KR20230087351A - 전분화능 줄기세포 기반 혈관성 인지장애 및 치매 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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이만렬
박세필
김은영
정형민
홍기성
이승은
박민지
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주식회사 미래셀바이오
제주대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 인지장애 및 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포는 성체 줄기세포 유래 중간엽줄기세포보다 뇌혈관 손상에 의한 행동 및 인지 기능 저하를 정상 수준으로 빠르게 회복시키고, 뇌혈관의 안정성과 혈관-뇌 장벽의 형성을 촉진시키는바, 혈관성 인지장애의 예방 및 치료에 효과적인 세포치료제로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명은 가장 효과적으로 혈관성 인지장애를 치료할 수 있는 중간엽줄기세포 투여방법을 제공하여 임상 적용에 가이드로 제공될 수 있다.

Description

전분화능 줄기세포 기반 혈관성 인지장애 및 치매 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating vascular cognitive impairment and vascular dementia based on pluripotent stem cells}
본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 혈관성 인지장애 및 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 골수, 제대혈, 지방, 근육 등의 조직으로부터 분리될 수 있는 다분화능을 가진 세포로서 세포재생, 분비 단백질, 항염증 효과 등을 기대할 수 있는 세포치료제로서 가장 주목받고 있는 세포 자원이다. 현재까지의 성체줄기세포 연구는 대부분 골수 (bone marrow)에서 이루어져 있고 일부에서는 지방조직 (adipose tissue) 혹은 제대혈 (cord blood)에서 줄기세포를 분리 및 배양하여 투여하는 방식으로 이루어졌다. 그러나 골수 및 지방조직 세포는 침습적인 방법으로 채취되며, 뇌졸중이 주로 발생하는 장년기나 노년기 환자에서 분리한 줄기세포의 경우 분화능 및 증식력이 감소하는 단점이 있다.
뇌졸중을 포함한 허혈성 뇌혈관 질환 발병 후 인지 장애의 높은 발병률에도 불구하고 임상에서 사용할 수 있는 치료제는 현재 매우 제한적이다. 치료제의 부재는 단기 및 장기적으로 뇌졸중 후 인지장애 후유증과 혈관성 치매의 발병률을 늘릴 뿐 아니라, 알츠하이머 치매의 위험도를 높인다.
늘어나는 노인인구와 뇌졸중 발병률에도 불구하고, 급성기 허혈성 뇌졸중 치료 분야가 눈부시게 발전해 환자 사망률은 낮추고 있지만, 인지장애 후유증은 개선되지 않고 환자 생존 이후 오히려 더 증가하고 있어 이로 인한 경제적 사회적 부담은 심각한 상태이다. 늘어나는 인지장애 후유증 발병 대비 국가의 간병 보호 제도와 재활 시설 확충에 대한 여건이 따라오지 못해 환자와 가족의 부담이 늘고 사회 경제적 손실 또한 심각한 수준이다. 따라서 허혈성 뇌졸중 이후 인지장애 후유증 및 치매에 대한 적절한 치료와 예방을 위하여 기존의 방식과 다른 좀 더 적극적이고 혁신적인 치료법 개발이 시급히 요구되고 있다.
본 발명자들은 임상에 적용할 수 있는 수준의 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cell. hESC-MSC)를 이용한 세포치료제 개발에 예의 연구한 결과 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포를 허혈성 치매의 치료에 적용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Lessons from a Mouse Model Characterizing Features of Vascular Cognitive Impairment with White Matter Changes. Journal of Aging Research 2011: 978761.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(hESC-MSC, MMSC)를 포함하는 혈관성 인지장애 및/또는 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)를 포함하는 허혈성 뇌졸중 후 인지장애 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)를 유효성분으로 포함하는, 혈관성 인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 혈관성 인지장애는 인지기능 저하 정도에 따라서 혈관성 경도인지장애 내지 혈관성 치매로 구분될 수 있고, 본 발명에서 예방 또는 치료의 대상이 되는 혈관성 인지장애는 그 정도에 구애되지 아니하고 뇌혈관 질환에 의한 인지기능 저하를 증상으로 나타내는 질환을 모두 포함한다. 본 명세서에서 용어 혈관성 인지장애는 허혈성 인지장애와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)는 상기 혈관성 인지장애 예방 또는 치료를 위한 세포치료제로 제공될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 전분화능 줄기세포는 역분화 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)일 수 있으며, 배아줄기세포(ESC)일 수 있으나, 본 발명의 구체적 실험에서는 배아줄기세포를 이용하여 중간엽줄기세포를 수득하여 이의 허혈성 인지장애에서 인지기능 및 운동성 향상 효과를 확인하였다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 약학적 조성물 또는 세포치료제는 인체를 대상으로 투여되는 경우 1회 투여시 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)가 1 × 105 내지 1 × 107개, 바람직하게는 1 × 106 내지 5 × 106개, 더욱 바람직하게는 약 3 × 106 개 투여되도록 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 약학적 조성물 또는 세포치료제는 주사제 형태로 제공될 수 있으며, 개체의 뇌실(ventricle) 내에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 개체에 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(MMSC)를 투여하는 단계를 포함하는 혈관성 인지장애 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전후로 개체의 인지기능을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 투여 이후의 인지기능 평가 결과를 투여 전의 인지기능 평가 결과와 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 방법은 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)를 개체의 단위 체중(1kg)당 1 × 106 내지 5 × 106개를 1회/1일 이상 투여하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여가 2회 이상 수행되는 경우 약 1주일의 시간을 두고 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 방법은 상기 개체가 인간을 제외한 포유동물인 경우 하기 (1) 내지 (5) 중에서 1이상의 행동인지 분석을 인지기능 평가를 위한 수단으로 이용할 수 있다: (1) Y-maze test, (2) Barnes maze test, (3) Open field test, (4) Passive avoidance test, 및 (5) Rotarod test.
또한, 본 발명은 혈관성 인지장애의 예방 또는 치료 약제 제조를 위한 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(MMSC)는 하기 단계를 수행하여 수득되는 것일 수 있다:
(a) 인간 전분화능 줄기세포를 70회 이하, 바람직하게는 40~60회 계대 배양하는 단계;
(b) 상기 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 낭성 배상체를 선별하는 단계;
(c) 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체의 상부에 로딩하고 상기 배양삽입체의 하부로 이동한 중간엽 줄기세포의 군집을 분리하는 단계; 및
(d) 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 군집 중 단층 형태의 군집만을 분리하는 단계.
본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)는 성체 줄기세포 유래 중간엽줄기세포보다 뇌혈관 질환 이후 발생한 뇌손상에 의한 행동 및 인지 기능 저하를 정상 수준으로 빠르게 회복시키고, 뇌혈관의 안정성과 혈관-뇌 장벽의 형성을 촉진시키는바, 혈관성 인지장애의 예방 및 치료에 효과적인 세포치료제로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명은 가장 효과적으로 혈관성 인지장애를 치료할 수 있는 중간엽줄기세포 투여방법을 제공하여 임상 적용에 가이드로 제공될 수 있다.
도 1a은 마이크로코일(microcoil)을 이용한 양측경동맥협착모델(bilateral carotid artery stenosis, BCAS) 제작의 모식도와 마이크로코일 삽입 시 수술 부위의 사진이다.
도 1b는 실험 계획의 모식도이다.
도 2는 BCAS로 허혈성 치매를 유도한 동물모델에서 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC) 1회와 2회, 골수 유래 중간엽줄기세포(BMSC), 및 도네페질(Done) 투여에 따른 효과를 확인하기 위한 Y-maze test 결과이다.
도 3은 BCAS로 허혈성 치매를 유도한 동물모델에서 MMSC 1회와 2회, BMSC, 및 Donepezil 투여에 따른 효과를 확인하기 위한 Barnes maze test 결과이다.
도 4는 BCAS로 허혈성 치매를 유도한 동물모델에서 MMSC 1회와 2회, BMSC, 및 Donepezil 투여에 따른 효과를 확인하기 위한 Passive avoidance test 결과이다.
도 5는 BCAS로 허혈성 치매를 유도한 동물모델에서 MMSC 1회와 2회, BMSC, 및 Donepezil 투여에 따른 효과를 확인하기 위한 Open field test 결과이다.
도 6은 BCAS로 허혈성 치매를 유도한 동물모델에서 MMSC 1회와 2회, BMSC, 및 Donepezil 투여에 따른 효과를 확인하기 위한 Rotarod test 결과이다.
도 7은 BCAS로 허혈성 치매를 유도한 동물모델에서 MMSC, BMSC, Donepezil 투여에 따른 Rock1 및 Rock2 유전자 발현 수준의 변화를 비교확인한 그래프이다.
도 8은 BCAS로 허혈성 치매를 유도한 동물모델에서 MMSC, BMSC, Donepezil 투여에 따른 Occludin, Claudin-5, 및 Cdh5 유전자 발현 수준의 변화를 비교확인한 그래프이다.
도 9는 BCAS로 허혈성 치매를 유도한 동물모델에서 MMSC, BMSC, Donepezil 투여에 따른 Ang1, Tie1 및 Tie2 유전자 발현 수준의 변화를 비교확인한 그래프이다.
도 10은 각 실험동물에서 대뇌 피질 조직의 H&E 염색 사진이다.
도 11은 각 실험동물에서 해마 조직의 H&E 염색 사진이다.
본 발명자들은 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)의 다양한 기능을 연구하며, 혈관성 인지장애 예방 및 치료에 적용 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
혈관성 인지장애는 뇌혈관질환에 의한 뇌손상 때문에 생긴 인지기능 저하를 의미하며 혈관성 경도인지장애(vascular mild cognitive impairment)부터 혈관성 치매(vascular dementia)까지 인지기능 저하 정도에 따라 구분될 수 있다.
혈관성 치매(vascular dementia, VD)는 혈관의 폐색이나 혈관 질환으로 발생한 만성 대뇌 저관류(chronic cerebral hypoperfusion)로 인하여 뇌의 혈류량이 감소하면서 점진적으로 기억력의 저하, 문제해결능력의 감퇴 및 사고 장애 등의 증상이 나타나는 질환으로 전체 치매 중 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease, AD) 다음으로 가장 큰 비율을 차지하고 있다. VD를 일으키는 병리적 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으나, AD와는 달리 만성 대뇌 저관류로 유도된 저산소증으로 인하여 산화 스트레스, 염증, 혈관 및 혈액-뇌 장벽(BBB)의 손상이 동반된다고 알려져 있다. 현재까지의 연구 결과를 살펴보면 혈류 감소로 인한 저산소증으로 유발된 산화 스트레스는 혈관과 신경세포에 손상을 일으키고, 이러한 손상은 주로 대뇌겉질(cerebral cortex), 해마(hippocampus), 백색질(white matter)에서 발생하여 기억 손상, 기분 장애, 문제해결과 수행기능의 상실과 같은 증상을 유발한다.
본 발명자들은 9주령의 마우스에 마이크로코일을 양측 경동맥에 삽입하여 양측경동맥결찰술(bilateral carotid artery stenosis, BCAS)을 수행하고, 수술 후 6주 경과시에 일련의 인지행동 평가 테스트를 수행하여 혈관성 치매 유도를 확인함으로서 혈관성 치매 동물모델을 수립하였다. 확립된 혈관성 치매 동물모델은 아무것도 처치하지 않은 VD 군과 중간엽줄기세포(MSC) 투여군, 혈관성 치매 약물로 공지된 도네패질(Donepezil) 투여군(Done 군)으로 구분하였으며, 중간엽줄기세포 투여군은 투여되는 중간엽줄기세포의 유래에 따른 효과 차이를 확인하기 위하여 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포 투여군(MMSC 군)과 골수 유래 중간엽줄기세포 투여군(BMSC 군)으로 구분하였다. 한편, MMSC 군은 투여 반복 횟수에 따른 효과 차이를 확인하기 위하여 1회 투여한 MMSCx1 군과 2회 투여한 MMSCx2 군으로 구분하였다. 각 실험동물군을 대상으로 (1) Y-maze test, (2) Barnes maze test, (3) Open field test, (4) Passive avoidance test, 및 (5) Rotarod test의 행동인지 분석을 수행하고, 마우스를 희생하여 좌반구, 대뇌피질, 해마를 각각 분리하고, 좌반구는 균질화하여 뇌혈관과 관련된 유전자의 발현 수준을 측정하였으며, 대뇌피질 및 해마는 조직을 절편화하여 H&E 염색을 수행하여 신경세포의 형태와 구조를 관찰하였다. 그 결과, 모든 MSC 투여군과 도네페질 투여군은 혈관성 치매 유도 후 아무것도 처치하지 않은 VD 군과 비교하여 전반적인 인지기능 및 운동기능을 회복시키는 효과를 나타내었으나, BMSC와 도네페질과 비교하여 MMSC 투여에 따른 인지기능 및 운동기능 회복의 효과가 보다 우수하였으며, MMSC를 반복투여한 MMSCx2 군에서 BCAS 수행에 따른 마우스의 운동 및 인지 기능 저하를 정상 마우스 수준으로 빠르게 회복됨을 확인하였다.
상술한 행동인지분석 결과는 분자생물학적 분석 결과에서 보다 분명하게 확인되었다. 구체적으로, 본 발명자들은 BCAS로 유도된 혈관성 치매와 관련된 특정 메커니즘을 확인하기 위해 각 실험 동물을 희생하여 뇌를 분리하고 Rock1, Rock2, Occludin, Claudin-5, Cdh5, Ang1, Tie1, 및 Tie2 유전자의 발현 수준을 확인하였다. Rock1 및 Rock2 유전자는 세포 골격과 내피 세포에서 밀착 접합과 접착 접합에 관여하는 단백질간의 상호 작용을 조절하며, BCAS 수행으로 VD 군에서 정상군과 비교하여 급격한 발현 증가를 확인할 수 있었으나, MMSC 투여에 따라서 정상 수준으로 회복됨을 확인하였다. 또한, Occludin, Claudin-5, 및 Cdh5는 BBB 단백질을 암호화하는 유전자로 BCAS 수행으로 VD 군에서 정상군과 비교하여 하향 조절되어 BBB 구조 붕괴를 시사하였으나, MMSC 투여는 이를 정상군과 유사한 수준으로 향상시킴을 확인하였다. 또한, Ang1, Tie1, 및 Tie2은 혈관 안정성과 관련된 지표로서 BCAS 수행으로 VD 군에서 정상군과 비교하여 하향조절이 확인되었으나, MMSC 투여는 이를 정상군과 유사한 수준으로 회복시켰다. 상술한 분자생물학적 지표는 MMSC 1회 투여보다 2회 투여시에 보다 정상군에 가깝게 회복되었으며, BMSC 및 도네페질 투여는 상기 지표에 거의 영향을 미치지 못함을 확인하였다. BBB는 뇌와 혈액 간의 세포 투과성을 제한하는 장벽으로 성상교세포와 혈관주위세포가 함께 지지하는 미세혈관 내피세포로 구성되고, BBB 구성 단백질의 감소는 혈관 안정화 마커의 감소와 동반된다. 상기 결과는 BCAS를 통한 혈관성 치매 유도는 BBB 단백질의 발현과 혈관 안정성에 관여하는 마커의 발현 수준을 감소시키고 Rock 발현을 통해서 BBB를 파괴시키지만, 이때 MMSC의 투여는 이를 다시 정상 수준으로 회복시켜 BBB를 재생시킴을 시사한다.
상기 결과로부터, 본 발명자들은 중간엽줄기세포 중에서도 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)가 효과적으로 혈관성 인지장애의 예방 및 치료를 위해 적용될 수 있으며, 이에 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)를 혈관성 인지장애의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제로 제공하고자 한다.
본 발명에서 중간엽줄기세포의 유래가 되는 인간 전분화능 줄기세포는 전분화능(pluripotency)을 가지는 줄기세포라면 제한되지 아니하며, 그 비제한적 예로 상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(ESC) 및/또는 유도만능 줄기세포(iPSC)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실험에서는 배아줄기세포 유래의 중간엽줄기세포(ESC-MSC)를 이용하였으며, 본 명세서에서 배아줄기세포는 전분화능 줄기세포의 일 예시로서 본 발명은 이에 제한되지 아니하고, 본 명세서에서 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포는 MMSC로 표시될 수 있으며, MMSC는 ESC-MSC와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 세포치료제로서 MMSC는 인간 전분화능 줄기세포 유래의 중간엽 줄기세포로서 그 제조는 KR 10-2280509에 기재된 '유사 중간엽줄기세포'의 제조방법과 동일하다.
보다 구체적으로, 인간 전분화능 줄기세포로부터 유사 중간엽 줄기세포를 분리하고 배양하였다. 인간 전분화능 줄기세포는 세포주 확립 후 70회 이하 계대 배양된 것을 이용하였다. 세포주 확립 후 70회 이하 계대 배양된, 인간 전분화능 줄기세포를 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 유지배양을 진행하였다. 유지배양된 인간 전분화능 줄기세포는 단순 효소처리에 의해 배양 플레이트로부터 분리하였다. 그리고, 배상체 형성을 통해, 낭성(Cystic) 배상체만 선별하였다. 세포투과성 3차원 배양삽입체를 새로운 배양 플레이트(6 well plate)에 결합시키기 전, 배양 시 최초 1회에 한하여, 새로운 배양플레이트에 먼저 2 ml의 배양액을 넣었다. 그리고, 2 ml의 배양액을 포함한 배양 플레이트에 세포투과성 3차원 배양삽입체를 결합시켰다. 그 후, 세포투과성 3차원 배양삽입체 내에 2 ml의 배양액을 추가로 넣고, 선별된 낭성 배상체를 결합된 세포 투과성 3차원 배양삽입체 위에 로딩하였다. 새로운 배양 플레이트에 넣은 배양액과 세포투과성 3차원 배양삽입체 내의 배양액은 EGM-2MV를 사용하였다. 낭성 배상체가 로딩된 세포투과성 3차원 배양삽입체 내의 배양액을 이틀동안 교체하지 않고 배상체를 배양하였다. 이후, 배양액을 제거하고, 세포투과성 3차원 배양삽입체 내에만 4 ml의 배양액을 추가로 넣고, 매일 배양액을 교체하여 유사 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하였다. 5-7일 동안 세포분화를 진행하였다. 상기 분리된 유사 중간엽 줄기세포에 있어서, 세포투과성 3차원 배양삽입체를 투과하여 세포투과성 3차원 배양삽입체의 아래로 이동한, 군집 형태의 세포를 분리하였다. 분리된 군집 중 다층(Multilayer) 형태의 군집은 기계적(mechanically)으로 제거하였다. 분리된 군집 중 단층(Monolayer) 형태의 군집만을 마이크로 파이펫 팁을 이용하여 가로 500 μm 이하, 세로 500 μm 이하의 크기로 잘라 균일화하여 선택적으로 배양하였다. 보다 바람직하게, 단층 형태의 군집은 가로와 세로 각각 100 μm ~ 500 μm의 크기로 균일화하여 유사 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 5-7일 동안 배양 후, 군집으로부터 단일세포 형태로 뻗어 나오는 유사 중간엽 줄기세포만을 분리하고, 계대 배양하여 증식시켰다. 단일세포 분리 전, 단일세포 형태가 아닌 군집 및 상피세포 모양의 세포들은 마이크로 파이펫 팁으로 완전히 제거하였다. 분리된 단일세포는 새로운 배양 플레이트로 옮겨 계대 배양을 통해 증식을 유도하였다. 이때, 배양 배지는 EGM-2MV를 사용하였다. 군집 형태의 유사 중간엽 줄기세포가 세포투과성 3차원 배양삽입체 아래로 이동하면, 세포투과성 3차원 배양삽입체를 배양 플레이트로부터 분리하였다. 분리된 세포투과성 3차원 배양삽입체의 아래로 이동한 군집 형태의 유사 중간엽 줄기세포를 수득한 후 다층(Multilayer) 형태의 군집은 기계적으로 제거하고, 단층(Monolayer) 형태의 군집의 크기를 균일화하여 선택적 배양하여 MMSC를 수득하였다.
이에, 본 발명에서 제공되는 세포 치료제로서 MMSC는 (a) 인간 전분화능 줄기세포를 70회 이하 계대 배양하는 단계; (b) 상기 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 낭성 배상체를 선별하는 단계; (c) 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체의 상부에 로딩하고 상기 배양삽입체의 하부로 이동한 중간엽 줄기세포의 군집을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 군집 중 단층 형태의 군집만을 분리하는 단계; 를 수행하여 수득되는 중간엽줄기세포인 것이 바람직하다.
본 발명에서 세포치료제는 상술한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에서 "세포치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명에서 중간엽줄기세포의 유래가 되는 인간 전분화능 줄기세포는 전분화능(pluripotency)을 가지는 줄기세포라면 제한되지 아니하며, 그 비제한적 예로 상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(ESC) 및/또는 유도만능 줄기세포(iPSC)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실험에서는 배아줄기세포 유래의 중간엽줄기세포(ESC-MSC)를 이용하였으며, 본 명세서에서 배아줄기세포는 전분화능 줄기세포의 일 예시로서 본 발명은 이에 제한되지 아니하고, 본 명세서에서 용어 ESC-MSC는 MMSC와 혼용될 수 있다.
본 발명의 예방 및/또는 치료 대상 질병은 인지기능 저하 정도에 무관하게 뇌혈관 질환에 의한 인지기능 저하 증상을 나타내는 혈관성 인지장애를 모두 포함하며, 본 명세서에서 혈관성 인지장애의 예방 및/또는 치료는 혈관성 치매 유도 동물모델을 통해 확인되었다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 상기 인지기능 저하를 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 인지기능 저하의 증세가 호전되거나 상기 증세의 원인이 되는 뇌혈관의 구조적 및 기능적 정상화로 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 바람직하게는 국소 투여를 위한 주사용액의 형태로 제형화되어 제공될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)를 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 혈관성 인지장애의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어, “개체”는 쥐, 가축, 생쥐, 인간 등 포유류일 수 있으며, 구체적으로 뇌혈관질환이 발생하여 인지장애 발생의 고 위험군에 속하는 반려견, 경주마, 인간 등일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 본 발명에 따른 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)를 세포치료제로서 인간에 투여하는 경우, 상기 줄기세포는 세포치료제를 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에 투여를 위한 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있으나, 바람직하게는 1일 1회 이상으로 투여되는 개체의 단위 체중(1kg)당 1 × 106 내지 5 × 106 개의 세포가 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 1 × 106 내지 5 × 106 개 세포의 유효용량으로 하루에 1회 이상 투여될 수 있으며, 1일 1회 반복 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포 (MMSC)이외에 공지된 상술한 혈관성 인지장애의 증상을 완화시키는 약물을 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실험 방법 및 재료]
1. 허혈성 치매 동물 모델 제작
10주령 수컷 마우스 (C57BL/6J, 24-29g)을 사용하였으며, 실험기간 내내 12/12 시간씩 규칙적인 명/암주기, 일정한 상대 습도 하에서 동물을 사육하였다.
수술을 위해 산소 가스 중 2 % 이소플루란(isoflurane)으로 마우스를 마취시키고, 중간 경추 부위 중심으로 V 모양으로 피부 절개를 통해 양측 경동맥을 노출하였다. 6-0 실크 봉합사로 한쪽 경동맥의 원위 부분 주위에 배치시키도록 한 후, 주변 조직을 박리하고 경동맥은 봉합사로 부드럽게 들어올린 후 0.18mm microcoil (Sawane Spring Co., Ltd.Hamamatsu, Japan)의 2-3번째 루프 사이에 위치시키고, 총경동맥를 중심으로 microcoil 회전하여 돌돌 말려 모든 코일이 총경동맥에 위치되도록 하였다. 반대쪽 경동맥 역시 동일한 크기의 다른 microcoil로 동일하게 장착하였다. (도 1a).
수술을 마친 후, 원위부 경동맥 혈류의 이상이 없는지 도플러로 확인하였다. 수술 중 가열 패드를 사용하여 체온을 37 ℃ ± 5로 유지하고, 1 분 이상 CBF(cerebral blood flow)가 중단되지 않도록 하였다. 양측 경동맥 협착 생성의 모든 절차는 일반적으로 30 분 간격을 제외하고 5분 이내에 수행하였다. 피부를 닫기 전에 코일의 원위부와 근위부의 총경동맥에서 혈류를 모두 확인하였다.
수술 당일과 다음날, 모든 마우스의 운동 기능의 결함을 확인하고, 수술 후 6주 이내에 혈관성 치매 유도를 정의하기 위해 일련의 행동 테스트를 수행하였다(도 1b).
2. 실험군
NT (Non-treatment group): 대조군으로 정상 마우스 분석.
VD (Vascular dementia group); 양측경동맥협착모델(bilateral carotid artery stenosis, BCAS)로 제작된 허혈성 치매 모델군
MMSCx1: 동종 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포 1회 투약군. (2.5*10^5)
MMSCx2: 동종 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포 2회 투약군. (2.5*10^5)
BMSC (Bone marrow derived mesenchymal stem cell): 골수 유래 중간엽줄기세포 투약군(2.5*10^5)
Done (Donepezil): 치료용 약물인 도네패질 투약군 (20mg/kg/saline)
3. 세포의 준비 및 줄기세포의 이식
허혈성 치매모델의 치료 효과를 확인하기 위해 세포치료제로써 MMSC와 BMSC를 준비하였다. 실험에 이용된 인간 배아줄기세포 유래 중간엽줄기세포(MMSC)는 미래셀바이오에서 생산된 GMP 완제품을 이용하였으며, 인간 골수 유래 중간엽줄기세포(BMSC)는 Lonza社에서 구입하여 이용하였다. 치료용 약물로는 Donepezil(sigma-aldrich)을 이용하였다.
세포치료제 투여는 뇌 정위적 방법 하에 뇌실내법으로 각각 진행하였다. 뇌실내 투여는 상대적으로 뇌혈류장벽의 취약함을 이용하여 뇌 정위적 방법으로 세포를 투여하여 보다 많은 세포가 뇌실질로 도달할 것으로 예상되는 루트로, 뇌실내 주입루트는 X +1.1.mm, Y posterior 0.5mm, Z depth 2.5 mm로 확보하였다. 뇌실 내 투여는 2.5 ×10^5개의 MSC가 포함된 10μl의 주사액을 해밀턴주사기 (26 gauge needle)를 이용하여 3분에 걸쳐서 서서히 2μl 주입하는 것을 통해 달성되었다. 비투여군(VD 군)은 동량의 PBS 생리 식염수를 같은 방법으로 주입하였다. 혈관성 치매 발생 후에 1주일째 Low dose 군(MMSCx1 군)과 high dose 군(MMSCx2 군) 모두에게 세포치료제를 2.5 ×10^5 1회 투여 완료하였으며, high dose 군에는 다시 1주일 뒤에 추가로 MMSC를 2.5 ×10^5를 투여하였다. 상술한 바와 같이, 최적의 전임상 프로토콜 확립을 위하여 동일한 줄기세포수를 뇌실내 1회 또는 2회 투여하고 6주차에 중간 결과를 확인해 이상시 투여 빈도와 경로에 대해 최적화 실험을 실시하였다.
4. 행동인지분석
1) Y-maze test
Y-maze test는 단기 기억 중 하나인 공간 작업 기억과 운동 활동 지수를 평가할 수 있는 검사로 실험시간은 한마리당 8분이다. Y자형 미로는 각각의 팔이 평면상에서 동일한 각도로 이루어져 있으며, 각각의 팔을 A, B, C 영역으로 지정하고, 마우스를 A 영역에서 시작하여 8분 동안 자유롭게 움직이게 하여 마우스의 움직임을 기록하였다. 미로의 팔(A, B, C)과 미로의 중앙에서의 마우스가 머무른 시간을 측정하였다. 챔버내의 밝기는 390lux 이다.
2) Barnes maze test
Barnes-maze test는 먹이와 안정감이 있는 은신처를 제공하여 실험 동물에게 긍정적 피드백을 주어, 시간이 지남에 따라 이러한 은신처를 찾아가는 시간과 거리의 변화를 분석하여 학습과 기억, 인지 유연성을 평가할 수 있는 테스트로 실험장비는 18개의 구멍이 있는 직경 90cm의 원형 검은색 플랫폼이다. 실험 단계에는 3가지가 있는데, 첫번째 실험단계는 훈련 단계로 탈출구를 찾아 입장하는데 3분을 지켜보고 두번째 실험단계는 탐색 단계로 탈출 상자와 원래 탈출 상자가 있던 사분면에서 보낸 시간을 측정한다. 각 마우스는 장치의 중앙에 배치되며 영역은 사분면(목표 영역), 목표 구멍(목적지), 오류 영역에서 보낸 시간이다. 이 실험을 4일 동안 반복하여 목표물을 찾는 시간을 확인한다. 실험챔버내의 밝기는 390lux이다.
3) Open field test
Open field test는 열린 공간에서 실험 동물이 본능에 의해 비교적 안전한 peripheral zone에서 활동한 거리와 시간을 분석하여 운동 활동과 불안을 확인할 수 있는 테스트로 45 x 45 x 40 (cm) 직경의 정사각형 오픈 필드를 사용하였다. 마우스를 필드 중앙에 위치시키고 10분 동안 자유롭게 이동할 수 있도록 하고 마우스의 움직임을 기록하였다. 중앙 구역과 주변 구역의 조도는 390lux이다.
4) Passive avoidance test
Passive avoidance test는 공포에 기초한 장기기억을 평가하는 검사이다. 처음에 밝은 메인박스에 마우스를 넣고 1분간 검색시간을 주고, 1분 후엔 마우스를 어두운 박스로 넣어 2초 후에 문을 닫는다. 그 다음 마우스에게 5초 동안 전기 충격을 준다. 다음날 다시 동일한 실험을 반복하여 마우스가 어두운 공간으로 들어가는데 걸리는 시간을 측정하여 전날의 시간과 비교한다. 실험은 4일 동안 반복한다. 광도는 메인 박스에서 390lux이다.
5) Rotarod Test
Rotarod Test는 실험 동물에게 시간의 흐름에 따라 점점 빨라지는 회전 레일을 걷게 하여 수평감각과 지구력을 축정하는 검사이다. 시작 속도는 4rpm으로, 가속 속도는 20rpm/min으로 최대 속도는 40rpm이다. 시작 후 지지대에서 떨어질 때까지 속도와 시간을 체크하여 검사한다. 이 실험은 4일 동안 반복한다. 광도는 390lux이다
6. 역전사 정량 실시간 PCR (RT-qPCR)
각 마우스의 동결된 좌반구 (200mg)를 준비하고 균질화한다. 표적 유전자의 mRNA 발현 정도를 결정하기 위해 easy-BLUE™ Total RNA Extraction Kit (iNtRON, Daejeon, Korea)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 마우스 뇌 조직에서 total RNA를 추출한다. 분리된 RNA의 농도와 품질은 NanoDrop 분광광도계 (NanoDrop Technologies, LLC; Wilmington, DE, USA)를 사용하여 결정한다. 다음으로 All-in-One 5 × First Strand cDNA Master Mix (CellScript, Madison, WI, USA)를 사용하여 1 μg total RNA를 사용하여 cDNA를 합성하고 TOPreal™을 사용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 수행한다. Rock1, Rock2, Occludin, Claudin-5, Cdh5, Ang1, Tie1, Tie2 mRNA 전사 수준은 CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템을 사용하여 검출한다.
7. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색
4% 파라포름알데히드(PFA)의 심장 내 주사에 의한 연속적인 관류 후, 뇌를 수확하고 밤새 4% PFA에 고정시킨다. 기존의 파라핀 포매 및 직렬 절편(5μm) 후, 조직을 각 단계 사이에 PBS로 5분씩 3회 헹구고 헤마톡실린과 에오신으로 염색한다. 이어서 섹션을 장착하고, 탈수하고, 커버슬립하고, Motic Easyscanone(Houston, TX, USA)에서 검사한다. H&E는 Motic Digital Slide 보조 시스템(Motic China Group Co., Ltd., Xiamen, China)으로 분석한다.
[실험 결과]
1. 행동인지분석 결과
1-1. Y maze test
도 2는 Y-maze test 결과이다.
도 2에 A는 실험 동물의 이동 경로를 중첩하여 시각화한 것으로, 왼쪽부터 대조군(NT), BCAS로 허혈성 치매를 유도한 VD 군, MMSC를 high dose로 투여한 MMSC×2 군이다. Y-maze의 모든 arm을 골고루 이동한 NT 군에 비해, VD 군은 다른 arm은 방문하지 않고 같은 arm을 반복하여 이동한 것을 확인할 수 있다. 그러나 이런 증상은 MMSC×2 군에서 개선되어 다시 NT 군의 이동 경로와 유사함을 나타냈다.
도 2에 B와 C는 Y-maze test의 alternation triplet (%)와 total arm entries를 정량한 결과이다. 대조군(NT)과 비교하여 가장 유사한 mean value를 보인 것은 MMSC×2 군이었다. VD 군은 NT 대비 매우 낮은 alternation triplet (%) mean value를 보여주었다. MMSCx1 군, BMSC 군, Donepezil 군은 비슷한 수준으로 허혈성 치매를 개선했지만, MMSC×2 군은 NT와 유사하게 상당한 수준으로 허혈성 치매를 개선하였다. Total arm entries의 횟수는 NT 군과 Done 군 간의 차이를 제외하곤 모두 비슷한 수준에 머물렀다.
각각의 군들은 1대1로 student t-test를 통한 통계 분석이 진행되었으며, 이에 따른 각 그룹 간 유의성을 *표시로 나타냈다(*= p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
1-2. Barnes maze test
도 3은 Barnes maze test 결과로, MMSC 투여는 MMSC×1 군과 MMSC×2 군 모두 탁월한 개선 능력을 보였다.
도 3에 A는 실험 동물의 이동 경로를 중첩하여 시각화한 것으로, 왼쪽부터 대조군(NT), BCAS로 허혈성치매를 유도한 VD 군, MMSC를 high dose로 투여한 MMSC×2 군이다. NT 군은 field의 중앙에서 시작하여 붉은 원의 목적지에 큰 지체없이 도착하였지만, VD 군은 목적지가 아닌 곳을 헤매며 결국 목적지에 도달하지 못하였다. 그에 반해, MMSC×2 군은 NT 군과 유사하게 합리적인 이동 거리로 목적지에 도달하였다.
도 3에 B는 각 군별 시간의 경과에 따라, 목적지에 도달하기까지 걸린 이동거리와 지연 시간을 나타낸다. VD 군은 매우 많은 이동거리와 지연 시간의 낭비를 보여주었고, VD 군을 제외한 모든 군은 비슷한 수준을 나타냈지만, 그중 MMSC×2의 군이 가장 좋은 성적을 나타내거나, 가장 NT 군과 유사한 성적을 보여주었다.
도 3에 C는 barnes maze 실험의 field를 사분면으로 나누어, 목적지가 포함된 사분면에 실험 동물이 머물러 있던 시간인 time spent in target quadrant [TSTQ (%)]을 측정하여 나타낸 그래프다. VD 군은 NT 군에 비해 상당히 낮은 TSTQ mean value를 보여주었다. 각 치료군(MMSC 투여군, BMSC 투여군, 약물 투여군)은 모두 NT와 유사하게 좋은 개선효과를 보여주었지만, 그 중에서도 MMSC×1 군과 MMSC×2 군은 VD 군과 가장 먼 거리를 벌리며 좋은 개선 효과를 보여주었다. 각각의 군들은 1대1로 student t-test를 통한 통계 분석이 진행되었으며, 이에 따른 군 사이 간 유의성을 *표시로 나타냈다(*= p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
1-3. Passive avoidance test
실험 동물에게 자극을 주어 장기적인 수동적 회피 능력을 확인하는 passive avoidance 실험에서는 VD 군을 제외한 모든 치료군이 좋은 개선 효과를 보여주었다(도 4). 실험 1일차에는 모든 군에게 자극이 주어졌다. 실험 3일차와 4일차에선 VD 군을 제외한 모든 군이 수동적 회피 반응을 보여주어 차이가 없었으나, 실험 2일차에선 NT 군과 MMSC×2 군을 제외한 모든 군이 자극을 기억하지 못하고 회피 반응을 보이지 못했다. MMSC×2 군은 NT 군과 같게 회피 반응으로 인해 자극을 받지 않았으며, MMSC×1 군은 자극을 받았지만 다른 치료군에 비해 가장 높은 자극 대기 시간을 나타냈다. 각각의 군들은 4일차 결과에서 1대1로 student t-test를 통한 통계 분석이 진행되었으며, 이에 따른 군 사이 간 유의성을 *표시로 나타냈다(*= p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
1-4. Open field test
도 5는 Open field test 결과이다.
도 5에 A는 실험 동물의 이동 경로를 중첩하여 시각화한 것으로, 왼쪽부터 대조군(NT), BCAS로 허혈성치매를 유도한 VD 군, MMSC를 high dose로 투여한 MMSC×2 군이다. NT 군은 center zone 대비 peripheral zone에서 많이 활동하였으며, VD 군은 center zone을 침범하여 공간의 구분 없이 모든 곳을 이동하였지만, MMSC×2 군은 NT 군과 유사하게 peripheral zone에서 활동한 비율이 높았다.
도 5에 B는 공간의 구분 없이, 각 군들의 모든 이동 거리를 정량한 결과이다. NT 군에 비해 VD 군은 매우 적은 이동 거리를 보여주지만, MMSC×2 군은 NT 군과 유사하게 개선되어 높은 이동 거리를 보여주었다.
도 5에 C와 D는 각 군별 peripheral zone과 center zone에서 이동한 거리와 시간을 정량한 결과이다. NT 군에 비해 VD 군은 center zone에서 활동한 시간과 거리가 높았다. 이어서 MMSC×1 군과 BMSC 군, done 군은 VD와 유사한 활동 시간과 거리를 보여주었지만, MMSC×2 군은 NT 군과 유사하게 높은 peripheral zone의 활동 시간과 거리를 나타냈다.
각각의 군들은 1대1로 student t-test를 통한 통계 분석이 진행되었으며, 이에 따른 군 사이 간 유의성을 *표시로 나타냈다(*= p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
1-5. Rotarod test
도 6은 Rotarod test 결과이다.
도 6에 A는 각 군별, 점점 빨라지는 레일을 버티지 못하고 바닥에 떨어지기까지의 지연 시간을 측정하여 나타낸 그래프이다. NT 군과 각 치료군들은 날의 경과에 따라, 첫 날에 비해 점점 높은 지연 시간을 보여주었다. VD 군은 날짜가 경과되어도 개선되지 않는 지연 시간을 보여주었다. 이 중에서 MMSC×2 군은 NT 군과 가장 유사한 지연 시간을 나타냈으며, 그 뒤는 MMSC×1 군이 잇따랐다.
도 6에 B는 점점 빨라지는 원반을 버티지 못한 각 군별, 마지막까지 버틴 속력을 보여준다. NT 군에 비해 VD 군은 현저히 낮은 속력에서 버티지 못하였다. 각 치료군은 VD 군에 비해 개선된 속력 한계를 보여주었지만, 그 중에서도 MMSC×2 군은 NT 군과 유사하게 치료군 중 가장 높은 속력까지 버텨냈다.
각각의 군들은 1대1로 student t-test를 통한 통계 분석이 진행되었으며, 이에 따른 군 사이 간 유의성을 *표시로 나타냈다(*= p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
2. 분자생물학적 분석 결과
BCAS로 유도된 혈관성 치매와 관련된 특정 메커니즘을 확인하기 위해 VD 모델 마우스의 뇌를 분리하고 RT-qPCR을 사용하여 Rock1, Rock2, Occludin, Claudin-5, Cdh5, Ang1, Tie1, Tie2 발현 수준을 확인하였다.
2-1. 허혈성 치매 유도 후 상향 조절되는 Rock1 및 Rock2 유전자의 발현 수준 확인
Rock은 액틴 세포골격 재구성 및 내피 세포에서 밀착 접합 (Tight Junction), 접착 접합(Adhesion Junction) 단백질과의 상호 작용을 조절한다.
NT, VD, MMSC, BMSC, Donepezil 군에서 ROCK의 mRNA 전사 수준을 결정하여 허혈성 뇌 손상이 유발된 혈관성 치매와 MMSC의 혈관성 치매 회복 메커니즘을 확인하였다(도 7).
Rock1과 Rock2 mRNA 발현은 NT군 대비 VD 군에서 각 6.30배, 13.6배 상대적으로 유의하게 증가하였다 (P＜0.0001). BCAS는 뇌 혈관장벽을 손상시키고 이로 인해 Rock1/2의 발현이 크게 증가된 것을 알 수 있었다.
MMSCⅹ1, MMSCⅹ2 군에서 Rock1 mRNA 발현은 VD 군 대비 각 0.72배, 0.82배 감소하였으며(P＜0.0001), Rock2 mRNA는 각 0.86배, 0.85배 감소하였다 (P＜0.0001). 이는 BCAS로 인한 혈관 손상이 MMSC 투여를 통해 빠르게 회복되어 Rock1/2의 발현이 감소되었음을 의미한다.
한편, BMSC 군에서 Rock1과 Rock2 mRNA 발현은 NT 군 대비 각 5.96배, 12.9배 증가하였고 (P＜0.0001), Done 군에서 Rock1과 Rock2 mRNA 발현은 NT 군 대비 각 7.88배, 16.3배 증가하였다 (P＜0.0001). 이는 BMSC 투여와 Donepezil 투여가 BCAS로 인한 Rock1/2 상향조절을 감소시키지 못하였음을 의미한다.
각 그룹간의 Rock1/2 발현에 유의적 차이는 One-way ANOVA와 Tukey의 다중 비교 검정법으로 분석되었으며 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 표 내의 위첨자 문자가 있는 값은 유의적 차이를 나타냄을 의미한다(P< 0.05).
Gene Group Relative fold_change
(±standard deviation)
Rock1 NTa 0.888 ±0.206
VDb 6.488 ±0.317
MMSCⅹ1a 1.775 ±0.095
MMSCⅹ1a 1.164 ±0.133
BMSCb 6.182 ±0.978
Donec 7.887 ±0.609
Rock2 NTa 0.979 ±0.063
VDb 14.367 ±0.754
MMSCⅹ1a 1.923 ±0.734
MMSCⅹ1a 2.015 ±0.084
BMSCb 13.605 ±1.531
Doneb 17.010 ±2.641
2-2. 허혈성 치매 유도 후 하향 조절되는 Occludin, Claudin-5, 및 Cdh5 유전자의 발현 수준 확인
Occludin, Claudin-5, 및 Cdh5는 뇌 혈관 내피에서 세포 투과성을 제한하는 BBB 단백질을 암호화한다.
NT, VD, MMSC, BMSC, Donepezil 군에서 Occludin, Claudin-5, 및 Cdh5의 mRNA 전사 수준을 결정하여 허혈성 뇌 손상이 유발된 혈관성 치매와 MMSC의 혈관성 치매 회복 메커니즘을 확인하였다(도 8).
Occludin, Claudin-5, 및 Cdh5의 mRNA 발현 수준은 NT 군 대비 VD 군에서 각 0.54배 (p=0.0035), 0.31배, 0.46배 (p=0.0003) 유의하게 감소했다. BCAS는 Occludin, Claudin-5, 및 Cdh5을 하향조절하고, 이는 BBB 구조의 붕괴와 이로 인한 혈관 안정성 감소를 의미한다.
MMSCⅹ1 군에서 Occludin, Claudin-5 및 Cdh5 발현이 VD 군 대비 각 0.65배, 0.59배 (P=0.0186) 그리고 0.65배 (P=0.0044) 증가하였다. 한편, MMSCⅹ2 군에서 Occludin, Claudin-5 및 Cdh5 발현은 NT 군 대비 각 1.37배 (P=0.0013), 0.66배 (P=0.0086) 그리고 0.73배 (P=0.0001) 증가하였다. MMSC 투여군은 NT 군과 유사한 수준으로 Occludin, Claudin-5, 및 Cdh5의 발현을 회복시킴을 확인할 수 있었다.
BMSC 군에서 Occludin, Claudin-5 및 Cdh5 발현은 NT 군 대비 각 0.79배 (P=0.0001), 0.61배 (P=0.0007) 그리고 0.57배 감소 (P＜0.0001)하였으며, Done 군에서의 발현은 각 0.81배 (P＜0.0001), 0.62배 (P=0.0006) 그리고 0.79배 (P＜0.0001) 유의하게 감소하였다. 이는 BMSC 투여와 Donepezil 투여가 BCAS로 인한 BBB 구조 불안정을 회복시키지 못함을 의미한다.
각 그룹간의 Occludin, Claudin-5 및 Cdh5 발현에 유의적 차이는 One-way ANOVA와 Tukey의 다중 비교 검정법으로 분석되었으며 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 표 내의 위첨자 문자가 있는 값은 유의적 차이를 나타냄을 의미한다(P< 0.05).
Gene Group Relative fold change
(±standard deviation)
Occludin NTa 0.844 ±0.205
VDb 0.380 ±0.016
MMSCⅹ1a 0.628 ±0.049
MMSCⅹ1a 0.902 ±0.175
BMSCb 0.175 ±0.041
Doneb 0.153 ±0.043
Claudin-5 NTa 0.892 ±0.149
VDb 0.607 ±0.110
MMSCⅹ1a 0.968 ±0.074
MMSCⅹ1a 1.010 ±0.178
BMSCb 0.346 ±0.025
Doneb 0.335 ±0.058
Cdh5 NTa 0.903 ±0.100
VDb 0.480 ±0.029
MMSCⅹ1a 0.794 ±0.017
MMSCⅹ1a 0.960 ±0.145
BMSCb 0.387 ±0.078
Donec 0.182 ±0.018
6-3. 허혈성 치매 유도 후 하향 조절되는 Ang1, Tie1/2 유전자의 발현 수준 확인
Ang1, Tie1 및 Tie2는 혈관 안정성과 관련된 마커이다.
NT, VD, MMSC, BMSC, Donepezil 군에서 Ang1, Tie1 및 Tie2의 mRNA 전사 수준을 결정하여 허혈성 뇌 손상이 유발된 혈관성 치매와 MMSC의 혈관성 치매 회복 메커니즘을 확인하였다(도 9).
Ang1, Tie1, 및 Tie2의 mRNA 발현 수준은 NT 군 대비 VD 군에서 각 0.43배 (P=0.0170), 0.52배 (P=0.0011), 0.57배 (P=0.0007) 유의하게 감소하였다. 그리고 VD 군과 비교하여 MMSCⅹ1 군에서 상기 혈관 마커의 발현이 각 1.00배 (P=0.0022), 1.78배 (P＜0.0001), 1.25배 (P=0.0011) 증가하였고, MMSCⅹ2 군에서 그 발현이 각 1.15배 (P=0.0007), 1.83배 (P＜0.0001), 1.48배 (P=0.0002) 증가하였다. 이는 BCAS로 혈관 안정성이 무너지고 MMSC 투여가 혈관 안정성을 향상시킴을 의미한다.
BMSC 군에서 상기 혈관 마커의 발현은 NT 군과 비교하여 각 0.92배 (P＜0.0001), 0.89배 (P＜0.0001), 0.89배 (P＜0.0001) 감소하였으며, Done 군에서의 발현은 VD 군과 비교하여 각 0.91배 (P＜0.0001), 0.91배 (P＜0.0001), 0.90배 (P＜0.0001) 감소하였다. 이는 BMSC 투여와 Donepezil 투여는 BCAS로 인한 혈관 안정성의 파괴를 회복시키지 못함을 의미한다.
각 그룹간의 Ang1, Tie1, 및 Tie2 발현에 유의적 차이는 One-way ANOVA와 Tukey의 다중 비교 검정법으로 분석되었으며 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 표 내의 위첨자 문자가 있는 값은 유의적 차이를 나타냄을 의미한다(P< 0.05).
Gene Group Relative fold change
(±standard deviation)
Ang1 NTa 1.124 ±0.151
VDb 0.635 ±0.038
MMSCⅹ1a 1.276 ±0.174
MMSCⅹ1a 1.369 ±0.282
BMSCc 0.089 ±0.012
Donec 0.096 ±0.009
Tie1 NTa 0.948 ±0.224
VDb 0.448 ±0.045
MMSCⅹ1c 1.249 ±0.062
MMSCⅹ1c 1.269 ±0.118
BMSCd 0.098 ±0.015
Doned 0.078 ±0.007
Tie2 NTa 0.896 ±0.132
VDb 0.385 ±0.013
MMSCⅹ1a 0.868 ±0.131
MMSCⅹ1a 0.958 ±0.172
BMSCc 0.095 ±0.016
Donec 0.082 ±0.012
3. 뇌 조직의 형태학적 분석 결과
3-1. 대뇌 피질에서 형태학적 분석 결과
도 10은 마우스의 피질에서 뉴런의 형태와 구조를 보여준다.
도 10에 A는 NT 군, B는 VD군, C는 MMSCx1 군, D는 MMSCx2 군, E는 BMSC 군, F는 Done 군이다.
NT 군에서 뉴런의 가지런한 배열, 응축되지 않은 핵 형태를 관찰할 수 있었으나, VD 군에서는 불규칙한 뉴런 배열, pyknotic 및 dark nuclei, 많은 수의 간격이 나타났다. 상기로부터 BCAS 후 대뇌 패질 영역에서 뉴런이 손상됨을 알 수 있다.
MMSC x2 군에서 정상적인 뉴런 배열과 핵이 관찰되었다. 그러나 BMSC 군에서는 VD 군과 유사한 핵 응축이 관찰되었으며 Done 군에서는 많은 수의 간격이 관찰되었다.
3-2. 해마에서 형태학적 분석 결과
도 11은 마우스의 해마에서 뉴런의 형태와 구조를 보여준다.
도 11에 A는 NT 군, B는 VD군, C는 MMSCx1 군, D는 MMSCx2 군, E는 BMSC 군, F는 Done 군이다.
대뇌 피질에서와 유사하게, NT 군에서는 해마 DG, CA3 영역의 가지런한 배열, 응축되지 않은 핵 형태를 관찰할 수 있었다. VD 군의 DG와 CA3 영역에서 핵 응축과 뉴런 감소가 관찰되었고, MMSC 군에서는 정상적인 핵 형태가 관찰되었고 뉴런의 수가 회복됨을 확인할 수 있었다. 그러나 BMSC 군에서는 적은 수의 세포와 핵 응축이 관찰되었으며 Done 군에서는 적은 수의 세포가 관찰되었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (12)

  1. 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 혈관성 인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 하기 단계를 수행하여 수득되는 것인, 약학적 조성물:
    (a) 인간 전분화능 줄기세포를 70회 이하 계대 배양하는 단계;
    (b) 상기 인간 전분화능 줄기세포를 분화 유도한 배상체 중 낭성 배상체를 선별하는 단계;
    (c) 상기 낭성 배상체를 세포투과성 3차원 배양삽입체의 상부에 로딩하고 상기 배양삽입체의 하부로 이동한 중간엽 줄기세포의 군집을 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 분리된 중간엽 줄기세포의 군집 중 단층 형태의 군집만을 분리하는 단계.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포를 1 × 106 내지 5 × 106 개/kg 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌실 내 투여용인 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 Rock 1/2의 활성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌혈관장벽을 향상시키는 것인, 약학적 조성물
  7. 제6항에 있어서,
    상기 뇌혈관장벽 향상은 Occludin, Claudin-5 및 Cdh5 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 상향 조절하는 것으로 달성되는 것인, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈관 안정성을 향상시키는 것인, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 혈관 안정성 향상은 Ang1, Tie1 및 Tie2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상 의 유전자 발현을 상향 조절하는 것으로 달성되는 것인, 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 산화적 스트레스로부터 뉴런을 보호하거나 산화적 스트레스로부터 뉴런의 손상을 회복시키는 것인, 약학적 조성물.
  11. 개체의 뇌실 내에 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 인지장애 치료 방법으로서,
    상기 개체는 인간을 제외한 포유동물인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 방법은 인간 전분화능 줄기세포 유래 중간엽줄기세포를 개체의 단위 체중(1kg)당 1 × 106 내지 5 × 106개를 1회 이상 투여하는 것인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Lessons from a Mouse Model Characterizing Features of Vascular Cognitive Impairment with White Matter Changes. Journal of Aging Research 2011: 978761.

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