JP2021531279A - 自然リンパ系細胞による小膠細胞活性化の抑制 - Google Patents

Abstract

小膠細胞活性化を低減させるため、又は血液脳関門（ＢＢＢ）透過性を低減させるためにＩＬＣ２を使用する組成物及び方法が記載される。また、小膠細胞活性化又はＢＢＢ透過性を低減させるために活性化ＩＬＣ２の数を増加させる薬剤を使用する方法及び組成物も記載される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年７月１６日出願の米国特許仮出願第６２／６９８，５４５号の優先権を主張し、参照によりその開示の全体が本書に組み込まれる。

（発明の分野）
本発明は、概して、小膠細胞活性化を抑制するための方法及び組成物に関する。具体的には、本発明は、ＩＩ型自然リンパ系細胞、又はＩＩ型自然リンパ系細胞の数又は活性を増加させる薬剤を投与することによる、小膠細胞活性化又は血液脳関門の破壊を抑制する組成物及び方法に関する。

自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）は、その名前が示唆するように、自然免疫及び適応免疫の両方の特徴を示す。ＩＬＣは、一般的なリンパ前駆体から生じ、Ｔヘルパー細胞に類似したサブセットに分化するが、ＩＬＣは、適応免疫を象徴する受容体多様性の根底にある体細胞組み換えを受けない。したがって、従来のＴ細胞とは異なり、ＩＬＣ２は抗原特異的ではなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、及びナチュラルキラーＴ細胞などの他のリンパ球を同定する特定の系統マーカーも欠いている。ＩＬＣは、これらが産生するサイトカイン、並びにこれらの発生及び機能を調節する転写因子に基づいて、３種類（ＩＬＣ１、ＩＬＣ２、ＩＬＣ３）に分類することができる（Ｓｐｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２）：１４５−９）。

ＩＬＣ２は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３などの２型サイトカインを主に産生する。これらは自然系細胞として、ＩＬ−２５及びＩＬ−３３などの内因性ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）である、アラーニンに主に応答する（Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ ４６４（７２９３）：１３６７−１３７０）。また、活性化ＩＬＣ２のサブセットは、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０も産生できる（Ｓｅｅｈｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｄｅｃ １；８（１）：１９００）。このエビデンスは、ＩＬＣ２が免疫応答において多様な役割を有することを示唆している。喘息のマウスモデルでは、ＩＬＣ２が好酸球性炎症及び応答性亢進に寄与することが示されており、ヒトの研究において、喘息、アレルギー性鼻炎、好酸球性食道炎、及びアトピー性皮膚炎患者におけるＩＬＣ２数の増加が明らかとなっている（Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；１３９（５）：１４６５−１４６７）。

ＩＬＣ２は組織常在性であり、最初に、粘膜、関門、及び脂肪組織で豊富であることが示されている。しかしながら、最近になって、末梢神経系及び中枢神経系（ＣＮＳ、ＰＮＳ）の環境内で予想外にもＩＬＣ２が検出された（Ｇａｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２１４（２）：２８５−２９６）。ＣＮＳでは、ＩＬＣは、病理的にのみ検査されており、ＩＬＣ２は脊髄損傷後に応答することが示され、ＩＬＣ３は、髄膜に通常常在し、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において疾患誘発性の蓄積及び活性化を呈することが明らかとなった（Ｈａｔｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９７（２）：６９−７９）。

ＣＮＳにおける炎症は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病、及びＨＩＶ認知症を含む多数の神経変性疾患において神経細胞死につながる経路で重要な役割を果たすと考えられている。炎症応答は、通常は神経損傷に応答し、食作用によって損傷した細胞を除去する、ＣＮＳの常在免疫細胞である小膠細胞の活性化によって媒介される。

神経炎症応答は、運動ニューロンの生存に有益か又は有害であり得る。活性化小膠細胞は、炎症性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子α、ＴＮＦα）、一酸化窒素、及びスーパーオキシドなどの神経毒性分子を放出し得る（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９（８）：２７３６−４１）。これらの神経毒性分子は、ニューロンを損傷又は死滅させ、特定の神経疾患に先行するか又は悪化し得る可能性がある。多くの研究では、活性化された小膠細胞は、脳病理学的な特徴であることが見出されている。

ＣＮＳに影響を及ぼす多くの疾患及び生理学的ストレス要因はまた、血液脳関門（ＢＢＢ）の機能的完全性も変化させる。これらは、血液から脳への物質の通過を選択的に制限する関門能に影響を及ぼす。ＢＢＢ破壊は、うつ病、不安、頭のもや、及び自己免疫性脳疾患などの疾患をもたらし得る。

小膠細胞の活性化を抑制することにより、神経変性疾患に関連する炎症を低減し、ＢＢＢ破壊に関連する疾患を予防又は治療するための有望な治療手段が提供される。小膠細胞活性化を調節するために化合物を利用する特定の治療法が提案されている（米国特許出願公開第２０１１０２１４１３号、国際公開第９９４５９５０号、米国特許出願公開第２０１２０２３７４８２号）が、化合物は、オフターゲット効果を有することが知られている。加えて、幹細胞療法は、小膠細胞活性化を変化させる可能性を有するものとして提案されている（Ｇｉｕｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．３０（９）：２０４４−５３、国際公開第２０１１１０６４７６号）。間葉系幹細胞の生存期間がｉｎ ｖｉｖｏでわずか数ヶ月であるため、これらの治療法の長期的効果は不明である（Ｖｏｌｋｍａｎ ａｎｄ Ｏｆｆｅｎ，２０１７，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，３５（８）：１８６７−１８８０）。

したがって、活性化された小膠細胞に関連する神経変性疾患などの疾患を治療できる有効な治療法が依然として必要とされている。

本発明は、小膠細胞活性化の抑制を必要とする対象における小膠細胞活性化の抑制のための方法を提供することによって、この必要性を満たす。これらの方法は、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数及び／又は活性を増加させることを含む。

発明者らは、意外にも、髄膜ＩＬＣ２の数を増加させることにより、小膠細胞の活性化が抑制されることを見出した。発明者らはまた、意外にも、髄膜ＩＬＣ２が活性化されてＩＬ−１０を産生することができ、これが小膠細胞活性化の抑制を媒介することを見出した。特に、発明者らは、ＩＬＣ欠損マウスが、小膠細胞の炎症応答の阻害と、血液脳関門（ＢＢＢ）透過性の増加を呈することを見出した。その後のトランスクリプトミクス解析によって、意外にも、ＩＬ−１０の供給源としての髄膜ＩＬＣ２が明らかになった。したがって、神経炎症性表現型を調節すると、養子移入されたＩＬＣ２の髄膜への生着が続き、ＩＬ−１０中和抗体又はＩｌ１０^−／−ＩＬＣ２によって無効化される利点を伴う。加えて、いくつかのマウス組織由来のＩＬＣ２は、ヒト血液由来のＩＬＣ２と同様にＩＬ−１０適格性を示し、これは、最近説明された組織特異的転写特有のＩＬＣＲＥＧサブセットに加えて、標準的ＩＬＣ２についてのこれまで認識されていない免疫調節的役割を示唆している。総じて、これらの発見は、神経炎症及びＢＢＢ安定性の抑制における髄膜ＩＬＣ２の役割を示しており、ＩＬＣ２系細胞療法が神経炎症性病変の治療に使用できることを意味している。

１つの一般的な態様では、本発明は、小膠細胞活性化の抑制、又はＢＢＢ透過性の低減、又はＢＢＢ安定性の増加を必要とする対象におけるこれらの方法に関する。

一実施形態では、本出願は、小膠細胞活性化の抑制を必要とする対象における小膠細胞活性化の抑制の方法であって、治療有効量の活性化ＩＬＣ２を対象に投与することを含む、方法を提供する。

一実施形態では、本出願は、ＢＢＢ透過性の低減又はＢＢＢ安定性の増加を必要とする対象におけるＢＢＢ透過性の低減又はＢＢＢ安定性の増加の方法であって、治療有効量の活性化ＩＬＣ２を対象に投与することを含む、方法を提供する。

本出願の実施形態では、活性化ＩＬＣ２は、ＩＬＣ２をＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、及びＩＬ−７、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと接触させることによって活性化される。

本出願の他の実施形態では、細胞は遺伝子改変されており、好ましくは、細胞は、それ以外は同一の非改変細胞と比較して、ＩＬ−１０産生の増加のために遺伝子改変されている。

本出願の実施形態では、治療有効量の活性化ＩＬＣ２は、静脈内又は髄腔内投与によって、それを必要とする対象に投与される。

別の実施形態では、本出願は、小膠細胞活性化の低減、ＢＢＢ透過性の低減、又はＢＢＢ安定性の増加を必要とする対象におけるこれらの方法であって、治療有効量の、対象において活性化ＩＬＣ２の数を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法を提供し、好ましくは活性化ＩＬＣ２は、髄膜ＩＬＣ２である。

更に別の実施形態では、本出願は、小膠細胞活性化の低減、ＢＢＢ透過性の低減、又はＢＢＢ安定性の増加を必要とする対象におけるこれらの方法であって、有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。

更に別の実施形態では、本出願は、小膠細胞活性化の低減、ＢＢＢ透過性の低減、又はＢＢＢ安定性の増加を必要とする対象におけるこれらの方法であって、有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＴＩｍｐ１の産生を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。

本出願の特定の実施形態では、対象は、神経変性疾患、炎症性障害、髄膜炎、脳卒中、神経心理学的障害、慢性疼痛、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、ウイルス又は細菌感染などの小膠細胞活性化又はＢＢＢ破壊に関連する疾患の治療を必要としている。

本出願の好ましい実施形態では、対象は、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、及び老化からなる群から選択される神経変性疾患の治療を必要としている。

本出願の他の好ましい実施形態では、対象は、うつ病、不安、双極性うつ病、及び統合失調症からなる群から選択される神経心理学的障害の治療を必要としている。

別の一般的な態様では、本出願は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物、及びその調製方法を提供する。

一実施形態では、本出願は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の単離された活性化ＩＬＣ２と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。本出願はまた、治療有効量の単離された活性化ＩＬＣ２を、医薬的に許容される担体と組み合わせることを含む、医薬組成物の調製方法も提供する。

別の実施形態では、本出願は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。本出願はまた、治療有効量の薬剤を、医薬的に許容される担体と組み合わせることを含む、医薬組成物の調製方法も提供する。

更に別の実施形態では、本出願は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０又はＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。本出願はまた、治療有効量の薬剤を、医薬的に許容される担体と組み合わせることを含む、医薬組成物の調製方法も提供する。

本発明のこれら及びその他の態様並びに利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面から明らかとなるであろう。本明細書に記載される様々な実施形態の特性の１つ、いくつか、又は全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成できることを理解されたい。

上述の「課題を解決するための手段」及び以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解されるべきである。

図面は、以下のとおりである。
髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。ＩＬＣ：Ｔｂｅｔ（ＩＬＣ１）、ＧＡＴＡ３（ＩＬＣ２）又はＲｏｒγｔ（ＩＬＣ３）を発現している、ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ９０^＋及びＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ１２７^＋細胞のゲーティング（左から右）を示している、Ｒａｇ２^−／−髄膜のＦＡＣＳプロット。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。髄膜に見られるＩＬＣ１、２、３の相対頻度（ｎ＝４マウス×２の実験）。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。全組織標本におけるＲａｇ２^−／−髄膜の代表的な共焦点画像。静脈洞内に分布したＣＤ９０^＋細胞（ＩＬＣ）を示す、ＣＤ９０（緑）及びＬｙｖｅ１（赤）に対する抗体で標識された矢状静脈洞が示されている。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。ＣＤ９０（緑）、Ｌｙｖｅ１（青）及びＧＡＴＡ３（赤）に対する抗体で標識された、Ｒａｇ２^−／−矢状静脈洞におけるｍｅｎＩＬＣ２の代表的な共焦点画像。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。死後ヒト髄膜から単離された細胞を示す代表的なＦＡＣＳプロットで、ＣＤ４５^＋／生／単一イベントが示されており、左プロットは、Ｌｉｎ⁻（系統カクテル、ＣＤ１１ｃ、Ｆｃεｒ１α）ＩＬ７ｒα^＋細胞を示し、右プロットは、ＩＬＣ２マーカーであるＣＲＴＨ２及びＣＤ１６１の標識を示し、２回の実験間の代表的な６つのサンプルを表す。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。３日間の全身性ＩＬ−３３治療後のＲａｇ２^−／−矢状静脈洞を示す代表的な共焦点画像。ＣＤ９０（緑）及びＧＡＴＡ３（赤）で標識したＩＬＣ２、３回の実験のうち１回分を示す。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。ＰＢＳ及びＩＬ−３３処理マウスから選別されたＩＬＣ２によって発現された転写物を比較するボルケーノプロット。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。（ｉ）転写因子、（ｉｉ）サイトカイン因子、及び（ｉｉｉ）細胞外マーカーについて、ＰＢＳ及びＩＬ−３３処理マウスから選別された髄膜ＩＬＣ２を比較するヒートマップ。Ｎ＝２０／２０マウス×２回実験。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。ＩＬ−２／ＩＬ−７と共に５日間培養し、ＩＬ−３３で再刺激したＲａｇ２^−／−髄膜から選別された、ＩＬＣ２中のＩＬ１３、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０の代表的なＦＡＣＳ細胞内サイトカイン標識。ｎ＝２０のマウス、２回の実験のうち１回分を示す。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。ＩＬ−３３で刺激したｍＩＬＣ２の上清由来のＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１０のＬｕｍｉｎｅｘ測定値。ｎ＝２０の髄膜、４ウェル。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。ＩＬ−３３による３日間全身処理後のマウスから急性的に単離された、髄膜ＣＤ９０^＋ＳＴ２^＋細胞のＩＬ−１０及びＩＬ−１３細胞内サイトカイン標識の代表的なＦＡＣＳプロット。ｎ＝３のマウス、２回の実験のうち１回分を示す。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。二光子タイムラプスのＩＬ−１０抗体捕捉動画から得た静止画像。ＣＤ９０（緑）及びＩＬ−１０（赤）に対する蛍光抗体は、１２、４０、６０及び１２０分でのＩＬ−１０蛍光の増加を示す。３回の実験のうち代表的なものを示す。 髄膜が、ＩＬ−１０顕性活性化プロファイルを示すＩＬＣ２に富んでいることを示す。健康なヒトドナーの血液から単離された、無刺激又はＩＬ−３３刺激ＩＬＣ２上清由来のＩＬ−１０のＬｕｍｉｎｅｘ測定値。２回の実験のうち１回から、合計９例のうちＮ＝５の固有のドナーのデータを示す。 ＦＡＣＳによって測定された、受動移入後のマウス由来の髄膜ＩＬＣ２の定量化を示す。 ＩＬＣ欠損Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスがベースラインで髄膜異常を呈することを示す。Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−脳（海馬）の代表的な共焦点画像。Ｉｂａ１（緑）は小膠細胞を標識する。 ＩＬＣ欠損Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスがベースラインで髄膜異常を呈することを示す。未処理のＲａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−海馬における、Ｉｂａ１^＋細胞／ｍｍ^２の数。^＊＊、Ｐ＜０．０１、スチューデントのＴ検定、ｎ＝３／３マウス。 ＩＬＣ欠損Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスがベースラインで髄膜異常を呈することを示す。代表的なＦＡＣＳプロットは、未処理のＲａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスから急性的に単離された小膠細胞の側方散乱（相対粒度）を表す。ｎ＝３／３（２回実験）。 ＩＬＣ欠損Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスがベースラインで髄膜異常を呈することを示す。Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウス由来の小膠細胞での相対ＣＤ４５発現を示す代表的なヒストグラム。 ＩＬＣ欠損Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスがベースラインで髄膜異常を呈することを示す。Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスから単離された脳における小膠細胞活性化に関連するマーカーパネルの相対発現。Ｒａｇ２^−／−対照の割合としての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１ ^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法による多重Ｔ検定、ｎ＝３／３（２回実験）。 ＩＬＣ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重篤度の増加が、Ｔ細胞の異常と一致し、髄膜内で停止することを示す。Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの平均臨床的ＥＡＥスコア。ｎ＝１０／１０（２回実験）。 ＩＬＣ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重篤度の増加が、Ｔ細胞の異常と一致し、髄膜内で停止することを示す。ＥＡＥ受動ＥＡＥ誘導後のＲａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスにおける発生率。^＊＊、ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝１０／１０（２回実験）。 ＩＬＣ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重篤度の増加が、Ｔ細胞の異常と一致し、髄膜内で停止することを示す。Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの脳から単離された総ＣＤ４５^＋細胞の割合としての浸潤性Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。 ＩＬＣ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重篤度の増加が、Ｔ細胞の異常と一致し、髄膜内で停止することを示す。図４Ｃ（ｉ）の全データのグラフ、ｎ＝７／７（２回の実験）。 ＩＬＣ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重篤度の増加が、Ｔ細胞の異常と一致し、髄膜内で停止することを示す。Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの髄膜から単離された総ＣＤ４５^＋細胞の割合としてのＴ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。 ＩＬＣ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重篤度の増加が、Ｔ細胞の異常と一致し、髄膜内で停止することを示す。図４Ｄ（ｉ）の全データのグラフ、ｎ＝７／７（２回の実験）。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、ＩＬＣ２上清及び／又は１μｇ／ｍＬのＲ８４８の存在下又は非存在下（各グラフの下のマトリックスを参照）で培養し、最終上清を分泌因子についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。２回の実験×２つずつのサンプル。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、ＩＬＣ２上清及び／又は１μｇ／ｍＬのＲ８４８の存在下又は非存在下（各グラフの下のマトリックスを参照）で培養し、最終上清を分泌因子についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。２回の実験×２つずつのサンプル。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、ｒＩＬ−３３の存在下又は非存在下で培養し、上清をＴｉｍｐ１についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、１μｇ／ｍＬのＲ８４８の存在下又は非存在下で培養し、上清をＭｍｐ２、３、８、９及び１２についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、ＩＬＣ２上清及び／又は１μｇ／ｍＬのＲ８４８の存在下又は非存在下（各グラフの下のマトリックスを参照）で培養し、最終上清を分泌因子についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。代表的な２回の実験を示す（２回の実験）。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、上述のとおりであるが、ＩＬ−１０及びＩＬ−１０ｒαに対する抗体の存在下又は非存在下も加えて培養し、最終上清を分泌因子についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。２つずつのウェル（２回の実験）。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、上述のとおりであるが、ＩＬ−１０及びＩＬ−１０ｒαに対する抗体の存在下又は非存在下も加えて培養し、最終上清を分泌因子についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。２つずつのウェル（２回の実験）。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、上述のとおりであるが、ｒｍＩＬ−１０の存在下も含めて培養し、最終上清を分泌因子についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。２つずつのウェル（２回の実験）。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞を、Ｒ８４８存在下又は非存在下で培養し、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−３３を含有し、ＩＬＣ２なしか、野生型ＩＬＣ２由来の上清、又はＩｌ１０^−／−ＩＬＣ２由来の上清を含む単純培地で処理し、最終上清をＴｉｍｐ１についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。 ＩＬＣ２分泌因子が小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効になることを示す。小膠細胞をＩＬＣ２上清又は培地で処理した後、Ｒ８４８で刺激し、最終上清をＭｍｐ９及びＴｉｍｐ１についてＬｕｍｉｎｅｘで分析した。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。ＩＬＣ２のｉ．ｖ．受動移入後のＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスから単離された髄膜内のＬｉｎ⁻ＣＤ９０^＋細胞と、これらの細胞のＧＡＴＡ３及びＳＴ２標識を示す、代表的なＦＡＣＳプロット。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。生着マウスの髄膜由来のＣＤ４５細胞のＩＬＣ２割合、ｎ＝３／３マウス（２回実験）。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。ＩＬＣ２又はＰＢＳ対照のｉ．ｖ．移入後のＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスから急性的に単離された小膠細胞の側方錯乱の比較発現を示す、代表的なＦＡＣＳヒストグラム。ｎ＝３／３（２回実験）。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。ＩＬＣ２又はＰＢＳ対照のｉ．ｖ．移入後のＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスから単離された脳のＦＡＣＳにおける、小膠細胞活性化マーカーのパネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定される比較発現。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、多重Ｔ検定、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法、ｎ＝３／３（２回実験）。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。ＩＬＣ２又はＰＢＳ対照のｉ．ｖ．移入、及び３日間のＩＭＱ後のＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの脳から選別された単球数。スチューデントのＴ検定、^＊＊、ｐ＜０．０１、ｎ＝５／５、３／３（２回実験）。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。Ｅのマウスの脳から選別された小膠細胞によって分泌される因子のＬｕｍｉｎｅｘ測定。スチューデントのＴ検定、^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ｎ＝５／５（２回の実験のうち１回分）。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。野生型又はＩｌ１０^−／− ＩＬＣ２又はＰＢＳのいずれかの受動移入後のＩＭＱ処理したＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスより、スライス状の脳海馬実質にエバンスブルー浸潤した代表的な共焦点画像。ｎ＝４／４／４（２回実験）。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。ＩＬＣ２又はＰＢＳ対照のｉ．ｖ．移入、及び３日間のＩＭＱ後のＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの脳から選別された単球数。スチューデントのＴ検定、^＊＊、ｐ＜０．０１、ｎ＝５／５、３／３（２回実験）。 髄膜内の受動移入されたＩＬＣ２の生着が、ＩＬ−１０依存的に神経炎症を抑制する方法である。２日間培養後の小膠細胞分泌因子のＬｕｍｉｎｅｘ分析。^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。類似の結果のｎ＝６／５／５（２回実験）。 ＩＬＣ欠損マウスは、ＩＭＱ負荷に対して「分離した」皮膚対脳応答を示す。ＩＭＱ処理後の野生型、Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの背部の毛がある皮膚の総臨床的皮膚病変スコア。^＊＊、ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝４／４／４。 ＩＬＣ欠損マウスは、ＩＭＱ負荷に対して「分離した」皮膚対脳応答を示す。３つの群の背部皮膚の代表的なＨ＆Ｅ標識。「Ｈ」は顕著な角質増殖、「Ｍ」は顕著な微小膿瘍、「Ａ」は顕著な表皮肥厚、「Ｉ」は顕著な皮膚浸潤、「ＤＰ」は顕著な真皮乳頭、「ＤＣ」の拡張毛細血管は、野生型の背部の毛がある皮膚で著しかった。「Ｈ」は角質増殖、「Ｍ」は微小膿瘍、「Ａ」は表皮肥厚、「Ｉ」の皮膚浸潤は、Ｒａｇ２^−／−で著しかった。Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−では、顕著な病理的変化が見られなかった。ｎ＝４／４／４。 ＩＬＣ欠損マウスは、ＩＭＱ負荷に対して「分離した」皮膚対脳応答を示す。３つの群の脳切片の代表的なＨ＆Ｅ標識。わずかな微小出血「Ｈ」が野生型及びＲａｇ２^−／−で見られ、Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスで顕著であった。ｎ＝４／４／４。 ＩＬＣ欠損マウスは、ＩＭＱ負荷に対して「分離した」皮膚対脳応答を示す。０．８ｍｇ／日のＴＬＲ７アゴニストであるＩＭＱを３日間局所処理した後の野生型、Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２γｃ^−／−の脳から単離された総ＣＤ４５^＋細胞の末梢単球（Ｌｙ６ｃ^ＨｉＣＤ１１ｂ^Ｈｉ）の内容を示す代表的なＦＡＣＳプロット。 ＩＬＣ欠損マウスは、ＩＭＱ負荷に対して「分離した」皮膚対脳応答を示す。（Ｄ）の定量。ｐ＜０．０１、^＊＊＊、ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ。ｎ＝３／３／３（２回実験）。 ＩＬＣ欠損マウスは、ＩＭＱ負荷に対して「分離した」皮膚対脳応答を示す。脳実質のエバンスブルー浸潤を示す、ＩＭＱ処理したＲａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの脳スライス（海馬）の代表的な共焦点画像。ｎ＝３／３（２回実験）。 ＩＬＣ欠損マウスは、ＩＭＱ負荷に対して「分離した」皮膚対脳応答を示す。オープンフィールド試験によって測定するときの、ビヒクル対ＩＭＱで処理したＲａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの自発運動行動。Ｒａｇ２^−／−マウスでは抑制は測定されず、Ｒａｇ２^−／−マウスと比較して、Ｒａｇ２γｃ^−／−マウスで見られた有意な運動抑制は、これもＲａｇ２^−／−γｃ^−／−で見られた神経炎症の増加と一致している。^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ。ｎ＝９／９（２回実験）。 ＩＬ−１０の遮断が、ＩＬＣ２受動移入に関連する抑制効果を無効にすることを示す。ＰＢＳ（対照）又はＩＬ−１０に対する中和抗体の存在下若しくは非存在下でＩＬＣ２を移入され、採取３日前に０．８ｍｇのＩＭＱで処理したマウスの脳から選別された小膠細胞の上清中の分泌因子についてのＬｕｍｉｎｅｘ検出が示される。スチューデントのＴ検定、ｎ＝１０／５／５マウス、合わせた２回の実験の結果が示される。

背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によって恰もその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。

特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」なる語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。

本明細書で使用するとき、用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はそれらの任意の他の変形形態は、明記される整数又は整数群を含むが、任意の他の整数又は整数群を除外することを示唆しないと理解され、非独占又は無制限であることが意図される。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な又はを指すものであり、排他的な又はを指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。

別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、直列の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。

本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしの第１の要素の適用性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしの第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、本明細書で使用される用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれることが理解され、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たす。

本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。

本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。

本明細書で使用するところの「対象」とは、本発明の実施形態による方法によって治療される、又は治療された任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」とは、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。

特定の実施形態では、対象は、小膠細胞活性化に関連する障害の治療を必要としている。そのような障害の例としては、神経変性疾患、炎症性障害、神経心理学的障害、慢性疼痛、脊髄損傷、視神経炎、ウイルス又は細菌感染が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、対象は、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、及び老化からなる群から選択される神経変性疾患の治療を必要としている。

特定の好ましい実施形態では、対象は、うつ病、不安、双極性うつ病、及び統合失調症からなる群から選択される神経心理学的障害の治療を必要としている。

好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、また機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外しないことを示すことも理解されたい。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。

本明細書で使用するとき、用語「併用される」は、対象への２つ以上の治療薬の投与との関連において、複数の治療薬の使用を指す。用語「併用される」の使用は、治療薬を対象に投与する順序について限定しない。例えば、第１の治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。

本明細書で使用するとき、用語「小膠細胞活性化」は、小膠細胞の自然活性化又は適応活性化に関連するプロセスを指す。このような活性化は、細胞プロセスの短縮及びそれらの細胞体の拡大、並びに炎症性サイトカイン及びケモカイン、活性酸素及び／又は窒素中間体、プロテアーゼ及び補体タンパク質の放出、並びに細胞表面活性化抗原の上方制御を含む、小膠細胞の形態的変化を含み得る。

髄膜ＩＬＣ２がＩＬ−１０の分泌によって脳の境界部で強力な調節作用を及ぼすことが、発明者らによって初めて実証されている。ＩＬＣ欠損マウスは、ベースラインにおける小膠細胞反応性の増加と、並びにＥＡＥ及びＩＭＱ介在性全身性炎症のそれぞれのモデルにおける適応性又は自然免疫曝露のいずれかに対する神経炎症応答の悪化を示した。これらの両モデルにおいて、ＩＬＣ欠損マウスは、脳から通常排除される分子の実質への漏出によって示されるように、末梢細胞の脳浸潤の増加及びＢＢＢ完全性の低下を示した。

マウスにおける髄膜ＩＬＣサブセットの特徴により、ＩＬＣ２が優勢であり、矢状静脈洞に位置するために、ＣＳＦ及び血液の両方への潜在的なアクセスを有することが示され、後にヒトの髄膜サンプルを調べると、ＩＬＣ２の同様の集団を示唆した。対照及びＩＬ−３３刺激マウスから選別された髄膜ＩＬＣ２のＲＮＡｓｅｑ分析により、転写因子及び細胞外マーカーによって標準的ＩＬＣ２に密接にマッピングされた活性化プロファイルを明らかにしたが、Ｉｌ１０シグネチャーが予想外にも優勢であった。

ＩＬ−３３で刺激したタンパク質レベルの髄膜ＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生及び放出と、並びに、細胞外マトリックス及び密着結合分解ペプチダーゼであるＭｍｐｓを抑制することによって、ＢＢＢにおいて保護的であると示されている因子のＴｉｍｐ１を含む、炎症の解消及び組織保護に関連するいくつかの他の因子が続いて確認された。したがって、活性化ＩＬＣ２由来の上清は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて小膠細胞からサイトカイン、ケモカイン、及びＭｍｐ放出を強力に抑制し、保護効果は、ＩＬ−１０のシグナル伝達が遮断されるときに大部分が消失することが示された。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＩＬＣ２の受動移入を受けたＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスは、髄膜ＩＬＣ２の生着を示した。ＰＢＳを投与された対照と比較して、生着したＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスは、ベースラインでの過活性化小膠細胞の表現型の調節と、ＩＭＱモデルにおいて神経炎症の著しい改善を示した。決定的には、神経保護は、ＩＬ−１０の中和によって、又はＩＬ−１０^−／− ＩＬＣ２の移入後に消失し、ＩＬＣ２由来ＩＬ−１０の重要な役割を示している。

それらの初期発見以来、ＩＬＣサブタイプの多様性は実質的に増えており、いくつかのＴ細胞種に機能的に類似するものが十分に特徴付けられている（Ａｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５１７：２９３−３０１）。それにもかかわらず、制御性Ｔ細胞の結果として生じるＩＬＣ、すなわち、制御性自然リンパ系細胞は、不在がはっきりと分かったままであった。しかしながら、最近では、標準的ＩＬＣ２マーカーを欠いており、ＩＬＣに共通の予測されるＩｄ２に対して、Ｉｄ３によって区別される転写因子シグネチャーを有する腸内常在系統陰性細胞が、抗ＣＤ４０誘導大腸炎モデルにおける保護的ＩＬ−１０の供給源として指定された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１７，１７１（１）：２０１−２１６）。このように、この細胞は、長期にわたって謎であった「ＩＬＣ_ＲＥＧ」であることが示唆された。更に、組織特異性が非常に高いことが指摘された。その後の発見では、ＩＬ−１０を選択してＩＬ−１３の産生を控える第２の特殊なＩＬＣが肺において明らかにされ、「ＩＬＣ２_１０」と名付けられた（Ｓｅｅｈｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７，８（１）：１９００）。したがって、組織特異性は、ＩＬＣファミリーによってまだ対処されていない包括的な免疫調節機能を残す。

本出願に記載の髄膜ＩＬＣ２の転写及び機能分析により、ＩＬ−３３活性化後に高く上方制御されるＩＬ−１０が確認された。他のマウス組織から、続いて本明細書に記載されるようにヒト血液からの標準的ＩＬＣ２においてＩＬ−１０産生が更に検出されたことは、ＩＬＣ２によるＩＬ−１０産生が例外ではなく規則的であり得ることを示唆する。本明細書に記載されるＲＮＡｓｅｑデータセットで強調されたＧａｔａ３、Ｉｒｆ４及びＮｆｉｌ３は、他の細胞型でのＩＬ−１０産生における真の担当を担うため、更に新たな因子の探索をなくすことに留意されたい。したがって、ＩＬＣ２は、予想外にも、広範な制御機能を有する主要な自然リンパ系細胞集団を表すことができる。この以前に認識されていなかった古典的なＩＬＣ２は、新たな治療的アプローチとしてのＩＬＣ２細胞療法を示唆している。更に、ＩＬ−１０産生に対するＩＬ−３３の重要性が実証されたことを考慮すると、アラーミンの理解は、時間的又は分子的文脈に応じて、修復シグナルを含むことをある程度再考する必要があるであろう。

本明細書に記載される観察結果は、髄膜ＩＬＣ２が、神経免疫ホメオスタシス、ケモカイン、例えばＣＣＬ３及びＣＣＬ４の調節によって末梢免疫細胞の脳指向的走化性に関与する複数の能力がある因子であり、更に、ＩＬ−１０及びＴｉｍｐ１の両方、及び恐らくは他のメカニズムを介してＢＢＢ完全性において予期せぬ役割を更に果たすことを示唆している。本開示を考慮すると、神経炎症及び関門完全性の調節に有用な追加の因子／薬剤を特定することができる。そのような因子／薬剤は、最終的には、多発性硬化症、髄膜炎若しくは脳卒中におけるＢＢＢ破壊、又は慢性炎症を合併する精神障害などのＣＮＳ炎症性病変の寛解において、細胞又は低分子療法のいずれかに有用であり得る（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）．２３３：１６２３−３６）。

一般的な態様では、本発明は、小膠細胞活性化の低減又は抑制、又はＢＢＢ破壊の低減を必要とする患者における、これらの方法に関する。

本発明の実施形態によると、この方法は、治療有効量の、ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）、好ましくは活性化ＩＬＣ２を対象に投与することを含む。

本明細書で使用するとき、用語「ＩＩ型自然リンパ系細胞」、「ＩＬＣ２」、及び「ＩＬＣ２細胞」はそれぞれ、リンパ系形態を有し、Ｔ細胞受容体を欠くが、活性化時に２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞関連サイトカインを発現することができる、リンパ級の集団を指す。Ｔｈ２サイトカインの例としては、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３が挙げられる。ＩＬＣ２は、自然ヘルパー細胞であると考えられる。

ＩＬＣ２は、本開示を考慮して、当該技術分野において既知の方法を使用して、１つ以上のマーカーの発現によって同定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬＣ２細胞は、リンパ系マーカーであるＣＤ９０の発現検査で陽性であり、リンパ系マーカーであるＩＣＯＳの発現検査で陽性であり、免疫細胞の運命決定及び成熟に関連する系統マーカー（以下、Ｌｉｎと称する）の発現検査で陰性である。いくつかの実施形態では、ＩＬＣ２細胞は、リンパ系マーカーであるＣＤ９０及びＩＣＯＳの発現検査で陽性であり、Ｌｉｎの発現に関して陰性であり、更に、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち１つ以上の追加マーカーの発現検査で陽性である。例えば、ヒトＩＬＣ２細胞は、胃腸管及び肺において見られ、ＣＤ１６１及びＴｈ２細胞に発現する化学誘引物質受容体ホモログ分子（ＣＲＴＨ２）によって同定され得る（Ｍｊｏｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１２（１１）：１０５５−１０６２）。ＩＬＣ２は、本開示を考慮して、既知の方法に従って得ることができる。例えば、細胞は、骨髄から単離され、市販のキット及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を使用して、ＩＬＣ２を濃縮することができる。

本明細書で使用するとき、用語「活性化ＩＬＣ２」は、ＩＬＣ２によってＴｈ２サイトカインの産生を誘導する薬剤と接触しているＩＬＣ２を意味する。いくつかの実施形態では、ＩＬＣ２は、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−７、ＩＬ−２、及び／又はこれらの組み合わせなどのサイトカインによって活性化される。

活性化ＩＬＣ２は、本開示を考慮して、当該技術分野において既知の方法を用いて得ることができる。ＩＬＣ２細胞は、肺組織、胃腸（ＧＩ）管、ＣＮＳ組織、哺乳類血液及び／又は血液製品が挙げられるがこれらに限定されない、ＩＬＣ２細胞の様々な好適な供給源から単離され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬＣ２細胞は、ヒト臍帯血細胞から誘導され得る。このようなヒト臍帯血細胞は、ドナー対象及び／又は患者自身の臍帯血由来であってもよい。単離中、細胞を、目的の細胞に対応する寸法のＤａｃｒｏｎメッシュを通して濾過し、次いで、それぞれ５０×ｇで１分間、２回洗浄してよい。細胞生存率をトリパンブルー染料排除により決定できる。＞９０％生存率を有する細胞を移植に使用することができる。ｅｘ ｖｉｖｏ細胞は、成体体細胞、成体前駆細胞、成体幹細胞、胚性前駆細胞、又は胚性幹細胞であり得る。このような細胞源は、当業者には周知である。単離後、細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化し、任意選択的に改変することができる。

ＩＬＣ２細胞は、他の細胞と共培養することによって、及び／又は、１種以上の刺激性又は活性化分子、例えば様々なサイトカインと培養することによって活性化することができる。例えば、マウスＩＬＣ２と同様に、ヒトＩＬＣ２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで増殖して活性化され、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−３３又はＩＬ−２５に応答してかなりの量のＩＬ−５及びＩＬ−１３を産生することができる。いくつかの実施形態では、活性化ＩＬＣ２細胞は、対象からヒト臍帯血を採取することと、臍帯血からｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を単離することと、ＩＬ−３３サイトカインの存在下でｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を培養することによって、ＩＬ−３３活性化ＩＬＣ２細胞が生成されることと、を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて生成できる。いくつかの実施形態では、ＩＬＣ２細胞は、培養中のｃ−Ｋｉｔ陽性細胞を、１つ以上のサイトカインＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、及びＩＬ−７に曝露することによって活性化される。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、ＩＬＣ２細胞内のＳＴ２、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧメンバー１（ＫＬＲＧ１）、ＳＣＡ−１又はＣＤ１２７の発現など、ＩＬＣ２に対する１つ以上のマーカーの発現を測定することによって、生成されたＩＬＣ２細胞を分析することを更に含む。いくつかの実施形態では、活性化ＩＬＣ２細胞は、ＩＬ−２５応答性であるがＩＬＣ２とは異なる、多能性前駆細胞２（ＭＰＰ２）を実質的に含まない。

ＩＬ−３３は、ＩＬ−１スーパーファミリーに属するサイトカインである。これは、核内転写因子及び炎症促進性サイトカインとして作用する二重機能タンパク質である。核局在とヘテロクロマチンとの会合は、Ｎ末端ドメインによって媒介され、ＩＬ−３３がＮＦ−κＢ複合体のｐ６５サブユニットの新規転写調節因子として機能することを可能にする。Ｃ末端ドメインは、ＳＴ２受容体への結合と、分極したＴｈ２細胞及びＩＬＣ２細胞からの２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）の産生の活性化に十分である。したがって、いくつかの実施形態では、活性化ＩＬＣ２細胞は、ＩＬＣ２細胞をＩＬ−３３又はそのＣ末端ドメインと接触させることによって生成され得る。

活性化の長さは実験的に決定することができ、ＩＬＣ２の起源、サイトカイン、及び／又は活性化に使用される条件などの要因に依存し得る。特定の実施形態では、ＩＬＣ２を、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）などの薬剤と、少なくとも３０分間（例えば、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、又は８時間）接触させる。好ましい実施形態では、ＩＬＣ２を、対象に投与される前に、活性化のために少なくとも４時間サイトカインと接触させる。

いくつかの実施形態では、本発明に有用な活性化ＩＬＣは、ＣＤ９０、ＳＣＡ−１、ｉＣＯＳ及び／又はＳＴ２を発現し、ＩＬ−２５及び／又はＩＬ−３３に応答し、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３を生成する。

本出願の特定の実施形態では、投与されたＩＬＣ２は遺伝子改変されている。当業者であれば、本開示を考慮して、当該技術分野において既知の方法を利用して、遺伝子改変を細胞に導入できると認識するであろう。例えば、任意の所与の関連因子の遺伝子発現を操作するために、１種以上のウイルスベクター若しくは１種のウイルスベクター、並びにｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの使用を含むその他遺伝子送達及び編集ツール、又は別の遺伝子改変を使用することができる。

特定の実施形態では、ＩＬＣ２を改変し、サイトカインを含むがこれらに限定されない免疫調節分子を発現させてよく、好ましくは、ＩＬＣ２はＩＬ−１０を発現するように改変される。特定の実施形態では、ＩＬＣ２を遺伝子改変し、ＩＬＣ２数の増加及び／又はＩＬ−１０産生の増加をもたらす薬剤を発現させてよく、好ましくは、ＩＬＣ２はＩＬ−３３受容体を発現するように改変される。特定の実施形態では、ＩＬＣ２細胞を遺伝子改変し、小膠細胞活性化の低減に有効であることが知られている１つ以上のタンパク質、例えばＴＧＦ−βなど、目的の１つ以上の他の産物を発現させてよい。

本明細書で使用するとき、「自家」は、対象又は宿主の組織又は細胞由来の生物学的物質又は細胞を指す。対象に投与される活性化ＩＬＣ２は、自家であってもよい。

本明細書で使用するとき、「異種」とは、対象若しくは宿主とは異なる種、又は同じ種の異なる固体の組織若しくは細胞由来の生物学的物質又は細胞（例えば、アロジェネイック又はゼノジニック）を指す。対象に投与される活性化ＩＬＣ２は、異種であってもよい。

本出願の特定の実施形態では、小膠細胞活性化又はＢＢＢ透過性の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化又はＢＢＢ透過性の低減の方法は、治療有効量の、対象において活性化ＩＬＣ２の数を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む。活性化ＩＬＣ２の数を増加可能な薬剤の例としては、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７などのＩＬＣを活性化可能な薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。

対象における活性化ＩＬＣ２の数の増加とは、対象における全活性化ＩＬＣ２の数の増加、又は特定の組織常在活性化ＩＬＣ２の数の増加を意味し得る。ＩＬＣ２は、哺乳類の皮膚、肺、肝臓、腸、脂肪、及び脳内に存在する。好ましい実施形態では、対象は、本発明の１つ以上の治療の結果として、活性化髄膜ＩＬＣ２の数が増加している。

ＩＬＣ２を活性化し、活性化ＩＬＣの数を増加させることができると知られている薬剤に加えて、小膠細胞活性化又はＢＢＢ破壊の低減を必要とする対象において小膠細胞活性化又はＢＢＢ破壊の低減のために有用な他の薬剤は、
（１）ＩＬＣ２を、ＩＬＣ２の増殖及び活性化に好適な条件下で、試験化合物と接触させることと、
（２）活性化ＩＬＣ２の数を測定することと、を含む、方法を用いて同定できる。

ＩＬＣ２の増殖及び活性化に好適な条件は、当業者に既知である。細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させるための好適な増殖培地は、当該技術分野において周知であり、例えば、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，２０１０，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌに開示されている。各種細胞の最適培地は、細胞専門の供給元から得ることができる（例えば、ＡＴＣＣ−ＬＧＣ（ＭＩ，Ｉｔａｌｙ）；ＣＤＣ（Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ．，ＵＳＡ））。活性化ＩＬＣ２は、ＣＤ９０及びＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２などの１つ以上のＩＬＣ２のマーカーの発現と、Ｌｉｎ発現陰性によって同定し、定量化できる。

本出願の特定の他の実施形態では、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減の方法は、治療有効量の、対象においてＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む。ＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤の例としては、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３、ＩＬ−２、ＩＬ−４、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。全ての活性化ＩＬＣ２は、ＩＬ−１０の産生を増加させていない。ＩＬＣ２の組織位置が、役割を果たすと思われる。例えば、肺中のＩＬＣ２は、ＩＬ−３３単独での処理後に存在する場合、非常に少ない量のＩＬ−１０を産出する。しかしながら、肺中のＩＬＣ２がＩＬ−３３及びＩＬ−２及び／又はＩＬ−４によって励起される場合、高レベルのＩＬ−１０を産生する。特定の実施形態では、サイトカインの組み合わせを使用して、ＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生の増加において相乗反応を得ることができる。例えば、ＩＬ−２５とＩＬ−３３との組み合わせにより、それぞれ別々よりも、ＩＬ−１０の産生が非常に高くなり得る。特定の他の実施形態では、サイトカインの組み合わせを使用して、ＩＬＣ２によるＴｉｍｐ１の産生の増加において相乗反応を得ることができる。

対象における活性化ＩＬＣ２によるＩＬ−１０又はＴｉｍｐ１の産生の増加とは、対象における全活性化ＩＬＣ２によるＩＬ−１０若しくはＴｉｍｐ１の産生の増加、又は特定の組織常在活性化ＩＬＣ２によるＩＬ−１０若しくはＴｉｍｐ１の産生の増加を意味し得る。好ましい実施形態では、対象は、本発明の１つ以上の治療の結果として、活性化髄膜ＩＬＣ２によるＩＬ−１０又はＴｉｍｐ１の産生が増加している。

ＩＬＣ２によるＩＬ−１０又はＴｉｍｐ１の産生を増加させることができると知られている薬剤に加えて、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象において小膠細胞活性化の低減のために有用な他の薬剤は、
（１）ＩＬＣ２を、ＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生に好適な条件下で、試験化合物と接触させることと、
（２）ＩＬＣ２によって産生されたＩＬ−１０又はＴｉｍｐ１のレベルを測定することと、を含む、方法を用いて同定できる。

ＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生に好適な条件は、当業者に既知である。ＩＬＣ２によって産生されるＩＬ−１０又はＴｉｍｐ１は、本開示を考慮して当該技術分野において既知の方法を用いて、例えば、ＩＬ−１０又はＴｉｍｐ１に特異的な抗体によって同定し、定量化できる。

特定の態様では、本発明は、小膠細胞活性化の低減を必要とする患者における、小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物に関する。

一実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の活性化ＩＬＣ２と、医薬的に許容される担体と、を含む。

別の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む。

更に別の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の、対象においてＩＬＣ２によるＩＬ−１０又はＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む。Ｔｉｍｐ１の産生は、活性化ＩＬＣ２によって直接的に、又は活性化ＩＬＣ２によって産生及び／又は活性が増加する別の因子（例えば、ＩＬ−１０）によって間接的に増加させることができる。

医薬的に許容される担体は非毒性であり、活性成分の有効性を干渉すべきではない。医薬的に許容される担体としては、１種以上の、水、グリコール、糖、油、アミノ酸、アルコール、防腐剤、皮膚軟化剤、安定剤、着色剤などを挙げることができるが、これらに限定されない。任意の好適な医薬的に許容される担体は、対象への投与のために、活性化ＩＬＣ２、ＩＬＣ２の数を増加させる薬剤、又はＩＬ−１０若しくはＴｉｍｐ１の産生を増加させる薬剤と共に使用され得る。例えば、好適な製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、殺菌性抗生物質、及び対象とするレシピエントの体液と製剤を等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の滅菌注射剤、並びに、懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁剤を挙げることができる。製剤は、一回用量又は複数回用量容器、例えば、封止されたアンプル及びバイアル製剤であってよく、使用直前に滅菌液体キャリア、例えば注射用水の添加のみを必要とする冷凍又はフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管することができる。いくつかの例示的な成分は、ＳＤＳ、マンニトール、又は別の糖、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

上記に特に言及された成分に加えて、本開示の主題の製剤は、当該技術分野において従来の他の薬剤を、問題の処方の種類に関連して含み得ることを理解されたい。例えば、無菌の発熱物質を含まない水性及び非水性溶液を使用することができる。

本開示の主題の治療レジメン及び組成物は、サイトカインを含むがこれらに限定されない追加の薬剤又は生体応答修飾剤と共に使用することができる。

本開示の主題の組成物の投与は、静脈内投与、関節滑液嚢内投与、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与、直腸投与、膣内投与、腫瘍内投与、経口投与、頬側投与、鼻腔投与、非経口投与、吸入、及び吹送が挙げられるが、これらに限定されない、当業者に既知の任意の方法であってよい。いくつかの実施形態では、本開示の主題の組成物の投与に好適な方法としては、静脈内注射が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、組成物は、任意の他の方法で治療を必要とする部位に堆積され得る。本開示の主題の組成物を投与する特定の態様は、治療される細胞の分布及び豊富さ、組成物の追加の組織又は細胞標的化特性、及び投与部位からの組成物の代謝又は除去のための機構を含む、様々な因子に依存する。

本発明の実施形態によると、単離されたＩＬＣ２又はその医薬組成物の投与は、全身性又は局所的であり得る。特定の実施形態では、投与は非経口的ある。好ましい実施形態では、対象への単離ＩＬＣ２又はその医薬組成物の投与は、注射、注入、静脈内（ＩＶ）投与、髄腔内投与、又は大腿内投与によるものである。また更に好ましい実施形態では、対象への単離ＩＬＣ２又はその医薬組成物の投与は、静脈内、又は髄腔内投与によるものである。

活性化ＩＬＣ２の数又はＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生を増加させるサイトカインなどの薬剤の投与は、筋肉内、皮下、又は静脈内であってよい。しかしながら、皮膚、皮内、又は鼻腔などの他の投与方法も同様に想定され得る。薬剤の筋肉内投与は、薬剤組成物の懸濁液を注入するための針を使用することによって達成することができる。代替的には、組成物を投与するための針なし注射装置の使用（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）の使用）又は薬剤組成物の凍結乾燥粉末の使用である。

特定の実施形態では、ＩＬＣ２を患者から採取し、任意選択的に、遺伝子改変され、ｅｘ ｖｉｖｏ処理によって活性化され、その後患者に投与して戻して、小膠細胞の活性化を低減することができる。

静脈内、皮膚又は皮下注射では、薬剤組成物は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、乳酸リンゲル注射剤などの等張性ビヒクルを使用して好適な溶液を調製することが可能である。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、及び／又は他の添加剤を含めることができる。徐放性製剤もまた使用することができる。

本開示の組成物の有効用量は、それを必要とする対象に投与される。本明細書で使用するとき、「有効量」とは、それを必要とする対象に投与されると、対象に所望の局所的又は全身的効果を提供する組成物の量を指す。いくつかの実施形態では、有効量は、対象における小膠細胞活性化の低減の有益な又は所望の臨床結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回の投与で一度に全て、又は何回かの投与で有効量を提供する分量で提供することができる。

本開示の主題の組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象に対する所望の治療反応を達成するのに有効な量の活性化合物を投与するように変化させることができる。選択された投与量レベルは、治療組成物の活性、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療される状態の重篤度、並びに、各対象独自の因子、例えば体重、年齢、損傷及び／又は疾患の状態、並びに病歴、並びに疾患の発生又は疾患の始まりからの時間に依存し得る。しかしながら、本開示を考慮して、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで組成物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当業者の技能の範囲内である。

例えば、本明細書に提示される本開示の主題の開示を検討した後、当業者は、特定の製剤、組成物と共に使用される投与方法、及び状態の重篤度を考慮して、個々の患者に対して投薬量を調節することができる。用量の更なる計算は、患者の伸長及び体重、症状の重篤度及びステージ、並びに追加の有害な健康状態の存在を考慮し得る。このような調節又は変化、並びにそのような調節又は変化の実施タイミング及び方法の評価は、医学分野の当業者には周知である。

本出願全体で引用した全ての引用参考文献（論文参考文献、交付済み特許、公開された特許出願、及び同時係属の特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明白に組み込まれる。

実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。

実施形態１は、小膠細胞活性化の低減又は抑制を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減又は抑制の方法であって、治療有効量の活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態１ａは、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減を必要とする対象における血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減の方法であって、治療有効量の活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態２は、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ２をＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと接触させることによって活性化される、実施形態１又は１ａに記載の方法である。

実施形態２ａは、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ２をＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７からなる群から選択される２つのサイトカインと接触させることによって活性化される、実施形態２に記載の方法である。

実施形態２ｂは、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ２をＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７からなる群から選択される３つのサイトカインと接触させることによって活性化される、実施形態２に記載の方法である。

実施形態２ｃは、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ２をＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７であるサイトカインと接触させることによって活性化される、実施形態２に記載の方法である。

実施形態２ｄは、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ２をＩＬ−３３及びＩＬ−２５と接触させることによって活性化される、実施形態２に記載の方法である。

実施形態２ｅは、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ２を少なくとも１つのサイトカインと少なくとも３０分間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも４時間接触させることによって活性化される、実施形態２〜２ｄのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態３は、投与された活性化ＩＬＣ２細胞が自家である、実施形態１〜２ｄのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態３（ａ）は、投与された活性化ＩＬＣ２細胞がアロジェネイックである、実施形態１〜２ｄのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態３（ｂ）は、投与された活性化ＩＬＣ２細胞が同系である、実施形態１〜２ｄのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態４は、ＩＬＣ２が遺伝子改変されている、実施形態１〜３（ｂ）のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態４ａは、細胞が、それ以外は同一の非改変細胞と比較して、ＩＬ−１０産生の増加のために遺伝子改変されている、実施形態４に記載の方法である。

実施形態４ｂは、細胞が、それ以外は同一の非改変細胞と比較して、活性化ＩＬＣ２の数の増加のために遺伝子改変されている、実施形態４に記載の方法である。

実施形態４ｃは、細胞が、それ以外は同一の非改変細胞と比較して、Ｔｉｍｐ１産生の増加のために遺伝子改変されている、実施形態４に記載の方法である。

実施形態５は、治療有効量の活性化ＩＬＣ２が静脈内又は髄腔内に投与される、実施形態１〜４ｃのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態６は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減の方法であって、治療有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態６ａは、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減を必要とする対象における血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減の方法であって、治療有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態７は、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインを対象に投与することを含む、実施形態６又は６ａに記載の方法である。

実施形態７ａは、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７からなる群から選択される２つのサイトカインを対象に投与することを含む、実施形態７に記載の方法である。

実施形態７ｂは、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７からなる群から選択される３つのサイトカインを対象に投与することを含む、実施形態７に記載の方法である。

実施形態７ｃは、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−７を対象に投与することを含む、実施形態７に記載の方法である。

実施形態８は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減の方法であって、有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態８ａは、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減の方法であって、有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態８ｂは、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減を必要とする対象における血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減の方法であって、有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態８ｃは、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減を必要とする対象における血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減の方法であって、有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態９は、治療有効量のＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、又はこれらの組み合わせを対象に投与することを含む、実施形態８〜８ｃのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１０は、対象が、小膠細胞活性化に関連する障害の治療を必要としている、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態１１は、対象が、神経変性疾患、炎症性障害、神経心理学的障害、慢性疼痛、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、ウイルス又は細菌感染の治療を必要としている、実施形態１０に記載の方法である。

実施形態１２は、対象が、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、老化、髄膜炎、及び脳卒中からなる群から選択される神経変性疾患の治療を必要としている、実施形態１０に記載の方法である。

実施形態１３は、対象が、うつ病、不安、双極性うつ病、及び統合失調症からなる群から選択される神経心理学的障害の治療を必要としている、実施形態１０に記載の方法である。

実施形態１４は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の単離された活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物である。

実施形態１４ａは、組成物中でＩＬＣ２の活性化、又はＩＬＣ２の活性化状態での維持が可能な少なくとも１つの薬剤を更に含む、実施形態１４に記載の医薬組成物である。

実施形態１４ｂは、少なくとも１つの薬剤が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される、実施形態１４ａに記載の医薬組成物である。

実施形態１４ｃは、少なくとも１つの薬剤が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される２つの薬剤を含む、実施形態１４ａに記載の医薬組成物である。

実施形態１４ｄは、少なくとも１つの薬剤が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される３つの薬剤を含む、実施形態１４ａに記載の医薬組成物である。

実施形態１４ｅは、少なくとも１つの薬剤が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、及びＩＬ−７を含む、実施形態１４ａに記載の医薬組成物である。

実施形態１４ｆは、少なくとも１つの薬剤が、ＩＬ−３３及びＩＬ−２５を含む、実施形態１４ａに記載の医薬組成物である。

実施形態１４ｇは、ＩＬＣ２が髄膜ＩＬＣ２である、実施形態１４〜１４ｆのいずれか１つに記載の医薬組成物である。

実施形態１５は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物である。

実施形態１５ａは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、実施形態１５に記載の医薬組成物である。

実施形態１５ｂは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される２つの薬剤を含む、実施形態１５に記載の医薬組成物である。

実施形態１５ｃは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される３つの薬剤を含む、実施形態１５に記載の医薬組成物である。

実施形態１５ｄは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される４つの薬剤を含む、実施形態１５に記載の医薬組成物である。

実施形態１５ｅは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７を含む、実施形態１５に記載の医薬組成物である。

実施形態１５ｆは、医薬組成物が、ＩＬ−３３及びＩＬ−２５を含む、実施形態１５に記載の医薬組成物である。

実施形態１５ｇは、ＩＬＣ２が髄膜ＩＬＣ２である、実施形態１５〜１５ｆのいずれか１つに記載の医薬組成物である。

実施形態１６は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物である。

実施形態１６ａは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、実施形態１６に記載の医薬組成物である。

実施形態１６ｂは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される２つの薬剤を含む、実施形態１６に記載の医薬組成物である。

実施形態１６ｃは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される３つの薬剤を含む、実施形態１６に記載の医薬組成物である。

実施形態１６ｄは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７からなる群から選択される４つの薬剤を含む、実施形態１６に記載の医薬組成物である。

実施形態１６ｅは、医薬組成物が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＩＬ−２、及びＩＬ−７を含む、実施形態１６に記載の医薬組成物である。

実施形態１６ｆは、医薬組成物が、ＩＬ−３３及びＩＬ−２５を含む、実施形態１６に記載の医薬組成物である。

実施形態１６ｇは、ＩＬＣ２が髄膜ＩＬＣ２である、実施形態１６〜１６ｆのいずれか１つに記載の医薬組成物である。

実施形態１７は、治療有効量の単離された活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を医薬的に許容される担体と混合することを含む、実施形態１４〜１４ｇのいずれか１つに記載の医薬組成物の調製方法である。

実施形態１８は、治療有効量の対象においてＩＬＣ２の数を増加可能な薬剤を医薬的に許容される担体と混合することを含む、実施形態１５〜１５ｇのいずれか１つに記載の医薬組成物の調製方法である。

実施形態１９は、治療有効量の対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤を医薬的に許容される担体と混合することを含む、実施形態１６〜１６ｇのいずれか１つに記載の医薬組成物の調製方法である。

実施形態２０は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のために有用な薬剤を同定する方法であって、
（１）自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を、ＩＬＣ２の増殖に好適な条件下で、薬剤と接触させることと、
（２）ＩＬＣ２の数を測定することと、を含み、
対照レベルと比較したＩＬＣ２の数の増加が、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のために有用な薬剤であることを示す、方法である。

実施形態２１は、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のために有用な薬剤を同定する方法であって、
（１）自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を薬剤と接触させることと、
（２）ＩＬＣ２によって生成されたＩＬ−１０のレベルを測定することと、を含み、
対照レベルと比較したＩＬＣ２により産生されるＩＬ−１０の量の増加が、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のために有用な薬剤であることを示す、方法である。

実施形態２１ａは、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のために有用な薬剤を同定する方法であって、
（１）自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を薬剤と接触させることと、
（２）ＩＬＣ２によって生成されたＴｉｍｐ１のレベルを測定することと、を含み、
対照レベルと比較したＩＬＣ２により産生されるＴｉｍｐ１の量の増加が、小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のために有用な薬剤であることを示す、方法である。

実施形態２１ｂは、ＢＢＢ透過性の低減を必要とする対象におけるＢＢＢ透過性の低減のために有用な薬剤を同定する方法であって、
（１）自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を薬剤と接触させることと、
（２）ＩＬＣ２によって生成されたＩＬ−１０のレベルを測定することと、を含み、
対照レベルと比較したＩＬＣ２により産生されるＩＬ−１０の量の増加が、ＢＢＢ透過性の低減を必要とする対象におけるＢＢＢ透過性の低減のために有用な薬剤であることを示す、方法である。

実施形態２１ｃは、ＢＢＢ透過性の低減を必要とする対象におけるＢＢＢ透過性の低減のために有用な薬剤を同定する方法であって、
（１）自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を薬剤と接触させることと、
（２）ＩＬＣ２によって生成されたＴｉｍｐ１のレベルを測定することと、を含み、
対照レベルと比較したＩＬＣ２により産生されるＴｉｍｐ１の量の増加が、ＢＢＢ透過性の低減を必要とする対象におけるＢＢＢ透過性の低減のために有用な薬剤であることを示す、方法である。

実施形態２２は、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち１つ以上を発現し、Ｌｉｎの発現に関して陰性である、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法、実施形態１４〜１６のいずれか１つに記載の医薬組成物、又は実施形態１７〜２１ｃのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２２ａは、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち２つを発現し、Ｌｉｎの発現に関して陰性である、実施形態２２に記載の方法である。

実施形態２２ｂは、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち３つを発現し、Ｌｉｎの発現に関して陰性である、実施形態２２に記載の方法である。

実施形態２２ｃは、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち４つを発現し、Ｌｉｎの発現に関して陰性である、実施形態２２に記載の方法である。

実施形態２２ｄは、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち５つを発現し、Ｌｉｎの発現に関して陰性である、実施形態２２に記載の方法である。

実施形態２２ｅは、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち６つを発現し、Ｌｉｎの発現に関して陰性である、実施形態２２に記載の方法である。

実施形態２２ｆは、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち７つを発現し、Ｌｉｎの発現に関して陰性である、実施形態２２に記載の方法である。

実施形態２２ｇは、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＣＯＳ、ＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＣＤ１６１、ＳＴ２、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、及びＣＲＴＨ２のうち８つを発現し、Ｌｉｎの発現に関して陰性である、実施形態２２に記載の方法である。

実施形態２２ｈは、活性化ＩＬＣ２がＩＬ−１０を産生する、実施形態２２〜２２ｇのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２２ｉは、活性化ＩＬＣ２が、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３のうち少なくとも１つを更に産生する、実施形態２２〜２２ｈのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２２ｊは、活性化ＩＬＣ２が、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３のうち２つを更に産生する、実施形態２２ｉに記載の方法である。

実施形態２２ｋは、活性化ＩＬＣ２が、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３のうち３つを更に産生する、実施形態２２ｊに記載の方法である。

実施形態２２ｌは、活性化ＩＬＣ２が、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３を更に産生する、実施形態２２ｊに記載の方法である。

実施形態２２ｍは、活性化ＩＬＣ２がＴｉｍｐ１を産生する、実施形態２２〜２２ｌのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態２２ｎは、活性化ＩＬＣ２が髄膜ＩＬＣ２である、実施形態１〜２２ｍのいずれか１つに記載の方法である。

以下の実施例は、本開示の主題の様々な実施形態を更に例示するために含まれる。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態において多くの変更を行い、本開示の主題の趣旨及び範囲から逸脱することなく、同様又は類似の結果を依然として得ることができると理解するであろう。実施例は、いかなる方法によっても本発明を制限するものではない。これらは単に本発明を明確にするために役立つ。

実施例１．ＩＬＣ２は、髄腔内で豊富である
ＣＤ４５＋Ｌｉｎ−ＦＣεｒ１ａ−ＤＸ５−ＣＤ９０＋ＩＬ７ｒα＋細胞（図１Ａ）の転写因子標識を使用して、ＩＬＣ１（Ｔｂｅｔ＋）、ＩＬＣ２（Ｇａｔａ３Ｈｉ）及びＩＬＣ３（ＲＯＲγｔ＋Ｇａｔａ３−／ｌｏ）サブセットを分離した。最初に、髄膜自然リンパ系細胞（ｍＩＬＣ）をプロファイリングして、最も豊富な種類を決定した。未処理のマウスの脳を慎重に切開し、固定のために直ちに４％パラホルムアルデヒドに入れた。４℃で４８時間（ｈｒ）の固定後、Ｈ_２Ｏ中３０％スクロース中で脳を２４時間インキュベートし、続いて−８０℃で保存した。頭蓋冠を、ペトリ皿内の２０ｍＬ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）緩衝液（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２＋２％ＦＢＳ）中に置き、鉗子を使用して髄膜を慎重に剥離した。髄膜を７０μｍの細胞濾過器に入れ、注射器プランジャの裏側を回転運動（最低１００回）させて穏やかに解離させた。次いで、３回フィルターを通して細胞を洗浄し、解離した組織から細胞を更に放出した。チューブを、４℃、１５００ＲＰＭで７分間（ｍｉｎ）遠心分離し、次いで注意深くデカントした。ペレットを２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、細胞を氷上に置いた。細胞を、系統マーカーである、ＦＣεｒ１α、ＤＸ５、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＩＬ７ｒαに対する抗体で細胞外標識し、固定し、透過処理し、その後、ＴｒｕｅＮｕｃｌｅａｒ（登録商標）標識キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を製造元のプロトコルに従って使用して、ＴＢＥＴ、ＧＡＴＡ３、及びＲｏＲγｔについて核内標識した。転写因子ＦＡＣＳにより、ＩＬＣ２（ＩＬＣ２）がマウスの硬膜リンパ管において多数を占める集団であることを明らかとなった（図１Ｂ）。

ＩＬＣ２がＣＮＳに影響を及ぼし得る可能性のある解剖学的経路を探索するために、ＩＬＣ及びＬｙｖｅ１を標識するＣＤ９０を用いて、完全な髄膜の免疫標識及び高解像度共焦点画像解析を行い、リンパ系対非リンパ系組織を表した（Ｌｏｕｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ ５２３，３３７−３４１）。ＣＤ９０＋ＩＬＣは、主に静脈洞内で可視化されたが、Ｌｙｖｅ１＋リンパ系自体に限定されず（図１Ｃ（ｉ））、ｉｎ ｓｉｔｕ Ｇａｔａ３免疫標識を加えると、ＩＬＣ２が静脈洞に存在することが確認された（図１Ｃ（ｉｉ））。脳脊髄液（ＣＳＦ）及びＣＮＳ血流の両方に対する導管として、静脈洞が、髄膜ＩＬＣのＣＮＳ内の他の細胞との相互作用を可能にする、考えられる機構的リンクとしての分泌因子を示唆した。

ＩＬＣは、ヒト髄膜においてこれまで特徴が確認されていなかった（更には同定もされていなかった）。新しい死後髄膜においてこれらが存在することが、この研究で調べられた。簡潔に述べると、受領時に死後１８〜２４時間の矢状静脈洞、軟膜及び脈絡叢組織を切開し、慎重にＰＢＳで洗浄し、解離させ、フローサイトメトリーによる分析のために標識した。ＣＤ４５＋Ｌｉｎ−ＣＤ１１ｃ−ＦｃεＲ１−ＣＤ１２７＋ＣＲＴＨ２＋ＣＤ１６１＋細胞の、全てのサンプルからの分離に成功した（図１Ｄ）。新しい死後髄膜を用いた研究から得られた初期の結果は、ヒト髄膜も、マウス髄腔で見られるものと同様のＩＬＣ２集団を保有することを示唆する。

実施例２．ＩＬ−３３及びＩＬ−２５は髄膜ＩＬＣ２を活性化する
ＩＬ−２５及びＩＬ−３３の相対的な機能的応答を調べるため、Ｒａｇ２^−／−マウスを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって各サイトカインで処理し、マウスには、０．０３３ｍｇ／ｋｇ、毎日、３日間、２４時間毎に注射した。実施例１に記載されるように、脳及び髄膜を取り出した。細胞を単離し、系統マーカーである、ＦＣεｒ１α、ＤＸ５、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＩＬ７ｒα、ＫＬＲＧ１、ＳＴ２、ＧＡＴＡ３、ＫＩ−６７に対する抗体で標識し、ＦＡＣＳで分析した。ＣＤ４５＋のｍＩＬＣ２割合、数、及びＫＩ−６７標識によって測定される増殖の増加は、いずれの因子の注射によって見られたが、ＩＬ−３３で最も堅牢であった。

実施例３．ＩＬＣ２欠損マウスは小膠細胞活性を呈する
ＣＮＳ内の主要な免疫系が存在する小膠細胞は、常時監視に携わっており、周囲の繊細な神経組織を保護するために容易に応答する。ＣＮＳの免疫調節におけるｍＩＬＣ２由来因子の役割を調べるため、小膠細胞をＩＬＣ２欠損Ｒａｇ２^−／− γ□^−／−マウスの脳から単離し、ＦＡＣＳを用いて対照Ｒａｇ２^−／−マウスと比較した。

Ｉｂａ−１を用いた免疫標識は、実際に、ＩＬＣ欠損マウスの脳において小膠細胞密度が目に見えて差があることを示唆しており（図３Ａ）、単位面積当たりの小膠細胞の数が増加したことを示している（図３Ｂ）。急性的に単離された脳細胞懸濁液のフローサイトメトリーによるその後の分析により、ＩＬＣ欠損マウスの小膠細胞による側方散乱の上昇（細胞粒度の一般的な指標であるため、細胞内活性を意味する）（図３Ｃ）、ＣＤ４５（図３Ｄ）及び他の表面活性化マーカー、例えば、ＦｃＲＩＩ／ＩＩＩ及びＭＡＲＣＯの発現増加（図３Ｅ）が明らかとなった。これらの観察結果は、実際に、ＩＬＣ欠損に関連して小膠細胞のベースラインの状態が変化したことを示唆している。Ｉ型及びＩＩ型応答の両方に関連する活性化マーカーは同様に上昇し、Ｍ１又はＭ２のｓｋｅｗｉｎｇではなく一般的な活性化を示唆した。

ｍＩＬＣ２の機能的役割を調べるため、対照及びＩＬＣ２欠損マウスに、０．０３３ｍｇ／ｋｇ、毎日、３日間、２４時間毎にｒＩＬ−３３を注射し、ＩＬＣ２を活性化した。次いで、髄膜及び脳細胞を単離し、１０％ＦＢＳ、１：１００ Ｐ／Ｓ、１：１００ Ｌ−グルタミン、１：１００ ＮＥＡＡ、１：１００ピルビン酸Ｎａ、１：１０００ β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ（全てＧｉｂｃｏ）の３７℃の培養液に一緒に入れた。ＩＬ−３３処理は、ＩＬＣ２が十分なマウスと欠損マウスとの間の差を拡大し、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアッセイによって分析するとき、分泌プロファイルはＩＬＣ２欠損マウスにおいていくつかのサイトカイン及びケモカインのレベルが増加したことを示した。

ＩＬＣ２欠損マウスにおけるこの「過活性化」小膠細胞状態は、ＩＬＣによる免疫抑制作用の損失によって説明することができ、これにより、小膠細胞の抑制解除を実行可能な方法で高めることができる。あるいは、しかしながら、漏れやすい血液脳関門及び／又は血液脳脊髄液関門（ＢＢＢ、ＢＣＢ）もまた、正常では末梢に限定される免疫賦活因子の実質レベルの増加につながり、小膠細胞の「超活性化」をもたらし得る。第１のシナリオは、ＩＬＣの直接的な免疫調節的作用と一致しており、第２のシナリオは、腸内ＩＬＣと同様に、髄膜ＩＬＣが関門機能の調節に関与する別の可能性と一致している。これらの可能性を包括的に調べるため、適応免疫及び自然免疫曝露の両方に対する応答の特徴確認を行った。ＣＮＳの直接的自己免疫発作を伴う実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を適応モデルとして選択し、皮膚炎症及び脳炎症の両方を誘発することが示された免疫賦活剤であるイミキモド（ＩＭＱ）の局所投与を選択して、ＩＬＣ及び小膠細胞を含む脳の境界部における自然エフェクター間の相互作用を調べた。

ＩＬＣ欠損マウスにおけるＥＡＥ重篤度の増加は、Ｔ細胞の異常と一致して、髄膜内で停止することが見出された。簡単に言えば、Ｍｏｇ_{３５〜５５}ペプチドで免疫化した野生型マウスから選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を、Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスにｉ．ｖ．で移入した。受動的ＥＡＥ誘導により、群間のＴ細胞が同じ数であることと病原性が保証された。注目すべきことに、初回の実験は全例において早期終了を必要としたが、１例で、Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスは、最初の症状検出から２４〜３６時間以内に完全麻痺及び／又は瀕死状態まで急激に進行し、一方Ｒａｇ２^−／−マウスは、予想どおりの進行を呈した。したがって、ＣＤ４数を５０％まで調節して疾病の経過を遅くさせ、このとき、ＩＬＣ欠損マウスは依然として対照よりわずかに早く初期症状を示し、その後、疾患の重篤度が上昇したものの死亡率が低下した（図４Ａ）。重篤度と共に、ＥＡＥの発生率は、Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスにおいて顕著に増加した（図４Ｂ）。より高い臨床スコアと同時に、ＩＬＣ欠損マウスは、実質へのＴ細胞浸潤をより示した（図４Ｃｉ〜ｉｉ）。しかしながら興味深いことに、Ｒａｇ２^−／−の髄膜は、Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−の髄膜よりも有意に多くのＴ細胞を含んでおり（図４Ｄｉ〜ｉｉ）、脳及び脊髄で観察されたことと逆であった。血清因子の定量により、Ｒａｇ２^−／−マウスにおける炎症促進性サイトカインの増加に対する差又は傾向のいずれも示されず、循環中のＴ細胞が、リンパ節又は脾臓内に末梢性ＩＬＣが存在するときの病原性を低下させるという仮説に相反する。

Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−のＣＮＳ中のＴ細胞蓄積における実質と髄膜との間の逆相間により、ＩＬＣが、脳炎惹起性Ｔ細胞のＢＢＢ通過の停止に関与する可能性が示唆された。

加えて、ＩＬＣ欠損マウスは、局所ＩＭＱに対する、分離した皮膚対脳応答を示した。ＴＬＲ７／８アゴニストであるＩＭＱは、げっ歯類モデルにおいて乾癬皮膚炎症を誘導するために局所的に幅広く使用されており、活発な小膠細胞応答及び脳の免疫浸潤を促進することも示された。Ｒａｇ２^−／−マウスがＩＭＱに対する中程度の乾癬性応答を維持しているが、Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−が維持していないという知見と共に、これが、小膠細胞、ＩＬＣ及び関門完全性を同時に調べるための唯一のモデルであることが示唆された。十分に立証された臨床的併存疾患である末梢炎症性疾患を伴う精神障害、例えば乾癬を伴う気分障害を考慮すると、末梢炎症モデルはＣＮＳ病状に関連性を有し得ることに留意されたい。

野生型、Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスによるＩＭＱに対する皮膚及び脳応答を比較した。予想したとおり、皮膚の臨床スコア（図７Ａ）及び組織構造（図７Ｂ）は、野生型、Ｒａｇ２^−／−及びＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスにおいて、それぞれ、重篤、中程度、及び軽度から病状なしを示した（図７Ｂ）。しかしながら驚くべきことに、同一群由来の脳でヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）を行ったところ、異なるパターンでの微小出血が明らかとなり、すなわち、野生型及びＲａｇ２^−／−マウスの両方で同等に軽度であったが、意外にも、Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスにおいて重篤であった（図７Ｃ）。解離した脳のフローサイトメトリー分析により、類似した単球浸潤パターンが示され（図７Ｄ）、ＩＬＣ欠損マウスの脳は、有意に多くの単球を示した（図７Ｅ）。したがって、驚くべきことにＴ細胞ではなく、ＩＬＣは、ＢＢＢ破壊の観察された表現型に極めて重要であるように見えた。

実質の微小出血及び免疫浸潤は、巨視的レベルでの完全性の有効な尺度と考えられ得るが、細胞内粒子に対するＢＢＢ透過性の変化も評価した。ＩＭＱ処理を、通常はインタクトな血液脳関門及び血液ＣＳＦ関門（ＢＣＢ）によって脳から除外されるエバンスブルー染料の経心臓的注射によりモニターした。細胞浸潤の測定値と一致して、ＩＬＣ欠損マウスの脳は、Ｒａｇ２−／−対照と比較して、実質のエバンスブルー染料のレベルが増加したことを示した（図７Ｆ）。

実施例４．ＩＬＣ２移入は小膠細胞の活性化を抑制する
小膠細胞に対するＩＬＣ２特異的効果を調べるため、Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−又はＲａｇ２^−／−対照マウスへの、ＩＬＣ２又はＰＢＳ（対照）の静脈内受動移入を行った。

ＩＬＣ２の単離
Ｒａｇ２^−／−マウスを、０．０３３ｍｇ／ｋｇの組換えＩＬ−３３を毎日３日間腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスを安楽死させ、脛骨及び大腿骨を無菌フード内で単離した。鉗子で骨から筋肉を取り外した後、滅菌ＰＢＳ中で氷上に維持した。骨を、乳鉢及び乳棒を使用して、滅菌ＰＢＳ中で１度に４つずつ穏やかに破砕した。放出された骨髄細胞と全ての骨の物質をピペットマンを使用して５０ｍＬ容の円錐管に移し、７０μμｍの細胞濾過器を通して、大きな粒子を濾別した。次に、細胞を４０μμｍの細胞濾過器に通し、あらゆる細胞片を更に除去した。チューブを、４℃、１５００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、次いでデカントした。ペレットを赤血球溶解緩衝液に再懸濁し、室温で２分間インキュベートした。氷冷ＰＢＳを加えて、細胞溶解を希釈し、停止させた。チューブを、４℃、１５００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、次いでデカントした。ペレットを２％ＢＳＡに再懸濁し、生細胞数を数え、細胞濃度を１×１０^８／ｍＬに調整して細胞を氷上に置いた。ＥａｓｙＳｔｅｐ（商標）Ｍｏｕｓｅ ＩＬＣ２ Ｅｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔを製造元の説明書に従って使用して、ＩＬＣ２細胞を濃縮した。

ＩＬＣ２の選別
濃縮した細胞を、以下の抗体カクテルを２μＬ／１０^６細胞の濃度で使用して（１μＬ／１０^６細胞を使用したＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ、２０μＬ／１０＾６細胞を使用した系統カクテルは除く）標識した：Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ、系統カクテル、＋ＦＣεｒ１ａ、＋ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ９０．２、ＩＬ７ｒα、ＳＴ２。生存しており、単一の、ＣＤ４５＋系統−ＣＤ４９ｂ−ＦＣεｒ１ａ−ＣＤ９０．２＋ＩＬ７ｒα＋ＳＴ２＋の事象を、ＩＬＣ２培地内に選別した。

ＩＬＣ２の増殖
選別した細胞を、９６ウェルのＴＣコーティングした丸底プレート内の５０単位／ｍＬの組換えＩＬ−２、及び５０ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ−７を加えた１００μＬのＩＬＣ２培地に、１×１０^６／ｍＬの密度で入れた。これらのプレートで細胞を２日間増殖させ、次いで、４８ウェルのＴＣコーティングした平底プレートに移して更に３日間置いた。５日目に、１００ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−３３（最終濃度）を添加した。６日目に、細胞を回収し、無菌ＰＢＳで２回洗浄し、滅菌生理食塩水中に５×１０^５／ｍＬで再懸濁した。

ＩＬＣ２の受動移入
雌性Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスの尾静脈内に、１００μＬのＩＬＣ２細胞懸濁的（０．５×１０^６細胞）又は等量の生理食塩水（対照）を注射した。４１日目に、ＣＯ_２吸入によりマウスを安楽死させた。安楽死させたマウスを、可変速度ポンプ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃１３−８７６−１）を使用して速度４．５の「高速」で３分間、灌流緩衝液を経心的に直ちに灌流し、全ての血液を除去した。骨髄を上記のように単離した。実施例１に記載されるように、単一の髄膜細胞を単離した。次いで、ＦＡＣＳを用いて細胞を分析した。

移入から５週間後、全ての動物は、髄膜（図２）、肺、及び大腿骨骨髄におけるＩＬＣ２の生着を示し、生着した細胞は、養子組織に対応する異なるマーカーシグネチャーを有していた。ＩＬＣ２が髄膜生着したマウスの小膠細胞は、ＰＢＳ対照に対して活性化マーカーの減少を示した（例えば、図６Ａ〜６Ｉ参照）。小膠細胞の密度は、恐らくは活性化の低下の結果として、ＩＬＣ２を移入したマウスの海馬において減少した。

実施例５．ＩＬ−１０はアラーミン活性化後にＩＬＣ２によって産生される
末梢組織内のＩＬＣ２は、アラーミンによって活性化されることが示されている（Ｖａｎｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，８（３３７）：３３７ｒａ６５）。ＩＬ−３３は、これまでに髄膜ＩＬＣ２を活性化することが示されており（Ｇａｄａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１７；２１４（２）：２８５−２９６）、絶対数、Ｋｉ−６７標識、サイトカイン標識（データ示さず）、及びＩＬ−３３処理マウスの静脈洞におけるＧａｔａ３^＋ ＩＬＣの高密度集団の全組織標識（図１Ｅ）によって確認された。

ｍＩＬＣ２の全トランスクリプトームを調べるため、マウス（ｎ＝２０／群、２つの独立した群）に、ＰＢＳ、ｒＩＬ−２５又はｒＩＬ−３３（両方とも０．０３３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。次に、ｍＩＬＣ２を選別し、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑ分析を行った。階層的クラスター化によって、処理対ＰＢＳ群で明らかな差異が示された。純度試験から予想されたように、階層的クラスター化は、標準的ＩＬＣ２関連因子の存在を反映した（図１Ｆ、１Ｇ_{ｉ〜ｉｉｉ}）。しかしながら、驚くべきことに、ＩＬ−１０はこれらでさえも現れ、＞１１ ｌｏｇ２倍上方制御された（図１Ｇ_ｉｉ）。髄膜ＩＬＣ２によるＩＬ−１０産生は予想外であった。腸内では「ＩＬＣ_ＲＥＧ」、肺では「ＩＬＣ２_１０」と称される組織特異性非標準的新規自然サブセットによるＩＬ−１０産生が報告されている（Ｓｅｅｈｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかしながら、ＩＬＣ_ＲＥＧについて記載されるＩｄ３依存性とは対照的に、本明細書に記載される結果は、Ｉｄ２顕性とＩｄ３の欠如を示した（図１Ｇ_ｉ）。同様に、ロバストなＩｌ１３転写物レベル（図１Ｆ、１Ｇ_ｉｉ）は、Ｉｌ１３発現を欠くと報告されている肺特異性ＩＬＣ２_１０から分岐している。一般に、髄膜ＩＬＣ２は、トランスクリプトーム及び表現型マーカーの両方によって、新規系統ではなく、標準的ＩＬＣ２と同一であると明確にマッピングされる。

転写データを確認するために、いくつかの方法を用いてＩＬ−１０タンパク質産生を調べた。最初に、髄膜ＩＬＣ２をＩＬ−３３処理マウスから選別し、ＩＬ−２及びＩＬ−７を含む培養液中で維持し、次いでＩＬ−３３で再刺激した。ＦＡＣＳ分析は、これらの細胞がＳＴ２を発現しており、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１０に対しても強い陽性であることを示し（図１Ｈ）、培養物上清のＬｕｍｉｎｅｘ分析により、ＩＬ−１０放出が確認された（図１Ｉ）。細胞培養物のアーチファクトの可能性を排除するため、次に、細胞をＩＬ−３３処理マウスから急性的に単離し、細胞内標識により、かなりの部分の髄膜ＩＬＣ２がＩＬ−１０陽性として明らかにされた（図１Ｊ）。最後に、ＩＬ−１０抗体捕捉試薬を使用して、ＩＬ−３３処理Ｒａｇ２^−／−マウスの髄膜の急性的ｅｘ ｖｉｖｏ調製物において二光子タイムラプス顕微鏡法を行った。ＣＤ９０^＋細胞は、生体組織における経時的な抗ＩＬ−１０抗体の蛍光を蓄積し（図１Ｋ）、放出後の直接ＩＬ−１０捕捉と一致した。

上記実験では、ＩＬＣ２を、比較のため非髄膜組織からも急性的に単離した。驚くべきことに、頭蓋冠、脛骨、及び肺由来のＩＬＣ２もまた、ＩＬ−１０に対する陽性標識を示し（データは示さず）、ＩＬＣによるＩＬ−１０産生が、これまで示唆されていたように組織特異性ではない可能性があることを示唆している。これらの観察結果に基づいて、ＩＬ−１０の応答能についてヒトＩＬＣ２を試験した。これを行うため、ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ１１ｃ⁻ＦｃεＲ１⁻ＣＤ１２７^＋ＣＲＴＨ２^＋ＣＤ１６１^＋細胞を健康ドナーの血液より選別し、マウスＩＬＣ２と同じ条件で培養した。その後の上清の分析により、ＩＬ−３３刺激後のＩＬ−１０放出が示され（図１Ｋ及び１Ｌ）、ヒトＩＬＣ２が実際にＩＬ−１０産生可能であることを示している。全体的に、これらの結果は、ＩＬＣ２がＩＬ−３３刺激後にＩＬ−１０を生成するといういくつかの証拠を提供する。更に、これらのデータは、ＩＬ−１０産生が、ほとんどのＩＬＣ２に共通する、これまで認識されていない特性であり得ることを示唆する。

実施例６．ＩＬＣ２由来因子は小膠細胞ＬＰＳ応答を抑制する
次に、ＩＬＣ２によるＩＬ−１０産生が小膠細胞活性化を抑制するかどうかを判定するために、ｍＩＬＣ２及び小膠細胞を一緒に共培養した。最初に、ＩＬＣ２をＩＬ−３３処理マウスから選別し、小膠細胞を未処理マウスから選別した。次いで、小膠細胞を、単独、又はＩＬＣ２と共に、又はＩＬＣ２上清と共に培養し、続いてＬＰＳ刺激を行った。ＩＬ−３３に結合させ、ＩＬ−３３の受容体も発現する小膠細胞に依然として存在する直接効果を遮断するために、可溶性ＳＴ２を３００ｎｇ／ｍＬの濃度で全ての条件に含めた。

Ｌｕｍｉｎｅｘにより測定したとき、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０のタンパク質レベルは、ＬＰＳ含有／非含有で小膠細胞のみを含むウェルと比較して、ＩＬＣ２又はＩＬＣ２上清のいずれかを含有するウェル中でより高かった。ＩＬ−１０及びＩＬ−１３の両方のレベルは、上清単独と比較して、上清及びＬＰＳで処理された小膠細胞において低減され、活性化された小膠細胞によるＩＬ−１０及びＩＬ−１３の活発な消費と受容体結合を示唆した。この解釈は、小膠細胞が受容体を発現していないＩＬ−５レベルに差が見られなかったという観察によって強固になった。いくつかの他のサイトカイン及びケモカインについても分析し、一部はＩＬＣ２又はＩＬＣ２上清によるほぼ完全な抑制（例えばＩＬ−６）、他は部分的抑制（ＴＮＦ−ａ）又は抑制なし（ＣＸＣＬ１０）を示し、小膠細胞に対する単純な毒性因子ではなく特異性を示唆した。ＩＬ−１０媒介効果を特異的に決定するために、ＩＬ−１０（３００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ１０ｒａ（３００ｎｇ／ｍＬ）中和抗体の両方を２４時間添加して実験を繰り返した。ＩＬ−１０の中和により、サイトカイン及びケモカインレベルの上昇が再出現することによって証明されるように、小膠細胞応答の抑制が無効化された。この結果は、ＩＬＣ２由来ＩＬ−１０が、観察された小膠細胞抑制に主に関与していたことを強く示唆した。

実施例７．ヒトＩＬＣ２細胞はＩＬ−１０を産生する
ヒトＩＬＣ２細胞が、マウスＩＬＣ２で見られるようにＩＬ−１０を産生し得ることを確認するために、ヒト細胞を用いて同様の実験を行った。ＩＬＣ２（Ｌｉｎ−ＩＬ７ｒａ＋ＣＲＴＨ２＋ＣＤ１６１＋）を６人の別々の正常ヒト血液ドナーから選別し、ＩＬ−３３刺激の有無でマウスＩＬＣ２と類似の条件で培養し、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアッセイを用いてサイトカイン含量について上清を分析した。６人のうち５人のドナー由来のＩＬＣ２は、ＩＬ−３３刺激後にＩＬ−１０（及び陽性対照としてＩＬ−１３）のレベルが増加した。これは、ヒトＩＬＣ２がＩＬ−１０産生可能であったことを示唆した。ＩＬＣ２がＩＬ−１０を産生する能力において固有であることを調べるために、更なるサンプルを得たが、今回は、ＩＬＣ１、２、及び３について選別した。細胞を、ＩＬＣ１、２、又は３のサブタイプの補強に適切な因子（それぞれ、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１５、ＩＬ−３３、及びＩＬ−１ｂ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−２３）を含有する培地中でインキュベートした。３つの細胞型全ての上清中のサイトカインレベルを、前述のように測定した。ＩＬＣ２を含有するウェルは、ＩＬＣ１又は３のいずれかを含有するウェルよりも有意にＩＬ−１０及びＩＬ−１３を示した。１人のドナー由来のＩＬＣ３上清はＩＬ−１０を示し、ＩＬＣ３もＩＬ−１０を産生する可能性を示唆している。これらの結果は、ヒトＩＬＣ、特にＩＬＣ２がＩＬ−１０を産生可能であるという更なる証拠を提供した。

実施例８．ＩＬＣ２分泌因子は小膠細胞炎症を抑制し、ＩＬ−１０の中和が抑制を無効にする
ＩＬ−３３処理マウス由来のＩＬＣ２及び未処理マウス由来の小膠細胞を単離し、小膠細胞炎症因子の抑制に対するＩＬＣ２の能力を試験した。小膠細胞を、単独で、直接ＩＬＣ２と共に、又はＩＬＣ２由来の上清と共に培養した後、ＴＬＲ７／８アゴニストであるＲ８４８（ＩＭＱと同様に、細胞培養に十分に適している）を含む培地、又はアゴニストを含まない対照培地に変更した。ＩＬＣ２上清由来のＩＬ−３３によるＳＴ２＋小膠細胞に対する任意の考えられる直接効果を遮断するため、可溶性ＳＴ２を含めた。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１０は全て、ＩＬＣ２（拡張データ）又はＩＬＣ２上清のいずれかを含有するウェルから測定されたが、小膠細胞のみを含有するウェルの上清では検出されず（ＩＬ−５、ＩＬ−１３）、又はわずか（ＩＬ−１０）であり（図５Ａ）、小膠細胞がこれらの因子の重要な供給源ではないことを示した。いくつかの他のサイトカイン及びケモカインも、特異性を示唆する不均一な抑制パターンで測定された（図５Ｂ）。ＩＬＣ２及び上清の両方が同様の効果を示したため、可溶性因子が直接細胞接触より恐らく優先されると結論付けた。炎症促進性サイトカインに加えて、小膠細胞は、細胞外マトリックス成分の酵素的分解によって、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍｍｐｓ）、特に、神経毒性において重要な役割があるＭｍｐ９、及びＢＢＢ２５−２７を産生する。次に、Ｍｍｐｓは、メタロプロテアーゼ（Ｔｉｍｐ）ファミリーの組織阻害性メンバーによって逆制御される。Ｔｉｍｐ１メッセージは、ＲＮＡｓｅｑによると活性化ＩＬＣ２中で高度に（６．７ Ｌｏｇ２倍、調整済みｐ＜０．０２）上方制御され、ＩＬ−３３活性化ＩＬＣ２由来の上清のタンパク質分析によって確認された（図５Ｃ）。予想されるように、小膠細胞は、Ｒ８４８負荷後、Ｍｍｐ９の産生が強く増加したことを示し（図５Ｄ）、これは、活性化ＩＬＣ２由来の上清によって強力に抑制された（図５Ｅ）。

ＩＬＣ２上清によるこれらの因子の抑制におけるＩＬ−１０の重要性を調べるために、ＩＬ−１０及びＩＬ−１０ｒαに対する中和抗体を次にアッセイに含めた。抗体のみで処理されたウェルでＩＬ−１０シグナルがほぼ完全に消失したことから、抗体による遮断が有効であったことが示された（図５Ｆ）。したがって、サイトカイン及びケモカイン（図５Ｇ）レベルの上昇が再出現することによって証明されるように、ＩＬ−１０の中和により抑制が無効化された。ＩＬ２、小膠細胞、及びＭｍｐ９の調節間の関係は、予想どおりに、ＩＬ−１０及びＴｉｍｐ１に関してやや複雑であった。Ｍｍｐ９の産生はＩＬ−１０によって直接的に負に調節されるが、自身がＩＬ−１０３１によって誘導され得るＴｉｍｐ１によっても調節されることが示された。Ｔｉｍｐ１はまた、オートクリン並びにパラクリン様式で作用することも示された。したがって、ＩＬ−１０とＴｉｍｐ１との組み合わせは、Ｔｉｍｐ１の非存在下でＩＬ−１０に対する優れたＭｍｐ９抑制を示すと予想される。この裏付けとして、ｒｍＩＬ−１０は実際にＭｍｐ９を抑制したが、完全であったＩＬＣ２上清よりも非確定低い程度であった（図５Ｈ）。この可能性の更なる試験では、Ｉｌ１０−／−マウス由来のＩＬＣ２と野生型マウス由来のＩＬＣ２の上清の、非刺激及びＲ８４８刺激小膠細胞に対する影響を、総Ｔｉｍｐ１タンパク質分泌の点で比較し、ＩＬ−１０の存在により、いずれかの条件においてＴｉｍｐ１レベルを増加させることが見出された（図５Ｉ）。ＩＬ−１０とＴｉｍｐ１との間の相乗効果は、Ｍｍｐ９／Ｔｉｍｐ１比によって示唆され、ＩＬ−１０及びＩＬ−１０ｒａの遮断は、ＩＬＣ２上清によって媒介される抑制を強く取り消すのに十分である（図５Ｊ）。

全体として、これらのデータは、髄膜ＩＬＣ２が、炎症性サイトカイン及びケモカイン産生のみならずＭｍｐ９などのＭｍｐｓによるＢＢＢの分解も抑制するように、複数の方法で機能する可能性が高いことを示唆している。ＩＬ−１０は、Ｍｍｐ９の抑制因子として直接的に、またＴｉｍｐ１を介して間接的に、二重の役割を果たすことが更に示唆されている。活性化髄膜ＩＬＣ２で上方制御される、ＲＮＡｓｅｑデータによって強調される他の因子、例えば、アンフィレギュリン、アルギナーゼもまた、ＢＢＢ保護及び神経炎症の抑制において役割を果たし、更なる調査を受けることができる。

受動移入されたＩＬＣ２は髄膜内に生着し、神経炎症のＩＬ−１０依存性抑制を示す
ＩＬＣ２単独で小膠細胞の表現型に影響を与え、ｉｎ ｖｉｖｏで神経炎症を抑制し得るかどうか調べるため、また、Ｒａｇ２^−／−とＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスとの間で観察された違いが、発生上の差異か、又は小膠細胞のＩＬ−２受容体共通のγ鎖の欠損かのいずれかによるものである可能性を排除するため、成体Ｒａｇ２^−／−γｃ^−／−マウスへのＩＬＣ２のｉ．ｖ．養子移入を行った。ＣＤ４５＋Ｌｉｎ−ＣＤ９０＋ＳＴ２＋ＧＡＴＡ３＋細胞のロバストな髄膜生着が確認され（図６Ａ）、生着した髄膜ＩＬＣ２の機能性を、ＩＬＣ２を移入したＲａｇ２^−／−γｃ^−／−マウス由来の培養髄膜の上清が、ＩＬ−５の検出について陽性であり、対照ではなかったことから確立した（図６Ｂ）。急性的に単離された脳のその後の検査では、側方散乱は有意に減少し（図６Ｃ〜Ｄ）、小膠細胞活性化マーカーの発現は、ＰＢＳ処理したＩＬＣ欠損対照と比較して著しく減弱した（図６Ｄ）。これらのデータから、ＩＬＣ２単独では、ベースラインの小膠細胞の表現型を調節するのに十分であることが示唆されたため、特に考えられるＩＬＣ２ベースの治療用途への効果を考慮して、生着したＩＬＣ２が神経炎症を抑制できるかどうかを試験することが求められた。

これを調べるために、ＩＭＱ負荷前のＩＬＣ２の養子移入も実施した。全脳サンプルを骨髄細胞について選別した場合、小膠細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５Ｍｉｄ）の数は、群間で違いがなかった（データは示さず）が、ＩＬＣ２が生着したマウスの脳は、ＩＬＣ欠損対照の脳よりも有意に少ない単球を含有し（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５ＨｉＬｙ６ｃＨｉ）、ＩＬＣ２を補充することで、浸潤を鈍らせるのに十分であったことを示唆した（図６Ｅ）。また、マウスあたり同等数の小膠細胞についても脳から選別し、培養液中に入れ、分泌因子について上清を分析したところ、ＩＬＣ２が生着したマウスの脳由来の小膠細胞が、主にケモカインレベルの観点で抑制されたプロファイルを示したことが明らかになった（図６Ｆ）。

更に、ＩＬ−１０の遮断が細胞浸潤及び小膠細胞炎症を阻害するＩＬＣ２移入の能力に影響を及ぼすかどうかを判定するために、上記実験を繰り返したが、今回はＩＭＱ処理の２日目及び３日目に、ＩＬ−１０に対する中和抗体を注入した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験と同様に、ＩＬ−１０の遮断は、炎症促進因子の小膠細胞からの放出に対するＩＬＣ２移入の抑制効果を無効にした（図８）。最後に、マウスを野生型又はＩｌ−１０^−／− ＩＬＣ２のいずれかと共に養子移入して、細胞特異的なＩＬＣ２由来ＩＬ−１０の重要性を調べた。ここでも、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果によって示唆されるように、野生型では、ただしＩｌ１０^−／− ＩＬＣ２ではなく、移入により、エバンスブルー染色（図６Ｇ）及び単球による実質浸潤（図６Ｈ）の両方が遮断された。これらの観察と同様に、小膠細胞の上清は、野生型ＩＬＣ２を移入されたマウスの免疫因子の抑制を示したが、Ｉｌ１０^−／− ＩＬＣ２を移入されたマウスから単離された小膠細胞は、抑制の証拠をほとんど示さず（図６Ｉ）、ＩＬＣ２由来ＩＬ−１０の重要性を示唆した。

要するに、これらの結果は、ＩＬＣ２分泌因子が、繊細なＣＮＳ組織を保護する関門の強化、及び関連する小膠細胞炎症の抑制における恐らくいくつかの機構的役割のうちの１つを果たすことができることを示唆した。実際、このような活性は、ＩＬ−１０もまた顕著な役割を果たす、腸などの末梢粘膜組織で示されるＩＬＣ媒介関門調節と一致した。

当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

〔実施の態様〕
（１） 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための方法であって、治療有効量の活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を前記対象に投与することを含む、方法。
（２） 前記活性化ＩＬＣ２が、前記ＩＬＣ２をＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、及びＩＬ−７、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと接触させることによって活性化される、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記ＩＬＣ２が遺伝子改変されており、好ましくは、前記ＩＬＣ２が、それ以外は同一の非改変細胞と比較して、ＩＬ−１０産生の増加のために遺伝子改変されている、実施態様１に記載の方法。
（４） 前記治療有効量の活性化ＩＬＣ２が、前記対象に静脈内又は髄腔内投与される、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記ＩＬＣ２が髄膜のＩＬＣ２である、実施態様１に記載の方法。

（６） 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための方法であって、治療有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
（７） 前記薬剤が、前記対象において髄膜のＩＬＣ２の数を増加させる、実施態様６に記載の方法。
（８） 前記薬剤が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、又はこれらの組み合わせである、実施態様６又は７に記載の方法。
（９） 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための方法であって、有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
（１０） 前記薬剤が、前記対象において活性化された髄膜のＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生を増加させる、実施態様９に記載の方法。

（１１） 前記薬剤が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、又はこれらの組み合わせである、実施態様９又は１０に記載の方法。
（１２） 前記対象が、小膠細胞活性化又はＢＢＢの透過性増加に関連する障害の治療を必要としている、実施態様１〜１１のいずれかに記載の方法。
（１３） 前記対象が、神経変性疾患、炎症性障害、神経心理学的障害、慢性疼痛、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、又はウイルス若しくは細菌感染の治療を必要としている、実施態様１２に記載の方法。
（１４） 前記対象が、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、老化、髄膜炎、及び脳卒中からなる群から選択される神経変性疾患の治療を必要としている、実施態様１３に記載の方法。
（１５） 前記対象が、うつ病、不安、双極性うつ病、及び統合失調症からなる群から選択される神経心理学的障害の治療を必要としている、実施態様１３に記載の方法。

（１６） 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための方法であって、有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
（１７） 血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減を必要とする対象における血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減のための方法であって、治療有効量の、活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤、又は、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０若しくはＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
（１８） 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の単離された活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）又は遺伝子改変された活性化ＩＬＣ２と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
（１９） 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
（２０） 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

（２１） 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

Claims (21)

1. 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための方法であって、治療有効量の活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）を前記対象に投与することを含む、方法。
2. 前記活性化ＩＬＣ２が、前記ＩＬＣ２をＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、及びＩＬ−７、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと接触させることによって活性化される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＩＬＣ２が遺伝子改変されており、好ましくは、前記ＩＬＣ２が、それ以外は同一の非改変細胞と比較して、ＩＬ−１０産生の増加のために遺伝子改変されている、請求項１に記載の方法。
4. 前記治療有効量の活性化ＩＬＣ２が、前記対象に静脈内又は髄腔内投与される、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＩＬＣ２が髄膜のＩＬＣ２である、請求項１に記載の方法。
6. 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための方法であって、治療有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
7. 前記薬剤が、前記対象において髄膜のＩＬＣ２の数を増加させる、請求項６に記載の方法。
8. 前記薬剤が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、又はこれらの組み合わせである、請求項６又は７に記載の方法。
9. 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための方法であって、有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
10. 前記薬剤が、前記対象において活性化された髄膜のＩＬＣ２によるＩＬ−１０の産生を増加させる、請求項９に記載の方法。
11. 前記薬剤が、ＩＬ−３３、ＩＬ−２５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、又はこれらの組み合わせである、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記対象が、小膠細胞活性化又はＢＢＢの透過性増加に関連する障害の治療を必要としている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記対象が、神経変性疾患、炎症性障害、神経心理学的障害、慢性疼痛、外傷性脳損傷、脊髄損傷、視神経炎、又はウイルス若しくは細菌感染の治療を必要としている、請求項１２に記載の方法。
14. 前記対象が、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、老化、髄膜炎、及び脳卒中からなる群から選択される神経変性疾患の治療を必要としている、請求項１３に記載の方法。
15. 前記対象が、うつ病、不安、双極性うつ病、及び統合失調症からなる群から選択される神経心理学的障害の治療を必要としている、請求項１３に記載の方法。
16. 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための方法であって、有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
17. 血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減を必要とする対象における血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性低減のための方法であって、治療有効量の、活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤、又は、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０若しくはＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
18. 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の単離された活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）又は遺伝子改変された活性化ＩＬＣ２と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
19. 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）の数を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
20. 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＩＬ−１０の産生を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
21. 小膠細胞活性化の低減を必要とする対象における小膠細胞活性化の低減のための医薬組成物であって、治療有効量の、前記対象において活性化ＩＩ型自然リンパ系細胞（ＩＬＣ２）によるＴｉｍｐ１の産生を増加可能な薬剤と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

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