KR20090074044A

KR20090074044A - 혈액 특히 말초 혈액으로부터 얻은 성체 줄기세포의 증대 방법 및 의학 분야의 관련 적용

Info

Publication number: KR20090074044A
Application number: KR1020097007818A
Authority: KR
Inventors: 감바쿠르타 알레산드라; 폴레티니 마르코
Original assignee: 세일즈 엔지니어링 에이지
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2007-09-11
Publication date: 2009-07-03
Also published as: DK2076588T3; MX2009003059A; AU2007299043A1; US8263400B2; EP2076588A1; CN101553565B; CA2663072A1; CN101553565A; IL197575A; ITRM20060498A1; HRP20131104T1; KR101570446B1; SI2076588T1; IL197575A0; RS53039B; EP2076588B1; ZA200901748B; BRPI0715036A2; JP2010504083A; AU2007299043B2

Abstract

본 발명은 혈액 특히 말초혈액으로부터 얻은 성체 줄기세포를 증대시키는 방법에 관한 것으로, 혈액의 줄기세포를 취한 후 즉시 MCSF 8-15 nM로 시험관내 처리함으로써 증대시키는 제 1 단계 및 증대된 줄기세포를 정제하는 제 2 단계를 포함하여 구성된다.

혈액, 말초혈액, 성체 줄기세포, 증대

Description

혈액 특히 말초 혈액으로부터 얻은 성체 줄기세포의 증대 방법 및 의학 분야의 관련 적용 {EXPANSION METHOD FOR ADULT STEM CELLS FROM BLOOD, PARTICULARLY PERIPHERAL BLOOD, AND RELATIVE APPLICATION IN MEDICAL FIELD}

본 발명은 성년 포유동물의 혈액, 특히 말초혈액으로부터 얻은 줄기 세포의 증대 방법, 및 병소, 만성 및/또는 급성 염증성 병리, 신경학적 및 신경퇴행적 병리의 치료로, 의학적 특히 수의학적 분야의 적용에 관한 것이다.

여기서 및 본 명세서의 이후에서, 문헌에서 알려진 바와 같이, 용어 "증대"는 세포의 수가 증가하는 과정을 의미하는 것으로, 세포 분열에 의하거나 또는, 특정 경우에 설명되고 청구되는 바와 같이, "탈-분화", 즉, 후술하는 바와 같이, 혈액 내의 세포가, 적절한 시험관 내 처리 후에, 줄기 세포로 형질전환되는 과정에 의한다.

최근, 요법에 줄기 세포를 사용하는 것은 이전에 불치성으로 생각되어지는 다양한 병리를 치료하는 데 성공하였기 때문에 커다란 호응을 얻고 있다. 그러나, 현재까지 알려진 줄기 세포를 얻는 방법은 노동집약적이고 비용이 많이 든다.

다능성 줄기세포 (PSC)는 연구뿐 아니라 약물 개발에 및 이식체에 이용가능 한 원천이다 (Wagers A. J. 등, 2002; Griffith L. G. 등, 2002).

줄기 세포의 두 가지 넓은 카테고리가 존재한다, 배아 및 성체 줄기 세포: 첫 번째는 배아로부터, 더 정확하게는 8-일 배반포로부터 유래되며, 반면에, 성체 줄기 세포는 주로 척수, 지방 도는 근육 조직 및 말초혈액으로부터 얻을 수 있다.

줄기세포의 정의는 끊임없이 진화되고 있고, 지금으로서는, 이를 분리하거나 동정하는 일반적인 일치된 또는 표준 방법이 없다. 모든 이러한 세포에 대하여, 배아 (ES) 및 성체, 둘 다가 조혈성 (HSC) 및 중간엽 (MSC) 인(Kuwana M. 등, 2003), 다른 유전적 마커가 확인되었고, 이의 일부는 많은 세포 유형에 공통적이다 (Condomines M. 등, 2006; Kang W. J. 등, 2006; Zhao Y. 등, 2003; Rabinovitch M. 등, 1976).

특히, Zhao Y. 등은, 논문 "A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells” 및 WO 2004/043990 에서, 단핵구-유도 줄기 세포를 제조하는 방법을 개시하는 바, 이 방법은 말초 혈액 단핵구를 분리하고, 이를 유사분열발생 요소와 접촉하고, 및 페포의 증식에 적절한 조건하에서 말초 혈액 단핵구를 배양하는 단계를 포함한다.

이러한 방법은, 먼저, 단핵구를 분리하고, 후속적으로 이를 배양 배지에 증대하는 단계를 포함하는 데, 상당 수의 줄기 세포를 얻는 데 매우 긴 시간, 약 15 - 20 일을 요하며, 만능 유형의 줄기 세포, 즉 환자에 직접적으로 접종하는 데 적합한, 특정화 되지 않은 줄기 세포를 상기 첫 번째 상태에서 단시간 내에 얻을 수 없다.

많은 학술적 작업들이 상이한 유형의 병변을 재생하는 줄기 세포의 능력을 설명하고 있는 바, 기계적으로 또는 다양한 병리에 의해 손상된 조직을 재생하고, 병리를 야기한 원인을 근본 제거하지만 이의 효과 상에서 단순히 작용하는 것이 아닌 능력을 언급하고 있다.

현재, 연구는 배아 조직, 태아 또는 제대로부터 분리된 줄기 세포의 사용으로 더욱 지향되고 있지만, 그러나 이것은 다양한 법적 및 윤리적 의문을 낳는다. 무엇보다, 오늘날, 이러한 세포를 사용하는 것은, 다양한 금기사항, 예를 들어, 감염의 위험, 이식시 이식거부의 위험 및 말에서는 기형종의 발생 등을 야기한다.

이러한 문제를 제거하기 위해, 따라서, 바람직하게는 척수, 지압 조직 또는 말초 혈액으로부터 분리한 자가 줄기 세포를 "생체 내” 요법에 사용하는 것을 고려하고 있다. 이러한 방법들은, 성체 줄기 세포로부터 시작되어 사용되는 데, 특이적 분화 유도 인자를 사용하여 원하는 세포주의 줄기세포를 "시험관 내” (또는 "생체 외”) 분화하는 단계 및 후속적으로 얻어진 분화된 세포주를 "생체 내” 이식하는 단계를 포함한다. 이러한 방법들에서, 시험관 내 유도된 분화 단계 동안 환자로 재 도입된 분화된 세포가 자기 인식 요소를 상실하는 관계로 자가 세포로서 인식되지 않기 때문에, 한계에 봉착하게 된다.

인간에서, 말초 혈액으로부터 줄기 세포를 얻는 것은 "전혈구 소실 (aphaeresis)” 또는 "백혈구 소실 (leucophaeresis)”로 불리우는 과정으로 그들을 정제하는 것이 필요하다. 실제, 세포를 혈액으로부터 추출하고, 모은 후, 화학 또는 방사선 요법 후 즉시 환자에 접종한다. 보통 6 내지 8 시간 지속되는, 전혈구 소실에서, 혈액은 팔의 정맥 또는 목이나 가슴의 정맥으로부터 취해지고, 줄기 세포를 제거하는 기구를 통과하게 된다. 결과적으로 정제된 혈액은 환자로 되돌리게 하고, 수집된 세포는 액체 질소에서 냉동하는 방식으로 보존된다 (Condomines M. 등., 2006; Kang W.J. 등, 2006). 이러한 기술은 환자에게는 고통스러울 뿐 아니라, 극도의 스트레스를 준다. 더욱이, 작거나 큰 크기의 동물에는 실행불가이다; 무엇보다도, 상기 기술은 유동하는 줄기 세포를 분별하거나 및/또는 정제하지 못한다.

현재, 수의학에서, 줄기세포는 병변이 있는 힘줄과 인대의 복원에 주로 성공적으로 사용된다. 주요 정제 기술은:

- 성장 인자 또는 혈소판 유도체 (TGF-B, VEGF)를 사용하나, 그러나 이러한 것들을 추출하는 경제적 비용이 엄청나다 (Hou M. 등, 2006);

- 척수로부터 얻은 줄기 세포의 분리. 이러한 기술은 추출된 물질 내에 포함된 세포의 15% 만을 정제하고 요법에 사용하게 할 뿐이다;

- 지방 조직에서 얻은 줄기 세포의 분리. 이러한 기술은 공여자 동물로부터 상당한 양의 조직을 먼저 수술적으로 제거하는 것을 요하는 것으로, 정맥내 투여를 할 수 없다;

- 텐도트로핀(Tendotrophin )으로 알려진 IGF-1 (인슐린 유사 성장 인자 1) (Fiedler J. 등, 2006);

- UBM (방광 매트릭스urinary bladder matrix): 이것은 돼지로부터 유래된 것으로, 병변의 영역을 재생하지 않고, 상처에 치유 반흔을 남기는 사이토카인류을 포함하나 (그러나 핵세포는 미포함) (Zhang Y.S. 등, 2005).

상술한 것에 비추어, 용이하게 접근할 수 있는 원천으로부터 줄기세포를 얻을 수 있게 하며, 일단 포유동물에 투여되면, 이식현상을 야기하지 않고 및 보존하기 용이한, 의학-수의학 분야에서 의약물로서 사용하기 적합하게 하는 성체 줄기 세포의 증대 및 정제하기 위한 방법이 필요한 것이 분명하다.

다능 및 만능형, 즉 특이화 되지 않은 것으로, 환자에 직접적으로 접종할 수 있고, 현재 제공된 것 보다 훨씬 짧은 생성 시간으로 줄기 세포를 얻을 필요성이 있다.

본 발명의 저자들은 말초 혈액으로부터 줄기세포를 시험관 내 증대 및 정제하는 방법을 완성하여, 이식 거부, 감염, 기형종과 같은 부작용을 야기하기 않고, 일단 성체 포유동물에 투여되면, "생체내” 분화될 수 있고, 및 다능 중기세포로서 작용할 수 있는 줄기세포를 얻게하였다.

상기 저자들은 따라서 증대된 세포가, 일단 국소적 또는 정맥내 주사되면, 처리된 동물의 필요와 병리에 따라서, 대식성, 임파구성, 상피, 내피, 신경 및 간세포의 "생체 내” (당해 분야에서 공지된 방법에서와 같이, 적절한 성장 인자 및/또는 화학적 자극 (Gulati R. 등, 2003; Katz R. L. 등, 2002; Okazaki T. 등, 2005)으로 인한 "시험관 내”가 아닌) 모든 형상과 화학적 특성을 획득하는 것을 발견하였다. 상기 방법은 현재까지 줄기 세포를 수집하는 데 사용된 다른 방법들 보다 훨씬 덜 침습적이고, 고통스럽지 않고 (전혈구소실과 비교하여), 경제적이며, 및 모든 동물종 (작고 및 큰)에 사용하기에 기술적으로 가장 적합하다.

마지막으로, 이러한 세포를 용이하게 얻고 다음 이를 액화질소에 오랫동안 냉동 보관할 수 있는 가능성으로 인하여, 본 발명에 따른 방법으로 얻은 세포는, 자가 이식체로서, 많은 인간 및 수의 병리 (다양한 유형의 병변, 대사 질환, 급성 및 만성 신경 및 염증성 병리)의 치료에 또는 말과 같은 특정 동물의 경쟁적 성능의 향상에 적합하게 만들 수 있다.

본 발명은 따라서 혈액, 특히 말초 혈액뿐만이 아닌, 혈액으로부터 성체 줄기 세포를 증대시키는 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다.

첫 번 단계는 두 가지 부속 단계를 포함한다:

a) 혈액, 특히 말초 혈액만이 아닌 혈액의 줄기 세포의 증대의 첫 부속 단계는, 얻는 즉시, 8-15 nM 사이, 바람직하게는 10 nM의 농도로 MCSF (대식세포 콜로니 자극 인자)로 시험관 내 처리하는 것이다; 상기 증대 단계는 상기 시험관 내 처리가 수행되는 조건에 따라서 다양한 기간을 가진다; 본 저자들은 24 내지 96 시간 사이, 유리하게는 48 내지 72 시간의 MCSF로 시험관 내 처리하는 기간은 안정적인 증대를 이끌어 내면서 증대를 안정하게 이끌어 내면서, 마커 CD 90, CD34 및 혼합된 CD 90/CD 34의 동시 존재를 동시에 확인할 수 있다는 것을 실험적으로 증명하였다. 이러한 조건이 최적인 것으로 고려되었다.

용어 "즉시”는 혈액 세포를 취하고 및 상기 시험관 내 처리의 시작 사이의 가능한 가장 짧은 시간을 의미하는 것으로, 어느 경우에든지 10 분을 넘지 않고, 유리하게는 5 분을 넘지 않는다 (혈액 응고를 피하고, 및 혈액 샘플과 최종 처리 사이의 가장 짧은 시간에서의 요청되는 줄기 세포를 얻기 위해서).

b) 상기 첫 번 부속 단계 후, 정제의 두 번째 부속 단계는, 바람직하게는, 파이콜(Ficoll) 구배 상에서 분별하는 것이다.

상기 정제 단계는 기본적으로 적혈구를 파괴하기 위한 것이다.

그러므로, 당해 기술 분야의 상태와는 달리, 본 발명은 먼저 세포를 MCSF 및 가능한 항-응고 생성물과, 예를 들어, 적절한 시험관 내에서 접촉시킴으로써 세포의 증대하는 단계를 제공한다; 이러한 증대 단계는 환자로부터 혈액의 세포를 취한 즉시 수행되며, 이들의 특정 부분을 분리하거나 임의의 배양액을 사용하지 않는다.

본 발명의 일 구체예는 성체 포유동물의 말초 혈액으로부터 줄기세포를 증대하는 방법에 관한 것이다.

정제 단계 후, 다음 단계가 주어진다:

c) 단계 b)에서 정제된, 혈액, 특히 말초혈액의 줄기 세포를 35-55 nM 사이, 바람직하게는50 nM, 더욱 바람직하게는 45 nM의 농도의 MCSF로 시험관 내 처리하는 방법으로 더 증대시킨다.

이러한 단계는 또한 24 내지 96 시간, 바람직하게는 48 시간 내지 72 시간의 가변적인 기간을 가질 수 있다.

24 시간이 이미 지난 후, 55 nM이상 (예 70 nM)의 농도로 사용하면, 상기 세포는 다능 중기 세포의 표현형을 유지하지 못하는 것으로 관찰되었다 (참조, 도 12). 특히, 혈액을 취한 후 즉시 로 현탁액으로 선행 증대하는 단계 a)는 줄기 세포의 비율을 증가시킨다 (참조 도 13). 후속 단계는 거부 또는 감염의 현상을 야기하지 않고, 생체 내에서 직접적으로 분화되는 다능 줄기 세포를 얻는 것이다.

본 발명은 또한, 전술한 증대 방법에 따라서 얻어진 성체 줄기 세포를 병변을 치료하는 의약물 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다. 치료될 수 있는 병변은 하기의 군과 같다: 포유 동물에서의 피부 병변, 힘줄에 대한 병변, 인대에 대한 병변, 골 병변, 점막에 대한 병변, 또는 골절.

본 발명은 또한 전술한 방법에 따라 얻은 성체 줄기 세포를, 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 신경적 및 신경퇴행적 병리를 치료하는 의약물을 제조하는 데 사용되는 용도에 관한 것이다: 쿠싱병, 헤드세이킹(head shaking), 우블러 증후군, 호흡 곤란, 사지 마비; 제엽염 (laminitis), 골막염, 위염, 바이러스성, 세균성, 기생충성, 균사성 염증으로부터 선택된 급성 또는 만성 염증성 병리; 포유 동물에서의 위의 팽창-뒤틀림.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법으로 얻은 줄기세포를 암말의 불임, 수망아지의 조숙성을 치료하는 데 및 포유동물에서 경쟁적 성능을 향상사키는 데 사용되는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 증대 방법에 따라서 얻은 성체 줄기 세포를, 약학적으로 허용되는 보조제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

구체예의 특정 바람직한 양태에 따라서, 전술한 방법에 따라서 얻은, 활성 핵심으로서 사용되는 성체 줄기 세포는 조성물에 90-250x10³ 세포/ml, 바람직하게는 150x10³ 세포/ml의 농도로, 약학적 허용 보조제 및/또는 부형제와 같이, 존재하며, 상기 조성물은 정맥내 투여용으로 배합된다.

구체예의 다른 양태에 따라서, 전술한 증대 방법에 따라서 얻은, 활성 핵심으로서 사용되는 성체 줄기 세포는 조성물에서 4-40x10⁶ 세포/ml의 농도로, 상기 약학적 허용 보조제 및/또는 부형제와 같이 존재하며, 상기 조성물은 국소 적용용으로 배합되어 있다 (외부 상처의 경우 또한 국소적이다).

전술한 약학적 조성물은 또한 본 발명의 구체예의 특히 바람직한 양태에 따라서, 항생제를 활성 성분으로서 5-15 nM, 바람직하게는 10 nM의 농도로 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 항생제는 겐타마이신 또는 아미카신이다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 약학적 조성물(즉, 항생제와 같이 또는 없이 국소 적용에 적합한)의, 포유동물에서 피부 병변, 힘줄에 대한 병변, 인대에 대한 병변, 골 병변, 점막에 대한 병변으로 구성되는 군으로부터 선택된 병변을 치료하는 의약물로서의 용도에 관한 것이다.

다른 특징에 따라서, 본 발명은 전술한 바와 같은 약학적 조성물 (즉, 항생제와 같이 또는 없어, 국소 적용에 적합한) 의, 포유 동물에서의 골절을 치료하는 의약물로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 약학적 조성물 (즉, 정맥내 투여에 적합한)의, 포유동물에서의 쿠싱병, 헤드 세이킹, 우블러 증후군, 호흡 곤란, 사지 마비를 포함하는 군으로부터 선택된 신경적 또는 신경퇴행적 병리를 치료하는 의약물로서의 용도에 관한 것이다.

다른 양태에 따라서, 본 발명은 전술한 바와 같은 약학적 조성물(즉, 정맥내 투여에 적합한)의, 포유동물에서 제엽염, 골막염, 위염, 바이러스성, 세균성, 기생충성, 균사성 염증으로부터 선택된 급성 또는 만성 염증성 병리를 치료하는 의약물로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 약학적 조성물(즉, 정맥내 투여에 적합한)의, 포유 동물에서 위의 팽창-뒤틀림의 증후군을 치료하는 약물로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 방광의 병리, 심혈관 병리, 스트레스 및 동반된 우울증, 및 양육시 암말의 불임성 및 수망아지의 조숙성에, 및 또한 동물의 경쟁적 활동을 향상시키는 데 유용할 수 있다.

본 발명의 구체예의 바람직한 양태에서, 의학 분야에서의 상기 용도는 수의학 분야에서 바람직하게 적용될 수 있고, 치료될 동물들은 말, 개, 고양이 및 사람으로부터 선택된다.

본 발명은 바람직한 구체예의 양태로서 비제한적 예로서, 첨부된 도면을 참조하여 설명될 것이다:

도 1은 암말에서 클로스트리디아로 감염되고 신전근건이 파괴된, 중족골과 제 1 지골 사이의 20 cm 병변을 나타낸다;

도 2는 본 발명에 따른 줄기 세포를 국소 적용한 후 3 달 후의, 도 1과 동일한 암말을 나타낸다;

도 3은 치료 6 개월 후의 암말을 나타낸다;

도 4는 표면 굴곡건의 80%에서 병변을 가지는 말의 초음파 사진을 나타낸다;

도 5는 본 발명에 따른 줄기 세포를 국소 처리한 약 3개월 반 후의 말의 초음파 사진을 나타낸다;

도 6은 줄기 세포로 국소 처리한 약 3 개월 반 후 말의 초음파 사진을 나타낸다;

도 7은 국소 처리한 약 4 개월 후 초음파 사진을 나타내며; 힘줄이 완전 재생되었고 반흔 조직이 소실됨이 주목된다;

도 8은 더 적어진 실체로 있는(직경 1 cm 이하) 힘줄 병변을 가진 암말의 초음파 사진을 나타낸다;

도 9는 국소 처리 한달 후 도 7과 동일한 암말의 초음파사진을 나타낸다;

도 10은 본 발명에 따른 줄기 세포로 처리 전, 산통에 대해 수술한, 총체적으로 약한 17년령 말을 나타낸다;

도 11은 본 발명에 따른 줄기 세포로 정맥내 치료 1 년 후 17년령 말의 능력을 나타낸다;

도 12는 본 발명의 방법의 단계 c)에서 상이한 양의 MCSF로 (최적의 MCSF 농도를 결정하기 위해) 얻은 세포의 수를 나타낸다: 15 nM (십자가 파선), 25 nM (역삼각형 파선), 35 nM (삼각형 파선), 50 nM (검은원 파선), 60 nM (흰사각형 파선), 70 nM (흰원 파선); 그 결과는 말초 혈액의 세 가지 샘플로부터 계산된 세포의 평균값이다;

도 13은 본 발명의 방법의 단계 a)에서 말초 혈액으로부터 얻은 세포수의 증가를 나타낸다: MCSF로 전처리 (검은 점선), MCSF로 처리되지 않음 (십자가로 파선); 결과는 말초 혈액의 세 가지 샘플로부터 계산된 평균값이다.

실시예 1:말초혈액으로부터 얻은 성체 줄기 세포의 증대와 정제 및 이의 의학적 용도

말초혈액으로부터 분리된 세포는 본 발명에 따른 증대 후 다능 줄기세포 (PSC)로서 "생체 내” 작용을 하며 통상적인 방법 및/또는 약물로는 불치이거나 매우 느리게 치유되는 병변들 또는 병리들을 수 개월 내의 기간 내에 해결 할 수 있다.

재료 및 방법

샘플링

약 5-7 ml의 각 말초 혈액 샘플을 말과 개의 하부 사지로부터 얻고 이를 즉시, 헤파린 (150 U), 및 MCSF (10 nM)을 포함하는 시험관 내에 두었다.

그러나, 헤파린은 다른 적절한 항응고 물질로 대체할 수 있다.

정제

상기 혈액 샘플 (5-7 ml)을 NH4Cl (200 mM)을 함유한 PBS (인산 완충 생리액)에 1:5로 희석시켜 적혈구를 용출시키고, 10,000 g에서 원심분리시키고, PBS로 두 번 세척하고 및 200 g에서 다시 원심분리하였다. 얻어진 핵 세포들을 37℃에서 7-12 시간, 바람직하게는 10-12 시간 배양하고, 및 파이콜 구배상에서 분별하여 정 제한 후, 분리하고, 및 RPMI 배지1640 (Life Technologies, Grand Island, New York)으로 세 번 세척하였다. 일단 정제되면, CD90 표현형을 가진 세포를 약 95% 포함하는 (FACScan - Becton Dickinson 유세포 광학측정기(flow photometer)를 사용하여 유세포측정 분석으로 측정시) 세포를 50 ng/ml MCSF 45 nM 에서 다시 24 시간 배양한 후 국소 처리에 필요한 세포의 수를 증대하거나 또는 10,000 g에서 원심분리하고 PBS에서 약 90x10³ 세포/ml의 농도로 재 현탁하여 정맥 내 처리용으로 만들었다.

면역염색

세포표현형 발현을 위해, 세포를 PBS로 세척한 후 포름알데히드 4% 를 함유하는 PBS 내의 슬라이드 상에서 20 분간 20℃에서 고정시켰다.

세포내 단백질을 확인하기 위해, 세포를 0.5% 트리톤X-100에 5 분간 20℃에서 담근 후 1% BSA (불특정 항원부위를 막기위해)를 포함하는 PBS 내에 희석된 일차 항체와 같이 배양하였다. 세 번 연속 세척 후, 상기 슬라이드를 가장 적합한 플루오로크롬: FITC 또는 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트 (TRITC), 또는 Cy5과 연합된 이차 항체로 45 분간 배양하였다.

모든 이차 항체는 당나귀을 숙주로 사용하여, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)에서 개발되었다. 면역세포화학을 4℃의 온도 및 습도 포화 분위기에서 수행하였다. 세 번 세척 후, 상기 슬라이드를 "gelvatol-PBS”를 사용하여 올려놓았다. 다음, 형광 이미지를, 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나제 (다중클론성 양 항체, Cortex Biochem, San Leandro, CA에서 생산)에 지향된 면역형광을 내부 표준으로 사용하는 형광 현미경으로 얻었다. 음성 대조군으로서, 및 형광 배경의 수준을 정하기 위해, 샘플이 포함하는 것과 동일한 이소타입의 비특정 항체로 항온처리된 슬라이드를 사용하였다.

위상차 현미경으로 통해서 얻은 영상에 따르면, 본 세포는, 나일 레스로 염색된 지질의 형광 영상과 포개어 지며, 및 DAPI (4',6-디아미딘-2-페닐인돌)로 염색된 핵의 영상과 포개어 진다. 참조 막대는 40 μm 길이이다. 상대적인 형광 세기를 MCSF 및 대식세포로 처리된 세포 간의 정량적 비율 영상 현미경기술로 조사하였다.

전술한 방법을 사용하여 조사된 모든 마커 (CD 90, CD 34, CD90/CD34)를 확인하였다.

결과

국소 용도

외부 상처의 경우, 상기 세포를 직접 적용하였다. 반대로, 힘줄, 인대 및 골절에 대한 병변인 경우, 세포를, 병변의 경중에 따라, 별다른 지시가 없으면, 5-10x10⁶ 세포/ml의 최종 농도로 병변의 부위에 직접 접종하였다; 세포를 병변에 정밀하게 삽입하지 못하는 경우, 하기 방법을 사용하였다:

● 측부 인대에 대한 병변의 경우, 두 번째 및 세 번째 지골 사이에 주입하였다,

● 주상골에 대한 병변의 경우, 수근관(carpal tunnel)에 주입하였다,

● 천장관절(sacroiliac articulations)에 대한 병변의 경우 및 우블러의 경우, 다섯째 및 여섯째 경부 사이, 또는 여섯째와 일곱째 사이에 주입하였다.

피부 병변

중족골 과 첫번째 지골 사이에, 클로스트리디아 합병증을 가진 20 cm 의 상처를 가진 암말의 경우, 신전근건 (extensor tendon)을 위시한 하부 조직의 파괴가 나타난다 (도 1). 사고 후 및 켈로이드를 없애기 위한 두 번의 수술 일 년 후, 일 차 적용하였고 10 내지 400x10⁶ 세포가 현탁된 생리액을 사용하여 겐타미아신 존재하에서 일차 적용이 이루어 졌고, 15일 간격으로 세 번 반복하였다. 100일 후, 상처는 완전히 치유되었고 (도 2) 및 6 개월 후, 모발이 상처 부위의 70%에서 다시 나타났다 (도 3).

힘줄

표면굴건의 80%의 병변을 가진 세 마리 말을 치료하였고, 300x10⁶ 세포로 치료 3 개월후, 더 이상 초음파 조사에서 저음영 부분이 보이지 않았고, 반대로, 힘줄의 두께 (열상 및 염증 과정 후에 증가된)는, 도 4-7에서 제시된 초음파 스캔 영상으로부터 보여지는 바와 같이, 80% 만큼 눈에 띄게 감소하였다.

힘줄에 더 작은 병변 (1 cm 직경)을 가진 다른 말들은 치료 1 달 후에 더 이상 병변을 보니지 않았다 (도 8 및 9).

인대

처리된 병변 중에서, 서스펜더 (suspender) 힘줄을 비절 아래에 삽입하였고, 그 결과 절게되었다: 국소 접종 세 달 후, 상기 말은 절지 않고 다시 일하기 시작하였고, 일년 후에도 다시 재발되지 않았다.

앞과 뒤의 서스펜더 힘줄의 분지와 중심부 사이에 병변을 가진 다른 말을 치료하였고 모두 완전 회복하였다.

골절

치료된 골절 중에서, 대퇴부 골절된 개의 경우, 수술 후 4 개월 후에도 여전히 뼈 유합조직이 형성되지 않았다. 10x10⁶ 세포의 국소 적용요, 30 일 내고 완전 회복이 있었다.

점막

점막에 대한 병변의 치유에 관하여, 다양한 만성궤양이 치료되었다. 가장 획기적 사건은 구강에 수 개의 궤양이 있고, 두 번의 수술을 받은 조마(dressage horse)의 경우였다. 상기 치료후, 상기 말은 4x10⁵ 세포를 국소적용한 3일 후에 이미 출혈을 멈추었다. 15일 후, 상기 병변은 완전 치유되었다.

결론적으로, 본 발명의 방법으로 분리된 세포를 힘줄, 인대, 관절 및 골절부위에 국소적용하면, 80% 넘게, 수주, 적어도 4 개월 내에 완전한 회복을 보였다. 나머지 20% 경우는 하여간 상당한 진전을 보였다. 이러한 경우에서 수의학에서 오늘날 통상적으로 사용되는 방법들은, 약 6-15 개월 처리 후에, 긍정적인 결과를 내는 경우가 60% 이상을 넘지 않고5%의 경우에만 진전이 있다.

정맥내 사용

세포를 하기 병리에서 정맥내 사용하였다 (1 투여량 = 150x10³ 세포):

쿠싱병: 이것은 시상하부에 의해 도파민 생성이 감소되고 중간 시상하부가 비대해진 것으로 나타나는 병리 현상으로 인간의 파킨슨병과 유사하다.

질환의 통상적인 증후군과는 별도로, 용혈현상으로 면역 방어가 또한 감소된, 쿠싱병을 앓는 조랑말을 치료하였다. 치료 당 150x10³ 세포로 5 일 간격으로 세 번 치료 후, 개선되었다. 40일 간격으로 4 번의 치료 주기를 마친 후, 상기 증상은 완전히 없어졌다. 동일한 방식으로 치료한 다른 네 마리 말들도 동일한 결과를 나타내었다.

헤드 세이킹: 삼차신경의 제 2 합병증을 가진 중추신경계의 신경 병리는 끊임없는 헤드 세이킹 및 광공포증을 나타낸다. 치료된 말은 이러한 증후군들을 6 개월 동안 가지고 있었다. 치료는 5 주간 동안 일 주간의 간격으로 150x10³ 세포로 실시하였다. 삼 주차에 이미 상기 증상이 사라졌다. 두 마리 다른 말들로 동일한 방식으로 치료하였고 동일한 결과를 나타내었다.

우블러의 세 가지 경우: 이것은 선천적 경부 신경 압착이다. 일 주일 간격으로 세 번의 투여 (정맥내 및 국소)로 치료한 경우 치료 후 증상들이 완전히 경감되었다.

전술한 방법을 사용하여 증대되고 정제딘 줄기 세포를 정맥내 사용하여, 신경 조직을 영향을 주는 병리에 대하여, 이러한 세포들이 "생체 내”에서 어떻게 해 결하는 가를 나타내었고, 치료 1 주일 후에 상기 첫 번째 결과를 이미 보였다.

혈관 재구성. 제엽염 (발에서 말초 혈관이 파괴되는 것으로, 극도로 고통스러운 절름발이가 되어 움직일 수 없게 됨)으로 병리된 말에서, 떨어진 혈관내로 투여 12-24 시간 후에 고통이 이미 사라졌다. 동일한 병리의 다른 두 마리 말의 경우도 동일한 결과를 얻었다.

상기 세포를 정맥 내 투여한 다른 일반적인 경우는 다음과 같다:

- 주상골의 골절이 있는 말의 경우, 말초 혈관, 주상골낭 및 굴곡건과 주상골 사이의 관절 표면에 상기 줄기 세포를 동시에 투여한 후, 그 경쟁 활동을 재개하였다;

- 골막염을 앓는 말의 경우, 두 번의 정맥 내 투여로 절름걸이가 개선되었다;

- 산통(colic)으로 수술받고 총체적인 쇠약 상태의 지속으로 인해 계속적인 경기 활동을 더 이상 할 수 없는 관계로 방목되고 있는 17년령의 말의 경우. 매 5일 마다 3 번 투여를 4번 한 후, 말은 경기 활동을 다시 시작하였고, 경기 할동에 참가하여 이전에 하지 못했던 결과를 얻었다 (도 10 및 11);

- 뇌허혈이 의심되고, 이로 인해 세 다리의 협력작용을 못하는 20년령의 말의 경우, 코르티손 유도체에 근거한 약학적 치료 후, 여전히 불확실하고 비틀거리면서 걸었다. 일 주일 간격으로 두 번 투여 후, 상기 동물은 더 이상의 증후를 보이지 않고 정상적 활동을 재개하였다;

- 21세에 임신한 23년령의 암말의 경우, 수유기가 끝난 후, 세포를 두 번 정 맥내 투여하였다. 치료후, 암말은 완전히 경기 활동을 재개하였다 (20 살이면, 말은 경기하기에 너무 늙은 것으로 판단된다);

- 골반뼈가 골절된 말의 경우, 세포를 두 번 투여한 우, 국제 경기에 참가하였다;

- 호흡 곤란 및 매우 신경질적 성격을 가진 17년령 말의 경우, 두 번의 치료 후, 국제 경기에 참가하였고, 조금이라도 호흡곤란을 보이지 않았다;

- 첫 째 및 두 째 지골 사이의 측부 인대가 당김으로 일어난, 2 년간에 걸친, 극도의 절름발이 두 마리 말의 경우. 이러한 병리는 75% 가 고칠 수 없는 것으로 판단되었다. 두 마리 동물에 3 개월간 3 번 투여한 후, 정상적으로 경기를 재개하였다;

- 7세에 산통으로 수술 받고 12세에 거세된 13년령 말의 경우. 두 번째 수술 후, 항생재 및 항염증제로 처리에도 불구하고 비-이장성(remittent) 박테리아성 합병증을 앓았다. 더욱이, 상기 동물은 위내시경으로 본 결과 만성 위염을 앓았다. 일주일 간격으로 4 번의 투여 후, 상기 말을 위내시경하여본 결과 위점막의 완전한 재생을 보였다. 동일한 결과가 10 마리 다른 경주마에서 얻었다;

- 전수축기 잡음 및 심장 세동시 비전형적인 많은 잡음을 가지며, 신경학적 문제와 평형의 손실을 야기하는 허피스 바이러스 1의 활성 형태에 양성으로 혈액 검사가 나오는 말의 경우; 5 일 간격으로 정맥내 투여한 후, 척추 관을 수준에서 네 번째 투여를 실시하였다. 2 달 후에 이미, 말은 움직이기 시작하였고, 평형을 완전히 되찾았다;

- 일반적인 퇴행으로 인하여 경쟁 활동에서 완전히 퇴역한 19년령 말의 경우, 200x10³ 세포를 일주 간격으로 두 번 투여하고 반복 투여한 결과, 3 달 후에 그의 경력에서 최고의 것으로 되찾았다 (점프 경기에서, 1.35-1.40 m 높이의 점프).

동일한 유형의 치료를 매우 늙은 개에게 적용하여 동일한 결과를 얻었다. 개에서, 하기 병리가 치료되었다:

- 위 뒤틀림이 있는 개의 두 가지 경우: 하나는 6년령의 그레이트 데인으로 수술 후 일주간이 지났고 따라서 다른 수술을 하였다;

- 150x10³ 세포로 첫 번 투여후, 상기 개는 다시 먹기 시작하였고, 일 주일 간격으로 두번 투여후, 개는 일상 활동으로 복귀하였다; 두 번째 경우는 10년령의 암컷 그레이트 데인으로 관절염을 앓고 있으며, 당뇨가 진단되었고, 자궁절제술을 받았다; 수술 4 개월 후, 위장 두틀림을 나타냈고, 후속적으로 외과 수술을 하였지만, 그다지 큰 진전이 없었다. 이 시점에서, 일 주 간격으로 두 번 투여 하였고, 이를 후 속 4 달 동안 4 번 반복하였다. 지금, 마지막 투여 주기 후 8 달 만에, 상기 개는 정상적인 혈당치 뿐 아니라 걸을 수 있는 능력이 80%까지 향상되었다;

- 뒷다리 마비와 실금을 가지는 13년령 암컷 잡종개의 경우; 코르티손으로 처리될 때 까지, 분명한 결과가 없었다. 코르티손을 중지한 15일 후, 세포를 취하여 개에게 일 주 간격으로 두 번의 주기로 투여하였다. 마지막 치료 후 6일이 지나서, 상기 개는 다리를 사용할 뿐 아니라 정상적으로 배뇨와 배변을 수행하였다.

본 발명에 따른 방법으로 얻은 결과들은 이러한 과정이 극도로 다양하다는 것을 나타내는 바, 이는 현재, 어떠한 "생체 내” 기술도 다능 세포를 증대하지 못한다는 사실에 기인된 것이다. 더욱이, 모든 보고된 경우에서 투여 후 어떠한 형태의 이식 거부나 감염이 없다는 것은 이러한 기술이 자가-이식에 적합하다는 것을 나타내고 있다.

Claims

혈액으로부터, 특히 말초혈액으로부터 성체 줄기 세포를 증대시키는 방법에 있어서:

a) 혈액의 줄기세포를 취한 후에, 이들을 MCSF의 8-15 nM의 농도로 시험관 내 처리함으로써 혈액의 줄기세포를 증대하는 제 1 단계, 및

b) 증대된 줄기 세포를 정제하는 제 2 단계를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 MCSF로 시험관 내 처리 단계는 24 내지 96 시간 동안 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 MCSF로 시험관 내 처리 단계는 48 내지 72 시간 동안 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 시험관 내 처리는 샘플을 취한 후 10분 내에, 유리하게는 5 분 내에 시작하는 것을 특징으로 하는 방법.
전기 항 중 임의의 항에 있어서, c) 35 내지 55 nM의 농도의 MCSF로 24-72 시간 동안 시험관내 처리함으로써 단계 b)에서 정제된 혈액의 줄기 세포를 증대시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
전기 항 중 임의의 항에 있어서, 단계 a)에서의 MCSF의 농도는 바람직하게는 10 nM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 단계 c)에서의 MCSF의 농도는 바람직하게는 50 nM, 더욱 바람직하게는 45 nM인 것을 특징으로 하는 방법.
전기 항 중 임의의 항에 있어서, 단계 a) 및/또는 단계 c)에서의 MSCF로 시험관 내 처리하는 것은 24-48 시간, 바람직하게는 45-48 시간 지속하는 것을 특징으로 하는 방법.
전기 항 중 임의의 항에 있어서, 상기 정제 단계 b)는 파이콜 (Ficoll) 구배 상에서의 분별로써 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
포유동물에서 피부 병변, 힘줄에 대한, 인대에 대한, 뼈에 대한, 점막에 대한 병변 또는 골절로 구성되는 군으로부터 선택된 병변을 치료용 의약물 제조에 사용되는, 1 항 내지 9 항의 방법에 따라 얻어진 성체 줄기 세포의 용도.
포유동물에서 쿠싱병, 헤드 세이킹, 우블러 증후군, 호흡 곤란, 사지 마비로 구성되는 군으로부터 선택된 신경학적 또는 신경퇴행적 병리를 치료하기 위한 의약 물 제조에 사용되는, 1 항 내지 9 항의 방법에 따라서 얻은 성체 줄기세포의 용도.
포유동물에서 제엽염, 골막염, 위염, 관절염, 바이러스성, 세균성, 기생충성, 균사성 염증으로부터 선택된 급성 또는 만성 염증성 병리를 치료하는 의약물 제조에 사용되는, 1 항 내지 9 항의 방법에 따라 얻은 성체 줄기 세포의 용도.
포유 동물에서 위의 팽창-뒤틀림의 증후군을 치료하는 의약물 제조에 사용되는 1 항 내지 9 항의 방법에 따라 얻은 성체 줄기 세포의 용도.
암말에서의 불임증, 수망아지에서의 조숙증을 치료하는 또는 포유 동물에서 경기 활동을 향상시키는 의약물의 제조에 사용되는 1 항 내지 9항의 방법에 따라 얻은 성체 줄기 세포의 용도.
활성 성분으로서 1 항 내지 9 항의 방법에 따라 얻은 성체 줄기 세포를, 약학적 허용 보조제 및/또는 부형제와 같이 포함하는 약학적 조성물.
활성 성분으로서 1 항 내지 9 항의 방법에 따라 얻은 성체 줄기 세포를 90-250x10³ 세포/ml, 바람직하게는 100-120x10³ 세포/ml의 농도로, 약학적 허용 보조제 및/또는 부형제와 같이, 포함하며, 정맥내 주사액으로서 배합된, 약학적 조성물.
활성 성분으로서 1 항 내지 9 항의 방법에 따라 얻은 성체 줄기 세포를 4-40x10⁶ 세포/ml, 바람직하게는 7x10⁶ 세포/ml의 농도로 약학적 허용 보조제 및/또는 부형제와 함께 포함하며, 국소 적용용으로 배합된, 약학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 항생제를 활성 성분으로서 5-15 nM, 바람직하게는 10 nM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 항생제는 겐타마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
포유동물에서 피부 병변, 힘줄에 대한, 인대에 대한, 뼈에 대한, 점막에 대한 병변으로 구성되는 군으로부터 선택된 병변을 치료용 의약물로서의, 15 항 및 17 항 내지 19 항의 약학적 조성물 용도.
포유동물에서 골절을 치료하는 의약물로서의, 15 항 및 17 항 내지 19 항의 약학적 조성물의 용도.
포유동물에서 쿠싱병, 헤드 세이킹, 우블러 증후군, 호흡 곤란, 사지 마비로 구성되는 군으로부터 선택된 병변을 치료용 의약물 제조에 사용되는, 15 항 및 16 항의 약학적 조성물 용도.
포유동물에서 제엽염, 골막염, 위염, 관절염, 바이러스성, 세균성, 기생충성, 균사성 염증으로부터 선택된 급성 또는 만성 염증성 병리를 치료하는 의약물로서의, 15 항 및 16 항의 약학적 조성물 용도.
포유 동물에서 위의 팽창-뒤틀림의 증후군을 치료하는 의약물로서의, 15 항 및 16 항의 약학적 조성물 용도.
암말에서의 불임증, 수망아지에서의 조숙증을 치료하는 또는 포유 동물에서 경기 활동을 향상시키는, 15 항 및 16 항의 약학적 조성물 용도.
제 20 내지 24 항에 있어서, 상기 조성물은 150x10³ 세포/ml의 농도로 성체 줄기 세포를 포함하고 일주일에 한번 정맥 내 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 9 항 내지 26 항에 있어서, 상기 포유동물은 사람, 말, 고양이 또는 개로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.