WO2021174738A1 - 表面pd-l1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒及其制备和应用。本发明的表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒包括纳米核和包裹于纳米核外部的间充质干细胞膜；纳米核包括具有生物相容性的聚合物，间充质干细胞膜的膜表面过表达PD-L1分子。本发明还公开了上述表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在制备炎症治疗制剂中的应用。本发明的仿生纳米颗粒具有显著的免疫抑制效果，生物相容性好，制备工艺简单成熟，可用于制备炎症治疗制剂，该制剂可有效富集在炎症部位，通过抑制炎症部位过度激活的免疫反应和细胞因子风暴，在炎症治疗中展现出卓越的疗效。

Description

表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒及其制备和应用 技术领域

本发明涉及生物医学材料领域，尤其涉及一种表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒及其制备和应用。

背景技术

炎症是机体对各种物理、化学、生物等有害刺激所作出的一种以防御为主的病理反应，是多种细胞和因子共同参与的复杂反应，其中则包括免疫系统中的各种免疫细胞和细胞因子。适度的炎症反应有助于机体恢复健康，而过度的炎症反应则会导致组织损伤，甚至死亡。这种高炎症反应状态的本质其实是过度激活的免疫反应，诱发了细胞因子风暴，进而导致严重的炎性损伤。细胞因子风暴的发病机制复杂，但进展迅速，且死亡率极高。因此在危重的急性炎症治疗中，尽早阻止细胞因子风暴的产生是缓解机体损伤、挽救病人生命的关键。目前，在这种疾病的治疗方面，如SARS-Cov和COVID-19，临床上除支持治疗外，例如采用大剂量的激素药物来抑制机体的免疫反应，帮助患者度过细胞因子风暴。然而，大剂量使用激素药物虽然可以有效抑制免疫反应，但会导致严重的后遗症，如股骨头坏死等，极大地影响了患者愈后的生活质量。所以，寻找有效且毒副作用小的炎症治疗新方法具有推进现代医学发展和造福广大患者的重大意义。

间充质干细胞(MSC)是一种具有自我更新和多向分化能力的多能干细胞，目前广泛用于治疗各种疾病，例如器官移植、组织修复等。从基础研究到临床试验，MSC已广泛用于基于细胞的治疗。安全性和有效性已在许多临床试验中明确记录，尤其是在免疫介导的炎症性疾病，例如移植物抗宿主病(GVHD)和系统性红斑狼疮(SLE)。MSC主要通过两种方式发挥积极作用：即免疫调节作用和分化能力。MSC可以分泌许多通过旁分泌分泌或与免疫细胞直接相互作用的细胞因子类型，介导免疫调节。MSC中TLR受体的激活进一步触发了MSC的免疫调节作用，该激活受病原体相关分子(例如LPS或HCoV-19病毒的双链RNA)刺激。除干细胞的特性外，MSC还具有免疫调节能力，可影响固有和适应性免疫反应。它们可以与免疫系统发生相互作用，并发挥抗炎或促炎作用。因此，间充质干细胞疗法被认为是目前治疗炎症最具潜力的方法，并已被用于多种免疫相关疾病的治疗，包括自系统性红斑狼疮、肝 炎等，也取得了良好的疗效。但是，MSC作为一种活细胞，培养手段复杂，要求人员专业，运输不便，不宜长时间储存，治疗机制也特别未明确。而且人们普遍认为MSC在调节免疫方面主要发挥抑制作用，因而其在肿瘤发展进程中所起的作用也备受争议。例如有研究称MSC通过分泌生物活性分子，促进肿瘤微环境中免疫耐受的产生，从而推动肿瘤的发展和转移。这些争议在一定程度上限制了MSC在炎症治疗方面的临床应用。

值得注意的是，虽然很多学者认为MSC抑制免疫细胞增殖、活化是通过分泌可溶性的抑制性因子实现的，但也有报道称失活的MSC依旧具备免疫调节特性，暗示着MSC的细胞膜具有免疫抑制能力。而且，MSC细胞膜表面表达有PD-L1分子，其可以与免疫细胞表面的免疫抑制分子PD-1相结合，向免疫细胞传递抑制信号，达到抑制免疫细胞活化的效果。

CN201910740365.0公开了一种抗炎靶向递送系统，利用血小板衍生囊泡和装载在血小板衍生囊泡内或附着于血小板衍生囊泡表面的抗炎药物形成。CN201910166781.4公开了一种肿瘤抗原呈递系统，由红细胞膜制备得到，同时公开了将抗原呈递系统与肿瘤细胞膜融合后用于制备抗肿瘤药物。以上技术中均采用源于生物体细胞的物质作为载体，其来源受限，且处理方法复杂。US2012/039411、WO2013/052167和CN103857387A公开了一种膜包封的纳米颗粒及使用方法，在非细胞物质的内核表面包覆源自细胞的细胞膜或源自病毒的膜，但这些膜包封的纳米颗粒的免疫抑制效果不佳。

因此，为了避免争议，减少副作用，开发一种制备工艺简单，成本低廉，且基于PD-L1高表达的MSC的细胞膜的制剂应用于炎症治疗将会是更安全方便且有效的策略，但是目前几乎没有此类制剂的报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒及其制备和应用，本发明的仿生纳米颗粒具有显著的免疫抑制效果，生物相容性好，制备工艺简单成熟，可用于制备炎症治疗制剂，该制剂可有效富集在炎症部位，通过抑制炎症部位过度激活的免疫反应和细胞因子风暴，在炎症治疗中展现出卓越的疗效。

本发明的第一个目的是提供一种表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒，其包括纳米核和包裹于纳米核外部的间充质干细胞膜；纳米核包括具有生物相容性的聚合物，间充质干细胞膜的膜表面过表达PD-L1分子。

进一步地，具有生物相容性的聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸 (PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己酸内酯、聚赖氨酸、聚谷氨酸、葡聚糖(Dextran)中的一种或几种。优选地，具有生物相容性的聚合物为PLGA。PLGA纳米核作为一种广泛应用的纳米载体，生物安全性高。

进一步地，具有生物相容性的聚合物的分子量为10-1000kDa。更优选地，具有生物相容性的聚合物的分子量为10-100kDa。采用此范围的分子量，一方面既可以保证产生纳米尺寸结构，又保证所行程呢过的细胞核对间充质干细胞膜产生足够的支撑作用。

进一步地，仿生纳米颗粒的粒径为50-1000nm。优选地，仿生纳米颗粒的粒径为50-300nm。

进一步地，纳米核和间充质干细胞膜中总蛋白的质量比不大于1。优选地，纳米核和间充质干细胞膜中总蛋白的质量比为1:2。

本发明的仿生纳米颗粒中，纳米核的作用是作为间充质干细胞膜的载体和支架，维持其粒径和形态的稳定，防止仿生纳米颗粒在使用过程中，细胞膜发生聚集或破碎。其次，能够产生纳米尺寸的结构，可有效靶向炎症部位。间充质干细胞膜的膜表面过表达PD-L1分子，使得仿生纳米颗粒既继承了间充质干细胞的膜生物学特性，具有免疫抑制能力，同时由于间充质干细胞膜表面过表达PD-L1分子，该PD-L1分子通过与免疫细胞表面PD-1分子相互作用，显著增强了仿生纳米颗粒的免疫抑制效果。本发明的仿生纳米颗粒生物相容性高，使用失活的间充质干细胞膜，避免使用活细胞，不仅排除了活细胞储存介质带来的安全性问题，也避免了间充质干细胞内含物和分泌物的促癌争议，且保存方便，便于临床使用，不需要干细胞复杂的分离培养过程，可及时使用，成本相对低廉，且具备长途运输的可能性。其次，纳米尺寸的颗粒跟容易富集于炎症部位，提高其靶向效果，有效针对炎症部位而避免全身副作用。

本发明的第二个目的是提供一种上述表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

将纳米核和间充质干细胞膜的囊泡混合，并经均质机反复挤压后得到仿生纳米颗粒，纳米核包括具有生物相容性的聚合物，间充质干细胞膜的膜表面过表达PD-L1分子。

进一步地，按照纳米核和间充质干细胞膜中总蛋白的质量比为不大于1进行混合。优选地，按照纳米核和间充质干细胞膜中总蛋白的质量比为1:2进行混合。

进一步地，挤压过程中首先使用400nm滤膜，阻力明显变小后换用200nm滤膜继续挤压，即可得到表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒。

进一步地，间充质干细胞膜的囊泡的制备方法包括以下步骤：

(1)将清洗过的膜表面过表达PD-L1分子的间充质干细胞在细胞破碎溶液中重悬，超声至体系无明显颗粒，离心分离出细胞破碎混合物中的沉淀物，得到细胞膜；

(2)将细胞膜用均质机挤压过膜，得到间充质干细胞膜的囊泡。以上细胞膜提取和包被的制备工艺简单成熟。

进一步地，在步骤(1)中，采用PBS清洗膜表面过表达PD-L1分子的间充质干细胞，清洗次数为三次。

进一步地，在步骤(1)中，超声过程中加入冰块保持低温。

进一步地，在步骤(2)中，过膜时首先使用400nm滤膜，阻力明显变小后换用200nm滤膜继续挤压，即可得到均匀的间充质干细胞膜的囊泡。

进一步地，使间充质干细胞膜表面过表达PD-L1分子的方法包括以下步骤：

将间充质干细胞于添加了100ng/mL伽马干扰素的培养基中正常培养24小时。以上诱导PD-L1过表达的方法安全便捷。

优选地，使间充质干细胞膜表面过表达PD-L1分子的方法包括以下步骤：

(1)将间充质干细胞在培养箱中正常培养，使其贴壁；

(2)移除细胞培养上清，换成含有100ng/mL伽马干扰素的新鲜培养基，于培养箱中继续培养24小时；

(3)24小时后，移除细胞培养上清，用PBS清洗细胞三遍，即可得到表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞。

进一步地，PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜的提取方法为：将细胞从培养皿中刮下，重悬于细胞破碎溶液中并进行超声处理，得到细胞破碎混合物；将此混合物在4000rpm下离心10分钟，收集上清液，14800rpm继续离心20分钟，得到细胞膜沉淀，将其重悬在干净的PBS中，备用。

进一步地，纳米核的制备方法包括以下步骤：

将具有生物相容性的聚合物溶于有机溶剂中，然后将得到的溶液缓慢滴加入PVA水溶液中，超声处理后充分混合以使得具有生物相容性的聚合物固化为纳米粒子，即得到纳米核。

优选地，具有生物相容性的聚合物为PLGA，有机溶剂为DMSO，PVA水溶液的治疗分数为5％。

优选地，DMSO与5wt％PVA水溶液的体积比为1:3。

优选地，采用搅拌方法进行充分混合，混合时间为12-24h。

进一步地，充分混合后还包括离心分离出纳米核的步骤。

本发明的第三个目的是公开本发明的上述表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在制备炎症治疗制剂中的应用。

进一步地，炎症包括脑、心、肝、脾、肺、肾和肠等全身器官、关节或组织的炎症。炎症为超急性、急性、亚急性或慢性炎症。

优选地，炎症为肝炎或肺炎。

优选地，炎症由细菌、真菌、病毒、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)等微生物和所有外来抗原侵入人体所引起急性或慢性免疫反应。

进一步地，炎症治疗制剂的给药方式为静脉注射。

进一步地，炎症治疗制剂包括炎症治疗药物或药物载体。即本发明的上述仿生纳米颗粒既可以作为治疗炎症的药物直接使用，也可将其作为治疗炎症的药物载体，负载一些其他小分子药物后再进行炎症的治疗。

本发明的仿生纳米颗粒在间充质干细胞膜本身即具备的免疫抑制能力的基础上，膜表面PD-L1分子的大量表达显著增强了仿生纳米颗粒的免疫抑制效果，通过抑制炎症部位过度激活的免疫反应和细胞因子风暴，在炎症治疗中展现出卓越的疗效。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明中的仿生纳米颗粒制备工艺简单成熟，生物安全性高，炎症部位靶向性好，该纳米颗粒可以有效地富集到炎症部位。

(2)间充质干细胞膜提取方法简单快捷，且膜本身具有免疫抑制作用，避免了间充质干细胞胞质内和分泌的生物活性分子可能带来的副作用。

(3)仿生纳米颗粒中本身即具备免疫调节功能的间充质干细胞膜在PD-L1大量表达后，其免疫抑制效果明显增强，间充质干细胞膜表面过表达的PD-L1通过与免疫细胞表面的PD-1相互作用，显著增强了膜的免疫抑制效果，能够显著地压制炎症部位过度激活的免疫反应，并抑制细胞因子风暴的产生，从而有效缓解了炎性损伤。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1为间充质干细胞经伽马干扰素诱导后PD-L1表达量的流式结果分析图，图中1为未染色的阴性对照，2为不经伽马干扰素处理的普通间充质干细胞，3为经伽马干扰素处理的间充质干细胞；

图2为本发明中使用的PD-L1过表达的间充质干细胞膜和未经伽马干扰素处理的普通间充质干细胞膜的PD-L1表达量的蛋白质免疫印迹分析结果图，图中1为未经伽马干扰素处理的普通间充质干细胞膜，2为本发明中使用的PD-L1过表达的间充质干细胞膜；

图3为本发明中PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒的外观形貌；

图4为本发明的仿生纳米颗粒的粒径分布图；

图5为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒及PLGA纳米核在水(图5b)和PBS(图5a)中的粒径变化图；

图6为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在体外对巨噬细胞极化表型的影响；

图7为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在体外对巨噬细胞分泌的炎性因子TNF-α(图7a)和IL-6(图7b)的影响；

图8为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在体外对巨噬细胞与T细胞混合物的免疫表型的影响；

图9为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在体外多巨噬细胞与T细胞混合物中炎性因子TNF-α(图9a)和IL-6(图9b)分泌的影响；

图10为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在肝炎鼠体内分布的荧光成像分析结果；

图11为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在肝炎鼠的肝脏中与淋巴细胞相互作用的共聚焦分析图；

图12为本发明中PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒经静脉注射到肝炎鼠体内5小时后的肝脏免疫流式细胞图；

图13为图12中肝脏免疫细胞表型分析结果；

图14为本发明中PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒经静脉注射到肝炎鼠体内5小时后，肝脏组织中炎性因子TNF-α(图11a)、IL-6(图11b)和IL-1β(图11c)的水平；

图15为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒经静脉注射到肝炎鼠体内5小时后，肝脏HE切片结果；

图16为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒经静脉注射到肝炎鼠体内5小时后，血清中肝功能四项指标的结果；

图17为本发明的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒对肝炎鼠存 活率的影响；

在图6-9中，1表示不经任何处理的阴性对照组，2表示加LPS刺激但不经治疗的阳性对照组，3表示PLGA组(LPS刺激后加PLGA纳米核处理)，4表示普通膜组(LPS刺激后加普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒处理)，5表示PD-L1过表达膜组(LPS刺激后加PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒处理)；在图10和11中，1表示游离Cy5.5组，2表示Cy5.5标记的PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒组；在图12-17中，1表示阴性对照组(健康鼠)，2表示阳性对照组(LPS/D-GalN刺激，肝炎鼠)，3表示PLGA组(LPS/D-GalN刺激后给予PLGA纳米核)，4表示普通膜组(LPS/D-GalN刺激后给予普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒)，5表示PD-L1过表达膜组(LPS/D-GalN刺激后给予PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒)。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明各实施例中的材料来源为：

间充质干细胞由小鼠骨髓中提取并进行纯化和扩增。巨噬细胞由小鼠腹腔中提取获得，T细胞由小鼠脾脏中提取获得。

5-8周龄的C57BL/6小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。小鼠按照中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(IACUC)的指导操作方法进行处理。

伽马干扰素IFN-γ(315-05-100)购于PeproTech公司。聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)购于Sigma-Aldrich公司。

实施例1：间充质干细胞表面PD-L1分子过表达的诱导

(1)纯化扩增后的间充质干细胞于培养箱中正常培养，使其贴壁。

(2)移除细胞培养上清，换成含有100ng/mL伽马干扰素的新鲜培养基，于培养箱中继续培养24小时。

(3)24小时后，移除细胞培养上清，用PBS清洗细胞三遍，使用胰酶消化得到细胞。

使用流式细胞术分析所获细胞的PD-L1表达水平，结果显示，伽马干扰素处理过的间充质干细胞的PD-L1表达量显著增加(图1)。

实施例2：PD-L1过表达的间充质干细胞膜的提取和表征

(1)收获伽马干扰素处理过的间充质干细胞，重悬于细胞破碎溶液中，超声处理，得 到细胞破碎混合物。

(2)将步骤(1)中的混合物在4000rpm下离心10分钟，收集上清液，14800rpm继续离心20分钟，得到细胞膜沉淀，备用。

(3)使用膜蛋白提取试剂提取步骤(2)中膜沉淀的蛋白，并对其进行蛋白免疫印迹分析，结果显示，与不经伽马干扰素处理的间充质干细胞膜相比，伽马干扰素处理过的间充质干细胞膜上的PD-L1信号明显更强，表明PD-L1的过表达(图2)。

实施例3：PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒的制备和表征

(1)将收获的PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜重悬于PBS中，超声至体系无明显颗粒，超声过程中加入冰块保持低温。

(2)将步骤(1)得到的膜悬液用均质机反复挤压，首先使用400nm滤膜，阻力明显变小后换用200nm滤膜继续挤压，得到均匀的纳米质膜囊泡。

(3)按照膜蛋白总量/PLGA质量比为2:1的比例，将步骤(2)得到的纳米质膜囊泡与制备好的PLGA纳米核混合均匀。

(4)将步骤(3)得到的混合物用均质机反复挤压，首先使用400nm滤膜，阻力明显变小后换用200nm滤膜继续挤压，得到本发明中所述的PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒。

其中，在步骤(3)中，所使用的PLGA纳米核的制备方法如下：

将10mgPLGA聚合物(分子量为44kDa)粉末溶于1mL DMSO中，按照DMSO与5wt％PVA水溶液的体积比为1:3的比例，将溶有PLGA的DMSO溶液缓慢滴入5wt％PVA水溶液中，超声处理后搅拌过夜，高速离心后得到PLGA纳米核。

使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)对步骤(4)中获得的仿生纳米颗粒进行微观成像，证明PD-L1过表达的间充质干细胞膜成功包被在PLGA纳米核上(图3)。

使用动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)测量步骤(4)中获得的仿生纳米颗粒的粒径分布情况，结果如图4。结果表明，以上方法制备的仿生纳米颗粒的粒径主要分布于70-200nm之间。

测试步骤(4)中获得的仿生纳米颗粒及单独的PLGA纳米核的稳定性，将其分别重悬于水和PBS溶液中。图4可见，放置时间两周内，该仿生纳米颗粒和PLGA纳米核在两种介质中均没有出现明显的粒径突变，表明其在这两种介质中未发生明显的团聚现象，稳定性好。

实施例4：PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒的体外免疫抑制效果

(1)C57BL/6小鼠处死后，无菌条件下提取其腹腔巨噬细胞和脾脏T细胞，于培养箱中进行体外培养。

(2)首先将步骤(1)中提取的巨噬细胞均匀铺于12孔板中进行培养，设置5组，分别为阴性对照组、阳性对照组、PLGA组、普通膜组和PD-L1过表达膜组。待其贴壁后，除阴性对照组外，全部弃去原培养液，加入含1μg/mL LPS的新鲜培养基，继续培养。24小时后，弃去原培养液，加入新鲜培养基，PLGA组、普通膜组和PD-L1过表达膜组再分别加入10μgPLGA纳米核、20μg总蛋白量的普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒、20μg总蛋白量的PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒，与巨噬细胞进行共孵育。24小时后收集巨噬细胞和细胞培养上清液。

(3)利用流式细胞术检测步骤(2)中巨噬细胞的极化表型，结果如图6所示，LPS的刺激使得巨噬细胞表面CD80表达升高，表明其向M1型极化，表现出促炎表型；PLGA纳米核对巨噬细胞表型影响不大，普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在一定程度上抑制了CD80的升高，而PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒显著抑制了巨噬细胞向M1型极化，表明PD-L1的过表达极大地增强了间充质干细胞膜的免疫抑制作用。

(4)使用ELISA试剂盒检测步骤(2)中细胞培养上清液内炎性因子TNF-α和IL-6的水平。如图7所示，LPS的刺激使得巨噬细胞分泌了大量的TNF-α和IL-6等炎性因子；PLGA纳米核对炎性因子水平影响不大，普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在一定程度上减少了这两种炎性因子的分泌量，而PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒显著抑制了这两种因子的分泌，表明PD-L1的过表达极大地增强了间充质干细胞膜的免疫抑制和抗炎能力。

(5)将步骤(1)中巨噬细胞均匀铺于12孔板中进行培养，设置5组，分别为阴性对照组、阳性对照组、PLGA组、普通膜组和PD-L1过表达膜组。待其贴壁后，所有组都加入等量的T细胞，共同培养。同时，除阴性对照组外，全部弃去原培养液，加入含1μg/mL LPS的新鲜培养基，继续培养。24小时后，弃去原培养液，加入新鲜培养基，PLGA组、普通膜组和PD-L1过表达膜组再分别加入10μgPLGA纳米核、20μg总蛋白量的普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒、20μg总蛋白量的PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒，与两种免疫细胞进行共孵育。24小时后收集巨噬细胞、T细胞和细胞培养上清液。

(6)利用流式细胞术检测步骤(5)中巨噬细胞和T细胞的免疫表型，结果如图8所示，LPS的刺激使得巨噬细胞表面CD80表达升高，表明其向M1型极化，表现出促炎表型，也使得T细胞表面CD69和PD-1表达升高，表明T细胞被活化；PLGA纳米核对两种细胞的 表型几乎没有影响，普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在一定程度上抑制了巨噬细胞向促炎表型——M1型激活，并抑制了T细胞的活化，但PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒显著地抑制了巨噬细胞向M1型极化，也强有效地抑制了T细胞的活化，这表明PD-L1的过表达极大地增强了间充质干细胞膜的免疫抑制作用。

(7)使用ELISA试剂盒检测步骤(5)中细胞培养上清液内炎性因子TNF-α和IL-6的水平。如图9所示，LPS的刺激使得TNF-α和IL-6等炎性因子的水平急剧升高；同样地，PLGA纳米核对炎性因子水平影响不大，普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒轻度地减少了这两种炎性因子的分泌量，而PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒显著地降低了这两种炎性因子的水平，表明PD-L1的过表达极大地增强了间充质干细胞膜的免疫抑制和抗炎能力。

实施例5：PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒的炎症靶向能力

(1)C57BL/6小鼠称重，随机分为2组，分别为游离Cy5.5组和Cy5.5标记的仿生纳米颗粒组。根据小鼠体重，腹腔注射LPS(100μg/kg)和D-GalN(1.25g/kg)，建立肝炎模型。

(2)将游离Cy5.5，Cy5.5标记的PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒经静脉注射到步骤(1)中肝炎鼠体内，在注射后第1、2、3、4、5小时时使用小动物成像仪进行体内示踪，并在5小时后处死小鼠，进行解剖，检测纳米颗粒在各主要脏器中的分布情况。如图10所示，尽管其他脏器中也有纳米颗粒的信号，但此仿生纳米颗粒主要富集在肝炎鼠的肝脏中，可见其具有炎症靶向能力。

将步骤(2)中收获的肝脏制成切片，对其中淋巴细胞标志物CD45进行免疫荧光染色，使用DAPI对细胞核进行染色，随后利用蔡司共聚焦显微镜观察切片。由图11可以看出，PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在肝脏中有明显的富集，并在空间上与CD45标记的淋巴细胞非常靠近，暗示着它们之间可能发生的密切的相互作用。

实施例6：PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在肝炎治疗方面的效果分析

(1)C57BL/6小鼠称重，随机分为5组，分别为阴性对照组、阳性对照组、PLGA组、普通膜组和PD-L1过表达膜组。除阴性对照组外，其他组根据小鼠体重，腹腔注射LPS(100μg/kg)和D-GalN(D-氨基半乳糖，1.25g/kg)，建立肝炎模型。

(2)肝炎模型建立成功后，立即进行静脉给药治疗。其中，阴性对照组不处理，阳性对照组给予等量PBS(体积约200μL)作为对照，其余三组分别给予相应的20μgPLGA纳米核、40μg总蛋白量的普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒、40μg总蛋白量的PD-L1过 表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒。

(3)给药5小时后，处死小鼠，收集血清和肝脏样本。

对步骤(3)中收获的肝脏样本进一步处理，取适量肝脏组织进行破碎，使其成为单细胞悬液，随后采用流式细胞术对其中的巨噬细胞和T细胞进行免疫表型分析，其中，对巨噬细胞进行CD45、F4/80、CD80和PD-1染色，对T细胞进行CD45、CD3、CD44、CD69和PD-1染色。结果显示，与阴性对照组相比，阳性对照组的肝炎小鼠肝脏内有大量的淋巴细胞浸润，且巨噬细胞显著地向M1促炎表型极化，T细胞也呈现高度活化状态；与体外结果相似，PLGA纳米核对这两种免疫细胞的表型影响不大，普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在一定程度上阻止了巨噬细胞向促炎表型——M1型激活，并压制了T细胞的活化状态，但PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒显著地抑制了巨噬细胞向M1型极化，也强有效地抑制了T细胞的活化，表明PD-L1的过表达极大地增强了间充质干细胞膜的免疫抑制作用(图12)。

取适量步骤(3)中收获的肝脏组织，研磨裂解得肝脏组织裂解液，使用ELISA试剂盒检测其中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。如图14所示，与阴性对照组的健康鼠相比，阳性对照组肝炎鼠的肝脏组织中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性因子的水平急剧升高；同样地，PLGA纳米核对这些炎性因子水平影响不大，普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒轻度地减少了这些炎性因子的分泌量，而PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒非常有效地降低了这些炎性因子的水平，表明PD-L1的过表达显著地增强了间充质干细胞膜的免疫抑制和抗炎能力，抑制了细胞因子风暴的爆发。

取适量步骤(3)中收获的肝脏组织进行H&E染色，做病理观察。根据切片结果，与阴性对照组相比，阳性对照组的肝炎小鼠肝脏内有大量的炎性细胞浸润，且大量肝细胞呈破碎状态，肝损伤严重；PLGA纳米核对肝脏中炎性细胞浸润和肝损伤的情况几乎没有影响，普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒轻微地减少了浸润肝脏的炎性细胞，而PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒显著地抑制了肝脏中炎性细胞的浸润，但是对肝细胞破碎的情况似乎没有明显的挽救效果(图15)。

对步骤(3)中收获的血清样本测定肝功能四项指标，结果显示，与阴性对照组相比，阳性对照组的肝炎小鼠血清中ALT、AST和TBA水平急剧升高，ALB水平明显降低，表示肝功能严重受损；PLGA纳米核和普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒对这四项肝功能指标影响不大，而PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒则显著地恢复了肝功能，暗示了本发明的PD-L1过表达抑制细胞因子风暴爆发后对肝脏机能的挽救效果(图16)。

实施例7：PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒对肝炎鼠存活率的影响(1)C57BL/6小鼠称重，随机分为4组，分别为阳性对照组、PLGA组、普通膜组和PD-L1过表达膜组。根据小鼠体重，腹腔注射LPS(100μg/kg)和D-GalN(1.25g/kg)，建立肝炎模型。

(2)肝炎模型建立成功后，立即进行静脉给药治疗。其中，阳性对照组给予等量PBS(体积约200μL)作为对照，其余三组分别给予相应的20μgPLGA纳米核、40μg总蛋白量的普通间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒、40μg总蛋白量的PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒。

对治疗效果进行检测，记录小鼠存活时长和存活率。如图17所示，除PD-L1过表达膜组外，其他组的肝炎小鼠在8小时内全部死亡，而PD-L1过表达膜组的小鼠的生存时间和存活率都得到了提升，表明PD-L1过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒对LPS和D-GalN诱导的急性肝炎有较好的治疗效果。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1. 一种表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒，其特征在于：包括纳米核和包裹于所述纳米核外部的间充质干细胞膜；所述纳米核包括具有生物相容性的聚合物，所述间充质干细胞膜的膜表面过表达PD-L1分子。
2. 根据权利要求1所述的仿生纳米颗粒，其特征在于：所述具有生物相容性的聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸内酯、聚赖氨酸、聚谷氨酸和葡聚糖中的一种或几种。
3. 根据权利要求1所述的仿生纳米颗粒，其特征在于：所述具有生物相容性的聚合物的分子量为10-1000kDa。
4. 根据权利要求1所述的仿生纳米颗粒，其特征在于：所述仿生纳米颗粒的粒径为50-1000nm。
5. 一种权利要求1-4中任一项所述的表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

   将所述纳米核和间充质干细胞膜的囊泡混合，并经均质机反复挤压后得到所述仿生纳米颗粒，所述纳米核包括具有生物相容性的聚合物，所述间充质干细胞膜的膜表面过表达PD-L1分子。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞膜的囊泡的制备方法包括以下步骤：

   (1)将清洗过的膜表面过表达PD-L1分子的间充质干细胞在细胞破碎溶液中重悬并破碎，分离出细胞破碎混合物中的沉淀物，得到细胞膜；

   (2)将所述细胞膜用均质机挤压过膜，得到所述间充质干细胞膜的囊泡。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述纳米核的制备方法包括以下步骤：

   将具有生物相容性的聚合物溶于有机溶剂中，然后将得到的溶液缓慢滴加入PVA水溶液中，超声处理后充分混合以使得所述具有生物相容性的聚合物固化为纳米粒子，即得到所述纳米核。
8. 权利要求1-4中任一项所述的表面PD-L1分子过表达的间充质干细胞膜包被的仿生纳米颗粒在制备炎症治疗制剂中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，炎症包括脑、心、肝、脾、肺、肾和肠的炎症。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述炎症治疗制剂的给药方式为静脉注 射。

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