CRV-EM),将获得的CRV-293T外泌体沉淀重悬于含有1毫摩尔/升苯甲基磺酰氟的膜和胞质溶胶蛋白提取试剂盒试剂A。在冰浴中孵育15分钟后,将混合物冻融5个循环。将混合物在4C以14000g的速度离心30分钟。CRV-293T外泌体膜(CRV-EM)使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒进行量化,并储存在-80C。
优选的,步骤(6)中,所述NPC与CRV-EM按质量比1:0.1-10混合;例如1:0.1、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10。
本发明的第三方面提供一种内外工程化外泌体在重塑肿瘤微环境的应用。
具体的,内外工程化外泌体能选择性地靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞,并进入细胞核内,有效降低P3IKγ表达,将M2型肿瘤相关巨噬细胞表观重编程为M1型肿瘤相关巨噬细胞,从而重塑肿瘤微环境,激活抗肿瘤免疫反应,有效抑制肿瘤生长。
相对于现有技术,本发明的有益效果如下:
(1)本发明利用基因工程的方法使内外工程化外泌体修饰M2型TAM靶向肽CRV,使外泌体膜过表达CRVLRSGSC,CRVLRSGSC(CRV)作为M2型TAM靶向肽,可与M2型TAM高表达的类视黄醇X受体β结合。从而提高内外工程化外泌体靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞的能力,更多靶向肿瘤微环境中的M2型TAM。
(2)本发明以NLS-PBAE作为内外工程化外泌体的内核,NLS-PBAE通过正负电吸附压缩dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒,从而提高了内外工程化外泌体的负载效率。在NLS介导下,NLS-PBAE携带dCas9-KRAB-sgPI3Kγ进入细胞核,从而提高转染效率,进一步提高PI3Kγ抑制效率,从而使M2型TAM表观重编程为M1型TAM,进而激活抗肿瘤免疫反应,有效抑制肿瘤生长。
附图说明
图1为CRV-293T外泌体形貌粒径结果图;
图2为不同NLS-PBAE与pDNA质量比制备的NPC粒径及电势变化图;
图3为不同CRV-EM与NPC质量比制备的I3E粒径及电势变化图;
图4为NPC粒径结果图;
图5为I3E粒径结果图;
图6为纳米颗粒稳定性结果图;
图7为考马斯亮蓝染色图;
图8为内外工程化外泌体的药物释放图;
图9为不同纳米颗粒的摄取结果图;
图10为细胞选择性摄入情况图;
图11为溶酶体逃逸情况结果图;
图12为纳米颗粒表型逆转效果WB验证结果图;
图13为LLC细胞经巨噬细胞培养基上清处理后细胞活力图;
图14为LLC细胞划痕结果图;
图15为划痕愈合率统计图;
图16为肿瘤细胞球活死染色图;
图17为小鼠活体成像不同纳米颗粒的体内分布图;
图18为小鼠肿瘤组织光声成像图;
图19为肿瘤部位48小时荧光强度定量分析图;
图20为小鼠肿瘤体积变化曲线图;
图21为小鼠肿瘤组织拍照图;
图22为小鼠肿瘤TUNEL染色图;
图23为小鼠体重变化曲线图;
图24为各主要内脏器官苏木精-伊红染色图。
图25为肿瘤部位M1和M2 TAM的免疫荧光染色;
图26为肿瘤部位M1和M2 TAM的流式细胞仪分析;
图27为肿瘤部位T淋巴细胞和骨髓来源单核细胞(MDSC)的流式细胞仪分析。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案,现列举以下实施例进行说明。需要指出的是,以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明,均可从常规商业途径得到,或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种内外工程化外泌体及其制备方法。
HEK 293T细胞接种到细胞培养皿,待细胞密度为40-50%时,将培养液换成低血清培养基Opti-MEM。10微升Lamp2b-CRV质粒(浓度1毫克/毫升)和10微升PX458-AAVSI质粒(浓度1毫克/毫升)加到80微升Opti-MEM培养基中,制备0.2毫克/毫升的悬液。40微升Lipofectamine 2000加入到60微升Opti-MEM中,并与100微升质粒悬液混合均匀,静置20分钟后均匀滴加到培养皿,转染6小时后换液,继续孵育48小时。48小时后向培养基中加入嘌呤霉素,使其终浓度为5微克/毫升,每天观察细胞生长状态,两天换一次液,维持嘌呤霉素浓度直至产生细胞克隆,挑单克隆,待细胞长满后将其消化传代,测序验证CRV的敲入情况。敲入CRV并稳定传代的HEK 293T细胞即为CRV-293T。CRV-293T接种至大皿中,收集细胞培养液,4℃3000g离心15分钟后100000g离心70分钟,沉淀即为CRV-293T外泌体。为了提取外泌体膜,将获得的CRV-293T外泌体沉淀重悬于含有1毫摩尔/升苯甲基磺酰氟的膜和胞质溶胶蛋白提取试剂盒试剂A。在冰浴中孵育15分钟后,将混合物冻融5个循环。将混合物在4℃以14000g的速度离心30分钟。CRV-EM使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒进行量化,并储存在-80℃。
WB鉴定外泌体的HSP70、ALIX、DYKDDDDK-tag(Flag-tag)、Lamp2b的表达。
取20毫克PBAE溶于二甲基亚砜中制成100毫克/毫升的母液,取10毫克N-γ-马来酰亚胺基丁酰-氧琥珀酰亚胺酯溶于二甲基亚砜中制成10毫摩尔/升的溶液,将两者混合均匀,室温搅拌反应2小时;将NLS加入到上一步的反应液中,室温搅拌反应2小时得到NLS-PBAE;用截留分子量为3000透析袋透析过夜除去N-γ-马来酰亚胺基丁酰-氧琥珀酰亚胺酯和未结合的NLS。1微升NLS-PBAE(浓度20毫克/毫升)与1微升dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(浓度1毫克/毫升)质粒分别稀释在50微升的pH5.2的醋酸钠缓冲溶液中,按质量比20:1混合涡旋30秒,室温静置30分钟得到NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(NPC,质粒浓度0.01毫克/毫升)。上述100微升NPC溶液与5.77微升CRV-EM(浓度6.93毫克/毫升)按质量比1:2混合涡旋30秒,室温静置30分钟得到CRV-EM/NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(internally andexternally engineered exosomes,I3E,内外工程化外泌体)。
实施例2
一种内外工程化外泌体及其制备方法。
HEK 293T细胞接种到细胞培养皿,待细胞密度为40-50%时,将培养液换成低血清培养基Opti-MEM。10微升Lamp2b-CRV质粒(浓度1毫克/毫升)和10微升PX458-AAVSI质粒(浓度1毫克/毫升)加到80微升Opti-MEM培养基中,制备0.2毫克/毫升的悬液。40微升Lipofectamine 2000加入到60微升Opti-MEM中,并与100微升质粒悬液混合均匀,静置20分钟后均匀滴加到培养皿,转染6小时后换液,继续孵育48小时。48小时后向培养基中加入嘌呤霉素,使其终浓度为5微克/毫升,每天观察细胞生长状态,两天换一次液,维持嘌呤霉素浓度直至产生细胞克隆,挑单克隆,待细胞长满后将其消化传代,测序验证CRV的敲入情况。敲入CRV并稳定传代的HEK 293T细胞即为CRV-293T。CRV-293T接种至大皿中,收集细胞培养液,4℃3000g离心15分钟后100000g离心70分钟,沉淀即为CRV-293T外泌体。为了提取外泌体膜,将获得的CRV-293T外泌体沉淀重悬于含有1毫摩尔/升苯甲基磺酰氟的膜和胞质溶胶蛋白提取试剂盒试剂A。在冰浴中孵育15分钟后,将混合物冻融5个循环。将混合物在4℃以14000g的速度离心30分钟。CRV-EM使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒进行量化,并储存在-80℃。WB鉴定外泌体的HSP70、ALIX、DYKDDDDK-tag(Flag-tag)、Lamp2b的表达。
取20毫克PBAE溶于二甲基亚砜中制成100毫克/毫升的母液,取10毫克N-γ-马来酰亚胺基丁酰-氧琥珀酰亚胺酯溶于二甲基亚砜中制成10毫摩尔/升的溶液,将两者混合均匀,室温搅拌反应2小时;将NLS加入到上一步的反应液中,室温搅拌反应2小时得到NLS-PBAE;用截留分子量为3000透析袋透析过夜除去N-γ-马来酰亚胺基丁酰-氧琥珀酰亚胺酯和未结合的NLS。1微升NLS-PBAE(浓度20毫克/毫升)与1微升dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(浓度1毫克/毫升)质粒分别稀释在50微升的pH5.2的醋酸钠缓冲溶液中,按质量比20:1混合涡旋15秒,室温静置15分钟得到NLS-PBAE/dCas9-sgPI3Kγ(NPC,质粒浓度0.01毫克/毫升)。上述100微升NPC溶液与5.77微升CRV-EM(浓度6.93毫克/毫升)涡旋30秒,微型挤出机依次通过孔径0.4微米和0.2微米的聚碳酸酯膜分别挤出11次得到CRV-293T EM/NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(internally and externally engineered exosomes,I3E,内外工程化外泌体)。
对比例1(普通外泌体包裹的纳米颗粒ENPC组,与实施例1相比没有敲入CRV)
一种内外工程化外泌体及其制备方法。
HEK-293T细胞接种至大皿中,收集细胞培养液,4℃3000g离心15分钟后100000g离心70分钟,沉淀即为HEK-293T外泌体,用无菌水重悬保存于-80℃。为了提取外泌体膜(EM),将获得的HEK-293T外泌体沉淀重悬于含有1毫摩尔/升苯甲基磺酰氟的膜和胞质溶胶蛋白提取试剂盒试剂A。在冰浴中孵育15分钟后,将混合物冻融5个循环。将混合物在4℃以14000g的速度离心30分钟。EM使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒进行量化,并储存在-80℃。
取20毫克PBAE溶于二甲基亚砜中制成100毫克/毫升的母液,取10毫克N-γ-马来酰亚胺基丁酰-氧琥珀酰亚胺酯溶于二甲基亚砜中制成10毫摩尔/升的溶液,将两者混合均匀,室温搅拌反应2小时;将NLS加入到上一步的反应液中,室温搅拌反应2小时得到NLS-PBAE;用截留分子量为3000透析袋透析过夜除去N-γ-马来酰亚胺基丁酰-氧琥珀酰亚胺酯和未结合的NLS。1微升NLS-PBAE(浓度20毫克/毫升)与1微升dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(浓度1毫克/毫升)质粒分别稀释在50微升的pH5.2的醋酸钠缓冲溶液中,按质量比20:1混合涡旋30秒,室温静置30分钟得到NLS-PBAE/dCas9-sgPI3Kγ(NPC,质粒浓度0.01毫克/毫升)。上述100微升NPC溶液与7.05微升HEK-293T外泌体膜(EM,浓度5.67毫克/毫升)按质量比1:2混合涡旋30秒,经微型挤出机依次通过孔径0.4微米和0.2微米的聚碳酸酯膜分别挤出11次得到EM/NLS-PBAE/dCas9-sgPI3Kγ(ENPC)。
对比例2(缺少NLS的纳米颗粒CEPC组,与实施例1相比没有对PBAE修饰NLS)
一种内外工程化外泌体及其制备方法。
HEK 293T细胞接种到细胞培养皿,待细胞密度为40-50%时,将培养液换成低血清培养基Opti-MEM。10微升Lamp2b-CRV质粒(浓度1毫克/毫升)和10微升PX458-AAVSI质粒(浓度1毫克/毫升)加到80微升Opti-MEM培养基中,制备0.2毫克/毫升的悬液。40微升Lipofectamine 2000加入到60微升Opti-MEM中,并与100微升质粒悬液混合均匀,静置20分钟后均匀滴加到培养皿,转染6小时后换液,继续孵育48小时。48小时后向培养基中加入嘌呤霉素,使其终浓度为5微克/毫升,每天观察细胞生长状态,两天换一次液,维持嘌呤霉素浓度直至产生细胞克隆,挑单克隆,待细胞长满后将其消化传代,测序验证CRV的敲入情况。敲入CRV并稳定传代的HEK 293T细胞即为CRV-293T。CRV-293T接种至大皿中,收集细胞培养液,4℃3000g离心15分钟后100000g离心70分钟,沉淀即为CRV-293T外泌体,为了提取外泌体膜,将获得的CRV-293T外泌体沉淀重悬于含有1毫摩尔/升苯甲基磺酰氟的膜和胞质溶胶蛋白提取试剂盒试剂A。在冰浴中孵育15分钟后,将混合物冻融5个循环。将混合物在4℃以14000g的速度离心30分钟。CRV-EM使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒进行量化,并储存在-80℃。WB鉴定外泌体的HSP70、ALIX、DYKDDDDK-tag(Flag-tag)、Lamp2b的表达。
1微升PBAE(浓度20毫克/毫升)与1微升dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(浓度1毫克/毫升)质粒分别稀释在50微升的pH5.2的醋酸钠缓冲溶液中,按质量比20:1混合涡旋30秒,室温静置30分钟得到PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(质粒浓度0.01毫克/毫升)。上述100微升PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ溶液与5.77微升CRV-EM(浓度6.93毫克/毫升)按质量比1:2混合涡旋30秒,微型挤出机依次通过孔径0.4微米和0.2微米的聚碳酸酯膜分别挤出11次得到CRV-EM/PBAE/dCas9-sgPI3Kγ(CEPC)。
粒径检测:
使用动态激光散射仪分析人工外泌体的粒径和电位。结果如图1-3所示,图1为CRV-293T外泌体形貌粒径结果图,所提取的CRV-293T外泌体粒径在141.0纳米,符合人工外泌体大小范围,具有人工外泌体的典型结构。图2为不同PBAE/pDNA质量比制备的NPC粒径及电势变化图,当PBAE与pDNA质量比为20:1时,粒径最小,电势在20毫伏左右。优选NPC质量比为20:1。图3为不同CRV-EM与NPC质量比制备的I3E粒径及电势变化图,随着质量比的增加,I3E粒径和电势逐渐减小,当CRV-EM与NPC质量比为2:1时,粒径在200纳米以内,电势接近-20毫伏,确定I3E最适质量比为CRV-EM:NPC=2:1。图4为NPC粒径结果图,图5为I3E粒径结果图;由图4和图5可知,NPC粒径为104.4纳米,电势为正,而I3E粒径是131.2纳米,电势为-21.9毫伏,从粒径增大和电势变负可知外泌体膜成功修饰在NPC表面。并且图4和图5NPC和I3E的纳米颗粒成球状,分散均匀,两者粒径在100纳米左右,与粒径结果相符。图6为纳米颗粒稳定性结果图,NPC在7天后粒径增大到1000纳米,而I3E只变化到400纳米左右,说明外泌体膜包裹纳米颗粒可提高稳定性。
考马斯亮蓝染色:
取内外工程化外泌体(I3E)溶液4℃14000g离心30分钟后的沉淀,定量后变性与等质量的CRV-EM蛋白于SDS-PAGE胶电泳后用考马斯亮蓝染色1小时,再洗脱至胶的蓝色背景消失,凝胶成像仪拍照保存。图7为考马斯亮蓝染色图,由图可知I3E和CRV-EM考马斯染色结果,I3E的蛋白几乎与CRV-EM蛋白一致,综合图1-6粒径电势结果说明CRV-EM成功包裹在纳米颗粒表面,内外工程化外泌体(I3E)制备成功。
内外工程化外泌体(I3E)在不同pH药物释放情况:
采用Cy5标记的dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒为原料,与NLS-PBAE混合形成NPC后,转移到透析袋中(截留分子量,14000道尔顿)。将透析袋浸入5毫升pH 5.0或pH 7.0PBS缓冲液中。容器在37℃下摇动,并在设定的时间点(1、2、3、4、5、6、8、12、24、36、48、64和72小时),收集透析袋外的透析液,分光光度计检测Cy5的荧光情况。
图8为内外工程化外泌体的药物释放图,I3E在两种pH环境下的药物释放情况,在pH5.4的弱酸性环境中,I3E在72小时后药物释放率接近100%,而在pH7.4条件下不到50%,说明I3E可在肿瘤微环境弱酸性环境中快速完全的释放药物。
不同纳米颗粒的摄取情况:
通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析M2巨噬细胞对I3E的细胞摄取情况。对于激光共聚焦显微镜分析,将M2巨噬细胞以2×105个/毫升的密度接种到共聚焦培养皿中,孵育12小时。将含有的NPC、ENPC、CEPC、I3E(Cy5标记质粒为1.5微克/毫升)的Opti-MEM培养基加到细胞中孵育12小时,去除培养液,PBS洗涤,4%的多聚甲醛固定,鬼笔环肽-FITC和Hoechst 33342染色,激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光分布情况。对于流式细胞仪分析,将M2巨噬细胞以2×105/毫升的密度接种到6孔板中,孵育12小时。如上所述用不同的制剂处理细胞。6孔板中的细胞用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化,并制备成单细胞悬液,流式细胞仪分析Cy5阳性细胞(激发波长,650纳米,发射波长,670纳米)。
图9为不同纳米颗粒的摄取结果图,由图可知修饰了NLS的纳米颗粒(NPC、ENPC、I3E)红色荧光有与细胞核蓝色荧光有部分重合,说明进入了细胞核。而没有NLS的纳米颗粒(CEPC)红色荧光只出现在细胞骨架和细胞核之间的细胞质中。说明普通HEK-293T外泌体和CRV-293T外泌体膜包裹进一步促进纳米颗粒进入细胞和细胞核。NPC、ENPC、CEPC、I3E在给药12小时后细胞摄取率分别为89.5%、95.0%、99.9%、100%。结果说明I3E能够有效被M2型巨噬细胞摄取并进入细胞核。
细胞选择性摄入情况:
NIH 3T3、LLC、MLE-12、M2型巨噬细胞在6孔板或共聚焦小皿中,2×105个/毫升。培养24小时后将培养液换成无FBS的DMEM,分别加入含20μgCy5-dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒的I3E,继续孵育12小时,流式细胞仪和共聚焦荧光显微镜检测细胞摄取情况。
图10为细胞选择性摄入情况图,由图可知,MLE-12、LLC、NIH 3T3细胞给等量的I3E孵育12小时后用共聚焦和流式检测细胞摄取情况,3种细胞内均有微弱的荧光,但显著弱于M2型巨噬细胞摄入量,结合图9,说明I3E可以特异性靶向M2型巨噬细胞,且基本不会被其他细胞摄取造成脱靶。
内外工程化外泌体的溶酶体逃逸情况:
M2型巨噬细胞接种在共聚焦小皿中,2×105个/毫升。培养24小时后将培养液换成无FBS的DMEM,分别加入含1.5微克/毫升Cy5-dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒的I3E,继续孵育1、9小时。用绿色溶酶体探针对细胞溶酶体染色,共聚焦观察I3E在细胞内的溶酶体逃逸情况。
图11为溶酶体逃逸情况结果图,细胞加入I3E后1小时和9小时后用lysotracker对溶酶体进行染色,发现1小时时药物红色荧光大部分与溶酶体绿色荧光重合,说明I3E进入细胞后首先被溶酶体吞噬;而9小时后绿色荧光减少,红色荧光与绿色荧光分开,是因为PBAE具有质子海绵效应,涨破溶酶体,扩散到胞质中。
纳米颗粒表型逆转效果WB验证情况:
M2型巨噬细胞接种在6孔板中,2×105个/毫升。转染前每孔换上2mL Opti-MEM,分别加入DMEM、dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒(即pDNA)、NPC、ENPC、CEPC、I3E,每孔含质粒浓度为1.5微克/毫升,轻轻摇匀37℃孵育12小时后将培养液换为含有10% FBS的DMEM培养液,继续培养36小时。
每孔加入100微升细胞裂解液RIPA裂解细胞,4℃14000g离心15分钟取上清的蛋白溶液,BCA法定量后变性,Western blot分析iNOS、CD206、GAPDH、PI3Kγ蛋白表达水平。
图12为纳米颗粒表型逆转效果WB验证结果图,由图可知,I3E能够明显抑制PI3Kγ表达,I3E诱导后的细胞细胞蛋白iNOS(M1型巨噬细胞标志物)表达增强,而M2型巨噬细胞的标志物CD206显著下调,说明I3E高效抑制dCas9-KRAB-sgPI3Kγ表达,实现巨噬细胞M2到M1的重编程。
内外工程化外泌体(I3E)的体外抗肿瘤作用:
LLC接种在6孔板中,700000个/每孔,待细胞长到90%以上汇合度时,换成无FBS的DMEM培养液培养12小时,10μL枪头划痕后PBS洗2遍,加入2mL M0型巨噬细胞(阴性对照)、I3E诱导的M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞培养两天后的培养液。倒置显微镜观察拍照细胞划痕,并计算愈合率。
LLC接种在6孔板中或共聚焦小皿,浓度为2×105个/毫升。12小时后,将细胞培养液换成2mL M0型巨噬细胞(阴性对照)、I3E诱导的M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞培养两天后的培养液,继续孵育48小时。用无EDTA的胰酶消化后离心。分别加入Annex V-FITC和PI对细胞染色20分钟,流式细胞仪检测细胞凋亡率。或用Calcein-AM/PI染色后共聚焦观察细胞活死情况。
图13为LLC细胞经巨噬细胞培养基上清处理后细胞活力图,处理24小时后,I3E诱导的M1型巨噬细胞的培养基上清处理的LLC细胞有较少PI红光,说明有少部分LLC细胞死亡,到48小时时PI红光数量增加说明死亡的LLC细胞更多,而M2型巨噬细胞的培养基上清处理LLC细胞几乎没有红光,表明LLC细胞生长状态良好,并没有被M2型巨噬细胞清除。
图14为LLC细胞划痕结果图,I3E诱导的M1型巨噬细胞培养液显著抑制了LLC细胞的迁移速率,而M2型巨噬细胞培养液则促进LLC细胞迁移。
图15为划痕愈合率统计图,48小时各处理组间存在显著性差异,说明了I3E诱导的M1型巨噬细胞产生的培养液抑制肺癌细胞的生长和迁移,并在体外诱导肺癌细胞凋亡。
图16为肿瘤细胞球活死染色图,I3E诱导的M1型巨噬细胞培养基上清处理的细胞球直径小于其他处理组,且细胞球内部的细胞也已经死亡。
综上所述,图13-16结果表明重编程后的M1型巨噬细胞具有良好的抑制肿瘤细胞迁移和杀死肿瘤细胞的效果。
小鼠活体成像不同纳米颗粒的体内分布情况:
C57BL/6J小鼠右腋下皮下注射3×106个LLC细胞,建立皮下移致瘤模型。待肿瘤体积达到100mm3时,小鼠随机分成5组,尾静脉注射PBS、dCas9-KRAB-sgPI3Kγ、NPC、ENPC、I3E,dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒经Cy7标记,20微克/只。在6、12、24、48小时用小动物荧光成像仪对小鼠进行成像,同时取20微升血液测定血清中Cy7荧光强度。48小时后解剖小鼠取心肝脾肺肾及肿瘤,再次成像观察Cy7在各器官的分布。
图17为小鼠活体成像不同纳米颗粒的体内分布图,在小鼠尾静脉给药6小时后,各组的荧光在腹部蓄积,随着时间的延长,I3E组的荧光逐渐从腹部转移到肿瘤部位并在24小时肿瘤荧光最亮,荧光强度大于没有外泌体包裹的纳米颗粒组(NPC)和普通外泌体包裹的纳米粒组(ENPC)。48小时后,游离的Cy7标记的质粒已经被代谢完全,没有外泌体包裹的纳米颗粒组(NPC)也仅有少部分荧光,有外泌体包裹的两组(ENPC、I3E)则还有相当一部分的荧光残留,说明ENPC、I3E的靶向性增强了肿瘤部位的富集。
小鼠肿瘤组织光声成像情况:
小鼠肿瘤部位采用脱毛剂去毛后,5%的异氟烷将小鼠麻醉,医用超声耦合凝胶涂抹肿瘤,Vevo LAZR-XA成像系统用于记录Cy7信号。
图18为小鼠肿瘤组织光声成像图,给药12小时后I3E在肿瘤部位荧光量最多最强,48小时后仍有相当一部分发荧光量,而游离pDNA组则在24小时内代谢完全,与活体成像结果趋势一致,说明I3E增加了肿瘤部位的蓄积。
肿瘤部位48小时荧光强度定量分析情况:
Vevo LAZR-XA成像系统自带软件分析肿瘤部位的荧光情况。
图19为肿瘤部位48小时荧光强度定量分析图,I3E组肿瘤部位荧光强度与其他组存在显著差异,说明I3E在体内具有M2型巨噬细胞靶向性。
肿瘤抑制情况:
当肿瘤体积达到100mm3时,小鼠随机分为6组,尾静脉注射PBS、dCas9-KRAB-sgPI3Kγ、NPC、ENPC、CEPC、I3E,dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒20微克/只,每4天给一次药,共给药5次,每两天测量一次肿瘤体积。最后一次给药后3天解剖小鼠,取肿瘤组织拍照。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测肿瘤组织坏死情况(小鼠肿瘤TUNEL染色)。称取第1、5、9、13、17、21天的小鼠体重。取小鼠的心肝脾肺肾及肿瘤组织4%多聚甲醛固定后切片,苏木精伊红染色。
图20为小鼠肿瘤体积变化曲线图,图21为小鼠肿瘤组织拍照图;由图20和图21可知,游离的pDNA治疗组的肿瘤与空白组体积变化基本一致,说明游离的pDNA没有治疗效果,而NPC、ENPC、CEPC、I3E均具有肿瘤抑制效果,抑制效率I3E>CEPC>ENPC>NPC,I3E与其他各组存在明显差异。图22为小鼠肿瘤TUNEL染色图,绿色死细胞面积生理盐水≈pDNA<NPC<ENPC<CEPC<I3E,说明I3E具有更好的肿瘤抑制效果。图23为小鼠体重变化曲线图,治疗过程中小鼠体重均未发生明显下降,说明纳米颗粒(pDNA、NPC、ENPC、CEPC、I3E)具有良好的生物安全性。图24为各主要内脏器官苏木精-伊红染色图,心、肾、肝、肺、脾的小时苏木精-伊红染色均未发现有明显病变,进一步说明纳米颗粒(pDNA、NPC、ENPC、CEPC、I3E)具有较高的安全性。
实施例3
一种内外工程化外泌体在重塑肿瘤微环境的应用。
应用的方法:
按照以上方法构建肿瘤模型后,当肿瘤体积达到100mm3时,小鼠随机分为6组,尾静脉注射PBS、dCas9-KRAB-sgPI3Kγ、NPC、ENPC、CEPC、I3E,dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒20微克/只,每4天给一次药,共给药5次,每两天测量一次肿瘤体积。第21天获取小鼠肿瘤后,4%多聚甲醛固定后切片。
肿瘤微环境的重塑情况检测:
将各组小鼠肿瘤组织剪碎后用胶原酶37℃消化30分钟,过40微米筛网后离心制成单细胞悬液,细胞用APC-Cy7-CD45/PE-F4/80/BV421-CD80/Alexa Flour647-CD206、APC-Cy7-CD45/BV421-CD3e/APC-CD4/FITC-CD8、APC-Cy7-CD45/PE-GR-1/Percp-Cy5.5-CD11b染色30分钟,流式分析肿瘤组织内M1型TAM、M2型TAM、CD4阳性T细胞CD8阳性T细胞和对髓源性抑制细胞的含量。
由图25-27可知,I3E诱导后,CD80+F4/80+(M1巨噬细胞,31.3%)、CD4+CD3e+(CD4+T细胞,23.6%)和CD8+CD3e+(CD8+T细胞,29.4%)的百分比显着增加,同时减少了CD206+F4/80+(M2巨噬细胞,18.3%)和CD11b+Gr1+CD45+(MDSC,6.53%)细胞(图25、图26和图27)。然而,dCas9-KRAB-sgPI3Kγ(pDNA)处理显示免疫细胞组成没有明显变化(M1巨噬细胞,12.5%;CD4+T细胞,3.85%;CD8+T细胞,5.63%;M2巨噬细胞,37.8%;MDSCs,10.3%),与盐水处理过的情况类似。NPC(M1巨噬细胞,18.6%;CD4+T细胞,13.3%;CD8+T细胞,15.5%;M2巨噬细胞,33.9%;MDSC,9.6%),ENPC(M1巨噬细胞,20.6%;CD4+T细胞,15.6%;CD8+T细胞,19.4%;M2巨噬细胞,29.6%;MDSCs,9.33%)或CEPC(M1巨噬细胞,23.2%;CD4+T细胞,22.4%;CD8+T细胞,23.6%;M2巨噬细胞,26.7%;MDSCs,8.78%)在M1巨噬细胞和T细胞的升高中表现出较低的能力。这种影响可能是由于M1巨噬细胞分泌促炎细胞因子,如TNF-α和IL1α,它们刺激肿瘤组织中的T细胞浸润和激活。TNF-α还抑制MDSCs的功能,直接激活T细胞诱导MDSCs凋亡。I3E能够重塑肿瘤微环境,将抗炎环境转变为炎症环境。
Claims (10)
1.一种内外工程化外泌体,其特征在于,所述内外工程化外泌体为CRV-293T外泌体负载NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ;所述CRV-293T外泌体通过修饰M2型肿瘤相关细胞靶向肽CRV到HEK 293T细胞中离心获得。
2.权利要求1所述内外工程化外泌体的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)将Lamp2b-CRV质粒和PX458-AAVS1质粒混合转染HEK 293T细胞,制得CRV-293T细胞;所述Lmp2b-CRV质粒为Lamp2b克隆到载体中,使靶向肽CRV在Lamp2b之后表达;所述靶向肽CRV为CRVLRSGSC;
(2)将所述CRV-293T细胞进行离心,制得CRV-293T外泌体;
(3)将核定位信号与聚β氨基酯混合,制得核定位信号-聚β氨基脂;
(4)将所述核定位信号-聚β氨基脂与dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒分别稀释后再混合、静置,制得NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ;所述dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒由靶向小鼠PI3Kγ基因座的sgRNA插入载体生成;
(5)将所述CRV-293T外泌体重悬、冷冻、离心,制得CRV-293T外泌体膜;
(6)将所述NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ与所述CRV-293T外泌体膜混合,制得内外工程化外泌体。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述Lamp2b-CRV质粒和所述PX458-AAVS1质粒混合的质量比为1-10:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述离心为1000-5000g离心5-25min后80000-150000g离心30-100min。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述核定位信号-聚β氨基脂与所述dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒分别稀释在pH为4-8的缓冲溶液中。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述缓冲溶液为醋酸钠缓冲溶液。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述核定位信号-聚β氨基脂与所述dCas9-KRAB-sgPI3Kγ质粒稀释后按质量比1-50:1混合。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述混合的时间为10-60s;所述静置的时间为10-60min。
9.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(6)中,所述NLS-PBAE/dCas9-KRAB-sgPI3Kγ与所述CRV-293T外泌体膜按质量比1:0.1-10混合。
10.权利要求1所述内外工程化外泌体在重塑肿瘤微环境的应用。
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