CN114652703B - 雾化吸入功能性细胞外囊泡在改善急性肺损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了雾化吸入功能性细胞外囊泡在改善急性肺损伤中的应用，本发明将功能性细胞外囊泡的冻干粉稀释为悬液后进行雾化吸入，明显改善了急性肺损伤的炎症反应和氧化应激水平，并且药物易于保存、使用简单、无创给药，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

Description

雾化吸入功能性细胞外囊泡在改善急性肺损伤中的应用
技术领域
本发明属于肺损伤的药物治疗领域，涉及细胞外囊泡(Extracellular vesicle,EVs)在改善急性肺损伤(acute lung injury,ALI)中的应用，尤其涉及通过雾化吸入治疗急性肺损伤的新策略。
背景技术
急性肺损伤(ALI)以肺气体交换受损、炎性细胞浸润和非心源性水肿为特征，可由机械创伤、细菌、病毒等不同刺激因素引起，并对人体健康产生严重危害。ALI通常伴随有炎症反应及感染相关的血管通透性增加、肺上皮细胞和内皮细胞死亡等症状，如果在早期没有得到有效的治疗，可能会发展为高死亡率的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。由于刺激因素的不确定性，目前针对ALI的诊疗方案在药物及给药途径的选择上仍面临较大的挑战，药物的治疗机制也尚未得到阐明。
细胞外囊泡(EVs)是一种由细胞释放、具有双层膜结构的囊泡状小体，几乎存在于所有生物体液中，包括外泌颗粒(30～50nm)、包膜病毒(80～400nm)、外泌体(50～150 nm)、微囊泡(100～1000nm)及凋亡小体(≥1000nm)。EVs携带有大量的蛋白、核酸及代谢产物。部分EVs由具有治疗潜能的细胞分泌，其作为经修饰的EVs具有显著的抗原递呈、免疫调节和组织修复等生物学功能，且易于透过生物学屏障，从而在治疗潜能上优于母体细胞本身。因此，这些功能性EVs可作为良好的纳米药物活性成分或无细胞 (Cell-free)治疗手段，改善肺部炎症反应或修复肺组织损伤。
目前EVs治疗肺损伤尚存诸多问题：1)EVs目前研究多集中在尾静脉注射处理动物或临床前模型，其给药模式属于有创给药，并且药物经全身代谢而消耗较多；2)专利 WO/2020/247675“METHODS FOR ATTENUATING VIRAL INFECTION AND FOR TREATING LUNGINJURY”中揭示了感染患者与健康对照尿液来源EVs中多个差异表达的microRNA，但该专利在进行ALI的肺部并发症干预(延缓)时仅围绕miR-199、miR-29a 的调控设计了功能性细胞或外泌体，而且面临免疫排异风险、医学伦理学以及化学合成成本高昂的问题；3)EVs囊括的内容物众多，既有有益成分，也有有害成分，不是所有动植物细胞衍生的EVs均具有抗炎、抗氧化等生物学活性，同时各类EVs发挥治疗功效的具体作用机制尚待阐明，这增加了利用修饰调节手段构建可高效发挥生物学活性的EVs 的难度。
另外，经气管肺给药主要在治疗哮喘的药物临床应用中效果明显，其他应用则较少(饶小春.经气管肺给药的进展.国外医学(儿科学分册),2001(03):150-152.)。
发明内容
本发明的目的在于提供雾化吸入功能性细胞外囊泡在改善急性肺损伤中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种功能性细胞外囊泡在制备用于治疗肺损伤的药物中的应用，所述功能性细胞外囊泡的生物学功能包括细胞修复、组织重塑中的一种或多种。
优选的，所述功能性细胞外囊泡由具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的动/植物细胞(动物细胞或植物细胞)分泌；或者所述功能性细胞外囊泡为在分泌前或分泌后经功能性microRNA修饰的由任意动/植物细胞(例如，具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的动物细胞、或者不具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的植物细胞等)分泌的细胞外囊泡。
优选的，所述具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的动/植物细胞(例如间充质干细胞)经物理或化学方式处理(例如低氧诱导、H2O2刺激等)以使功能性microRNA在该动物细胞或植物细胞分泌的细胞外囊泡中表达升高。
优选的，所述功能性microRNA选自miR-215-5p、miR-424-5p、miR-31-3p、miR-193b-3p、 miR-200b-3p中的一种或多种。
优选的，所述药物为纳米制剂。
优选的，所述纳米制剂的保存形式为冻干粉，给药时配制为冻干粉混悬液，溶媒采用临床使用的输注介质(例如糖盐水、生理盐水、无菌注射用水等)。例如，将应用冷冻干燥制成的功能性细胞外囊泡冻干粉通过糖盐水、生理盐水或无菌注射用水配制成细胞外囊泡悬液即可作为纳米制剂使用。
优选的，所述药物的给药方式为经气管肺给药(例如雾化吸入等经气管到肺的无创给药方式)。
优选的，所述肺损伤为由机械创伤或病原体感染(细菌性、病毒性、支原体、衣原体等)导致的急性肺损伤。
一种治疗肺损伤的药物，该药物包括上述功能性细胞外囊泡。
优选的，所述功能性细胞外囊泡由本身具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的动/植物细胞分泌。
优选的，所述功能性细胞外囊泡由经物理或化学方式处理(例如低氧诱导、H2O2刺激等)的具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的动物细胞(例如间充质干细胞)分泌，该动物细胞所分泌的细胞外囊泡中表达升高的microRNA(miR-215-5p、miR-424-5p、 miR-31-3p、miR-193b-3p、miR-200b-3p)即功能性microRNA。
优选的，所述功能性细胞外囊泡为由不具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的植物细胞分泌，并在分泌后经功能性microRNA修饰的细胞外囊泡。
优选的，所述功能性细胞外囊泡的制备包括以下步骤：
将本身具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的动物细胞(例如间充质干细胞)进行培养后分离培养上清，将培养上清经系列离心、过滤，再用PBS缓冲液悬浮并蛋白定量 (1～3mg/mL)，获得功能性细胞外囊泡的悬液。应用物理、化学(例如低氧诱导、H2O2刺激)、基因工程等修饰手段，可以增强功能性细胞外囊泡的生物学功能(增强其生物学功能的机制包括，通过修饰使功能性microRNA在该细胞外囊泡中的表达升高)。
或者，从植物组织匀浆液中提取并分离纯化由本身不具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的植物细胞分泌的细胞外囊泡，将功能性microRNA载入该细胞外囊泡，得到功能性细胞外囊泡。
本发明的有益效果体现在：
本发明根据功能性EVs治疗ALI小鼠模型的实验，首次证明功能性EVs可以通过细胞修复、组织重塑促进肺损伤组织修复，为ALI等肺损伤的药物治疗提供了新策略。
进一步的，本发明通过实验还表明功能性EVs的经气管肺给药(例如雾化吸入功能性EVs)较尾静脉注射，不仅实现了无创给药，而且显著降低了肺部组织的炎症和氧化应激反应，提高了ALI的治疗效果(例如降低促炎性细胞因子水平和病理学评分)。
进一步的，本发明通过实验还表明正常间充质干细胞经化学方式处理后分泌的EVs (化学修饰的EVs)较正常间充质干细胞EVs更显著的抑制了ALI的受损肺部组织的炎症和氧化应激反应(实验结果还显示miR-215-5p、miR-424-5p、miR-31-3p、miR-193b-3p、miR-200b-3p的表达升高，提示其为这些功能性EVs发挥并增强生物学活性的主要物质)。
进一步的，本发明的实验中还通过将miR-215-5p等功能性microRNA载入动/植物细胞EVs(特别是不具有调节炎症反应和/或氧化应激功能的植物细胞，例如不具有抗炎活性的黄瓜EVs)，从而利用经功能性microRNA修饰的相应细胞外囊泡显著降低M1型巨噬细胞标志物iNOS，以及提高M2型巨噬细胞标志物Arg1的表达水平，即通过功能性microRNA修饰明显提升抗炎活性，从而达到利用这一功能性EVs治疗ALI的效果。
附图说明
图1A为间充质干细胞EVs抗原(蛋白)表达检测(免疫印迹，间充质干细胞为对照)。
图1B为间充质干细胞EVs冻干粉形态(电镜)。
图1C为间充质干细胞EVs粒径分析(纳米粒子跟踪分析直径分布)。
图1D为小鼠ALI模型接受间充质干细胞EVs处理24h后的促炎性细胞因子(炎症细胞因子)水平。
图1E为小鼠ALI模型接受间充质干细胞EVs处理4d后肺组织病理变化(HE染色)。
图1F为小鼠ALI模型接受间充质干细胞EVs处理4d后肺组织病理变化(病理学评分)。
图2A为炎症标志物(CD11b)、氧化应激标志物(8-OHdG)免疫荧光染色(DAPI：细胞核标志物，蓝色；ED1：巨噬细胞标志物，绿色)。
图2B为炎症标志物(CD11b)、氧化应激标志物(8-OHdG)荧光强度分析。
图3A为Microarray测序筛选EVs携带的功能性microRNAs的结果。
图3B为miR-215-5p修饰的EVs处理后M1(iNOS)和M2(Arg1)型巨噬细胞标志物免疫荧光染色(DAPI：细胞核标志物，蓝色；ED1：巨噬细胞标志物，绿色)。
图3C为M1(iNOS)和M2(Arg1)型巨噬细胞标志物荧光强度分析。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明的保护范围。
(一)小鼠ALI模型接受雾化吸入间充质干细胞EVs处理后的治疗效果
1.间充质干细胞EVs冻干粉制备
提取EVs：用无EVs血清培养人脐带间充质干细胞(MSCs，脐带采集于陕西省西安市中心医院，采集时间2020年3月，伦理编号No.20180715-1)至第3～5代(37℃，5％ CO2)，取细胞培养上清，滤纸过滤后先通过2000g离心10分钟(2000g×10分钟)进一步去除滤液中杂质，然后经系列离心(依次为13000g×30分钟、上步离心所得上清 20000g×30分钟、上步离心所得上清70000g×60分钟)，再经0.22μm滤器过滤后通过 110000g离心70分钟，收集沉淀物。
将收集的沉淀物用PBS缓冲液(pH为7.35～7.45)悬浮后进行蛋白定量(1～3mg/mL)，然后根据EVs的抗原表达、形态学和粒径大小特征完成鉴定，具体说明如下：
取沉淀物的悬液进行免疫印迹检测，结果发现沉淀物具有EVs的标志蛋白TSG101、CD9(图1A)，初步确定沉淀物为间充质干细胞EVs；应用冻干机将沉淀物的悬液(称为 EVs悬液)制成冻干粉(称为EVs冻干粉，保存于－4℃冰箱备用)，根据电镜下EVs冻干粉的形态观察结果(图1B)和纳米粒子跟踪分析所得EVs的大小分布(图1C)，最终确定制备得到了间充质干细胞EVs(粒径主要分布于60至500nm范围内)，保存形式为冻干粉。
2.小鼠ALI模型处理
将C57BL/6小鼠通过4.0％水合氯醛(10mL/kg)腹腔注射麻醉，气管插管后滴注10mg/kg的脂多糖(LPS)溶液诱导ALI，假手术组(Sham)采用同样方式滴注生理盐水。LPS刺激完成的3小时后，实验组ALI模型分别接受雾化吸入(小鼠雾化器，YSKD Bio-Tec，北京)、尾静脉注射50～100μL(例如50μL)的生理盐水配制的间充质干细胞EVs悬液，该悬液含30～50μg(例如50μg)Evs，剂量为1.2～2mg/kg，即实验组包括雾化吸入EVs 组(ALI-inh+EVs)和尾静脉注射EVs组(ALI-iv+EVs)。对照组(vehicle)ALI模型分别接受雾化吸入、尾静脉注射50～100μL(例如50μL)的生理盐水，即对照组包括雾化吸入生理盐水组(ALI-inh+Veh：ALI模型雾化吸入等容量的生理盐水)和尾静脉注射生理盐水组(ALI-iv+Veh：ALI模型尾静脉注射等容量的生理盐水)。
ALI模型处理完成(处理一次)的24小时(h)、4天(d)或14d后分别收集各组小鼠血清或肺组织，应用Luminex液相芯片检测炎症细胞因子，应用HE染色观察各组样本肺组织的病理变化，结果如下：
参见图1D，将小鼠ALI模型接受间充质干细胞EVs雾化吸入(ALI-inh+EVs)、尾静脉注射(ALI-iv+EVs)24h后的促炎性细胞因子水平，与对照组(ALI-inh+Veh或ALI-iv+Veh)比较，可见雾化吸入和静脉注射这2种处理方式均能降低白介素1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-1α、肿瘤坏死因子α(TNFα)和IL-12的表达，但雾化吸入间充质干细胞EVs较尾静脉注射能进一步降低这些炎症细胞因子水平，不同实验组以及实验组与对应对照组之间均存在统计学显著性差异(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)；
参见图1E及图1F，小鼠ALI模型接受间充质干细胞EVs雾化吸入(ALI-inh+EVs)、尾静脉注射(ALI-iv+EVs)4d后的肺组织HE染色及各时间点的病理学评分分析，显示雾化吸入间充质干细胞EVs较尾静脉注射能进一步降低ALI的组织病理学评分，并且雾化吸入间充质干细胞EVs 4d后，对ALI的组织修复作用最为明显(nsP>0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)。
3.结论
雾化吸入间充质干细胞EVs与尾静脉注射间充质干细胞EVs相比，对ALI的治疗效果更为明显。
(二)小鼠ALI模型接受雾化吸入经H2O2刺激间充质干细胞衍生的EVs(称为 H2O2-EVs)处理后的治疗效果
1.化学修饰EVs
考虑到适当浓度的H2O2刺激明显增强了间充质干细胞的抗氧化应激活性(Castroet al.,J Tissue Eng Regen Med.2019；13:328-41)，通过100μM的H2O2作用间充质干细胞3h，然后更换为无EVs血清培养基培养48h(37℃，5％CO2)，收集细胞培养上清，按(一) 中方法步骤提取EVs，将收集的沉淀物用PBS缓冲液悬浮后进行蛋白定量(1～3mg/mL)，经冷冻干燥形成冻干粉，并通过免疫印迹法、电镜观察和纳米粒子跟踪分析确定制备得到了化学修饰的间充质干细胞EVs(具体指H2O2-EVs)。
2.小鼠ALI模型处理
采用雾化吸入H2O2-EVs(实验组，50μg H2O2-EVs+50μL生理盐水)或(一)中制备的正常间充质干细胞EVs(对照组，50μg EVs+50μL生理盐水)处理按(一)中方法步骤获得的ALI模型，同时设置了假手术组(空白对照)。ALI模型处理完成(处理一次)的 4d后收集各组小鼠肺组织，进行免疫荧光染色后分析各组的炎症和氧化应激信号变化，结果如下：
参见图2A，经雾化吸入H2O2刺激间充质干细胞所衍生的EVs(即H2O2-EVs)处理小鼠ALI模型4d后，免疫荧光染色各组(Sham：假手术组；ALI+生理盐水：ALI模型组，雾化吸入生理盐水；ALI+EVs：模型接受正常间充质干细胞EVs雾化吸入处理； ALI+H2O2-EVs：模型接受H2O2-EVs雾化吸入处理)炎症(巨噬细胞活化标志物CD11b，红色)和氧化应激(氧化损伤标志物8-OHdG，红色)标志物，显示H2O2刺激间充质干细胞所衍生的EVs较正常间充质干细胞EVs更显著的抑制ALI小鼠肺部组织的炎症和氧化应激反应；结合图2B中所示各组的炎症(CD11b)、氧化应激(8-OHdG)标志物的平均荧光强度分析结果(**P<0.01,****P<0.0001)，提示H2O2刺激间充质干细胞所衍生的EVs较未修饰的间充质干细胞EVs(即正常间充质干细胞EVs)具有更高的抗炎症和抗氧化应激活性，从而更好的消除肺部炎症反应和氧化应激的影响。
3.结论
同样进行雾化吸入的情况下，化学修饰的间充质干细胞EVs与未修饰的间充质干细胞EVs相比，对ALI的治疗效果更为明显。
(三)小鼠ALI模型接受雾化吸入功能性microRNA修饰的黄瓜EVs处理后的治疗效果
1.功能性microRNA筛选
考虑(二)中化学修饰的间充质干细胞EVs活性明显增强，分别提取H2O2-EVs(实验组，exp)和正常间充质干细胞EVs(对照组，ctrl)的RNA，用Agilent Human miRNA (8*60K)array进行杂交分析，并获得microRNAs的差异性表达图(参见图3A)。
在图3A中，红色、绿色分别代表表达水平升高(Up regulation)、表达水平降低(Down regulation)的各差异性表达的microRNAs。经Microarray分析上述H2O2-EVs与正常间充质干细胞EVs中microRNA的表达差异后，初步筛选出hsa-miR-215-5p、hsa-miR-424-5p、 hsa-miR-31-3p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-200b-3p作为间充质干细胞EVs中的功能性物质(在H2O2刺激后表达明显升高)。
2.黄瓜EVs制备
1)洗净黄瓜，用料理机制备黄瓜汁，将黄瓜汁先以3000g离心20分钟，将离心所得上清以10000g离心40分钟以去除大的黄瓜纤维，剩余的上清液以150000g超速离心2h，所得上清即含有EVs的悬浮液；
2)使用蔗糖密度梯度分离法分离纯化EVs
将所述悬浮液转移到不连续的蔗糖梯度(8％、30％、45％和60％[g/v])中，并以150000g超速离心2小时，收集8％/30％、30％/45％和45％/60％层之间的沉淀物，将收集的沉淀物用PBS缓冲液悬浮混合后进行蛋白定量(1～3mg/mL)，经冷冻干燥形成冻干粉，并通过免疫印迹法、电镜观察和纳米粒子跟踪分析确定制备得到了黄瓜EVs(粒径大小为40～160nm)。
3.miR-215-5p载入黄瓜EVs
取50～100μg黄瓜EVs冻干粉重悬在500μL的PBS缓冲液(pH为7.35～7.45)中，加入10μL Exo-Fect溶液(美国SBI公司)、20μL含20pmol miR-215-5p的核酸混合液(Takara，大连)和70μL PBS缓冲液(pH为7.35～7.45)，混合均匀，37℃孵育10分钟后置于冰上，得转染的黄瓜EVs样品，将30μL的ExoQuick-TC试剂(美国SBI公司)加入到转染的黄瓜EVs样品中，充分混合以停止反应，随后将转染的黄瓜EVs样品置于冰上(或4℃) 30分钟，10000g离心3分钟去除上清液，从而完成在黄瓜EVs中载入miR-215-5p，经实时定量PCR定量分析后，确定得到载入有miR-215-5p的黄瓜EVs(EVs-miR-215-5p)，冻干备用。
4.小鼠ALI模型处理
对按(一)中方法步骤获得ALI模型进行分组：实验组为接受雾化吸入EVs-miR-215-5p 处理(50μg EVs-miR-215-5p+50μL生理盐水)，对照组为接受雾化吸入黄瓜EVs处理。同时设置了假手术组(空白对照)。ALI模型处理完成(处理一次)的4d后收集各组小鼠肺组织，进行免疫荧光染色后分析各组的M1/M2巨噬细胞(炎症损伤与保护)标志物表达变化，结果如下：
参见图3B，经雾化吸入载入有miR-215-5p的黄瓜EVs(EVs-miR-215-5p)处理小鼠ALI模型4d后，免疫荧光染色各组(Sham：假手术组；ALI+生理盐水：ALI模型组，雾化吸入生理盐水；ALI+EVs：模型接受黄瓜EVs雾化吸入处理；ALI+EVs-miR-215-5p：模型接受EVs-miR-215-5p雾化吸入处理)巨噬细胞活化M1型(iNOS，红色，提示损伤) 和M2型(Arg1，红色，提示保护)标志物，显示EVs-miR-215-5p明显降低M1型巨噬细胞标志物iNOS的表达水平，并提高M2型巨噬细胞标志物Arg1的表达水平；结合图 3C所示肺组织巨噬细胞M1型(iNOS)标志物的平均荧光强度分析的结果(nsP>0.05,***P<0.001,****P<0.0001)，以及肺组织巨噬细胞M2型(Arg1)标志物的平均荧光强度分析的结果(nsP>0.05,**P<0.01)，提示黄瓜EVs对小鼠ALI模型的肺组织巨噬细胞活化表型的调节作用不明显(对ALI的炎症反应无明显抑制作用)，但载入miR-215-5p (EVs-miR-215-5p转染处理)后，黄瓜EVs的抗炎活性显著提升，并明显促进巨噬细胞 M1型向M2型的转变，从而能够抑制肺组织损伤。
5.结论
雾化吸入功能性microRNA修饰的黄瓜EVs对ALI的治疗效果明显。

Claims (6)

1.一种功能性细胞外囊泡在制备用于治疗肺损伤的药物中的应用，其特征在于：所述功能性细胞外囊泡的生物学功能包括细胞修复、组织重塑中的一种或多种；
所述功能性细胞外囊泡为由任意动/植物细胞分泌的经功能性microRNA修饰的细胞外囊泡；所述功能性microRNA为miR-215-5p。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为纳米制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述纳米制剂的保存形式为冻干粉，给药时配制为冻干粉混悬液，溶媒采用临床使用的输注介质。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的给药方式为经气管肺给药。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肺损伤为由机械创伤或病原体感染导致的急性肺损伤。
6.一种治疗肺损伤的药物，其特征在于：包括功能性细胞外囊泡，所述功能性细胞外囊泡的生物学功能包括细胞修复、组织重塑中的一种或多种；
所述功能性细胞外囊泡为由植物细胞分泌的经功能性microRNA修饰的细胞外囊泡；所述植物为黄瓜，所述功能性microRNA为miR-215-5p。
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